CN113774012A - 一种角膜细胞衰老模型及其建立方法和应用 - Google Patents
一种角膜细胞衰老模型及其建立方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供一种角膜细胞衰老模型，其特征在于，其通过下述步骤构建：细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；细胞衰老步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下暴露角膜细胞；再培养步骤：弃去缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。还提供上述角膜细胞衰老模型的建立方法以及一种体外评价药物对角膜细胞的抗衰老效果的方法。本申请的角膜细胞衰老模型设备简单、易操作、耗时短、无有毒有害试剂，且能够得到结果重现性高的良好效果。
Description
技术领域
本申请涉及生物医学领域，具体涉及一种角膜细胞衰老模型、角膜细胞衰老模型建立方法及体外评价药物对角膜细胞的抗衰老效果的方法。
背景技术
中华医学会的统计数据显示，随着科技的发展和生活、工作的需要，人们在智能手机、电脑、电视上花费越来越多的时间，到2020年预计增加53％智能手机用户。60％的人每天花费至少6h在数字设备上，63.5％的人因蓝光辐射存在视力下降、白内障、失明等不同程度的眼疾。这些视频显示终端配备的液晶显示器，多采用发光二极管(LED)作为背光源，而LED中蓝光含量极高，对眼角膜造成极大损害。还有随着臭氧层的不断被破坏、户外活动的普及以及科技发展，人类接触紫外线及蓝光的机会增加。而眼睛是一个重要的感光器官，强烈而大量的紫外线会造成眼表的急性损伤如电光性眼炎和雪盲等。而眼睛长期接触紫外线及蓝光会造成慢性损伤如翼状胬肉、白内障以及视网膜黄斑等病变，损伤程度严重，甚至会导致永久性视力伤害。近年来，紫外线及蓝光致眼部损伤机制一般被认为是由于紫外线及蓝光的损伤，细胞产生氧自由基增多，最终导致氧化应激及光化学损伤，诱导角膜细胞走向衰老。
正常角膜为透明、有弹性、不含血管和淋巴管的组织，与巩膜一同构成眼球壁最外层，角膜占眼球壁前1/6，具有保护眼内容物的作用。正常人角膜横径11.5-12mm，垂直径10.5-11mm，正常情况下活体角膜中央厚度最薄，约0.5mm，越靠近角膜缘越厚，平均约1mm。角膜厚度随着年龄的增加有变薄的趋势，即老年人较成年人角膜薄，而成人较儿童薄。角膜从前往后分为五层，依次是上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮细胞层。角膜上皮细胞约7-14天更新一次。细胞衰老在形态学上表现为细胞结构的退行性改变，如在细胞核，核膜凹陷，最终导致核膜崩解，染色质结构变化，超二倍体和异常多倍体的细胞数目增加；细胞膜脆性增加选择性通透能力下降，膜受体种类、数目和对配体的敏感性等发生变化；脂褐素在细胞内堆积，多种细胞器和细胞内结构发生退行性变。在生理学上的表现为功能衰退与代谢低下，如细胞周期停滞，细胞增殖能力丧失，对促凋亡因素的反应性改变；细胞内酶活性中心被氧化，酶活性降低，蛋白质合成下降等。
现有的衰老模型的制备一般有复制衰老法、氧化应激法、高糖刺激法等。这些方法或者刺激周期长，或者较难造模成功，或者需要使用有毒试剂。但由于眼部主要的伤害来自于光的损伤，所以用光刺激的方法制备眼角膜细胞的衰老模型是比较符合眼部细胞衰老机制的。
发明内容
为克服现有技术中用于制备衰老模型常用方法不符合眼部衰老机制的问题，本申请提供一种角膜细胞衰老模型，其条件温和，不使用毒性试剂，成功率高，还提供一种上述模型的建立方法及体外评价药物对角膜细胞的抗衰老效果的方法。
本申请的具体技术方案如下：
1.一种角膜细胞衰老模型，其特征在于，其通过下述步骤构建：
细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；
细胞衰老步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下暴露角膜细胞；
再培养步骤：弃去缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。
2.根据项1所述的模型，其特征在于，细胞衰老步骤中，在2～7.2J/cm2 UVA、50～126mJ/cm2 UVB和1000～2000lux蓝光的条件下暴露所述角膜细胞；
优选地，细胞衰老步骤中，在4～7.2J/cm2 UVA、70～126mJ/cm2 UVB和1500～2000lux蓝光的条件下暴露所述角膜细胞；
优选地，细胞衰老步骤中，在25℃±5℃的条件下暴露所述角膜细胞。
3.根据项1或2所述的模型，其特征在于，所述角膜细胞为角膜上皮细胞；
优选地，所述角膜细胞为哺乳动物角膜上皮细胞，优选为原代人角膜上皮细胞；
优选地，细胞培养步骤中，培养结束后的角膜细胞为复苏后第3～4代的原代人角膜上皮细胞。
4.根据项1～3中任一项所述的模型，其特征在于，
细胞培养步骤中，在细胞培养皿上使用细胞培养液对角膜上皮细胞进行培养，当角膜上皮细胞达到80％以上融合时，对角膜上皮细胞进行消化，然后再继续对角膜上皮细胞进行培养；
优选地，细胞培养步骤中，对角膜上皮细胞进行消化后，用完全培养液重悬混匀，以5～10×103个角膜上皮细胞/孔加入细胞培养板，对角膜上皮细胞进行培养；
优选地，细胞培养步骤中，所述在细胞培养皿和细胞培养板上的细胞培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养24～48h。
5根据项1～4中任一项所述的模型，其特征在于，
细胞衰老步骤中，弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，每孔加入100～150μL缓冲液，加盖无菌保鲜膜，然后将所述角膜细胞放入灯箱照射UVA、UVB和蓝光；
再培养步骤中，弃去缓冲液，每孔加入100～150μL无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。
6.根据项1～5中任一项所述的模型，其特征在于，细胞衰老步骤中，测定UVA计量、UVB计量和蓝光计量的仪器的探头上均覆盖无菌保鲜膜。
