TWI777448B - 生物活性物質用於製備眼睛保健及/或抗發炎的組合物之用途 - Google Patents

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Abstract

一種生物活性物質用於製備眼睛保健及/或抗發炎的組合物之用途，其中該生物活性物質為胜肽，該胜肽具有如SEQ ID NO：1所述之胺基酸序列，其中該胺基酸序列為一牛皮的胜肽片段；其中該組合物用以降低發炎相關基因的表現量，該發炎相關基因包含血管內皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A, VEGFA)基因、介白素-1β(Interleukin-1 beta, IL-1β)基因及介白素-8(Interleukin-8, IL-8)基因中至少一項基因。

Description

生物活性物質用於製備眼睛保健及/或抗發炎的組合物之用途
本發明涉及一種生物活性物質的用途，特別是關於一種作為生物活性物質的胜肽用於製備眼睛保健及/或抗發炎的組合物之用途。
隨著科技產品的日新月異，現代人花費大量時間使用手機及電腦，隨之而來的是對眼睛的負擔逐漸增長，容易產生視功能衰退及乾眼症等問題，因此眼睛保健是現今社會格外重視的課題，另外藍光對眼睛造成的傷害更是不可忽視，甚至會導致眼睛的發炎等症狀。
眼睛發炎的臨床症狀包含紅眼、眼睛發癢、結膜水腫、眼瞼腫脹及流淚等，其係因外在刺激使血管內皮細胞受器活化導致血管舒張以及血管滲透率提高，進而促進發炎因子如IL-1β及IL-8進入血管，促使白血球進入結膜組織，最終產生發炎，常見的病例如過敏性結膜炎等。
膠原蛋白係人體中重要的蛋白質，其廣泛存在於結締組織中，其可潤滑關節，並使肌膚保持彈性，而隨著膠原蛋白的流失，肌膚會產生皺紋及鬆弛等現象。膠原蛋白除了作為人體韌帶及細胞外基質等組織的主要成分，其亦是眼睛角膜的主要組成。
現今社會亟需一種有效保護眼睛之保健營養產品，而目前沒有較佳的研究探討膠原蛋白相關胜肽對於眼睛之保健功效，另外特定的膠原蛋白之相關胜肽片段是否具有眼睛保健或抗發炎之功效亦有待釐清。
有鑑於此，本發明之目的在於提供一種生物活性物質用於製備眼睛保健及/或抗發炎的組合物之用途，其中該生物活性物質為胜肽，該胜肽具有如SEQ ID NO：1所述之胺基酸序列，其中該胺基酸序列為一牛皮的胜肽片段。
在一些實施例中，其中該胺基酸序列可分離純化自牛皮細胞、牛皮膠原蛋白或牛肉細胞。
在一些實施例中，其中該胺基酸序列可由固相合成法(Fmoc-Solid Phase Peptide Synthesis)或其他化學合成法合成。
在一些實施例中，其中該組合物用以降低發炎相關基因的表現量，該發炎相關基因包含血管內皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)基因、介白素-1β(Interleukin-1beta,IL-1β)基因及介白素-8(Interleukin-8,IL-8)基因中至少一項基因。
在一些實施例中，其中該生物活性物質之濃度至少為0.0125mg/mL。
在一些實施例中，其中該眼睛保健包含預防眼睛發炎、抗藍光、舒緩眼睛疲勞及減少光線對眼睛之傷害。
在一些實施例中，其中該組合物係一醫藥品、一食品或一保養品。
在一些實施例中，其中該食品係為保健食品。
綜上所述，本發明提供一種生物活性物質用於製備眼睛保健及/或抗發炎的組合物之用途，其中該生物活性物質為胜肽，該胜肽具有如SEQ ID NO：1所述之胺基酸序列，其中該胺基酸序列為一牛皮的胜肽片段；該胺基酸序列具有降低發炎相關基因表現量的功效，該發炎相關基因包含血管內皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)基因、介白素-1β(Interleukin-1beta,IL-1β)基因及介白素-8(Interleukin-8,IL-8)基因中至少一項基因，進而達到預防眼睛發炎、抗藍光、舒緩眼睛疲勞、減少光線對眼睛之傷害、減緩視功能衰退、預防乾眼症及抗發炎等功效。
圖1係本發明實施例三中各組的VEGFA基因表現量的相對比率結果圖；圖2係本發明實施例三中各組的IL-1β基因表現量的相對比率結果圖；圖3係本發明實施例三中各組的IL-8基因表現量的相對比率結果圖。
以下將配合圖式進一步描述本案的部分具體實施態樣，下 述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。
