CN111632129B - 短链胜肽组合物于保护眼睛抗光害的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明关于一种短链胜肽组合物在保护眼睛抗光害的应用。本发明的短链胜肽组合物包含一由5～10个氨基酸组成的短链胜肽，具有防止眼睛细胞不受高能量的紫外线、蓝光照射及氧化压力伤害的功效。

Description

短链胜肽组合物于保护眼睛抗光害的应用
技术领域
本发明关于一种用于保护眼睛抗光害的短链胜肽组合物。更特别地，本发明关于一种包含一或多种其结构是具有5～10个选自丝氨酸(Serine)与赖氨酸(Lysine)和其他氨基酸的组合的氨基酸的寡肽的短链胜肽组合物，用于预防或治疗眼睛因高能量的紫外线或蓝光照射及氧化压力的伤害的用途。
背景技术
瞳孔可通过睫状肌收缩或是放大来调解进入眼睛的光线，当光线强的时候瞳孔自动会缩小，光线弱瞳孔就会放大，这种瞳孔反应跟视网膜感光细胞是有关的。感光细胞有两种，锥状细胞和杆状细胞。锥状细胞主要分布于黄斑部，负责中心视力跟颜色，当黄斑部出现病灶时，中心视力便会降低。
生活环境的光线，特别是阳光带来的紫外线，也是造成白内障及黄斑部病变的主要原因。UVB(波长范围280～320nm)来源以阳光居多，大部分会被眼睛的表层组织，例如角膜、结膜，或是深一点的水晶体吸收。在雪地、沙滩、泳池嬉戏时，会因为阳光的反射，造成更严重的破坏，水晶体首当其冲，当眼睛长期暴露在大量的UVB的照射下，易导致水晶体内的蛋白质被破坏，呈现混浊状，因而导致白内障的形成，这也是老年性白内障发生的原因之一。锥细胞过度吸收了紫外线的辐射能量会造成辐射能伤害，甚至造成视网膜黄斑部退化。
国外研究发现，长时间曝露在不论从阳光或照明设备而来的紫外线之下，眼睛视网膜外层的色素细胞会变薄、萎缩，进而使得眼睛负责中央视力的黄斑部位的感光细胞受伤，渐渐出现中央视觉模糊的情况。
除了紫外线，可见光里的蓝光目前也被认为是造成眼睛老化病变的危险分子。蓝光是在可见光之中能量较高的光源，波长范围在400-500nm左右，波长接近紫外光的光谱。蓝光的特性是非常容易散射，让眼睛不易聚焦，因此，眼睛必须更用力聚焦，长时间下来就会造成睫状肌紧绷、无法放松，眼睛很容易疲劳、酸痛，是导致眼睛疲劳及视物时影像模糊的主要原因，也可能造成假性近视。
3C产品或不良的光源都是导致现代人双眼容易受到光害的原因，因为电子产品中过量的蓝光会穿透水晶体到达视网膜，感光细胞若长时间在蓝光的烧灼下，会因氧化作用所产生的自由基，加速视网膜上皮细胞和黄斑部感光细胞氧化，使得视网膜细胞受到伤害，进而导致黄斑部病变，初期会产生眼睛刺痛、畏光等症状，严重可能导致失明。
当人体正在利用氧气进行某些代谢反应时，不可避免地会产生一些不稳定物质，而这些不稳定的物质都是氧气的化合物，它们的特性非常活泼，容易去攻击物质，称之为自由基。当生活的空间及形态造成体内自由基浓度增加的情形，称之为氧化压力。氧化压力越大，体内自由基的浓度就越高，而黄斑部具有极高的氧气浓度，接受极强的光线，且该处脂肪极厚又脂肪比醣类与蛋白质产出能量较多，故使得黄斑部成为人体中有最高氧化压力的组织，而此氧化压力，极有可能造成黄斑部病变。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用以保护眼睛对抗光害的短链胜肽组合物，经由试验证明，本发明的短链胜肽具有保护、修复视网膜细胞、清除自由基及抗氧化等保护眼睛的功效。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于保护眼睛对抗光害的短链胜肽组合物，包含一或多种具有5～10个选自丝氨酸与赖氨酸和其他氨基酸的组合的氨基酸的短链胜肽，其中丝氨酸和赖氨酸必须同时存在该短链胜肽中。较佳地，所述的短链胜肽具有分子量为550～1100Da。