7.根据项1～6中任一项所述的模型，其特征在于，相对于未经照射处理的空白对照组，所述模型的细胞活力降低10％～40％。
8.根据项1～7中任一项所述的模型，其特征在于，相对于未经照射处理的空白对照组，所述模型的细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率提高15％～70％。
9.根据项1～8中任一项所述的模型，其特征在于，相对于未经照射处理的空白对照组，所述模型的细胞ROS表达水平提高300％～3100％。
10.一种角膜细胞衰老模型建立方法，其特征在于，其包括以下步骤：
细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；
细胞衰老步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下暴露角膜细胞；
再培养步骤：弃去缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。
11.根据项10所述的方法，其特征在于，细胞衰老步骤中，在2～7.2J/cm2 UVA、50～126mJ/cm2 UVB和1000～2000lux蓝光的条件下暴露所述角膜细胞；
优选地，细胞衰老步骤中，在4～7.2J/cm2 UVA、70～126mJ/cm2 UVB和1500～2000lux蓝光的条件下暴露所述角膜细胞；
优选地，细胞衰老步骤中，在25℃±5℃的条件下暴露所述角膜细胞。
12.根据项10或11所述的方法，其特征在于，所述角膜细胞为角膜上皮细胞；
优选地，所述角膜细胞为哺乳动物角膜上皮细胞，优选为原代人角膜上皮细胞；
优选地，细胞培养步骤中，培养结束后的角膜细胞为复苏后第3～4代的原代人角膜上皮细胞。
13.根据项10～12中任一项所述的方法，其特征在于，细胞培养步骤中，在细胞培养皿上使用细胞培养液对角膜上皮细胞进行培养，当角膜上皮细胞达到80％以上融合时，对角膜上皮细胞进行消化，然后再继续对角膜上皮细胞进行培养；
优选地，细胞培养步骤中，对角膜上皮细胞进行消化后，用完全培养液重悬混匀，以5～10×103个角膜上皮细胞/孔加入细胞培养板，对角膜上皮细胞进行培养；
优选地，细胞培养步骤中，所述在细胞培养皿和细胞培养板上的细胞培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养24～48h。
14.根据项10～13中任一项所述的方法，其特征在于，细胞衰老步骤中，弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，每孔加入100～150μL缓冲液，加盖无菌保鲜膜，然后将所述角膜细胞放入灯箱照射UVA、UVB和蓝光；
再培养步骤中，弃去缓冲液，每孔加入100～150μL无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。
15.根据项10～14中任一项所述的方法，其特征在于，细胞衰老步骤中，测定UVA计量、UVB计量和蓝光计量的仪器的探头上均覆盖无菌保鲜膜。
16.一种体外评价药物对角膜细胞的抗衰老效果的方法，其特征在于，其包括：
细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；
加药步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，将所述角膜细胞分为第一、二、三组，第一组与第二组加入无血清细胞培养液，第三组加入用无血清细胞培养液稀释的待评价药物；
细胞衰老步骤：分别弃去各组加药步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下分别暴露第二组和第三组的角膜细胞，第一组的角膜细胞不做处理；
再培养步骤：分别弃去各组的缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到角膜细胞衰老模型；
结果评价步骤：测定各组的表征细胞衰老的参数，根据各组表征细胞衰老的参数的结果差异，评价所述药物对角膜细胞的抗衰老效果。
17.根据项16所述的方法，其特征在于，表征细胞衰老的参数选自细胞活力、β-半乳糖苷酶染色阳性率和ROS表达水平中的任意一种或两种或三种。
18.根据项16或17所述的方法，其特征在于，所述药物包括抗衰老活性物；
优选地，所述抗衰老活性物选自维生素、辅酶Q10、肽、中药提取物、植物提取物和发酵提取物中的任意一种或两种以上。
19.根据项16～18中任一项所述的方法，其特征在于，细胞衰老步骤中，在2～7.2J/cm2 UVA、50～126mJ/cm2 UVB和1000～2000lux蓝光的条件下分别暴露第二组和第三组的角膜细胞；
优选地，细胞衰老步骤中，在4～7.2J/cm2 UVA、70～126mJ/cm2 UVB和1500～2000lux蓝光的条件下分别暴露第二组和第三组的角膜细胞；
优选地，细胞衰老步骤中，在25℃±5℃的条件下暴露各组角膜细胞。
20.根据项16～19中任一项所述的方法，其特征在于，所述角膜细胞为角膜上皮细胞；
优选地，所述角膜细胞为哺乳动物角膜上皮细胞，优选为原代人角膜上皮细胞；
优选地，细胞培养步骤中，培养结束后的角膜细胞为复苏后第3～4代的原代人角膜上皮细胞。
21.根据项16～20中任一项所述的方法，其特征在于，细胞培养步骤中，在细胞培养皿上使用细胞培养液对角膜上皮细胞进行培养，当角膜上皮细胞达到80％以上融合时，对角膜上皮细胞进行消化，然后再继续对角膜上皮细胞进行培养；
优选地，细胞培养步骤中，对角膜上皮细胞进行消化后，用完全培养液重悬混匀，以5～10×103个角膜上皮细胞/孔加入细胞培养板，对角膜上皮细胞进行培养；
优选地，细胞培养步骤中，所述在细胞培养皿和细胞培养板上的细胞培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养24～48h。
22.根据项16～21中任一项所述的方法，其特征在于，
细胞衰老步骤中，分别弃去各组加药步骤后的细胞培养液，每孔加入100～150μL缓冲液，加盖无菌保鲜膜，然后将第二组和第三组的角膜细胞放入灯箱照射UVA、UVB和蓝光；