本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，各組之間的差異以學生t檢驗(student’s t-test)進行分析。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為食用組合物。換言之，食用組合物包含特定含量的該生物活性物質。在一些實施例中，前述之食用組合物可為食品產品或食品添加物(food additive)。在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)或膳食補充品(dietary supplements)。
在一些實施例中，作為生物活性物質的胜肽能用於製備眼睛保健及/或抗發炎的組合物之用途，其中該生物活性物質為胜肽，該胜肽具有如SEQ ID NO：1所述之胺基酸序列，其中該胺基酸序列為一牛皮的胜肽片段。
應理解，「胜肽」為介於胺基酸和蛋白質之間的物質，係由多個胺基酸組成。並且，作為生物活性物質的胜肽可為「經分離的胜肽」或「經合成的胜肽」。其中，「經分離的胜肽」是指從生物體或生物體衍生物中分離出來的胜肽片段，且此胜肽片段具有生物活性。「經合成的胜肽」是指藉由儀器或人工實驗操作依照欲得到的胺基酸序列合 成的胜肽片段，且此胜肽片段具有生物活性。並且，本文所述及的用語「經分離的胜肽」等同於「分離的胜肽」或「分離胜肽」，且用語「經合成的胜肽」等同於「合成的胜肽」或「合成胜肽」。
應可理解，本文所述及的用語「蛋白」等同於「蛋白質」，例如用語「膠原蛋白」等同「膠原蛋白質」。
在一些實施例中，作為生物活性物質的胜肽可分離自牛皮的胜肽片段或藉由儀器或人工實驗合成得之。舉例來說，牛皮的胜肽片段的來源包括牛皮細胞、膠原蛋白(下稱牛皮膠原蛋白)及牛肉細胞。由於牛皮中主要的成分為膠原蛋白，且從牛皮中提取牛皮膠原蛋白的過程中，除了主要提取的牛皮膠原蛋白，更會包含牛皮細胞中的蛋白質(即，牛皮細胞蛋白)以及殘留在牛皮上牛肉細胞的蛋白質(即，牛肉細胞蛋白)。應可理解，本文所述及的用語「牛皮的胜肽片段」是指以膠原蛋白為主的胜肽片段，且同時含有牛皮細胞蛋白及牛肉細胞蛋白的胜肽片段。
在一些實施例中，其中，牛皮的胜肽片段可包含至少一種膠原蛋白、前膠原蛋白、牛皮細胞蛋白、牛肉細胞蛋白或其組合的胜肽片段。舉例來說，膠原蛋白可為第四型膠原蛋白、第五型前膠原蛋白、第十四型膠原蛋白等。
舉例來說，可將牛皮的膠原蛋白胜肽原料進行分離以得到SEQ ID NO：1中所示的胺基酸序列，且此膠原蛋白胜肽原料包括牛皮膠原蛋白的胜肽片段、牛皮細胞蛋白的胜肽片段及/或牛肉細胞蛋白的胜肽片段。在一實施例中，膠原蛋白胜肽原料可以為德國牛膠原蛋白胜肽粉 (購自GELITA，德國)，或是將牛皮提取出的膠原蛋白經由酵素水解處理後並乾燥形成的膠原蛋白胜肽粉。
在一些實施例中，作為生物活性物質的胜肽可藉由儀器(如，快速蛋白質液性層析儀及高效液相層析系統)自牛皮膠原蛋白胜肽粉分離得之。並且，上述分離步驟是利用胜肽性質(例如分子量、親疏水性、極性非極性等物理或化學特性)分離出的SEQ ID NO：1胺基酸序列。
在一些實施例中，其中，該胺基酸序列可由固相合成法(Fmoc-Solid Phase Peptide Synthesis)或其他化學合成法合成。
在一些實施例中，其中該SEQ ID NO：1胺基酸序列製備的組合物用以降低發炎相關基因的表現量，該發炎相關基因包含血管內皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)基因、介白素-1β(Interleukin-1beta,IL-1β)基因及介白素-8(Interleukin-8,IL-8)基因中至少一項基因。
在一些實施例中，其中，該生物活性物質之濃度至少為0.0125mg/mL。
在一些實施例中，本案所述之生物活性物質用於製備眼睛保健及/或抗發炎的組合物之用途，其中，該眼睛保健包含預防眼睛發炎、抗藍光、舒緩眼睛疲勞及減少光線對眼睛之傷害。
在一些實施例中，其中，該組合物係一醫藥品、一食品或一保養品。其中，該食品係為保健食品。
在一些實施例中，前述之組合物可為可食用組合物。在一 些實施例中，此可食用組合物可以製成食品產品或可為食品添加物(food additive)，意即藉由習知方法於食材製備時添加而製得食品產品，或是於食品產品的製作過程中添加。於此，食品產品可以是與可食性材料配製成供人類或動物攝食的產品。
在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。
