BR112016019432B1 - Composição terapêutica, kit e seus usos na terapia gênica contra degeneração da retina - Google Patents

Composição terapêutica, kit e seus usos na terapia gênica contra degeneração da retina Download PDF

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Abstract

tratamento da degeneração da retina usando terapia genética. a presente invenção refere-se a um método melhorado de proporcionar a função de fotorreceptores a uma célula, por exemplo, para utilização no tratamento de degeneração da retina. a presente invenção também refere-se às composições e kits, em particular para utilização em tais métodos.

Description

CAMPO DA PRESENTE INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a um método melhorado de proporcionar a função de fotorreceptores a uma célula, por exemplo, para utilização no tratamento de degeneração da retina. A presente invenção também se relaciona com composições e kits, em particular para utilização em tais métodos.
ANTECEDENTES
[002] A retina do olho dos vertebrados serve a mesma função que um filme em uma câmara, recebendo uma imagem visual criada pela luz que passa através da lente e a córnea do olho. A imagem recebida é convertida em sinais elétricos e químicos os quais são transmitidos para o cérebro através do nervo óptico.
[003] A retina é uma estrutura complexa, que compreende dez camadas distintas de diferentes tipos de células. Uma destas camadas, que é a camada de fotorreceptores, que é responsável pela conversão da luz de entrada para um sinal elétrico químico e/ou que pode ser lido pelo cérebro e interpretado em imagem. A camada de fotorreceptores compreende as células fotossensíveis de dois tipos, conhecidas como bastonetes e cones. Estes tipos de células são ambos responsáveis por reagir a luz recebida e produzir um sinal elétrico, mas diferem no seu posicionamento no interior da retina e do tipo de luz as quais reagem. Especificamente, os bastonetes funcionam principalmente com pouca luz e são encontrados predominantemente na retina periférica. As células cone são mais reativas à luz brilhante (ou seja, visão do dia), são responsáveis pela visão de cores e são encontradas em maior densidade na retina central. A retina também contém um terceiro tipo menos numeroso de células fotorreceptoras - as células ganglionares fotossensíveis - que são responsáveis pela medição da luz de fundo, mas não de processamento de imagem.
[004] As células bastonetes e cones da camada de fotorreceptores da retina são capazes de reagir a luz e convertê-las em um sinal elétrico, devido à presença de pigmentos fotossensíveis (referidos como fotopigmentos) no seu interior, que se submetem a uma alteração química quando a célula é exposta à luz. Estes fotopigmentos são receptores acoplados à proteína. Os fotopigmentos compreendem uma porção de proteína, o qual está acoplado a um cofator cromofórico conhecido como retina. A exposição à luz provoca uma isomerização do cofator da retina de um cis-retiniano para um trans-retiniano, que por sua vez provoca uma alteração conformacional na proteína opsina, conhecida como fotobranqueamento. Esta é a primeira etapa de uma cascata de sinalização que resulta em um sinal a ser transmitido ao longo do nervo óptico. A fim de reter a fotossensibilidade, as opsinas precisam assim de um fornecimento contínuo de cis-retiniano. Nem as células fotorreceptoras de bastonete nem as de cone são capazes de produzir cis-retiniano por si. A principal fonte de cis-retiniano na retina é o EPR (epitélio do pigmento da retina), que leva todos os trans-retiniano de opsina branqueada e produz cis-retiniano. Na retina intacta, as células de bastonete e cone confinam o RPE permitindo-lhes o acesso a este cromóforo regenerado.
[005] Nos seres humanos, existem várias fotopigmentos intimamente relacionados, conhecidos como a família de opsina. Em seres humanos, estes compreendem 3 opsinas de cone que são sensíveis a diferentes comprimentos de onda (a origem de visão de cores), rodopsina encontrada em células de bastonete, e melanopsina encontradas em fotorreceptores células ganglionares. As opsinas de cone incluem opsina LWS para verde-amarelado, opsina MWS para o verde, e opsina SWS para azulado-violeta. Estas opsinas mostram elevada identidade de sequência.
[006] Tais condições como distrofias de retina causam cegueira devido à destruição dos fotorreceptores na retina externa (ou seja, os cones e bastonetes). Estas condições podem ser um resultado direto do dano para os fotorreceptores, ou indiretamente fotorreceptores sendo destruídos como consequência da patologia no epitélio pigmentado da retina e/ou coroide. A deficiência visual severa é comum em estágios avançados da degeneração. Estas condições são atualmente incuráveis. As distrofias retinais podem ser divididas em distrofias bastonete-cone (também chamado retinite pigmentosa), distrofias cone- bastonete e distrofias maculares. Em distrofias bastonete-cone, os bastonetes degeneram, resultando em uma perda de visão periférica e visão a noite, e muitas vezes isso é seguido pela destruição do cone levando a uma perda da visão central e de cor. Por outro lado, nas distrofias cone-bastonete há inicialmente uma perda de fotorreceptores de cone que conduzem a uma perda de visão detalhada e cor e este é então seguido por meio de uma degeneração bastonete resultando em uma perda de visão periférica e cegueira noturna. Ambas as formas podem resultar em cegueira com perda extensa ou completa do campo visual. Outro tipo de distrofia da retina, chamado distrofia macular, resulta em uma perda da visão central, mas a visão periférica é preservada.
[007] No entanto, apesar da perda de fotorreceptores da retina exteriores, os neurônios da retina interna, incluindo as células bipolares e células ganglionares da retina, podem sobreviver e manter sua capacidade de enviar a informação visual ao cérebro. Esses neurônios, portanto, fornecem um nicho promissor para as terapias optogenética que visam a convertê-los em fotorreceptores diretamente visuais e recriam a fotossensibilidade que foi perdido com a degeneração emergente. Várias estratégias terapêuticas têm mostrado resultados promissores na tentativa de substituir ou reviver estes neurônios da retina interna e restauram a visão. Transplante de células fotorreceptoras, ou suas linhagens progenitoras, é uma importante abordagem em estudo pré-clínico e tem sido demonstrado para restaurar a visão para camundongos cegos na fase tardia da degeneração após a completa perda de fotorreceptores. Em tentativas de reviver os neurônios da retina interna, as próteses eletrônicas implantáveis têm provocado queima da retina células ganglionares (RGC) através de câmeras externas e tem fornecido a discriminação espacial bruto por pelo menos alguns pacientes (Zrenner E, et al. 2011, Proc Biol Sci 278 (1711): 1489 a 1497; Humayun MS, et al 2012, Ophtalmology 119, 779 a 788). Outra estratégia utiliza as opsinas microbianas como fototrocas de atividade neuronal e que têm sido utilizados para induzir a atividade evocada à luz em retinas degeneradas. Nessa medida, foi demonstrado que a injeção intravítrea de um vetor AAV-2 transporta o gene channelrodopsina-2 (ChR2) no camundongo RD1 leva à despolarização ativada pela luz ou respostas 'on' em RGCs e potenciais visuais evocados no córtex. Este estudo liderado por Bi et al. (Bi A, et al 2006, Neuron 2006; 6; 50 (1): 23 a 33)) forneceu a primeira prova de princípio de que a função da retina pode ser restaurada usando a optogenética. (Lagali PS, et al 2008, Nat Neurosci 2008 Jun; 11 (6): 667 a 75; Cronin T, et al 2014, EMBO Mol Med, 04 de agosto de 2014; 6 (9):. 1175-90; Mace E et al 2014, Mol Ther 2015 Jan; 23 (1): 7 a 16), bem como fotorreceptores cone (Busskamp V, et al 2010, Science, 23 de julho de 2010; 329 (5990): 413-7) foram convertido com êxito em sensores artificiais à luz que levam ao resgate parcial da função visual em camundongos cegos. Além disso, as fototrocas sintéticas desenvolvidas recentemente têm mostrado resultados promissores em resgatar a visão em camundongos cegos. As fototrocas com base em azobenzeno de “um componente” usam pequenas moléculas, AAQ ou DENAQ (Polosukhina A, et al 2012, Neuron 26 de julho de 2012; 75 (2): 271 a 82; Tochitsky I, et al 2014, Neuron 19 de Fevereiro de 2014; 81 (4): 800 a 13), que diretamente fotossensitiza os canais iônicos nativos de neurônios. As fototrocas “de dois componentes", LiGluR/MAG, (Caporale N, et al 2011, Mol Ther 2011 Jul; 19 (7): 1212 a 9.; Gaub BM, et al 2014, Proc Natl Acad Sci US A. 23 de dezembro de 2014; 111 (51): E5574-83) primeiro geneticamente expressa sinteticamente a engenharia do receptor de glutamato ionotrópico fechado à luz (LiGluR) em retinas e, em seguida, exigem a adição de uma molécula de fototroca (MAG) para a ativação. Ambos os sistemas têm mostrado conferir sensibilidade à luz para as retinas de camundongos e cães cegos (Gaub BM, et al 2014, Proc Natl Acad Sci US A. 2014 Dez 23; 111 (51): E5574-83) e restauram as funções visuais básicas em roedores.