再培养步骤中，分别弃去各组的缓冲液，每孔加入100～150μL无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。
23.根据项16～22中任一项所述的方法，其特征在于，细胞衰老步骤中，测定UVA计量、UVB计量和蓝光计量的仪器的探头上均覆盖无菌保鲜膜。
发明的效果
本申请建立角膜细胞衰老模型的方法，选择特定的细胞培养条件和培养液对角膜细胞进行培养，使用2～7.2J/cm2 UVA、50～126mJ/cm2 UVB和1000～2000lux蓝光照射角膜细胞，最终可以获得有效的角膜细胞衰老细胞模型，该角膜细胞衰老模型显著降低细胞中线粒体活性，并使β-半乳糖苷酶与活性氧自由基表达升高，该角膜细胞衰老模型可以有效地用于评估药物的抗衰老效果，从而为眼部产品抗衰老效果的评价提供了一种新的方法，也为眼部光损伤患者用产品的研制提供了一种新的细胞模型。
本申请的角膜细胞衰老模型设备简单、易操作、耗时短、无有毒有害试剂，且能够得到结果重现性高的良好效果。
附图说明
图1为未经照射处理的空白对照组与照射模型组细胞中β-半乳糖苷酶染色对比结果图。
具体实施方式
下面结合附图所描述的实施方式对本发明做以详细说明，需要说明的是，在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本申请提供一种角膜细胞衰老模型，其特征在于，其通过下述步骤构建：
细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；
细胞衰老步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下暴露角膜细胞；
再培养步骤：弃去缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。
本申请的细胞衰老步骤中，UVA、UVB和蓝光三种光照的先后顺序没有限定，可以任意顺序进行光照，也可同时照射。
在一个具体实施方式中，所述角膜细胞为角膜上皮细胞，优选所述角膜细胞为哺乳动物角膜上皮细胞，更优选所述角膜细胞为原代人角膜上皮细胞。
在一个具体实施方式中，细胞培养步骤中，培养结束后的角膜细胞为复苏后第3～4代的原代人角膜上皮细胞。
在一个具体实施方式中，所述缓冲液为PBS。
本申请中的“复苏”符合生物技术领域的一般定义，是指将冻存在液氮或者-80℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，以使细胞恢复生长的过程。
在一个具体实施方式中，细胞培养步骤中，所述在细胞培养皿和细胞培养板上的细胞培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内进行培养的。
本申请中的“饱和湿度”表示在一定温度下，单位容积空气中所能容纳的水汽量的最大限度。
在一个具体实施方式中，细胞培养步骤中，在细胞培养皿上使用细胞培养液对角膜上皮细胞进行培养，当角膜上皮细胞达到80％以上融合时，对角膜上皮细胞进行消化，然后用完全培养液重悬混匀，以5～10×103个角膜上皮细胞/孔加入细胞培养板，对角膜上皮细胞进行培养，例如可为5×103个角膜上皮细胞/孔、6×103个角膜上皮细胞/孔、7×103个角膜上皮细胞/孔、8×103个角膜上皮细胞/孔、9×103个角膜上皮细胞/孔、104个角膜上皮细胞/孔等；优选地，所述细胞培养板为96孔的细胞培养板。
本申请中的“达到80％以上融合”是指在培养皿上培养时，贴壁细胞单层覆盖培养皿上表面80％的面积。
本申请中的“完全培养液”是指完全无机盐培养液，其是通过将1重量份硝酸钙、0.25重量份磷酸二氢钾、0.25重量份硫酸镁、0.25重量份氯化铁和0.25重量份氯化钾或硝酸钾溶解在1000重量份蒸馏水中配制而成。
在一个具体实施方式中，细胞衰老步骤中，在2～7.2J/cm2 UVA、50～126mJ/cm2UVB和1000～2000lux蓝光的条件下暴露所述角膜细胞，例如可为2J/cm2、2.5J/cm2、3J/cm2、3.5J/cm2、4J/cm2、4.5J/cm2、5J/cm2、5.5J/cm2、6J/cm2、6.5J/cm2、7J/cm2、7.2J/cm2等的UVA，50mJ/cm2、60mJ/cm2、70mJ/cm2、75mJ/cm2、80mJ/cm2、85mJ/cm2、90mJ/cm2、95mJ/cm2、100mJ/cm2、105mJ/cm2、110mJ/cm2、115mJ/cm2、120mJ/cm2、126mJ/cm2等的UVB，1000lux、1100lux、1200lux、1300lux、1400lux、1500lux、1600lux、1700lux、1800lux、1900lux、2000lux等的蓝光。
在一个具体实施方式中，细胞衰老步骤中，在4～7.2J/cm2 UVA、70～126mJ/cm2UVB和1500～2000lux蓝光以及25℃±5℃的条件下暴露所述角膜细胞。
本申请中的“UVA”是指波长为320～420nm的紫外线，又称为长波黑斑效应紫外线。其具有很强的穿透力，可以直达肌肤的真皮层，破坏弹性纤维和胶原蛋白纤维，将皮肤晒黑。
本申请中的“UVB”是指波长为280～320nm的紫外线，又称为中波红斑效应紫外线。其具有中等穿透力，其波长较短的部分会被透明玻璃吸收，日光中含有的中波紫外线大部分被臭氧层所吸收，只有不足2％能到达地球表面，在夏天和午后会特别强烈。UVB紫外线对人体具有红斑作用，能促进体内矿物质代谢和维生素D的形成，但长期或过量照射会令皮肤晒黑，并引起红肿脱皮。
在一个具体实施方式中，细胞衰老步骤和再培养步骤中，弃去细胞培养液和缓冲液的操作均可以采用注射器、移液管或者移液枪等任何适用的工具。
在一个具体实施方式中，细胞衰老步骤中，弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，每孔加入100～150μL缓冲液，打开细胞培养板盖子，加盖无菌保鲜膜，然后将所述角膜细胞放入灯箱照射UVA、UVB和蓝光；细胞衰老步骤中，测定UVA计量、UVB计量和蓝光计量的仪器的探头上均覆盖无菌保鲜膜；再培养步骤中，弃去缓冲液，每孔加入100～150μL无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。用无菌保鲜膜代替培养皿盖子是为了减少培养皿盖对紫外线及蓝光的遮挡，同时即可保持细胞的无菌环境。测量照度时覆盖保鲜膜使测量光强度与细胞接受的照射强度一致，使结果更精确。