本发明所称的“光害”指光线对眼睛造成的伤害，尤指光线照射(包括UV光与蓝光)及所产生的氧化压力对眼睛，特别是视网膜细胞及黄斑部造成的伤害。
在本发明的一些具体实施例，所述的短链胜肽组合物用于预防或治疗眼睛因高能量的紫外线照射的伤害。在本发明的另一些具体实施例，所述的短链胜肽组合物用于预防或治疗眼睛因蓝光照射的伤害。在本发明的另一些具体实施例，所述的短链胜肽组合物用于预防或治疗眼睛因氧化压力的伤害。
在本发明的另一方面，关于一种具有5～10个选自丝氨酸与赖氨酸和其他氨基酸的组合的氨基酸的短链胜肽作为制备保护眼睛对抗光害的医药品的用途，其中丝氨酸和赖氨酸必须同时存在该短链胜肽中。较佳地，所述的短链胜肽具有分子量为550～1100Da。在本发明的另一些具体实施例，所述的短链胜肽组合物具有增进视网膜细胞防御能力的功效。在本发明的另一些具体实施例，所述的短链胜肽组合物具有清除自由基的功效。在本发明的其他具体实施例，所述的短链胜肽组合物具有降低氧化压力的功效。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种用以保护眼睛对抗光害的短链胜肽组合物，经由试验证明，本发明的短链胜肽具有保护、修复视网膜细胞、清除自由基及抗氧化等保护眼睛的功效。
具体实施方式
胜肽是两个以上的氨基酸通过脱水缩合而成的聚合物，第一个氨基酸分子的羧基与第二个氨基酸分子的胺基缩合，脱去一个水分子，形成共价肽键，就称为二胜肽；三个氨基酸缩合而成的称为三胜肽，依此类推。通常小于10个氨基酸的胜肽称为寡肽。
在本发明使用的短链胜肽组合物是一种由一或多种具有5～10个选自丝氨酸与赖氨酸和其他氨基酸的组合的氨基酸的短链胜肽与必要载剂或赋形剂组成的组合物，各短链胜肽的分子量为550～1100Da。构成本发明短链胜肽结构的氨基酸必定包括丝氨酸与赖氨酸。丝氨酸是一种具有羟基(hydroxyl group)的极性、不带电氨基酸氨基酸，是生合成反应中最主要捐出一个碳的化合物，可促进脂肪和脂肪酸的新陈代谢，促进肌肉生长，协助体内制造抗体有助于维持，帮助神经纤维形成髓鞘；赖氨酸是一种人体必需的氨基酸，胶原蛋白中含有的羟基赖氨酸是由赖氨酸经羟基化而来，常被用于需要蛋白质修复的患者及需要额外增加肌肉量的运动员。
用于本发明的实施例，将具有五肽序列(Ala-Asn-Ser-Ile-Lys，SEQ ID No.1)的短链胜肽溶于生理食盐水，制得不同浓度的短链胜肽溶液(50、100、250、500、1000μg/ml，以下简称AE50、AE100、AE250、AE500、AE1000等)，再用过滤膜无菌处理后备用。
本发明的其他特色及优点将在下列实施范例中被进一步举例与说明，而该实施范例仅作为辅助说明，并非用于限制本发明的范围。
实施例一、短链胜肽组合物提高眼睛视网膜细胞受光害的存活率
本实施例使用的ARPE-19(Human Retinal Pigment Pithelium)细胞系是人类一种视网膜细胞，源自于一名19岁车祸罹难的健康男性的视网膜组织，由Amy Aotaki-Keen建于1986年。该细胞系表达视网膜色素细胞特有的分子标记如胞内视黄醛结合蛋白和PRE-65。ARPE-19在体内具有RPE细胞的结构和功能特性，并表明该细胞系对于视网膜色素上皮细胞生理学的体外研究是有价值的。
将ARPE-19细胞(5x105，培养于添加10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's Nutrient Mixture F12(DMEM/F12，Gibco，Grand Island，NY)(1：1)培养基中)接种在24孔培养盘，在每孔加入100μl不同浓度的短链胜肽(AE50、AE100、AE250、AE500及AE1000)，在5％CO2，37℃恒温培养箱中培养24小时，之后利用紫外线(100毫焦耳)照射约30分钟，施予逆境处理的UV照射时间视UV能量的强度而可有所调整，UV能量越强时，波长越短，则UV照射时间越短；UV能量越弱时，波长越长，则UV照射时间越长。