[008] No entanto melhorias são ainda necessárias para o tratamento destas condições.
[009] A presente invenção visa ultrapassar ou melhorar os problemas associados com o tratamento de degeneração da retina.
BREVE SUMÁRIO DA PRESENTE INVENÇÃO
[0010] Dessa maneira, em um primeiro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de fornecimento da função de fotorreceptores para uma célula, o método que compreende a introdução na cavidade vítrea do olho de i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível; e ii) uma enzima de degradação da matriz extracelular.
[0011] Em um segundo aspecto da presente invenção, proporciona- se uma composição que compreende i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível e ii) uma enzima de degradação da matriz extracelular. De preferência, a composição é terapêutica.
[0012] Em um terceiro aspecto da presente invenção, proporciona- se i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível; e ii) uma enzima de degradação de matriz extracelular, para utilização em um método de fornecimento da função de fotorreceptores a uma célula.
[0013] Em um quarto aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de fornecimento da função de fotorreceptores para uma célula, o método compreendendo a introdução de um olho de um vetor de ácido nucleico que compreende um ácido nucleico que codifica para uma proteína humana de fotorreceptores. Neste aspecto, de preferência, o vetor é introduzido sem a administração de uma enzima de degradação da matriz extracelular (por exemplo, é introduzido sem a coadministração de uma enzima, em que a coadministração inclui a administração separada, sequencial ou combinada durante a mesma terapia). O método pode ainda compreender a expressão do vetor em células da retina interna, em que a expressão da proteína de fotorreceptores humanos torna uma célula fotorreceptora da retina interna.
[0014] Em um quinto aspecto da presente invenção, é proporcionado um vetor de ácido nucleico que compreende um ácido nucleico que codifica para uma proteína humana de fotorreceptores.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0015] As modalidades da presente invenção são descritas adicionalmente a seguir com referência aos desenhos anexos, nos quais:
[0016] A Figura 1 mostra as injeções intraoculares e de entrega de genes por meio de AAV;
[0017] A Figura 2 mostra restauração de reflexo pupilar após o tratamento de rodopsina;
[0018] A Figura 3 A-E mostra os dados de gravações de eletrofisiologia in vivo; F) mapa de calor do representante das respostas à luz de dLGN in vivo de camundongos RD1 (n = 5) em que um olho foi tratado com opsina de bastonete, CAG-hRho (B) e outro com GFP, CAG-GFP (C) representando a diversidade de respostas restauradas: sustentadas, transitórias, ON e OFF. As respostas foram ordenadas de acordo com a amplitude da resposta sustentadas durante 1 segundo inicial de uma apresentação de 2 segundos de estímulo à luz (15,4 log fótons/cm2/s); GJ). Representativos de histogramas de tempo peri- estímulo (PSTHs) mostrando resposta média a várias apresentações de campo completo de flashes (15.4 fótons log/cm2/s) para ON-sustentada (G), ON-transiente (H), OFF (I) e ON-OFF (J). As contagens bin de teste correspondentes (EBTs) são mostradas no topo de cada PSTH.
[0019] A Figura 4 mostra os dados de gravações MEA in vitro;
[0020] A Figura 5 mostra que as respostas observadas são claramente distintas das respostas leves nativas normalmente presentes na retina de camundongo RD1 seguintes a estimulação à luz.
[0021] A Figura 6 mostra respostas dLGN em camundongo RD1 impulsionado por olhos tratados com opsina de bastonete respondendo sobre uma gama de intensidades de luz e condições adaptadas à luz A) perfil de resposta de sensibilidade (PSTH e TBC) de cinco unidades dLGN representativas de camundongos Rd1-CAG-hRho que apresentavam campo completamente de flashes em diferentes intensidades de luz (ND2 = 13,4, ND1 = 14,4 e ND0 = 15,4 fótons log/cm2/s); B) perfil de resposta de sensibilidade ao contraste (PSTH e TBC) de quatro unidades representantes de dLGN de camundongos Rd1-CAG-hRho gravadas sob a luz adaptada condições (Michelson contraste 96% @ ND0 = 15,4 log fótons/cm2/s).
[0022] A Figura 7 mostra a expressão alvo de opsina de bastonete para as células bipolares ON que restaura as respostas visuais em retinas de RD1 cegos: A) construto de DNA vetor AAV2 conduzindo a expressão específica de opsina de bastonete humano, com um promotor Grm6; B, C) Imagens de microscopia fluorescente exemplares de uma seção através da retina do camundongo após a entrega intravítrea de vetor viral em A em conjunto com as enzimas glicosídicas que decompõem a matriz extracelular (B). Alta ampliação das imagens fluorescentes que descrevem a localização membranosa da opsina de bastonete nas somas celulares de células do INL (C). As retinas foram tratadas com um anticorpo-hRho (vermelho) e os núcleos foram corados com DAPI (azul). barra de calibração = 50μm. camada de células ganglionares = GCL, IPL = camada plexiforme interna, INL = camada nuclear interna.
[0023] A figura 8 mostra os histogramas representativos de tempo peri-estímulo (PSTHs) que mostram as respostas médias para várias apresentações de 5 segundos do campo completo de flashes @ ND0 = 15,4 log fótons/cm2/s para as respostas ON (A) e OFF (B).
[0024] A Figura 9 mostra os histogramas representativos de tempo peri-estímulo (PSTHs) que mostram a média das respostas a várias apresentações de 2 segundos no campo completo de flashes @ níveis de luz mais baixa (ND2 -13.4 fótons log/cm2/s).
[0025] A Figura 10 mostra os histogramas representativos de tempo peri-estímulo (PSTHs) que mostram a média das respostas a várias apresentações de 5 segundos no campo completo de flashes sob luz condições adaptadas - contraste Michelson 96%.
[0026] A Figura 11 mostra a expressão ectópica da opsina de bastonete que restaura o comportamento visual em camundongos RD1 cegos tratados: a) curvas de irradiância-resposta para a constrição pupilar máxima durante 10s de luz branca em uma gama de intensidades de luz (A). Olhos RD1 tratados com opsina de bastonete (expressão CAG não segmentada, vermelho) mostram uma acentuada melhoria na sensibilidade visual em comparação com olhos RD1 injetados com GFP (verde). Com expressão direcionada (Grm6, azul) o reflexo pupilar à luz permaneceu em grande parte prejudicada. Os dados para os camundongos de tipo selvagem injetados com PBS/mistura de enzimas estão apresentados para comparação (preto). Os dados estão normalizados para o tamanho da pupila imediatamente anterior ao aparecimento de luz. Os valores são média ± SEM, com n indica o número de animais examinados; B) imagens de infravermelhos representativas da zona da pupila medida no escuro (linha de base), no ND4 (11,8 log fótons/cm2/s) e a NDO (15,8 log fótons/cm2/s) para WT, Rd1-GFP, Rd1-CAG- hRho, camundongos Rd1-grm6-hRho; C, D) A média de constrição pupilar máxima em toda a população de todos os quatro grupos de camundongos em ND4 (1 fótons 1,8 log/cm2/s; C) e NDO (15.8 fótons log/cm2/s; D). Número de animais examinados: WT n = 6; RD1-GFP n = 16; RD1-CAG-hRho n = 10; RD1-grm6-hRho n = 6. As barras de erro são SEM.
[0027] A Figura 12 mostra atividades de caixa abertas do escuro (sombreado no escuro) para a luz (área branca) para os quatro grupos de camundongos: WT n = 5; RD1 -GFP n = 6; RD1-CAG-hRho n = 6; RD1-grm6-hRho n = 5. Os valores das parcelas são médias populacionais de distância percorrida em 30 segundos bin anterior ± SEM. Histogramas à direita mostra a distância média percorrida por toda a população para o período de transição do escuro (30s pouco antes da luz, barras escuras) à luz (30 anos logo após a luz; barras brancas). As barras de erro são SEM. * P <0,05, ** p <0,005, Teste t-Student.