在一个具体实施方式中，相对于未经照射处理的空白对照组，所述模型的细胞活力降低10％～40％，例如可为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％等。
细胞增殖能力(细胞活力)由WST-1方法测得，将在给定条件下进行孵育后的未经照射处理组的吸光度值定义为细胞活力为100％，在给定条件下对照射模型组进行同样的孵育后，测定各组吸光度值，根据公式：照射模型组的细胞活力/100％＝照射模型组吸光度值/未经照射处理组吸光度值，得到照射模型组的细胞活力，并以百分比表示。
WST-1是一种检测细胞线粒体活性的试剂，为一种类似于噻唑蓝(MTT)的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒(formazan)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞增殖越少，则颜色越浅。WST-1是MTT的一种升级替代产品，WST-1产生的formazan是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。WST-1比MTT更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-1和MTT相比，线性范围更宽，灵敏度更高。WST-1对细胞无明显毒性。加入WST-1显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间。
在一个具体实施方式中，相对于未经照射处理的空白对照组，所述模型的细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率提高15％～70％，例如可为15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％等。
β-半乳糖苷酶染色是判断细胞衰老的金标准，该染色在普通显微镜下就可显示细胞或组织的衰老情况。衰老的细胞或组织能产生半乳糖苷酶，这种酶可以催化底物X-Gal生成深蓝色产物，从而在光学显微镜下很容易观察到。β-半乳糖苷酶染色阳性率的计算方法为：在200X目镜下从每个孔中随机选择5个视图，阳性细胞与总细胞数的百分比，即为β-半乳糖苷酶染色阳性率。
在一个具体实施方式中，相对于未经照射处理的空白对照组，所述模型的细胞ROS表达水平提高300％～3100％，例如可为300％、400％、600％、800％、1000％、1300％、1600％、1900％、2200％、2500％、2800％、3100％等。
在细胞衰老过程中，细胞衰老的损害来自机体活性氧自由基的升高导致机体内抗氧化能力的减弱，细胞毒性不同程度增加造成结构瞬间的不可逆改变损伤，环境外界刺激及线粒体、脂肪酸均可产生超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等各种过氧化因子，可以触发过氧化反应，诱导细胞内物质发生过氧化并且引起细胞凋亡，加速推进衰老进程。活性氧(Reactive oxygen species,ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等。活性氧检测是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比，检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
本申请还提供一种角膜细胞衰老模型建立方法，其特征在于，其包括以下步骤：
细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；
细胞衰老步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下暴露角膜细胞；
再培养步骤：弃去缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。
在一个具体实施方式中，所述角膜细胞为角膜上皮细胞，优选所述角膜细胞为哺乳动物角膜上皮细胞，更优选所述角膜细胞为原代人角膜上皮细胞。
在一个具体实施方式中，细胞培养步骤中，培养结束后的角膜细胞为复苏后第3～4代的原代人角膜上皮细胞。
在一个具体实施方式中，所述缓冲液为PBS。
在一个具体实施方式中，细胞培养步骤中，所述在细胞培养皿和细胞培养板上的细胞培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内进行培养的。
在一个具体实施方式中，细胞培养步骤中，在细胞培养皿上使用细胞培养液对角膜上皮细胞进行培养，当角膜上皮细胞达到80％以上融合时，对角膜上皮细胞进行消化，然后用完全培养液重悬混匀，以5～10×103个角膜上皮细胞/孔加入细胞培养板，对角膜上皮细胞进行培养，例如可为5×103个角膜上皮细胞/孔、6×103个角膜上皮细胞/孔、7×103个角膜上皮细胞/孔、8×103个角膜上皮细胞/孔、9×103个角膜上皮细胞/孔、104个角膜上皮细胞/孔等；优选地，所述细胞培养板为96孔的细胞培养板。
在一个具体实施方式中，细胞衰老步骤中，在2～7.2J/cm2 UVA、50～126mJ/cm2UVB和1000～2000lux蓝光的条件下暴露所述角膜细胞，例如可为2J/cm2、2.5J/cm2、3J/cm2、3.5J/cm2、4J/cm2、4.5J/cm2、5J/cm2、5.5J/cm2、6J/cm2、6.5J/cm2、7J/cm2、7.2J/cm2等的UVA，50mJ/cm2、60mJ/cm2、70mJ/cm2、75mJ/cm2、80mJ/cm2、85mJ/cm2、90mJ/cm2、95mJ/cm2、100mJ/cm2、105mJ/cm2、110mJ/cm2、115mJ/cm2、120mJ/cm2、126mJ/cm2等的UVB，1000lux、1100lux、1200lux、1300lux、1400lux、1500lux、1600lux、1700lux、1800lux、1900lux、2000lux等的蓝光。