细胞放置培养箱30分钟后，吸取上清液，在原有的24well培养平盘的每1个孔盘中添加200μl MTT(0.3mg/ml)试剂，并在37℃下反应1小时。之后，在24孔培养平盘的每1个孔盘中添加400μl DMSO(溶解细胞)，并以微量吸管冲吸方式加以搅拌均匀，各取100μl培养液加至96孔培养平盘的每一个孔盘中(注意气泡)，以ELISA计读机(ELISA Reader)，在540nm测量并读取OD值，用以评估本发明的短链胜肽组合物对经UV照射下的ARPE-19细胞存活率的影响。
四甲基噻唑蓝(MTT)分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide)为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞粒线体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下，四氮唑环生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死亡细胞中的琥珀酸脱氢酶失活，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶再用DMSO将其溶解来呈色。结果如表一所示。
表一、短链胜肽组合物应用于视网膜修护的评估
Figure BDA0001969688110000041
*以对照组(不施予UV照射也不添加任何药品)的ARPE-19细胞的存活率当作100％，实验数据以平均值±SE表示。
结果显示，不同测试浓度的短链胜肽组合物溶液(AE50、AE100、AE250、AE500、AE1000)，都有保护眼睛视网膜细胞的效果。在UV组(只施予UV照射不添加任何药品处理)的ARPE-19细胞中，经过UV照射造成视网膜细胞死亡，ARPE-19细胞的存活率降低了45％；而添加入不同浓度的短链胜肽溶液的处理组，ARPE-19细胞存活率较UV组增加4％～49％，其中以AE250的处理效果最佳。
参见表一，添加AE50的处理组，与UV照射组比较，ARPE-19细胞存活率上升4％；添加AE100的处理组，与UV照射组比较，ARPE-19细胞存活率上升16％；添加AE250的处理组，与UV照射组比较，则ARPE-19细胞存活率上升49％；添加AE500的处理组，与UV照射组比较，ARPE-19细胞存活率上升40％；添加AE1000的处理组，与UV照射组比较，ARPE-19细胞存活率上升35％。表示。本发明的短练胜肽能增进视网膜细胞防御能力，对抗高能量光线(包括UV光及蓝光)照射所诱导的视网膜细胞死亡伤害。
实施例二、短链胜肽组合物的抗氧化功效
本实施例使用的BV-2微胶细胞系是一种类似巨噬细胞，活化的微胶细胞能释放自由基物质ROS(reactive oxygen species)如oxygen(O2)、过氧化阴离子(O2 -)、过氧化氢(H2O2)、及羟基自由基(OH-)与一氧化氮(NO)。可通过将微胶细胞受到刺激物，例如H2O2或脂多醣(lipopolysacchariges,LPS)刺激后，经由一连串的信号传递系统所引起的反应造成自由基释放。
H2DCF-DA对过氧化氢(H2O2)非常敏感，可用来侦测细胞内产生的活性氧化物(reactive oxygen species,ROS)。H2DCF-DA本身不具荧光，加至培养液中可经由扩散作用通过细胞膜进入细胞，细胞内的酵素酯酶(esterase)会对H2DCF-DA进行去乙酰化作用(deacetylation)，进而形成极性的化合物(H2DCF)，当细胞内有过氧化物质存在时，会使H2DCF氧化形成具有荧光的产物(DCF)。当细胞内ROS的量越多，H2DCF被氧化成带荧光的产物(DCF)就会越多，故利用侦测DCF荧光强度即可得知细胞内ROS产生的多寡。