[0028] Figura 13. A) atividades de caixa aberta de tela cinza claro para 4 Hz de cintilação para Rd1-grm6-hRho (n = 5). Os dados são da população média de distância percorrida em 30 segundos bin anterior ± SEM. B) A resposta 4 Hz cintilação para camundongos Rd1-GFP (n = 6), Rd1-CAG-hRho (n = 6) e Rd1-grm6-hRho (n = 5). Os histogramas emparelhados são mostrados para cada grupo de camundongos que descrevem apenas o período de transição de todo o plano de atividade (como mostrado para Rd1-grm6-hRho na F) a partir de cinza claro (30s pouco antes da cintilação 4 Hz) à luz cintilação 4 Hz (30s logo após a cintilação 4 Hz). Os dados são da população média de distância percorrida ± SEM. ** P <0,005, Teste t-Student.
[0029] A Figura 14 mostra a resposta de contraste de sensibilidade para os camundongos Rd1-grm6-hRho (n = 5) que mostra a distância percorrida antes e depois de 4Hz cintilação em diferentes contrastes de Michelson. Para cada desempenho em contrapartida, apenas o período de transição da atividade é mostrado, o que representa a distância percorrida nos anos 30 antes (barras brancas) e nos 30 anos depois, após a apresentação de cintilação (barras xadrez). Os dados são da população média de distância percorrida ± SEM. * P <0,05, ** p <0,005, Teste t-Student.
[0030] A Figura 15 mostra a resposta de frequência de cintilação para os camundongos Rd1-grm6-hRho (n = 5) indicador da distância percorrida antes e depois da apresentação da luz de cintilação do campo completo em frequências diferentes. Para cada resposta de cintilação, apenas o período de transição entre o período da atividade é mostrado comparando a distância na década de 30 antes (barras cinza) para a distância na década de 30, após a apresentação de cintilação (barras padronizadas). Os dados são da população média de distância percorrida ± SEM. * P <0,05, ** p <0,005, Teste t-Student.
[0031] A Figura 16 mostra o alvo da expressão de opsina de bastonete que restaura as respostas para as cenas de filmes naturalistas: A, B) parcelas Raster para unidades dLGN responsivas representativas de Rd1-CAG-hRho (A) e (B) camundongos Rd1-Grm6- hRho expostos a várias apresentações de uns 30s de cinema naturalista (camundongos que se deslocam em uma arena aberta na vista horizontal); C) parcelas de atividades de caixa aberta a partir de tela cinza claro (misturado em cinza) para um filme de pouca luz iminente (sombreada em verde) para Rd1-grm6-hRho (n = 5). Os dados são da população média de distância percorrida em 30 segundos bin anterior ± SEM;
[0032] A Figura 17 mostra a resposta de filme naturalista para camundongos Rd1-GFP (n = 6), Rd1-CAG-hRho (n = 6) e Rd1-grm6- hRho (n = 5). Os histogramas emparelhados são mostrados para cada grupo de camundongos que descrevem apenas o período de transição de todo o plano de atividade a partir de cinza claro (30s pouco antes da apresentação do filme; barras brancas) para filmes com pouca luz (30s logo após o filme; barras pretas). Os dados são da população média de distância percorrida ± SEM. ** P <0,005, Teste t-Student.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0033] A presente invenção refere-se à utilização de uma proteína humana de fotorreceptores para fornecer a função de fotorreceptores para uma célula, a fim de restaurar a fotossensibilidade em retinas degeneradas ou parcialmente degeneradas. Tal função de fotorreceptores nativa é perdida com a degeneração de fotorreceptores. A presente invenção baseia-se na descoberta surpreendente de que a expressão de uma proteína humana de fotorreceptores na retina interna pode fornecer a função de fotorreceptores para as células neuronais da retina interna. A expressão transgênica de uma proteína humana de fotorreceptores na retina interna tem a vantagem de minimizar os efeitos adversos potenciais imunogênicos, em contraste com a utilização de matrizes opsinas microbianas e eletrônicas, respectivamente. Além disso, os fotorreceptores de fora, este GPCR tem potencial para sequestrar as máquinas da célula e fornece um mecanismo fotorreceptor completamente autossuficiente, capaz de suportar detecção de luz por conta própria e sem quaisquer outras intervenções, ao contrário das fototrocas sintéticas que requerem fornecimento exógeno constante de uma fototroca para ativação. Além disso, a opsina de bastonete necessita de luz visível para a ativação, e através da cascata a amplificação GPCR nativo tem um potencial para funcionar sob baixas intensidades de luz em contraste com o canal de corrente de base ou sistemas de fototroca sintéticos, que não são capazes de amplificar os sinais ao nível da proteína.
[0034] A injeção intravítrea como um método para a terapia genética tem vantagens particulares em termos de ser tecnicamente menos exigente no acesso à retina, e reduziu o risco de complicações durante a administração, nomeadamente quando as retinas tornaram- se fina através da degradação.
[0035] A presente invenção é, em parte, baseada na descoberta de que a coadministração de uma enzima de degradação da matriz extracelular em terapia genética conduz a um aumento da transdução de células da retina, melhorando assim o resultado em termos de aumento da restauração da visão. A presente invenção representa uma melhoria em relação aos métodos de terapia gênica intravítreo anteriores, permitindo o aumento da transdução reduzindo as barreiras para o contato do material genético estranho com as células alvo.
[0036] A aplicação combinada de terapia genética e de uma enzima de degradação da matriz extracelular conduziu a resultados surpreendentes, em particular, onde a terapia de genes compreende a introdução de uma sequência de ácido nucleico que codifica para a rodopsina ao vítreo de um olho. A rodopsina requer uma completa-trans da retina que é produzido a seguir a transdução visual para ser transportada para o epitélio pigmentado da retina (EPR) para que possa ser convertido em completo-cis retiniano, que é, então, transportado de volta para as células da bastonete para posterior resposta visual. Esta reciclagem foi pensada para ser dependente do contato íntimo entre as células de bastonete e o RPE. As células internas retinianas, mesmo na presença de distrofias retinais, onde os bastonetes e cones degeneram, não iriam ser fisicamente associadas com o EPR da mesma maneira. Os presentes inventores inesperadamente observaram que o fornecimento de rodopsina de células da retina interna por meio da terapia genética produz uma resposta visual, apesar da falta de contato entre as células da retina interna em funcionamento e o RPE. Além disso, pensa-se que as células da retina interna não têm o mecanismo intracelular necessário para trabalhar em conjunto com rodopsina para produzir um sinal elétrico que pode, então, ser transmitido através das células ganglionares para o cérebro.
[0037] Os resultados são ainda mais surpreendentes porque a rodopsina trabalha por meio da hiperpolarização das células em resposta à luz (os cérebros equivalentes de interrupção, as células de "off"), onde ela pode ser assumida que a visão exigiria células da retina interna a ser despolarizada ("on") pela luz.
[0038] A presente invenção prevê a administração de uma enzima de degradação da matriz extracelular em associação com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível para restaurar a função fotossensível para a retina. A retina e vítreo compreende uma variedade de moléculas de matriz extracelular, incluindo proteoglicanos (com diferentes classes de cadeias de GAG) (glicosaminoglicanos), tais como proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPGs), proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG), e proteoglicanos de sulfato de dermatano (DSPGs); ácido hialurônico, colágeno, tais como colágeno tipo IV na lâmina limitante interna; lamininas; nidogênio 1 e 2, e uma variedade de outras proteínas e glicoproteínas que são conhecidas por meio das pessoas que são versadas na técnica.
[0039] Prevê-se que a presente invenção pode utilizar qualquer enzima que é capaz de degradar uma proteína da matriz extracelular ou de carboidratos (tais como glicosaminoglicano) presentes na membrana limitante vítreo e/ou na retina e/ou internos, e/matriz extracelular ou da retina. Em particular, uma enzima para utilização na presente invenção pode ser uma que é capaz de degradar uma proteína da matriz extracelular ou de carboidratos, que é fornecida na retina, ou uma proteína da matriz extracelular ou de carboidratos que é fornecido no caminho entre o vítreo e as células da retina, e que podem, portanto, ter impacto sobre a transdução de uma sequência de ácido nucleico. Os preferidos são enzimas que degradam os glicosaminoglicanos (GAGs).