實施例一、牛皮膠原蛋白之胜肽分離
首先，秤取100毫克牛皮膠原胜肽粉(購自德國GELITA，德國)，並將其溶解於5毫升的緩衝液A，以得到膠原胜肽液。其中，緩衝液A係以50毫莫耳濃度(mM)的Tris/HCl緩衝液(pH 8.0)及100mM氯化鈉(NaCl)配置。
接著，使用快速蛋白質液性層析儀(FPLC純化儀，廠牌ÄKTA GE Healthcare Life Sciences，以下稱為純化儀器)進行膠原胜肽液的粗略分離，以得到初分離胜肽混合物。其中，純化儀器內裝設的分離管柱為分子篩膠體純化管柱(sephadex G-25，2.6cm×10cm，53毫升)。純化儀器的流速設定為每分鐘流一毫升(1mL/min)用以觀察的紫外光波長為220奈米(nm)。並且，將波峰測量值為5kDa以下的初分離胜肽混合物於-80℃下進行冷凍抽乾(儀器廠牌EYELA；型號：FD-1000)12小時，以得到固態的初分離胜肽混合物。
取30毫克固態的初分離胜肽混合物溶解於2毫升含有0.1% 三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)的二次去離子水中，以得到預分離胜肽混合物。接著，以高效液相層析(HPLC)系統(機型Hitachi Chromaster HPLC system，廠牌Hitachi,Tokyo,Japan)(下稱HPLC系統)將預分離胜肽混合物進行分離，以得到多組次分離胜肽。其中，HPLC系統內裝設分子篩C18高壓管柱(型號TSKgel G2000SWXL，廠牌Tosoh,30cm×7.8mm,5μm)。HPLC系統的設定值中，以緩衝溶液A(0.1% TFA溶於100%去離子水)及緩衝溶液B(0.1% TFA溶於100%ACN)依照分離梯度進行混合，且分離梯度為5%乙腈(Acetonitrile,ACN)/0.1%TFA到100%乙腈/0.1%TFA(即，於0.1%TFA溶液環境中將ACN的濃度由5%拉梯度至100%)、流速設定為每分鐘流一毫升(1mL/min)及管柱溫度設定為40℃。
於此，初分離胜肽混合物中的胜肽會隨不同極性及分子量於的HPLC溶液沖提出來，進而得到多組分離胜肽。並且，將多組分離胜肽於-80℃下進行冷凍抽乾(儀器廠牌EYELA；型號：FD-1000)12小時，以得到多組固態的分離胜肽。
實施例二、牛皮膠原蛋白之胜肽鑑定
將實施例一的多組分離胜肽進行蛋白質身分鑑定。首先，多組固態的分離胜肽以去離子水配置為20mg/ml的濃度後，以液相層析質譜儀(LC-MS/MS)進行蛋白質鑑定。並且，液相層析質譜儀(LC-MS/MS)為四級棒-飛行時間式串聯質譜儀系統(Q-TOF)，其中液相層析系統(LC system)的型號為UltiMate 3000 RSLCnano LC Systems(廠牌Thermo Fisher Scientific)，且質譜儀(Mass Spectrometer)的型號為TripleTOF® 6600 System(廠牌Applied Biosystems Sciex)。
液相層析系統內裝設的分離管柱號為C18分離管柱(Acclaim PepMap C18,75μm I.D.x 25cm nanoViper,2μm,100Å(Thermo Fisher Scientific))。液相層析質譜儀所使用的溶液系統為緩衝溶液A(0.1% TFA溶於100%去離子水)及緩衝溶液B(0.1% TFA溶於100%ACN)。液相層析質譜儀設定的分離梯度為5%緩衝溶液B到拉梯度到90%緩衝溶液B、流速設定為每分鐘流300奈升(300nl/min)及拉梯度30分鐘。
於質譜儀的設定值中，檢視質譜掃描(survey scan)設定為掃描在400m/z(質荷比)至1200m/z範圍內的所有離子化的分離的胜肽。在資料依靠收集模式(information dependent aquisition,CID)中，設定胜肽的偵測範圍是100-5000道爾頓(dalton,Da)。
胜肽在質譜的氣相環境中特別容易在胜肽鍵斷裂，a、b、c系列離子同屬斷裂在不同位置氨端碎片(N-terminal fragment)，x、y、z則為羧端碎片(C-terminal fragment)，數字則代表胺基酸的排列順序，由同一系列的碎片(如y1、y2、y3…)間的質量差距可計算出該胜肽全部序列，其中，即鑑定出如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列及分子量。
Figure 110108592-A0305-02-0011-1
