TWI698249B - 短鏈胜肽組合物於保護眼睛抗光害之應用 - Google Patents

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本發明係關於一種短鏈胜肽組合物於保護眼睛抗光害之應用。本發明之短鏈胜肽組合物包含一由5~10個胺基酸組成之短鏈胜肽，具有防止眼睛細胞不受高能量之紫外線、藍光照射及氧化壓力傷害的功效。

Description

短鏈胜肽組合物於保護眼睛抗光害之應用
本發明係依據專利法第30條第1項主張國內優先權，其國內優先權之申請案號為：107147507號，申請日期：107年12月27日。
本案係關於一種用於保護眼睛抗光害之短鏈胜肽組合物。更特別地，本發明係關於一種包含一由5~10個胺基酸組成之寡肽的短鏈胜肽組合物，用於預防或治療眼睛因高能量之紫外線或藍光照射及氧化壓力之傷害的用途。
瞳孔可藉由睫狀肌收縮或是放大來調解進入眼睛的光線，當光線強的時候瞳孔自動會縮小，光線弱瞳孔就會放大，這種瞳孔反應跟視網膜感光細胞是有關的。感光細胞有兩種，錐狀細胞和桿狀細胞。錐狀細胞主要分佈於黃斑部，負責中心視力跟顏色，當黃斑部出現病灶時，中心視力便會降低。
生活環境的光線，特別是陽光帶來的紫外線，也是造成白內障及黃斑部病變的主要原因。UVB(波長範圍280~320nm)來源以陽光居多，大部分會被眼睛的表層組織，例如角膜、結膜，或是深一點的水晶體吸收。在雪地、沙灘、泳池嬉戲時，會因為 陽光的反射，造成更嚴重的破壞，水晶體首當其衝，當眼睛長期暴露在大量的UVB的照射下，易導致水晶體內的蛋白質被破壞，呈現混濁狀，因而導致白內障的形成，這也是老年性白內障發生的原因之一。錐細胞過度吸收了紫外線的輻射能量會造成輻射能傷害，甚至造成視網膜黃斑部退化。
國外研究發現，長時間曝露在不論從陽光或照明設備而來的紫外線之下，眼睛視網膜外層的色素細胞會變薄、萎縮，進而使得眼睛負責中央視力的黃斑部位的感光細胞受傷，漸漸出現中央視覺模糊的情況。
除了紫外線，可見光裡的藍光目前也被認為是造成眼睛老化病變的危險分子。藍光是在可見光之中能量較高的光源，波長範圍在400-500nm左右，波長接近紫外光的光譜。藍光的特性是非常容易散射，讓眼睛不易聚焦，因此，眼睛必須更用力聚焦，長時間下來就會造成睫狀肌緊繃、無法放鬆，眼睛很容易疲勞、痠痛，是導致眼睛疲勞及視物時影像模糊的主要原因，也可能造成假性近視。
3C產品或不良的光源都是導致現代人雙眼容易受到光害的原因，因為電子產品中過量的藍光會穿透水晶體到達視網膜，感光細胞若長時間在藍光的燒灼下，會因氧化作用所產生的自由基，加速視網膜上皮細胞和黃斑部感光細胞氧化，使得視網膜細胞受到傷害，進而導致黃斑部病變，初期會產生眼睛刺痛、畏光等症狀，嚴重可能導致失明。
當人體正在利用氧氣進行某些代謝反應時，不可避免地會產生一些不穩定物質，而這些不穩定的物質都是氧氣的化合物，它們的特性非常活潑，容易去攻擊物質，稱之為自由基。當生活的空間及形態造成體內自由基濃度增加的情形，稱之為氧化壓力。氧化壓力越大，體內自由基的濃度就越高，而黃斑部具有極高的氧氣濃度，接受極強的光線，且該處脂肪極厚又脂肪比醣類與蛋白質產出能量較多，故使得黃斑部成為人體中有最高氧化壓力的組織，而此氧化壓力，極有可能造成黃斑部病變。
本發明遂提供一種用以保護眼睛對抗光害之短鏈胜肽組合物，經由試驗證明，本發明之短鏈胜肽具有保護、修復視網膜細胞、清除自由基及抗氧化等保護眼睛的功效。
於是，本發明係關於一種用於保護眼睛對抗光害之短鏈胜肽組合物，其特徵在於包含一由5~10個胺基酸組成之短鏈胜肽，其中構成該短鏈胜肽之胺基酸係選自由絲胺酸、賴胺酸和其他胺基酸的組合，且絲胺酸和賴胺酸須同時存在該短鏈胜肽之序列中。較佳地，所述之短鏈胜肽具有分子量為550~1100Da。
本發明所稱之“光害”係指光線對眼睛造成的傷害，尤指光線照射(包括UV光與藍光)及所產生的氧化壓力對眼睛，特別是視網膜細胞及黃斑部造成的傷害。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之短鏈胜肽組合物係用於預防或治療眼睛因高能量之紫外線照射之傷害。於本 發明之另一些具體實施態樣，所述之短鏈胜肽組合物係用於預防或治療眼睛因藍光照射之傷害。於本發明之另一些具體實施態樣，所述之短鏈胜肽組合物係用於預防或治療眼睛因氧化壓力之傷害。
於本發明之另一方面，係關於一種由5~10個胺基酸組成之短鏈胜肽用於製備保護眼睛對抗光害之醫藥品的用途，其中構成該短鏈胜肽之胺基酸係選自由絲胺酸、賴胺酸和其他胺基酸的組合，且絲胺酸和賴胺酸須同時存在該短鏈胜肽之序列中。較佳地，所述之短鏈胜肽具有分子量為550~1100Da。於本發明之另一些具體實施態樣，所述之短鏈胜肽具有增進視網膜細胞防禦能力的功效。於本發明之另一些具體實施態樣，所述之短鏈胜肽具有清除自由基的功效。於本發明之其他具體實施態樣，所述之短鏈胜肽具有降低氧化壓力的功效。