在一个具体实施方式中，细胞衰老步骤中，在4～7.2J/cm2 UVA、70～126mJ/cm2UVB和1500～2000lux蓝光以及25℃±5℃的条件下暴露所述角膜细胞。
在一个具体实施方式中，细胞衰老步骤和再培养步骤中，弃去细胞培养液和缓冲液的操作均可以采用注射器、移液管或者移液枪等任何适用的工具。
在一个具体实施方式中，细胞衰老步骤中，弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，每孔加入100～150μL缓冲液，打开细胞培养板盖子，加盖无菌保鲜膜，然后将所述角膜细胞放入灯箱照射UVA、UVB和蓝光；细胞衰老步骤中，测定UVA计量、UVB计量和蓝光计量的仪器的探头上均覆盖无菌保鲜膜；再培养步骤中，弃去缓冲液，每孔加入100～150μL无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。
本申请还提供一种体外评价药物对角膜细胞的抗衰老效果的方法，其特征在于，其包括：
细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；
加药步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，将所述角膜细胞分为未经照射处理组、照射模型组和样品组，未经照射处理组与照射模型组加入无血清细胞培养液，样品组加入用无血清细胞培养液稀释的待评价药物；
细胞衰老步骤：分别弃去各组加药步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下分别暴露照射模型组和样品组的角膜细胞，未经照射处理组的角膜细胞不做处理；
再培养步骤：分别弃去各组的缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到角膜细胞衰老模型；
结果评价步骤：测定各组的表征细胞衰老的参数，根据各组表征细胞衰老的参数的结果差异，评价所述药物对角膜细胞的抗衰老效果。
在一个具体实施方式中，表征细胞衰老的参数选自细胞活力、β-半乳糖苷酶染色阳性率和ROS表达水平中的任意一种或两种或三种。
在一个具体实施方式中，所述药物包括但不限于抗衰老活性物；所述抗衰老活性物包括但不限于维生素、辅酶Q10、肽、中药提取物、植物提取物和发酵提取物中的任意一种或两种以上。
在一个具体实施方式中，评价抗衰老效果的过程为：如果照射模型组的细胞活力显著低于未经照射处理组，和/或照射模型组的β-半乳糖苷酶染色阳性率显著高于未经照射处理组，和/或照射模型组的ROS表达水平显著高于未经照射处理组，则判定衰老模型有效；如果样品组的细胞活力显著高于照射模型组，和/或样品组的β-半乳糖苷酶染色阳性率显著低于照射模型组，和/或样品组的ROS表达水平显著低于照射模型组，则判定待测药物有抗衰老效果。
实施例
以下利用实施例对本申请做以详细说明。然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
1.试验材料及设备
实验材料：原代人角膜上皮细胞(HCEC，青旗生物技术发展有限公司)，DMEM高糖培养基(不含丙酮酸钠，Gibco)，胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(凯基生物)。
主要设备：倒置显微镜(OLYMPUS，CKX41)，超净工作台(东联哈尔，SCB-1520)，二氧化碳细胞培养箱(SANYO)，酶标仪(BIO-RAD，iMark)，UV-8型紫外线灯箱(北京电光源研究所)，ST-513型紫外线测量仪(台湾先驰)，流式细胞仪(BD，Accuri C6 PLUS)、蓝光辐照灯，蓝光辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。
2.试验方法
2.1细胞复苏
将购买的原代人角膜上皮细胞从干冰中取出，立即置于40℃水浴锅中，尽快融化后于超净工作台内用移液枪加入4mL含20％胎牛血清的DMEM细胞培养液中。1000rpm，离心3min。弃去上清，用含20％胎牛血清的DMEM(不含丙酮酸钠)细胞培养液重悬于细胞培养皿上于二氧化碳细胞培养箱37℃、5％CO2，饱和湿度条件下对细胞进行培养。
2.2细胞传代
待细胞长到80％融合时，弃去旧培养液，用PBS洗1遍，加入胰蛋白酶消化细胞，1:2传代，培养体系为含20％胎牛血清的DMEM细胞培养液。
2.3细胞衰老处理后对细胞增殖的影响
2.3.1细胞铺板
用复苏后第3代细胞，胰蛋白酶消化后细胞计数5×104个细胞/mL，加入96孔细胞培养板，每孔100μL，分为未经照射处理组与照射模型组，中间间隔三列，每个组6个平行。二氧化碳细胞培养箱孵育过夜，孵育条件是为37℃、5％CO2、饱和湿度。
2.3.2细胞衰老
弃去细胞培养液，加入PBS，加盖无菌保鲜膜，未经照射处理组用铝箔纸覆盖，然后将细胞培养板在4.2J/cm2 UVA与72mJ/cm2UVB照射后加1500lux蓝光照射1h，在25℃±5℃的条件下暴露细胞。照射完后，弃去PBS后加100μL无血清培养基。
2.3.3再培养及细胞增殖检测
在二氧化碳细胞培养箱中，在37℃、5％CO2，饱和湿度条件下，对细胞进行再培养24h后，每孔加10μL WST-1，继续于二氧化碳细胞培养箱中孵育2h后，用酶标仪于450nm波长处测定各组吸光度值，根据公式：照射模型组的细胞活力/100％＝照射模型组吸光度值/未经照射处理组吸光度值，得到照射模型组的细胞活力，并以百分比表示。
2.4细胞衰老处理后对β-半乳糖苷酶表达的影响
2.4.1细胞铺板
用复苏后第3代细胞，胰蛋白酶消化后细胞计数5×104个细胞/mL，加入6孔细胞培养板，每孔3mL，分为未经照射处理组与照射模型组，中间间隔1列，每个组2个平行。二氧化碳细胞培养箱孵育过夜。
2.4.2细胞衰老
弃去细胞培养液，每孔加入1mL PBS，加盖无菌保鲜膜，未经照射处理组用铝箔纸覆盖，然后将细胞培养板在4.2J/cm2 UVA与72mJ/cm2 UVB照射后加1500lux蓝光照射1h，在25℃±5℃的条件下暴露细胞。照射完毕后弃去PBS加入3mL无血清培养液。