由表1可知，在一些實施例中，本案所述的分離胜肽的胺基酸序列的分子量為1110.66，且其結構如下所示：
Figure 110108592-A0305-02-0012-2
於此可知，牛皮膠原蛋白胜肽原料包含上述分離出來的胜肽的胺基酸序列，即SEQ ID NO：1。
實施例三、牛皮膠原蛋白之胜肽合成
為驗證實施例二所鑑定到的分離胜肽的胺基酸序列對於眼睛保健的功效，於實施例三中依據前述實施例二鑑定所得的胺基酸序列(即SEQ ID NO：1)的胺基酸排列順序製備合成胜肽。使用合成方法為固相合成法(Fmoc-Solid Phase Peptide Synthesis)，且使用的儀器為胜肽合成儀(型號Focus XC III 0，美國，廠牌AAPPTEC)。
已知SEQ ID NO：1的胺基酸序列為Thr-Lys-Leu-Pro-Ser-Gly-Leu-Pro-Val-Ser-Leu。
步驟1：首先，於反應管中置入樹脂，並依照每1公克樹脂加入15毫升的二氯甲烷(DCM)，將樹脂浸泡在二氯甲烷中30分鐘以使樹脂於溶液中膨脹。
步驟2：去除反應管內的二氯甲烷，並依照每1公克樹脂加入15毫升的20%呱啶二甲基甲醯胺(呱啶DMF)溶液至反應管中與樹脂反應5分鐘，接著去除反應管內溶液。再次依照每1公克樹脂加入15毫升 的20%呱啶二甲基甲醯胺溶液至反應管中再次與樹脂反應15分鐘，以去除樹脂上保護基，得到去保護基的樹脂。
步驟3：於再次去除反應管內的溶液後，從反應管內取出十幾粒樹脂進行檢測。首先，將樹脂以乙醇清洗三次，並加入茚三酮、苯酚溶液各一滴。於105℃至110℃加熱5分鐘，當茚三酮及苯酚溶液和樹脂反應皆變成深藍色時，為陽性反應，代表此時反應管內的樹脂為去保護基的樹脂，並可與胺基酸結合。
步驟4：將去保護基的樹脂依照每1公克樹脂加入10毫升的二甲基甲醯胺至反應管內重複清洗6次。
步驟5：將三倍過量的保護蘇胺酸(Fmoc-Thr)及三倍過量的羥基苯並三唑(HOBt)以少量的二甲基甲醯胺溶解後，加入裝有去保護基的樹脂的反應管內反應90分鐘。
步驟6：於90分鐘反應後，依照每1公克樹脂加入10毫升的二甲基甲醯胺至反應管內重複清洗3次接有胺基酸的樹脂。
接著，重複上述步驟(2)至(6)，直到將其餘胺基酸(Lys、Leu、Pro、Ser、Gly、Leu、Pro、Val、Ser、Leu)依序接起以形成胺基酸序列為SEQ ID NO：1的初合成胜肽。
步驟7：依照每1公克樹脂加入10毫升的二甲基甲醯胺至反應管內重複清洗初合成胜肽3次、接著依照每1公克樹脂加入10毫升的二氯甲烷至反應管內清洗初合成胜肽3次，以及最後依照每1公克樹脂加入10毫升的乙醇至反應管內清洗初合成胜肽3次。
步驟8：將清洗後的初合成胜肽以10克裂解液(86%三氟 乙酸、4%苯甲硫醚、3%水、5%乙二硫醇(EDT)及2%苯酚)反應120分鐘，以分離初合成胜肽與樹脂。
步驟9：藉由砂芯漏斗將含有初合成胜肽之裂解液與樹脂分離，接著將含有初合成胜肽之裂解液中加入相對前述裂解液八倍體積的乙醚中以進行反應。接著，以布氏漏斗進行抽濾分離以初合成胜肽及裂解液，並於抽乾含有裂解液的乙醚後以乙醚清洗初合成胜肽三次，此時初合成胜肽為固體。並且，於常溫中待乙醚揮發後得到乾燥的初合成胜肽。
步驟10：取1毫克的乾燥的初合成胜肽以0.5毫升去離子水回溶後，取20毫升回溶後的初合成胜肽以HPLC系統(機型Hitachi Chromaster HPLC system，廠牌Hitachi,Tokyo,Japan)進行分離並純化，以得到純合成胜肽。其中。於HPLC系統中設置C18管柱(廠牌Gemini-NX)並設定檢測長為220nm，並且HPLC系統中以緩衝溶液A(0.1% TFA溶於100%去離子水)及緩衝溶液B(0.1% TFA溶於100%ACN)依照線分離梯度進行混合以沖堤並分離出合成胜肽。分離梯度的設定值從為10%緩衝溶液B拉線性梯度到90% ACN(溶於0.1%TFA)、流速設定為每分鐘流一毫升(1mL/min)且分離時間設定為30分鐘。並且，依據HPLC色譜圖中計算各合成胜肽的鋒面積可得出合成胜肽之純度皆達95%以上。於此，可得到胺基酸序列為SEQ ID NO：1的合成胜肽。
實施例四、護眼及抗發炎基因的功效測試
此實施例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定人類視網膜色素上皮細胞經SEQ ID NO：1的胺基酸序列胜肽處理後，細胞中護眼及抗發炎之基因表現量的變化，進而確認本發明之生物活性物質之牛皮胜肽對於抵抗藍光及抗發炎反應之功效。