[0040] Uma proteína de degradação da matriz extracelular pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma colagenase, hialuronano liase, heparinase I, heparinase II, heparinase III, condroitina ABC-liase, condroitina de liase AC, uma metaloproteinase, um ADAMTS, uma plasmina (protease plasmina serina ou sua microplasmina de forma truncada (Ocriplasmin)), elastase de neutrófilos e a catepsina G, a neuraminidase, com N-glicanase, O-glicanase, e a pronase. Uma enzima particularmente preferida pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em hialuronano liase de Streptomyces hyalurolyticus (CE 4.2.2.1; contidos Genbank acesso CP003990); A hialuronidase de testículos de bovino (EC 3.2.1.35); condroitina ABC liase de Proteus vulgaris (CE 4.2.2.4) e heparinase III de um Flavobacterium hepariem (EC 4.2.2.8; acesso Genbank L12534, de preferência na versão L12534.1). As enzimas para utilização na presente invenção estão disponíveis a partir de fontes comerciais, por exemplo Sigma Aldritch.
[0041] Por "degradar" ou "enzima de degradação" significa uma enzima que é capaz de quebrar uma proteína ou hidrato de carbono. Uma proteína pode ser dividida em sequências de peptídeos ou aminoácidos, por exemplo, por meio da hidrólise da ligação peptídica. Um hidrato de carbono pode ser dividido em oligossacarídeos ou unidades de açúcar simples. A proteína e/ou hidrato de carbono pode ser total ou parcialmente degradado, o que significa que uma parte dele pode ser dividida em fragmentos menores, ao passo que o restante da proteína e/ou hidrato de carbono pode estar na sua forma nativa. De preferência, uma proteína da matriz extracelular degradada ou hidrato de carbono perde alguma capacidade para proporcionar um suporte estrutural e/ou bioquímico de uma célula, de tal modo que uma sequência de ácido nucleico introduzida no vítreo pode aceder melhor uma célula da retina. Em particular, uma proteína da matriz extracelular degradada perde alguma ou toda a sua capacidade de impedir o movimento de uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, vetor de entrega do gene, tal como um vetor viral), dentro do vítreo, e para dentro e através da retina. Qualquer perda em função da matriz extracelular é suficientemente mínima de modo a que ele não tem qualquer efeito adverso significativo sobre o olho ou visão.
[0042] Na presente invenção, a referência a uma enzima de degradação da matriz extracelular inclui os fragmentos ativos. Um fragmento ativo pode ser uma versão mais curta de parte ou da enzima nativa, que retém a capacidade de funcionar como uma enzima de degradação da matriz extracelular isto é, retém a capacidade para degradar a matriz extracelular uma proteína ou hidrato de carbono, tal como definido na presente invenção. Um fragmento ativo pode compreender de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da sequência da enzima nativa.
[0043] Na presente invenção, a referência a uma enzima inclui uma ou mais enzimas. Dessa maneira, a presente invenção proporciona a coadministração de uma única enzima, ou uma combinação de duas ou mais enzimas. De preferência, quando duas ou mais enzimas são fornecidas, cada uma delas é selecionada de entre o grupo definido acima. Quando são administradas duas ou mais enzimas, que podem ser fornecidas em separado, sequencialmente, ou duas ou mais podem ser proporcionadas em combinação. De um modo preferido, duas enzimas são administradas em combinação. Quando são fornecidas duas ou mais doses separadas de enzima, qualquer uma ou mais destas pode ser proporcionada em combinação com a sequência de ácido nucleico.
[0044] Uma enzima para utilização na presente invenção pode ser derivada a partir de qualquer fonte adequada. A fonte pode ser de mamíferos ou de não mamíferos. Ela pode ser derivada de uma fonte animal, vegetal, bacteriana, ou fonte arqueabacteriana. Onde fonte de mamífero, prefere-se que seja uma enzima humana. Pode ser isolada ou purificada a partir de tal fonte. Pode ser produzida como uma proteína recombinante. Alternativamente, pode ser produzida sinteticamente.
[0045] As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos de enzimas para utilização na presente invenção são conhecidas na técnica.
[0046] Nisto, as enzimas incluem fragmentos e derivados das enzimas nativas. De preferência, um fragmento ou partes derivadas, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90%, pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com uma enzima nativa, ao longo de um comprimento de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou pelo menos 95% do comprimento de uma enzima nativa.
[0047] A identidade de sequência é determinada por meio da comparação das duas sequências alinhadas de uma janela de comparação predeterminado (o qual pode ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100% do comprimento da sequência de nucleotídeos de referência ou proteínas), e determinando o número de posições nas quais ocorrem os resíduos idênticos. Tipicamente, isto é expresso como uma porcentagem. A medição de identidade de sequência de nucleotídeos de uma sequência é um método bem conhecido por meio das pessoas que são versadas na técnica, usando o computador implementado de algoritmos matemáticos tais como ALIGN (versão 2.0), GAP, BESTFIT, BLAST (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)), FASTA e TFASTA (Wisconsin Genetic Software Package Versão 8, disponível a partir de Genetics Computer Group, Accelrys Inc. de San Diego, Califórnia), e CLUSTAL (Higgins et al, Gene 73: 237-244 (1998)), usando os parâmetros padrão.
[0048] Uma enzima para utilização na presente invenção pode ser fornecida na forma seca, que inclui formas quer desidratadas ou liofilizadas. Tipicamente, uma enzima irá ser fornecida na forma liofilizada. Alternativamente, uma enzima pode ser fornecida como uma solução aquosa, por exemplo, pré-dissolvida em água a uma concentração e volume predeterminado. Para a administração, uma forma aquosa é preferível, embora se preveja que um produto ou kit da presente invenção possa atender a provisão de uma forma seca da enzima, opcionalmente com instruções para a dissolução. Dessa maneira, um método da presente invenção pode compreender o uso de uma enzima seca para produzir uma solução de enzima. De preferência, isto é conseguido por meio da dissolução ou reconstituição da preparação de enzima em um solvente aquoso ou não aquoso. Os solventes adequados são aqueles que são não tóxicos, e adequados para uso com seres humanos ou animais. De um modo preferido, um solvente adequado é estéril. Um exemplo de um solvente adequado é solução salina estéril tamponada com fosfato. Os métodos para a dissolução de proteínas secas são conhecidos na técnica.
[0049] A presente invenção prevê a administração de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível para a retina, a fim de restaurar a capacidade fotorreceptora para a retina. Uma proteína fotossensível é aquela que reage à luz, submetendo-se a uma substância química ou mudança física. Por fotorreceptora, significa uma célula que é fotossensível ou compreende uma proteína fotossensível. Os termos fotorreceptores ou de fotorreceptores e fotossensível podem ser utilizados de forma intercambiável.
[0050] Uma sequência de ácido nucleico para ser utilizada na presente invenção pode codificar qualquer proteína fotossensível. De preferência, a sequência de ácido nucleico da presente invenção codifica uma proteína de mamífero fotossensível ou não mamífera. Ele pode ser de origem de mamífero, de não mamíferos, vegetal, bacteriana ou arqueabacteriana. Onde de origem de mamífero, prefere-se que codifica uma proteína humana. Uma sequência de ácido nucleico para utilização na presente invenção pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em rodopsina, melanopsina, uma opsina de cone (em particular opsina LWS, opsina MW, e opsina SWS), neuropsina (Opn5), encaphalopsina (Opn3), uma opsina parapineal, VAopsina, parapinopsina; parietopsina, pinopsina, TMT opsina,opsinas de Jelly fish, C-opsina, criptocromo e qualquer invertebrados de opsinas de retina e/ou opsinas normalmente apoiando a fotossensibilidade extra- retiniana em animais.
[0051] Uma sequência de ácido nucleico para utilização na presente invenção pode ser selecionada dependendo do indivíduo a ser tratado, de tal modo que a sequência de ácido nucleico codifica uma proteína nativa que é fotossensível para a retina do indivíduo a ser tratado. Dessa maneira, por exemplo, em que o indivíduo é um ser humano, uma sequência de ácido nucleico, de preferência codifica uma proteína fotossensível humano, por exemplo, a rodopsina. No entanto, prevê-se que em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico pode ser fornecida que codifica uma proteína fotossensível que não é nativa ao indivíduo a ser tratado, mas que de preferência não suscita uma resposta imunitária no indivíduo.