2.4.3再培养及染色步骤
在二氧化碳细胞培养箱中，在37℃、5％CO2，饱和湿度条件下，对细胞进行再培养24h后，弃去培养液，用PBS洗一遍，每孔加入1mLβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min。用PBS洗涤细胞3次，每次3min。弃去PBS后，每孔加入1mL染色工作液，37℃孵育过夜，于倒置显微镜下观察拍照。在孔中选择5个视野(上、下、左、右、中)拍照后计数100个细胞中β-半乳糖苷酶染色的细胞个数。
2.5细胞衰老处理后对细胞内总活性氧(ROS)的影响
2.5.1准备工作
样品溶液的配制：分别以无血清DMEM培养液配制供试品溶液，0.22μm滤膜过滤除菌。
二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针溶液的配制：按0.375uL DCFH-DA:1mLPBS比例稀释。
2.5.2细胞铺板
用复苏后第3代细胞，胰酶消化后，用培养基(DMEM添加20％胎牛血清)调细胞密度1×105个/mL，接种于12孔细胞培养板，每孔1.0mL细胞悬液。置二氧化碳细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下常规培养24h。
2.5.3细胞衰老
盖子取下，弃去细胞培养液，加入1mL PBS，加盖无菌保鲜膜，然后再将细胞培养板在4.2J/cm2 UVA与72mJ/cm2 UVB照射后加1500lux蓝光照射1h，未经照射处理组加盖铝箔纸。照射完成后弃去PBS加入1mL无血清培养液。
2.5.4再培养及细胞ROS水平检测
在二氧化碳细胞培养箱中，在37℃、5％CO2，饱和湿度条件下对细胞进行再培养4h，弃去培养液，用PBS洗两遍。每孔加入1.0mL DCFH-DA，放入细胞培养箱中继续孵育30min，每隔5min混匀一次使探针充分结合。弃去探针，用预热的无血清培养基洗两遍，每孔加入1mL无血清培养基37℃孵育10min。胰酶消化细胞，PBS洗两遍，300μL PBS重悬，用流式细胞仪双通道检测，FL1-H通道，每个样品收集10000个细胞。
实施例2
本实施例所有实验材料及试验方法与实施例1一致，区别仅在于，细胞衰老步骤中，将细胞培养板在2.0J/cm2 UVA与50mJ/cm2 UVB照射后加1000lux蓝光照射1h。
实施例3
实施例3所有实验材料及试验方法与实施例1一致，区别仅在于，细胞衰老步骤中，将细胞培养板在7.2J/cm2 UVA与126mJ/cm2 UVB照射后加2000lux蓝光照射1h。
实施例4
实施例4所有实验材料及试验方法与实施例2一致，区别仅在于，细胞衰老步骤中，将细胞培养板在4.2J/cm2 UVA与40mJ/cm2 UVB照射后加900lux蓝光照射1h。
对比例1
对比例1所有实验材料及试验方法与实施例1一致，区别仅在于，细胞衰老步骤中，细胞采用复制衰老的方式，传代15代。
对比例2
对比例2所有实验材料及试验方法与实施例1一致，区别仅在于，细胞衰老步骤中，将细胞培养板在4.2J/cm2 UVA照射。
对比例3
对比例3所有实验材料及试验方法与实施例1一致，区别仅在于，细胞衰老步骤中，将细胞培养板在72mJ/cm2 UVB照射。
对比例4
对比例4所有实验材料及试验方法与实施例1一致，区别仅在于，细胞衰老步骤中，将细胞培养板在1500lux蓝光强度下照射1h。
对比例5
对比例5所有实验材料及试验方法与实施例1一致，区别仅在于，细胞衰老步骤中，将细胞培养板在4.2J/cm2 UVA与72mJ/cm2 UVB照射。
将各实施例和各对比例的光照条件总结于表1中：
表1
试验例1
1细胞衰老处理后对细胞增殖的影响
将未经照射处理组细胞增殖率(细胞活性)设为100％，实施例经不同照射条件下细胞增殖率都显著降低。对比例5与未经照射处理组相比细胞增殖率也有显著下降，对比例1,2,3,4与未经照射处理组相比细胞增殖率都无显著性差异。实施例1衰老模型组与对比例1-5相比细胞增殖率都有显著性降低。
表2 照射后细胞相对增殖率(％)
注：**表示与未经照射处理组相比p<0.01。
2细胞衰老处理后对β-半乳糖苷酶的影响
不同照射条件照射后β-半乳糖苷酶染色率比对照组有极显著提升，说明衰老模型建立成功。对比例5β-半乳糖苷酶染色率与未经照射处理组相比也有显著提升，但不如实施例1～4染色率高。且实施例1-4衰老模型组与对比例2-4相比，β-半乳糖苷酶染色率都有显著性升高。
表3 照射后细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率(％)
注：*表示与未经照射处理组相比p<0.05，**表示与未经照射处理组相比p<0.01。
3细胞衰老处理后对细胞内总活性氧水平的影响
与未经照射处理组相比不同照射条件照射后平均荧光强度都显著上升，说明经过紫外及蓝光的照射，细胞内产生大量的活性氧自由基。对比例1复制衰老细胞内并未有大量活性氧产生。对比例2-5与未经照射处理组相比都有细胞内活性氧的显著上升。实施例1-4衰老模型组与对比例1相比细胞内ROS都有显著性升高。
表4 照射后细胞ROS表达水平(平均荧光强度)
注：**表示与未经照射处理组相比p<0.01。
试验例2四氢嘧啶对角膜细胞光衰老的防护作用
1.试验材料及设备
实验材料：四氢嘧啶(华熙生物科技股份有限公司)，原代人角膜上皮细胞(HCEC，青旗生物技术发展有限公司)，DMEM高糖培养基(不含丙酮酸钠，Gibco)，胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(凯基生物)。
主要设备：倒置显微镜(OLYMPUS，CKX41)，超净工作台(东联哈尔，SCB-1520)，二氧化碳细胞培养箱(SANYO)，酶标仪(BIO-RAD，iMark)，UV-8型紫外线灯箱(北京电光源研究所)，ST-513型紫外线测量仪(台湾先驰)，流式细胞仪(BD，Accuri C6 PLUS)、蓝光辐照灯，蓝光辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。
2.试验方法
2.1四氢嘧啶对细胞衰老的防护作用