舉例來說，發炎相關基因係為血管內皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)基因、介白素-1β(Interleukin-1beta,IL-1β)基因及介白素-8(Interleukin-8,IL-8)基因；上述發炎相關基因係於眼睛受外在環境刺激時會上調之基因，其用於促進發炎反應的產生，以致該發炎反應相關基因之調控與眼睛保健相關。
其中，血管內皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)基因所編碼的蛋白質是血管新生過程中血管形成不可或缺的組成部分，並且與血視網膜(blood-retinal)和血腦屏障(blood-brain barriers)的通透性有關。VEGFA蛋白會誘發酪氨酸激酶路徑(tyrosin kinase pathway)，以活化內皮細胞的一氧化氮生成酶(endothelial nitric oxidesynthase,eNOS)等酵素，進而促使血管通透性增加及血管新生。除血管生成外，VEGFA蛋白亦參與血管系統的維持，VEGFA蛋白的特異性結合與各種組織(如心臟，腎臟和腦)的血管成熟相關，且VEGFA在維持靜態血管內皮及促發炎反應中具有重要功能。
其中，介白素-1β(Interleukin-1beta,IL-1β)及介白素-8(Interleukin-8,IL-8)基因所編碼的蛋白質是發炎反應重要的調控因 子，其屬於白血球介素家族蛋白。該白血球介素家族包括11種蛋白，它們組成了促發炎反應的複雜網絡，白血球介素家族蛋白隨著白血球和內皮細胞受到外在環境刺激所表達，進而啟動和控制炎症反應，被視為促發炎反應之蛋白。
因此，實施例四中以VEGFA基因、IL-1β基因及IL-8基因作為分析標的，以驗證本發明之生物活性物質對於護眼及抗發炎反應之功效。
材料與儀器
1.細胞株：人類視網膜色素上皮細胞ARPE-19(購自ATCC，產品編號CRL-2302)。
2.培養基：以1：1體積混和DMEM培養基(Gibco公司，產品編號11965-092)和漢氏F12培養基(Gibco公司，產品編號31765035)，另外再加入10%胎牛血清(Gibco公司，產品編號10437-028)、0.5mM丙酮酸鈉(Gibco公司，產品編號11360-070)和15mM HEPES緩衝劑(Gibco公司，產品編號15630106)。
3.RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，產品編號Lot No.FC24015-G)。
4.反轉錄酶(SuperScript® III Reverse Transcriptase)購自Invitrogen公司，美國，產品編號18080-051。
5.測量標的基因引子，其中包含VEGFA基因、IL-1β基因、IL-8基因，另包括內部控制組(GAPDH基因)。
6.KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組(購自Sigma公司，產品編 號38220000000)。
7.ABI StepOnePlusTM即時PCR系統(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system)購自Thermo Fisher Scientific公司。
8.實驗樣品：此實施例中所使用的實驗樣品為生物活性物質，該生物活性物質特別係指牛皮胜肽，其係透過如上述實施例三所獲得之SEQ ID NO：1的合成胜肽(以下簡稱牛皮胜肽)。
實驗步驟
細胞培養階段：首先，取1.5x105個人類視網膜色素上皮細胞至每孔含有2毫升上述培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。
細胞處理階段：接著，將每孔的人類視網膜色素上皮細胞依據下列測試條件分為控制組、對照組(經藍光處理)以及實驗組(添加本發明之牛皮胜肽，並經藍光處理)三組，進行三重複試驗，其實驗條件如表2所示：
Figure 110108592-A0305-02-0017-3
詳細來說，在細胞處理階段時，控制組及對照組是使用2毫升培養液來培養人類視網膜色素上皮細胞；實驗組則是添加如上實施例三所製備的牛皮胜肽於培養液中使其濃度為0.0125mg/ml；各組於37 ℃下培養24小時。
經24小時培養後，將對照組及實驗組以藍光進行照射處理15分鐘。