[0052] As sequências de ácidos nucleicos e sequências de aminoácidos de muitas proteínas fotossensíveis são conhecidas na técnica. Por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos de proteínas fotossensíveis preferidas são fornecidas como se segue:
[0053] Melanopsina: Homo sapiens opsin 4 (OPN4), mRNA (cDNA clone MGC: 142118 IMAGE:8322610), GenBank: BC113558, Versão BC1 13558.1;
[0054] Rodopsina: Homo sapiens rhodopsin (RHO), GenBank: BC1 11451.3, Accession NM_000539, Versão NM_000539.3 Gl: 169808383;
[0055] Cone homo sapiens opsin 1: Homo sapiens opsin 1, sensível de comprimento de onda longo, OPN1 LW - NCBI Sequência de Referência: Accession: NM_020061, Versão NM_020061.5;
[0056] Homo sapiens opsin 1, sensível de comprimento de onda médio OPN1 MW - NM_000513, versão NM_000513.2;
[0057] Homo sapiens opsin 1 sensível de comprimento de onda curto (OPN1SW) NM_001708, versão NM_001708.2.
[0058] Parapinopsina (Número de Acesso Genbank NM_001200073, Versão NM_001200073.1 Gl:318056020);
[0059] Parietopsina (Número de Acesso Genbank DQ100320, Versão DQ100320.1 Gl:73666459); Pinopsin (Número de Acesso Genbank AF487546, Versão AF487546.1 Gl:20805654);
[0060] Opsina de VA (Número de Acesso Genbank AF233520, Versão AF233520.1 Gl:8272567);
[0061] Opsina de TMT (Número de Acesso Genbank AH011520 AF349943 AF349944 AF349945, versão AH011520.2 Gl:33951 1123);
[0062] Opsina de Jellyfish (Número de Acesso Genbank AB435549, Versão AB435549.1 G 1:210049957); OPN3 (Número de Acesso Genbank NM_014322, Versão NM_014322.2 Gl:71999130);
[0063] OPN5 (Número de Acesso Genbank AY377391, Versão AY377391.1 Gl:38482095);
[0064] C-opsina (Número de Acesso Genbank HF566407, versão HF566407.1 Gl: 543581059); e Criptocromo (Número de Acesso Genbank NM_169852, Versão NM_169852.1 Gl:24648151).
[0065] Nos quarto ou quinto aspectos da presente invenção acima descritos, a proteína é uma proteína de fotorreceptores de fotorreceptores humano. Uma proteína de fotorreceptores humanos pode ser rodopsina humana (também referido como Rh1, OPN2, RHO) ou um fotopsina. A PhotoSpin pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em Opsina sensível de comprimento de onda longo (OPN1 LW), Opsina sensível de comprimento de onda médio (OPN1 MW) e Opsina sensível de comprimento de onda curto (OPN1 SW).
[0066] Opsina sensível de comprimento de onda longo (OPN1 LW) tem uma Amax de 560 nm, na região amarelo-verde do espectro eletromagnético. É também referido como "opsina vermelho", "L opsina" ou "LWS opsina". Opsina sensível de comprimento de onda médio (OPN1 MW) tem uma Amax de 530 nm, na região verde do espectro eletromagnético. É também referido como o "opsina azul", "opsina M" ou "opsina MWS". Opsina sensível de comprimento de onda curto (OPN1SW) tem uma Amax de 430 nm, na região azul do espectro eletromagnético. É também referido como "opsina azul", "S opsina" ou "opsina SWS".
[0067] A sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fotorreceptores humano pode ser o gene Homo sapiens rodopsina (RHO) (GenBank: BC1 11451,3, acesso NM_000539, Versão NM_000539.3 GI: 169808383), ou um fragmento ou derivado dos mesmos.
[0068] A sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fotorreceptores humana pode ser Homo sapiens opsina 1 Cone, OPN1LW sensível de comprimento de onda longo (NCBI Sequência Referência: Acesso: NM_020061, Versão NM_020061.5), ou um fragmento ou derivado do mesmo.
[0069] A sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fotorreceptores humana pode ser Homo sapiens opsina 1 Cone: OPN1MW sensível de comprimento de onda médio, (NCBI Sequência de Referência: Acesso: NM_000513.2; (Science 232 (4747), 193-202 (1986)), ou um fragmento ou derivado do mesmo.
[0070] A sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fotorreceptores humana pode ser Homo sapiens opsina 1 Cone: opsina sensível de comprimento de onda curto (OPN1SW) NM_001708, versão NM_001708.2, ou um fragmento ou derivado do mesmo.
[0071] Referência a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível inclui as sequências de ácidos nucleicos que são derivadas das sequências descritas na presente invenção, ou codificam uma versão mais curta, ou um fragmento de uma proteína fotossensível, em que o derivado ou fragmento retém substancialmente a mesma função fotossensível como a proteína fotossensível nativa. Por substancialmente o mesmo se destina, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da função fotossensível da proteína nativa. Um fragmento pode compreender 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da sequência da proteína nativa.
[0072] De preferência, um fragmento ou derivado de uma sequência de ácidos nucleicos compartilha, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90%, pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou, pelo menos, 99% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico de referência, ao longo de um comprimento de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou pelo menos 95% do comprimento de uma sequência de ácido nucleico de referência. Um derivado ativo é, de preferência, e pode incluir substituições e/ou deleções e/ou adições em relação à sequência nativa. Os derivados podem também incluir porções de outras sequências de genes, que proporcionam uma atividade ou função desejada para a proteína fotossensível.
[0073] A identidade de sequência é determinada por meio da comparação das duas sequências alinhadas de uma janela de comparação predeterminado (o qual pode ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100% do comprimento da sequência de nucleotídeos de referência ou proteínas), e determinando o número de posições nas quais ocorrem os resíduos idênticos. Tipicamente, isto é expresso como uma porcentagem. A medição de identidade de sequência de nucleotídeos de uma sequência é um método bem conhecido por meio das pessoas que são versadas na técnica, usando o computador implementado de algoritmos matemáticos tais como ALIGN (versão 2.0), GAP, BESTFIT, BLAST (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)), FASTA e TFASTA (Wisconsin Genetic Software Package Versão 8, disponível a partir de Genetics Computer Group, Accelrys Inc. de San Diego, Califórnia), e CLUSTAL (Higgins et al, Gene 73: 237-244 (1998)), usando os parâmetros padrão.
[0074] Uma sequência de ácido nucleico pode ser um DNA, RNA, cDNA, ou PNA. Pode ser genômico, recombinante ou sintético. Uma sequência de ácido nucleico pode ser isolada ou purificada. Pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla. De um modo preferido, uma sequência de ácido nucleico vai codificar uma proteína fotossensível, tal como descrito na presente invenção. Uma sequência de ácido nucleico pode ser derivada por clonagem, por exemplo, utilizando as técnicas de clonagem molecular convencionais, incluindo a digestão de restrição, ligação, eletroforese em gel, por exemplo, tal como descrito em Sambrook et al; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Uma sequência de ácido nucleico pode ser isolada, por exemplo, utilizando tecnologia de PCR. Tal tecnologia pode empregar iniciadores com base na sequência da sequência de ácido nucleico a ser amplificada. Por isolado entende-se que a sequência de ácido nucleico que está separada de quaisquer impurezas e de outras sequências de ácido nucleico e/ou proteínas que são naturalmente encontradas associadas com a sequência de ácido nucleico na sua fonte. Por isso, podem ser separados a partir de sequências flanqueadoras de ácido nucleico, ou a partir de material cromossômico ou sequência. De preferência, também será livre de material celular, meio de cultura, ou outros produtos químicos a partir de um processo de purificação/produção. Uma sequência de ácido nucleico pode ser sintética, por exemplo, produzido por meio da síntese química direta, por exemplo, usando o método fosfotriéster (Narang et al Meth Enzymol 68: 109 a 151, 1979). Uma sequência de ácido nucleico pode ser fornecida como ácido nucleico nu, ou pode ser fornecida complexado com uma proteína ou lipídio.
[0075] A sequência pode ser alterada para melhorar a eficiência de expressão (por exemplo, por truncagem C-terminal ou a introdução de motivos de segmentação), ou para alterar as características da resposta à luz (por exemplo, por meio da remoção ou adição de resíduos alvo de rodopsina quinases como parte do processo de terminação de sinal).
[0076] Com a informação da sequência fornecida, a pessoa que é versada na técnica pode utilizar técnicas de clonagem disponíveis para produzir uma sequência de ácido nucleico ou vetor adequado para a transdução em uma célula.