2.1.1细胞铺板
用复苏后第3代细胞，胰蛋白酶消化后细胞计数5×104个细胞/mL，加入96孔细胞培养板，每孔100μL，分为阴性对照组，衰老模型组及四氢嘧啶组，每个组6个平行。二氧化碳细胞培养箱孵育过夜，孵育条件是为37℃、5％CO2、饱和湿度。
2.1.2加药
四氢嘧啶组加入用无血清培养液配制的0.5％样品溶液，阴性对照组及衰老模型组加入等量无血清培养液，继续培养24h。
2.1.3细胞衰老
加盖无菌保鲜膜，阴性对照组用铝箔纸覆盖，然后将细胞培养板在4.2J/cm2 UVA与72mJ/cm2UVB照射后加1500lux蓝光照射1h，在25℃±5℃的条件下暴露细胞。照射完后，弃去培养液及加药液，加入100μL无血清培养基。
2.1.4再培养及细胞增殖检测
在二氧化碳细胞培养箱中，在37℃、5％CO2，饱和湿度条件下，对细胞进行再培养24h后，每孔加10μL WST-1，继续于二氧化碳细胞培养箱中孵育2h后，用酶标仪于450nm波长处测定各组吸光度值。
2.2四氢嘧啶对衰老细胞β-半乳糖苷酶表达的影响
2.2.1细胞铺板
用复苏后第3代细胞，胰蛋白酶消化后细胞计数5×104个细胞/mL，加入6孔细胞培养板，每孔3mL，分为阴性对照组，衰老模型组及四氢嘧啶组，每个组3个平行。二氧化碳细胞培养箱孵育过夜。
2.2.2加药
四氢嘧啶组加入用无血清培养液配制的0.5％样品溶液，阴性对照组及衰老模型组加入等量培养液，继续培养24h。
2.2.3细胞衰老
阴性对照组用铝箔纸覆盖，然后将细胞培养板在4.2J/cm2 UVA与72mJ/cm2 UVB照射后加1500lux蓝光照射1h，在25℃±5℃的条件下暴露细胞。照射完毕后弃去培养液及加药溶液，加入3mL无血清培养液。
2.2.4再培养及染色步骤
在二氧化碳细胞培养箱中，在37℃、5％CO2，饱和湿度条件下，对细胞进行再培养24h后，弃去培养液，用PBS洗一遍，每孔加入1mLβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min。用PBS洗涤细胞3次，每次3min。弃去PBS后，每孔加入1mL染色工作液，37℃孵育过夜，于倒置显微镜下观察拍照。在孔中选择5个视野(上、下、左、右、中)拍照后计数100个细胞中β-半乳糖苷酶染色的细胞个数。
2.3四氢嘧啶对衰老细胞内总活性氧(ROS)产生的影响
2.3.1准备工作
样品溶液的配制：分别以无血清DMEM培养液配制样品溶液，0.22μm滤膜过滤除菌。
二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针溶液的配制：按0.375uL DCFH-DA:1mLPBS比例稀释。
2.3.2细胞铺板
用复苏后第3代细胞，胰酶消化后，调细胞密度1×105个/mL，接种于12孔细胞培养板，每孔1.0mL细胞悬液。置二氧化碳细胞培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度条件下常规培养24h。
2.3.3加药
分为阴性对照组、衰老模型组和四氢嘧啶组，四氢嘧啶组加入用培养液配制的0.5％样品溶液，阴性对照组及衰老模型组加入等量培养液，继续培养24h。
2.3.4细胞衰老
阴性对照组用铝箔纸覆盖，然后将细胞培养板在4.2J/cm2 UVA与72mJ/cm2 UVB照射后加1500lux蓝光照射1h，在25℃±5℃的条件下暴露细胞。照射完毕后弃去培养液及加药溶液，加入1mL无血清培养液。
2.3.5再培养及细胞ROS水平检测
在二氧化碳细胞培养箱中，在37℃、5％CO2，饱和湿度条件下对细胞进行再培养4h，弃去培养液，用PBS洗两遍。每孔加入1.0mL DCFH-DA，放入细胞培养箱中继续孵育30min，每隔5min混匀一次使探针充分结合。弃去探针，用预热的无血清培养基洗两遍，每孔加入1mL无血清培养基37℃孵育10min。胰酶消化细胞，PBS洗两遍，300μL PBS重悬，用流式细胞仪双通道检测，FL1-H通道，每个样品收集10000个细胞。
3试验结果
3.1四氢嘧啶对细胞衰老的防护作用
将未经照射处理组细胞增殖率(细胞活性)设为100％，衰老模型组细胞增殖率与阴性对照组相比显著降低。四氢嘧啶处理后细胞增殖率与衰老模型组相比细胞增殖率显著升高，说明四氢嘧啶有显著的抗光老化的功效。
表5 细胞相对增殖率(％)
注：**表示与阴性对照组相比p<0.01。##表示与衰老模型组相比p<0.01。
3.2四氢嘧啶对衰老细胞β-半乳糖苷酶表达的影响
角膜细胞在光诱导衰老后β-半乳糖苷酶染色率比阴性对照组有极显著提升，说明衰老模型建立成功。加入四氢嘧啶后β-半乳糖苷酶染色率与衰老模型组相比有显著降低，说明四氢嘧啶有显著抗光老化功效。
表6 照射后细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率(％)
注：**表示与阴性对照组相比p<0.01。##表示与衰老模型组相比p<0.01。
3.3四氢嘧啶对衰老细胞内总活性氧水平的影响
与阴性对照组相比，光诱导细胞衰老后细胞内活性氧自由基荧光强度显著上升，说明经过紫外及蓝光的照射，细胞内产生大量的活性氧自由基。四氢嘧啶作用后，衰老细胞内活性氧自由基与衰老模型组相比显著降低。说明四氢嘧啶具有防止光诱导衰老细胞内ROS产生的功效。
表7 细胞ROS表达水平(平均荧光强度)
| 分组 | 阴性对照组 | 衰老模型组 | 四氢嘧啶(0.5％) |
| 平均荧光强度 | 3645.38±257 | 45165.34±2388** | 23431.76±2720<sup>##</sup> |
注：**表示与阴性对照组相比p<0.01。##表示与衰老模型组相比p<0.01。
尽管对本申请的实施方案和具体实施例进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。
Claims (10)
1.一种角膜细胞衰老模型，其特征在于，其通过下述步骤构建：
细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；
细胞衰老步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下暴露角膜细胞；