細胞分析階段：將細胞處理階段的各組人類視網膜色素上皮細胞(即控制組、對照組及實驗組)以細胞裂解液分別破細胞膜。接著，以RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，Lot No.FC24015-G)分別萃取各組細胞溶液內的RNA。接著，每組取1000奈克(ng)的萃取出的RNA作為模板，透過SuperScript® III反轉錄酶(購自Invitrogene公司，美國，產品編號18080-051)將萃取出的RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM即時PCR系統(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，購自Thermo Fisher Scientific公司)、KAPA SYBR FAST(購自Sigma公司，美國，產品編號38220000000)及表3的引子(SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：9)對各組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)以觀察各組的人類視網膜色素上皮細胞內的VEGFA基因、IL-8基因以及IL-1β基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95℃反應20秒，接著95℃反應3秒，60℃反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-△Ct方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可定量VEGFA基因、IL-8基因以及IL-1β基因的mRNA表現量，進而推斷VEGFA基因、IL-8基因以及IL-1β基因編碼的蛋白質的表現量。
Figure 110108592-A0305-02-0019-4
請參閱圖1，將控制組的VEGFA基因的表現量視為100%時，對照組相對於控制組的VEGFA基因的表現量為109.47%，證實經藍光照射後，人類視網膜色素上皮細胞之VEGFA基因表現量會有上調之現象，進而促進發炎反應產生；而實驗組相對於控制組的VEGFA基因的表現量為84.07%，與對照組之結果相比，顯示實驗組經牛皮胜肽處理後，可在藍光的刺激下抑制VEGFA基因的表現量。
血管內皮生長因子A(VEGFA)在眼內的生理和病理性血管生成中都起著重要作用，當眼睛受到外在刺激時，會促使VEGFA的表現，進而導致眼睛的發炎。特定分子已成為藥物開發的目標，並獲得美國食品和藥物管理局的批准，貝伐單抗(Bevacizumab)是一種經批准用於靜脈注射治療晚期癌症的VEGFA抗體，其已在眼科領域廣泛用於滲出性黃斑變性(exudative age-related macular degeneration)、糖 尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy)、視網膜靜脈阻塞(retinal vein ocelusions)、早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity)和其他脈絡膜視網膜血管疾病(chorioretinal vascular disorders)的治療，且其他VEGFA抑制藥物如培加他尼(Pegaptanib)和蘭尼單抗(Ranibizumab)亦是專門為眼內使用而開發的，皆已證實其於人體中的安全性及有效性。
請參閱圖2，將控制組的IL-1β基因的表現量視為100%時，對照組相對於控制組的IL-1β基因的表現量為109.21%，證實經藍光照射後，人類視網膜色素上皮細胞之IL-1β基因表現量會有上調之現象，進而促進發炎反應產生；而實驗組相對於控制組的IL-1β基因的表現量為66.36%，與對照組之結果相比，顯示實驗組經牛皮胜肽處理後，可在藍光的刺激下抑制IL-1β基因的表現量。
請參閱圖3，將控制組的IL-8基因的表現量視為100%時，對照組相對於控制組的IL-8基因的表現量為121.77%，證實經藍光照射後，人類視網膜色素上皮細胞之IL-8基因表現量會有上調之現象，進而促進發炎反應產生；而實驗組相對於控制組的IL-8基因的表現量為88.29%，與對照組之結果相比，顯示實驗組經牛皮胜肽處理後，可在藍光的刺激下抑制IL-8基因的表現量。