[0077] De um modo preferido, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível é proporcionada como um vetor, de preferência um vetor de expressão. De um modo preferido, pode ser fornecida como um vetor de terapia genética, de preferência, que é adequado para a transdução e expressão em uma célula alvo da retina. Um vetor pode ser viral ou n viral (por exemplo, um plasmídeo). Os vetores virais incluem aqueles derivados de adenovírus, vírus adenoassociados (AAV), incluindo formas mutantes, retrovírus, lentivírus, vírus do herpes, vírus vaccínia, MMLV, galv, Vírus Símio Imunodeficiência (SIV), o HIV, o vírus da varíola, e SV40. Um vetor viral é de preferência deficiente para replicação, embora esteja previsto que pode ser de replicação deficiente, competente para replicação ou condicional. Um vetor viral pode persistir tipicamente em um estado extracromossômico, sem integração no genoma da célula da retina alvo. Um vetor viral preferido para a introdução de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível para uma célula alvo da retina é um vetor de AAV, por exemplo, vírus adenoassociados autocomplementar (scAAV). O alvo seletivo pode ser conseguido usando um sorotipo de AAV específico (AAV sorotipo 2 e AAV sorotipo 12) ou uma versão modificada de qualquer um destes sorotipos de AAV, incluindo os vetores AAV 4YF e 7M8. Dentro dos aspectos da presente invenção em que o vetor é fornecido por meio da administração intravítrea, o vetor pode ser um que tenha sido modificado de tal forma que este não se ligue a um ou mais proteínas da MEC. Por exemplo, um vetor preferido pode compreender um local de ligação ao sulfato de heparina modificado, de tal modo que ele tenha uma função reduzida ou incapaz de se ligar ao heparan sulfato, tais como AAV 7M8 (Dalkara D et al Sci Transl Med 2013; 5: 189ra76).
[0078] Um vetor viral pode ser modificado para excluir quaisquer sequências não essenciais. Por exemplo, no AAV o vírus pode ser modificado para eliminar a totalidade ou parte do gene IX, E1 A e/ou o gene E1 b. Para AAV de tipo selvagem, a replicação é a extremamente de baixa eficiência, sem a presença de vírus auxiliar, tal como adenovírus. Para o vírus recombinante adeno-associado, de um modo preferido, os genes de replicação e da cápside são fornecidos em trans (em pRep/Cap plasmídeo), e apenas os 2 ITRs do genoma AAV estão à esquerda e empacotado em um vírion, enquanto que os genes de adenovírus necessários são fornecidos por adenovírus ou fornecidos por outro plasmídeo. As modificações similares podem ser feitas para um vetor lentiviral.
[0079] Um vetor viral tem a capacidade para entrar na célula. No entanto, um vetor não viral tal como o plasmídeo pode ser complexado com um agente para facilitar a sua captação por uma célula alvo. Tais agentes incluem agentes policatiônicos. Alternativamente, pode ser utilizado um sistema de entrega, tal como um sistema de entrega de base de lipossoma.
[0080] Um vetor para utilização na presente invenção é de preferência adequado para utilização in vivo ou in vitro, e é de preferência adequado para ser utilizado em um ser humano.
[0081] Um vetor compreenderá de preferência uma ou mais sequências reguladoras para dirigir a expressão da sequência de ácido nucleico em uma célula da retina alvo. Uma sequência reguladora pode incluir um promotor operativamente ligado à sequência de ácido nucleico, um intensificador, um sinal de terminação da transcrição, uma sequência de poliadenilização, uma origem de replicação, um local de restrição de ácido nucleico, e um local de recombinação homóloga. Um vetor pode também incluir um marcador selecionável, por exemplo, para determinar a expressão do vetor em um sistema de crescimento (por exemplo, uma célula bacteriana) ou de uma célula da retina de destino.
[0082] Por "operativamente ligado" significa que a sequência de ácido nucleico está funcionalmente associada com a sequência à qual está ligada operacionalmente, de modo a que eles estão ligados de um modo tal que eles afetam a expressão ou função de uma outra. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico operativamente ligada a um promotor terá um padrão de expressão influenciado pelo promotor.
[0083] Um promotor medeia a expressão da sequência de ácido nucleico ao qual está ligada. Um promotor pode ser constitutivo ou pode ser induzível. Um promotor pode dirigir a expressão ubíqua nas células da retina interna, ou expressão específica de neurônio. Neste último caso, um promotor pode dirigir a expressão específica do tipo de célula, por exemplo, em células bipolares ON ou bipolares Off. Os promotores adequados serão conhecidos por meio das pessoas que são versadas na técnica. Por exemplo, um promotor adequado pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em L7, Thy-1, recoverina, calbindina, CMV humano, GAD-67, beta-actina de galinha, hSyn, Grm6, proteína de fusão de potenciador de SV40-Grm6. O alvo pode ser conseguido utilizando promotores específicos de células, por exemplo, Grm6-SV40 para segmentação seletiva de células bipolares ON. O promotor Grm6 é uma fusão de 200 pares de bases de sequência de potenciador do gene que codifica para o receptor Grm6 de célula bipolar ON específica de metabotrópico de glutamato, mGluR6, e um promotor eucariótico de SV40. As fontes preferidas do gene Grm6 são camundongo e seres humanos. A expressão ubíqua pode ser conseguida utilizando um promotor pan-neuronal, exemplos dos quais são conhecidos e disponíveis na técnica. Um exemplo é CAG. O promotor CAG é uma fusão de CMV precoce e promotor β-actina de frango.
[0084] A presente invenção proporciona uma composição terapêutica compreendendo i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível e ii) uma enzima de degradação da matriz extracelular. Uma composição pode ser fornecida em um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0085] A presente invenção também fornece um vetor de ácido nucleico que compreende um ácido nucleico que codifica para uma proteína humana de fotorreceptores. A proteína humana de fotorreceptores pode ser rodopsina humana (também referido como Rh1, OPN2, RHO) ou um fotopsina. A PhotoSpin pode ser selecionada a partir do grupo que consiste na Opsina sensível de comprimento de onda longo (OPN1 LW), Opsina sensível de comprimento de onda médio (OPN1 MW) e Opsina sensível de comprimento de onda curto (OPN1 SW). O vetor pode ser fornecido como uma composição, para a administração a um indivíduo.
[0086] Uma composição pode ser um líquido ou um sólido, por exemplo, um pó, gel ou pasta. De preferência, uma composição é um líquido, de preferência um líquido injetável. Os excipientes adequados serão conhecidos por meio das pessoas que são versadas na técnica.
[0087] Nos quarto e quinto aspectos da presente invenção relacionados com a administração de um vetor de ácido nucleico que compreende um ácido nucleico que codifica para uma proteína humana de fotorreceptores, o vetor pode ser administrado a um olho por meio da administração sub-retiniana ou intravítreo. Em qualquer um dos modos de administração, o vetor é de preferência fornecido como um líquido injetável. De preferência, o líquido injetável é fornecido como uma cápsula ou uma seringa. Neste aspecto, de preferência, o ácido nucleico é introduzido sem a administração de uma enzima de degradação da matriz extracelular (isto é, é introduzida, sem coadministração de uma enzima, em que a coadministração inclui a administração separada, sequencial ou combinada durante a mesma terapia), tal como definido na presente invenção. Neste aspecto, de preferência, o líquido injetável não compreende uma enzima de degradação da matriz extracelular.
[0088] Em aspectos da presente invenção que compreendem a administração de uma enzima de degradação da matriz extracelular, uma enzima pode ser proporcionada separadamente ou em combinação com a sequência de ácido nucleico, isto é, como uma única composição. Quando fornecidas em separado, a enzima e a sequência de ácido nucleico podem ser fornecidas no mesmo excipiente ou em diferentes excipientes. Em uma tal modalidade, pode ser realizada separadamente, por exemplo em microcápsulas separadas. Dessa maneira, em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona uma composição que compreende i) um primeiro líquido injetável compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível; e ii) um segundo líquido injetável compreendendo uma enzima de degradação de matriz extracelular. De preferência, os primeiro e segundo líquidos injetáveis são fornecidos em recipientes separados, tais como cápsulas ou seringas, de preferência dentro de uma mesma embalagem.