取BV-2微胶细胞(1×105cells/well)至96孔培养平盘，在37℃培养24小时，添加H2DCF-DA(10μM/ml)(购自Molecular Probes,USA)在37℃培养1小时。之后，将刺激物H2O2(1mM)与不同浓度的短链胜肽溶液(10μl)添加至细胞培养物，再在37℃下避光培养1小时。之后以PBS清洗细胞，并在荧光光度计(Fluorescence spectrophotometer)侦测荧光(Ex./Em.485/538nm)量。细胞以不同浓度的短链胜肽组合物溶液处理后的ROS量作表，所得数据如表二所示，数值以三重复实验次平均所得。标准差如表中所示。
表二、短链胜肽组合物品应用于抗氧化的效果评估
Figure BDA0001969688110000061
结果显示，不同测试浓度的短链胜肽组合物溶液(AE50、AE100、AE250、AE500、AE1000)，都有抗氧化的效果。对照组(不添加刺激物H2O2也不添加任何药品)的BV-2微胶细胞中的ROS表现量是2.99±0.41nM，经过H2O2刺激测试后，细胞中的ROS表现量是4.49±0.53，显示以H2O2刺激使细胞的ROS表现量明显增加了50％。经AM03处理后，ROS表现量是3.29±0.47，自由基降低27％。以不同测试浓度的短链胜肽组合物溶液处理后，ROS表现量为4.18±0.52至3.48±0.44，表示细胞内ROS含量(自由基量)，相较于H2O2刺激降低了7％至22％，且随短链胜肽的剂量升高，清除自由基的效果越好。由以上数据证明，本发明的短链胜肽组合物具有清除自由基的功效，可有效减低氧化压力，保护眼睛不受因光害所产生的氧化压力对眼睛(尤其是黄斑部)造成的伤害。
SEQUENCE LISTING
<110> 三凡生技研发股份有限公司
<120> 短链胜肽组合物于保护眼睛抗光害的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Asn Ser Ile Lys
1 5

Claims (6)

1.一种用于保护眼睛对抗光害的短链胜肽组合物，其特征在于，包含一或多种由5个氨基酸组成的短链胜肽，其中该氨基酸选自丝氨酸和赖氨酸和其他氨基酸的组合，条件为丝氨酸和赖氨酸同时存在该短链胜肽中；该短链胜肽具有分子量为550~1100 Da；
该短链胜肽为五肽，具有结构 Ala-Asn-Ser-Ile-Lys。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，该短链胜肽组合物用于预防或治疗眼睛因高能量的紫外线或蓝光照射的伤害。
3.一种由5个氨基酸组成的短链胜肽作为制备保护眼睛对抗光害的医药品的用途，其特征在于，该氨基酸选自丝氨酸和赖氨酸和其他氨基酸的组合，条件为丝氨酸和赖氨酸同时存在该短链胜肽中；
该短链胜肽具有分子量为550~1100 Da；
该短链胜肽为五肽，具有结构 Ala-Asn-Ser-Ile-Lys。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，该医药品用于防止高能量的紫外线或蓝光照射所诱导的视网膜细胞死亡。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，该医药品用于清除自由基。
6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，该医药品用于减低黄斑部的氧化压力。
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