其中，IL-1β係白血球介素家族蛋白中重要的促發炎反應因子，先天免疫細胞由Toll樣受體或者RIG樣受體激活後，會合成IL-1β的前體，並經蛋白酶修飾始為具活性的IL-1β，進而促進發炎反應。IL-8是巨噬細胞和上皮細胞等分泌的細胞因子。介白素-8結合趨化 因子受體介白素-8受體α(IL8RA，又叫CXCR1)和介白素-8受體β(IL8RB，又叫CXCR2)而對嗜中性粒細胞(neutrophils)有細胞趨化作用而對炎症反應進行調節，介白素-8具有強效的促血管生成作用，其在小支氣管炎和囊性纖維化等炎症病理中起重要作用。IL-1β和IL-8等細胞因子/趨化因子已證實與眼睛刺激的炎症機制有關，當人體受到環境暴露引起的眼睛刺激後，IL-1β和IL-8蛋白表現量會提升，以造成眼睛的發炎反應，進而產生如眼臉腫脹、紅眼及過敏性結膜炎等症狀。
圖1至圖3結果表明，經藍光刺激後，未經本發明牛皮胜肽處理之對照組之VEGFA基因、IL-1β基因及IL-8基因的表現量皆有上降之趨勢，用以促進發炎反應的進行；然實驗組相較於對照組經藍光處理之後VEGFA基因、IL-1β基因及IL-8基因表現量皆有下調之現象，顯示本發明之作為生物活性物質的牛皮胜肽具有抗藍光之功效，且可降低眼睛發炎反應相關基因之表現量，證實本發明之牛皮胜肽確實具有眼睛保健及抗發炎反應之實際效果，可達到抗藍光、舒緩眼睛疲勞、預防眼睛發炎及減少光線對眼睛之傷害等功效。
綜上所述，根據本發明任一實施例之作為生物活性物質的胜肽，其可製備眼睛保健及/或抗發炎的組合物之用途，該胜肽包括SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。在一些實施例中，該胺基酸序列可分離純化自牛皮細胞、牛皮膠原蛋白或牛肉細胞。在一些實施例中，作為生物活性物質的胜肽可降低發炎相關基因的表現量，該發炎相關基因包含血管內皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)基因、介白素-1β(Interleukin-1beta,IL-1β)基因及介白素-8 (Interleukin-8,IL-8)基因中至少一項基因。並且，所製備的組合物具有眼睛保健的功效，其包含預防眼睛發炎、抗藍光、舒緩眼睛疲勞及減少光線對眼睛之傷害。
本發明的技術內容以較佳實施例方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
Figure pseq-0
Figure pseq-1
Figure pseq-2
Figure pseq-3
Figure pseq-4

Claims (8)

  1. 一種生物活性物質用於製備眼睛保健及/或抗發炎的組合物之用途，其中該生物活性物質為胜肽，該胜肽具有如SEQ ID NO：1所述之胺基酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該胺基酸序列可分離純化自牛皮細胞、牛皮膠原蛋白或牛肉細胞。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該胺基酸序列可由固相合成法(Fmoc-Solid Phase Peptide Synthesis)或其他化學合成法合成。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物用以降低發炎相關基因的表現量，該發炎相關基因包含血管內皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A, VEGFA)基因、介白素-1β(Interleukin-1beta, IL-1β)基因及介白素-8 (Interleukin-8, IL-8)基因中至少一項基因。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該生物活性物質之濃度至少為0.0125 mg/mL。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該眼睛保健包含預防眼睛發炎、抗藍光、舒緩眼睛疲勞及減少光線對眼睛之傷害。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物係一醫藥品、一食品或一保養品。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該食品係為保健食品。
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