[0089] De preferência, uma composição doa primeiro, segundo e terceiro aspectos da presente invenção é fornecida para a administração separada, sequencial ou combinada do ácido nucleico e da enzima a um indivíduo
[0090] Uma composição da presente invenção pode ser proporcionada para utilização em um método de fornecimento da função de fotorreceptores a uma célula. Em uma modalidade, uma composição da presente invenção pode ser proporcionada para utilização em um método de restaurar a função de fotorreceptores de uma retina. Em uma modalidade, uma composição da presente invenção pode ser proporcionada para utilização em um método de restaurar a visão a um indivíduo. Em uma modalidade, uma composição da presente invenção pode ser proporcionada para utilização em um método de tratamento de uma doença degenerativa da retina, por exemplo, uma distrofia da retina incluindo uma distrofia de bastonete, uma distrofia de bastonete-cone, uma distrofia de cone-bastonete, uma distrofia de cone e uma distrofia macular; outras formas de degeneração da retina ou macular, uma condição isquêmica, uveíte e qualquer outra doença resultante de perda de capacidade de fotorreceptores, por exemplo retina pigmentosa.
[0091] A presente invenção proporciona um kit compreendendo um vetor de ácido nucleico que compreende um ácido nucleico que codifica para uma proteína humana de fotorreceptores. A proteína humana de fotorreceptores pode ser como descrito acima. O vetor de ácido nucleico pode ser proporcionado como uma composição, tal como descrito na presente invenção. A composição pode ser um líquido injetável. Neste aspecto, o kit de preferência não compreende uma enzima de degradação da matriz extracelular.
[0092] A presente invenção fornece um conjunto que compreende i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível; e ii) uma enzima de degradação da matriz extracelular. Em um kit da presente invenção, a enzima de degradação da matriz extracelular e a sequência de ácido nucleico pode ser fornecida separadamente, ou em combinação. Elas podem, cada um, independentemente, ser fornecidas como uma composição, por exemplo, tal como descrito na presente invenção. Dessa maneira, um kit da presente invenção pode compreender i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível e ii) uma enzima de degradação da matriz extracelular, em que a sequência de ácido nucleico e/ou enzima são fornecidas como uma composição. A sequência de ácido nucleico e a enzima podem ser proporcionadas em combinação, em uma única composição, ou podem ser proporcionadas como composições separadas. Quando fornecidos em separado, a enzima e a sequência de ácido nucleico pode ser fornecida no mesmo excipiente ou em diferentes excipientes. Em uma tal modalidade, o mesmo pode ser realizado separadamente, por exemplo em microcápsulas separadas.
[0093] Em uma modalidade preferida, um kit pode compreender i) um primeiro líquido injetável compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível e ii) um segundo líquido injetável compreendendo uma enzima de degradação de matriz extracelular. De preferência, os primeiro e segundo líquidos injetáveis são fornecidos em recipientes separados, tais como cápsulas ou seringas, de preferência dentro de uma mesma embalagem.
[0094] Um kit da presente invenção pode compreender ainda instruções para utilização, em um regime de dosagem, um ou mais agulhas finas, uma ou mais seringas, e solvente.
[0095] Um kit da presente invenção pode ser proporcionado para utilização em um método de fornecimento da função de fotorreceptores a uma célula. Em uma modalidade, um kit da presente invenção pode ser proporcionado para utilização em um método de restaurar a função de fotorreceptores de uma retina. Em uma modalidade, um kit da presente invenção pode ser proporcionado para utilização em um método de restaurar a visão a um indivíduo. Em uma modalidade, um kit da presente invenção pode ser proporcionado para utilização em um método de tratamento de uma doença degenerativa da retina, por exemplo, uma distrofia da retina incluindo uma distrofia de bastonete, uma distrofia de bastonete-cone, uma distrofia de cone-bastonete, uma distrofia de cone e uma distrofia macular; outras formas de degeneração da retina ou macular, uma condição isquêmica, uveíte e qualquer outra doença resultante de perda de capacidade de fotorreceptores.
[0096] A presente invenção proporciona um método de fornecimento da função de fotorreceptores para uma célula, o método compreendendo a introdução de um olho de um vetor de ácido nucleico que compreende um ácido nucleico que codifica para uma proteína humana de fotorreceptores. A proteína humana de fotorreceptores pode ser como descrito acima. O método pode compreender a administração sub-retiniana ou intravítrea do vetor de ácido nucleico para as células da retina interna do olho. Neste aspecto, de preferência, o método não compreende a administração de uma enzima de degradação da matriz extracelular. A presente invenção proporciona um vetor de ácido nucleico que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína de fotorreceptores humano para utilização em um método de tratamento de degeneração da retina, proporcionando a função de fotorreceptores a uma célula. Neste aspecto, de preferência, uma enzima de degradação da matriz extracelular não é utilizada (isto é, o ácido nucleico é introduzido sem a coadministração de uma enzima, em que a coadministração inclui a administração separada, sequencial ou combinada durante a mesma terapia).
[0097] A presente invenção proporciona um método de fornecimento da função de fotorreceptores para uma célula, o método que compreende a introdução na cavidade vítrea do olho de um i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível e ii) uma enzima de degradação da matriz extracelular. A presente invenção proporciona i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível e ii) uma enzima de degradação de matriz extracelular, para utilização em um método para proporcionar a função de fotorreceptores a uma célula.
[0098] A presente invenção também proporciona um método de aumentar a função de fotorreceptores na retina, em particular após a degeneração de células de bastonete e/ou do cone, o método que compreende a introdução na cavidade do vítreo de um olho de um vetor de ácido nucleico que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína de fotorreceptores humano. A proteína humana de fotorreceptores pode ser como descrita acima. O método pode compreender a administração sub-retiniana ou intravítrea do vetor de ácido nucleico para as células da retina interna do olho. Neste aspecto, de preferência, o método não compreende a administração de uma enzima de degradação da matriz extracelular. A presente invenção proporciona um vetor de ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico que codifica uma proteína de fotorreceptores humano para utilização no tratamento de degeneração da retina, aumentando a função de fotorreceptores na retina. A proteína humana de fotorreceptores pode ser como descrita acima. Neste aspecto, de preferência, uma enzima de degradação da matriz extracelular não é utilizada (isto é, o ácido nucleico é introduzido sem a coadministração de uma enzima, em que a coadministração inclui a administração separada, sequencial ou combinada durante a mesma terapia).
[0099] A presente invenção também proporciona um método de aumentar a função de fotorreceptores na retina, em particular, da degeneração de células de bastonete e/ou do cone a seguir, o método compreendendo proporcionar a função de fotorreceptores de uma célula, tal como descrito na presente invenção. A presente invenção proporciona i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível e ii) uma enzima de degradação de matriz extracelular, para utilização em um método de aumentar a função de fotorreceptores na retina, em particular após a degeneração de células de bastonete e/ou do cone, em que o método compreende proporcionar a função de fotorreceptores de uma célula, tal como descrito na presente invenção.
[00100] A presente invenção também fornece um método para restaurar a visão a um indivíduo, o método compreendendo a introdução de um olho de um vetor de ácido nucleico que compreende um ácido nucleico que codifica para uma proteína humana de fotorreceptores. A proteína humana de fotorreceptores pode ser como descrita acima. O método pode compreender a administração sub-retiniana ou intravítrea do vetor de ácido nucleico para as células da retina interna do olho. Neste aspecto, de preferência, o método não compreende a administração de uma enzima de degradação da matriz extracelular. A presente invenção proporciona um vetor de ácido nucleico de ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico que codifica para uma proteína humana para utilização de fotorreceptores em restaurar a visão a um indivíduo. A proteína humana de fotorreceptores pode ser como descrito acima. Neste aspecto, de preferência, uma enzima de degradação da matriz extracelular não é utilizada (isto é, o ácido nucleico é introduzido sem a coadministração de uma enzima, em que a coadministração inclui a administração separada, sequencial ou combinada durante a mesma terapia).
[00101] A presente invenção também fornece um método para restaurar a visão a um indivíduo, o método compreendendo proporcionar a função de fotorreceptores de uma célula, tal como descrito na presente invenção. A presente invenção proporciona i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível e ii) uma enzima de degradação de matriz extracelular, para utilização em um método de restaurar a visão de um indivíduo, em que o método compreende o fornecimento de função de fotorreceptores de uma célula, tal como descrito na presente invenção.