胜肽是兩個以上的胺基酸通過脫水縮合而成的聚合物，第一個胺基酸分子的羧基與第二個胺基酸分子的胺基縮合，脫去一個水分子，形成共價肽鍵，就稱為二胜肽；三個胺基酸縮合而成的稱為三胜肽，依此類推。通常小於10個胺基酸的胜肽稱為寡肽。
於本發明使用之短鏈胜肽是由5~10個胺基酸組成，分子量為550~1100Da。構成本發明短鏈胜肽結構的胺基酸必定包括絲胺酸與賴胺酸。絲胺酸是一種具有羥基(hydroxyl group)的極性、不帶電胺基酸，是生合成反應中最主要貢獻出一個碳的化合物，可促進脂肪和脂肪酸的新陳代謝，促進肌肉生長，協助體內製造抗體有助於維持，幫助神經纖維形成髓鞘；賴胺酸是一種人體必需的胺基酸，膠原蛋白中含有的羥基賴胺酸是由賴胺酸經羥基化而來，常被用於需要蛋白質修復的患者及需要額外增加肌肉量的運動員。
用於本發明之實施例，係將短鏈胜肽Ala-Asn-Ser-Ile-Lys(SEQ ID No.1)溶於生理食鹽水，製得不同濃度之短鏈胜肽溶液(50、100、250、500、1000μg/ml，以下簡稱AE50、AE100、AE250、AE500、AE1000等)，再用過濾膜無菌處理後備用。
本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。
實施例一、短鏈胜肽組合物提高眼睛視網膜細胞受光害的存活率
本實例使用之ARPE-19(Human Retinal Pigment Pithelium)細胞系是人類一種視網膜細胞，源自於一名19歲車禍罹難的健康男性的視網膜組織，由Amy Aotaki-Keen建於1986年。該細胞系表達視網膜色素細胞特有的分子標記如胞內視黃醛結合蛋 白和PRE-65。ARPE-19在體內具有RPE細胞的結構和功能特性，並表明該細胞係對於視網膜色素上皮細胞生理學的體外研究是有價值的。
將ARPE-19細胞(5x105，培養於添加10%胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's Nutrient Mixture F12(DMEM/F12，Gibco，Grand Island，NY)(1：1)培養基中)接種在24孔培養盤，於每孔加入100μl不同濃度之短鏈胜肽(AE50、AE100、AE250、AE500及AE1000)，於5%CO2，37℃恆溫培養箱中培養24小時，之後利用紫外線(100毫焦耳)照射約30分鐘，施予逆境處理之UV照射時間視UV能量之強度而可有所調整，UV能量越強時，波長越短，則UV照射時間越短；UV能量越弱時，波長越長，則UV照射時間越長。
細胞放置培養箱30分鐘後，吸取上清液，在原有的24well培養平盤之每1個孔盤中添加200μl MTT(0.3mg/ml)試劑，並於37℃下反應1小時。之後，在24孔培養平盤之每1個孔盤中添加400μl DMSO(溶解細胞)，並以微量吸管沖吸方式加以攪拌均勻，各取100μl培養液加至96孔培養平盤的每一個孔盤中(注意氣泡)，以ELISA計讀機(ELISA Reader)，於540nm測量並讀取OD值，用以評估本發明之短鏈胜肽組合物對經UV照射下之ARPE-19細胞存活率的影響。
四甲基噻唑藍(MTT)分析法係以活細胞代謝物還原 劑3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide)為基礎。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用於活細胞粒線體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下，四氮唑環生成藍色的formazan結晶，formazan結晶的生成量僅與活細胞數目成正比(死亡細胞中的琥珀酸脫氫酶失活，不能將MTT還原)。還原生成的formazan結晶再用DMSO將其溶解來呈色。結果如表一所示。
Figure 108111063-A0101-12-0007-1
結果顯示，不同測試濃度之短鏈胜肽溶液(AE50、AE100、AE250、AE500、AE1000)，都有保護眼睛視網膜細胞的效果。在UV組(只施予UV照射不添加任何藥品處理)之ARPE-19細胞中，經過UV照射造成視網膜細胞死亡，ARPE-19細胞的存活率降低了45%；而添加入不同濃度之短鏈胜肽溶液之處理組，ARPE-19細胞存活率較UV組增加4%~49%，其中以AE250之處理效果最佳。