再培养步骤：弃去缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。
2.根据权利要求1所述的模型，其特征在于，细胞衰老步骤中，在2～7.2J/cm2 UVA、50～126mJ/cm2 UVB和1000～2000lux蓝光的条件下暴露所述角膜细胞；
优选地，细胞衰老步骤中，在4～7.2J/cm2 UVA、70～126mJ/cm2 UVB和1500～2000lux蓝光的条件下暴露所述角膜细胞；
优选地，细胞衰老步骤中，在25℃±5℃的条件下暴露所述角膜细胞。
3.根据权利要求1或2所述的模型，其特征在于，所述角膜细胞为角膜上皮细胞；
优选地，所述角膜细胞为哺乳动物角膜上皮细胞，优选为原代人角膜上皮细胞；
优选地，细胞培养步骤中，培养结束后的角膜细胞为复苏后第3～4代的原代人角膜上皮细胞。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的模型，其特征在于，
细胞培养步骤中，在细胞培养皿上使用细胞培养液对角膜上皮细胞进行培养，当角膜上皮细胞达到80％以上融合时，对角膜上皮细胞进行消化，然后再继续对角膜上皮细胞进行培养；
优选地，细胞培养步骤中，对角膜上皮细胞进行消化后，用完全培养液重悬混匀，以5～10×103个角膜上皮细胞/孔加入细胞培养板，对角膜上皮细胞进行培养；
优选地，细胞培养步骤中，所述在细胞培养皿和细胞培养板上的细胞培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养24～48h。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的模型，其特征在于，
细胞衰老步骤中，弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，每孔加入100～150μL缓冲液，加盖无菌保鲜膜，然后将所述角膜细胞放入灯箱照射UVA、UVB和蓝光；
再培养步骤中，弃去缓冲液，每孔加入100～150μL无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的模型，其特征在于，细胞衰老步骤中，测定UVA计量、UVB计量和蓝光计量的仪器的探头上均覆盖无菌保鲜膜。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的模型，其特征在于，相对于未经照射处理的空白对照组，所述模型的细胞活力降低10％～40％。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的模型，其特征在于，相对于未经照射处理的空白对照组，所述模型的细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率提高15％～70％。
9.一种角膜细胞衰老模型建立方法，其特征在于，其包括以下步骤：
细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；
细胞衰老步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下暴露角膜细胞；
再培养步骤：弃去缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。
10.一种体外评价药物对角膜细胞的抗衰老效果的方法，其特征在于，其包括：
细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；
加药步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，将所述角膜细胞分为第一、二、三组，第一组与第二组加入无血清细胞培养液，第三组加入用无血清细胞培养液稀释的待评价药物；
细胞衰老步骤：分别弃去各组加药步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下分别暴露第二组和第三组的角膜细胞，第一组的角膜细胞不做处理；
再培养步骤：分别弃去各组的缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到角膜细胞衰老模型；
结果评价步骤：测定各组的表征细胞衰老的参数，根据各组表征细胞衰老的参数的结果差异，评价所述药物对角膜细胞的抗衰老效果。
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|---|---|---|---|
| CN202111093072.1A CN113774012A (zh) | 2021-09-17 | 2021-09-17 | 一种角膜细胞衰老模型及其建立方法和应用 |
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Citations (3)
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| CN108969415A (zh) * | 2018-07-25 | 2018-12-11 | 中山大学 | 黄芪总苷在抗皮肤光老化和光损伤中的应用 |
| CN111557875A (zh) * | 2020-06-02 | 2020-08-21 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种抗光污染、光损伤的护肤组合物及其制备方法和应用 |
| CN112779305A (zh) * | 2019-11-08 | 2021-05-11 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种肉苁蓉酶解寡糖浓缩液的制备方法及所得产品和应用 |
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2021
- 2021-09-17 CN CN202111093072.1A patent/CN113774012A/zh active Pending
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