參見表一，添加AE50之處理組，與UV照射組比較，ARPE-19細胞存活率上升4%；添加AE100之處理組，與UV照射組比較，ARPE-19細胞存活率上升16%；添加AE250之處理組，與UV照射組比較，則ARPE-19細胞存活率上升49%；添加AE500之處理組，與UV照射組比較，ARPE-19細胞存活率上升40%；添加AE1000之處理組，與UV照射組比較，ARPE-19細胞存活率上升35%。表示。本發明之短練胜肽能增進視網膜細胞防禦能力，對抗高能量光線(包括UV光及藍光)照射所誘導的視網膜細胞死亡傷害。
實施例二、短鏈胜肽組合物之抗氧化功效
本實例使用之BV-2微膠細胞系是一種類似巨噬細胞，活化的微膠細胞能釋放自由基物質ROS(reactive oxygen species)如oxygen(O2)、過氧化陰離子(O2 -)、過氧化氫(H2O2)、及羥基自由基(OH-)與一氧化氮(NO)。可藉由將微膠細胞受到刺激物，例如H2O2或脂多醣(lipopolysacchariges,LPS)刺激後，經由一連串之訊息傳遞系統所引起之反應造成自由基釋放。
H2DCF-DA對過氧化氫(H2O2)非常敏感，可用來偵測 細胞內產生的活性氧化物(reactive oxygen species,ROS)。H2DCF-DA本身不具螢光，加至培養液中可經由擴散作用通過細胞膜進入細胞，細胞內的酵素酯酶(esterase)會對H2DCF-DA進行去乙醯化作用(deacetylation)，進而形成極性的化合物(H2DCF)，當細胞內有過氧化物質存在時，會使H2DCF氧化形成具有螢光的產物(DCF)。當細胞內ROS的量越多，H2DCF被氧化成帶螢光的產物(DCF)就會越多，故利用偵測DCF螢光強度即可得知細胞內ROS產生之多寡。
取BV-2微膠細胞(1×105cells/well)至96孔培養平盤，於37℃培養24小時，添加H2DCF-DA(10μM/ml)(購自Molecular Probes,USA)於37℃培養1小時。之後，將刺激物H2O2(1mM)與不同濃度之短鏈胜肽溶液(10μl)添加至細胞培養物，再於37℃下避光培養1小時。之後以PBS清洗細胞，並於螢光光度計(Fluorescence spectrophotometer)偵測螢光(Ex./Em.485/538nm)量。細胞以不同濃度之短鏈胜肽溶液處理後之ROS量作表，所得數據如表二所示，數值以三重覆實驗次平均所得。標準差如表中所示。
Figure 108111063-A0101-12-0009-2
Figure 108111063-A0101-12-0010-3
結果顯示，不同測試濃度之短鏈胜肽溶液(AE50、AE100、AE250、AE500、AE1000)，都有抗氧化的效果。對照組(不添加刺激物H2O2也不添加任何藥品)之BV-2微膠細胞中的ROS表現量是2.99±0.41nM，經過H2O2刺激測試後，細胞中的ROS表現量是4.49±0.53，顯示以H2O2刺激使細胞的ROS表現量明顯增加了50%。經AM03處理後，ROS表現量是3.29±0.47，自由基降低27%。以不同測試濃度之短鏈胜肽溶液處理後，ROS表現量為4.18±0.52至3.48±0.44，表示細胞內ROS含量(自由基量)，相較於H2O2刺激降低了7%至22%，且隨短鏈胜肽之劑量升高，清除自由基的效果越好。由以上數據證明，本發明之短鏈胜肽具有清除自由基的功效，可有效減低氧化壓力，保護眼睛不受因光害所產生之氧化壓力對眼睛(尤其是黃斑部)造成的傷害。
<110> 三凡生技研發股份有限公司
<120> 短鏈胜肽組合物於保護眼睛抗光害之應用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Figure 108111063-A0305-02-0013-1

Claims (5)

  1. 一種由胺基酸序列為Ala-Asn-Ser-Ile-Lys之五肽組成之短鏈胜肽用於製備保護眼睛對抗高能量光線照射造成的視網膜或黃斑部傷害之醫藥品的用途。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該短鏈胜肽具有分子量為550~1100Da。
  3. 如請求項1所述之用途，其中該醫藥品係用於防止高能量光線照射所誘導的視網膜細胞死亡。
  4. 如請求項1所述之用途，其中該醫藥品係用於清除自由基。
  5. 如請求項1所述之用途，其中該醫藥品係用於減低黃斑部之氧化壓力。
TW108111063A 2018-12-27 2019-03-28 短鏈胜肽組合物於保護眼睛抗光害之應用 TWI698249B (zh)

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