[00102] A presente invenção também fornece um método de tratamento de doenças da retina de um indivíduo, o método compreendendo a introdução de um olho de um vetor de ácido nucleico que compreende um ácido nucleico que codifica para uma proteína humana de fotorreceptores. A proteína humana de fotorreceptores pode ser como descrito acima. O método pode compreender a administração sub-retiniana ou intravítrea do vetor de ácido nucleico para as células da retina interna do olho. Neste aspecto, de preferência, o método não compreende a administração de uma enzima de degradação da matriz extracelular. A presente invenção proporciona um vetor de ácido nucleico que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína de fotorreceptores humano para utilização no tratamento de doenças da retina em um indivíduo. A proteína humana de fotorreceptores pode ser como descrito acima. Neste aspecto, de preferência, uma enzima de degradação da matriz extracelular não é utilizada (isto é, o ácido nucleico é introduzido sem a coadministração de uma enzima, em que a coadministração inclui a administração separada, sequencial ou combinada durante a mesma terapia). A doença pode ser uma distrofia da retina incluindo uma distrofia de bastonete, uma distrofia de bastonete-cone, uma distrofia de cone-bastonete, uma distrofia de cone e uma distrofia macular; outras formas de degeneração da retina ou macular, uma condição isquêmica, uveíte e qualquer outra doença resultante de perda de capacidade de fotorreceptores.
[00103] A presente invenção também proporciona um método de tratamento de uma doença degenerativa da retina, o método compreendendo proporcionar a função de fotorreceptores de uma célula, tal como descrito na presente invenção. Dessa maneira, a presente invenção proporciona i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível e ii) uma enzima de degradação de matriz extracelular, para utilização em um método de tratamento de uma doença, tal como definido na presente invenção. A doença pode ser uma distrofia da retina incluindo uma distrofia de bastonete, uma distrofia de bastonete-cone, uma distrofia de cone-bastonete, uma distrofia de cone e uma distrofia macular; outras formas de degeneração da retina ou macular, uma condição isquêmica, uveíte e qualquer outra doença resultante de perda de capacidade de fotorreceptores.
[00104] Ao fornecer a função de fotorreceptores a uma célula que significa uma célula que anteriormente não têm capacidade de fotorreceptores ou cuja capacidade de fotorreceptores tenha sido degenerada, total ou parcialmente, torna-se foto-receptivo após expressão aí da sequência de ácido nucleico estranha que codifica uma proteína fotossensível. Uma tal célula pode ser na referida presente invenção como uma célula transformada, que compreende nela ácido nucleico não nativo. De um modo preferido, uma célula transformada da retina apresenta parte ou a totalidade da capacidade de fotorreceptores de uma célula fotorreceptora nativa. De um modo preferido, uma célula transformada retiniana expõe pelo menos a mesma ou substancialmente a mesma capacidade de uma célula fotorreceptora da retina nativa fotorreceptora. De um modo preferido, uma célula transformada exibe maior capacidade do que uma célula fotorreceptora da retina nativa fotorreceptora doente ou degenerada. Portanto, uma célula transformada, de preferência têm aumentado os fotorreceptores em comparação com uma célula degenerada ou doente a partir da mesma fonte, mantida sob as mesmas condições, sem tratamento. Uma célula transformada pode ser distinguida de uma célula nativa pela presença nele de ácido nucleico exógeno.
[00105] Aumentando a função de fotorreceptores entende-se o aumento da função de fotorreceptores da retina, quer através do aumento da função em células fotorreceptoras, tais como bastonetes ou cones, e/ou pelo fornecimento de função de fotorreceptores a uma célula. Dessa maneira, a retina terá uma maior capacidade de receber sinais de luz e transmitir esses sinais em comparação com uma retina que não tenha sido tratado com o método tal como descrito na presente invenção. O aumento pode ser em qualquer quantidade, de preferência, a níveis de tipo selvagem.
[00106] Ao restabelecer a visão em um indivíduo entende-se que o indivíduo mostra a visão melhorada em comparação com antes do tratamento, por exemplo, usando testes de visão, como descrito na presente invenção. A restauração inclui qualquer grau da melhoria, incluindo a plena restauração da visão de aperfeiçoar ou próximo a visão perfeita.
[00107] O tratamento da doença se destina a administração de como o ácido nucleico e a enzima de degradação extracelular, tal como descrito na presente invenção para melhorar ou aliviar um ou mais sintomas de uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em distrofia da retina incluindo uma distrofia de bastonete, uma distrofia de bastonete-cone, uma distrofia de cone-bastonete, a distrofia de cones e uma distrofia macular; mais formas de degeneração da retina ou macular, condições isquêmicas, uveíte e qualquer outra doença resultante de perda de capacidade de fotorreceptores. Melhoria ou alívio pode resultar em uma melhoria da visão periférica ou central, e/ou visão de dia ou noturna.
[00108] Os métodos da presente invenção compreendem a introdução na cavidade do vítreo de um olho de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível. De preferência, o método compreende o contato de uma célula com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível. De um modo preferido, uma célula é uma célula da retina, de preferência uma célula bipolar ON, uma célula bipolar OFF, uma célula horizontal, uma célula ganglionar e/ou uma célula amacrina.
[00109] De um modo preferido, um método da presente invenção compreende a segmentação de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível para a retina de um olho, de preferência a uma célula não fotorreceptora da retina, de preferência uma célula bipolar ON, uma célula bipolar OFF, uma célula horizontal, uma célula ganglionar e/ou uma célula amacrina. Dessa maneira, por contato de uma célula inclui a transfecção e/ou a transdução de uma célula.
[00110] Sempre que uma enzima é administrada, a enzima não precisa de ser internalizada em uma célula da retina, mas pode permanecer na cavidade vítrea ou na retina, em que degrada as proteínas da matriz extracelular para melhorar o acesso da sequência de ácido nucleico para as células da retina.
[00111] Um método da presente invenção é de preferência realizado in vivo.
[00112] A sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível e uma enzima pode ser proporcionada separadamente ou sequencialmente ou em combinação. Quando fornecida simultaneamente (ou seja, em combinação), uma sequência de ácido nucleico e uma enzima pode ser proporcionada como uma composição única, que é introduzida na cavidade vítrea, ou podem ser proporcionadas como composições separadas, mas fornecida à cavidade vítrea simultaneamente. Se fornecidos separadamente, uma sequência de ácido nucleico e a enzima podem ser proporcionadas em composições separadas, e podem ser fornecidas quer ao mesmo tempo, ou sequencialmente. Quando fornecida sequencialmente, uma enzima pode ser fornecida antes ou depois de uma sequência de ácido nucleico, de preferência antes. Nos quarto e quinto aspectos, uma enzima não é coadministrada através dos métodos descritos acima.
[00113] Quando são fornecidas duas ou mais enzimas, as mesmas podem ser introduzidas em uma única dose combinada ou em doses múltiplas. Uma dose de enzima pode ser proporcionada em combinação com uma sequência de ácido nucleico, ou separadamente aos mesmos. Quando são introduzidas doses múltiplas de enzima, qualquer uma ou mais doses podem ser uma dose combinada de enzima/sequência de ácido nucleico. Um método preferido compreende a introdução de i) uma dose da enzima combinada, e ii) uma dose sequencial de sequência de ácido nucleico. Em uma modalidade preferida, a dose de enzima compreende a heparinase III e hialuronano liase.
[00114] Qualquer método adequado pode ser utilizado para introduzir uma sequência de ácido nucleico e da enzima para a cavidade sub-retiniana ou vítrea. Um método preferido é a injeção. Dessa maneira, uma dose de sequência de ácido nucleico e/ou enzima pode ser fornecida como uma injeção. Um método da presente invenção pode compreender a injeção sub-retiniana ou na cavidade do vítreo de um vetor de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma proteína humana de fotorreceptores. De preferência, o método é o de proporcionar uma função de fotorreceptores a uma célula, por exemplo, para restaurar a visão, de preferência para o tratamento de uma doença degenerativa da retina, por exemplo, uma distrofia da retina incluindo uma distrofia de bastonete, uma distrofia de bastonete-cone, uma distrofia de cone- bastonete, uma distrofia de cone e uma distrofia macular; mais formas de degeneração da retina ou macular, condições isquêmicas, uveíte e qualquer outra doença resultante de perda de capacidade de fotorreceptores.
[00115] Um método pode compreender a injeção para dentro da cavidade vítrea, separadamente, simultaneamente ou sequencialmente, i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível e ii) uma enzima de degradação da matriz extracelular. Em uma modalidade preferida, um método da presente invenção compreende a injeção de uma dose única compreendendo um i) sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível e ii) uma enzima de degradação da matriz extracelular na cavidade vítrea do olho. De um modo preferido, um método compreende a injeção de uma dose única compreendendo i) uma sequência de ácido nucleico que codifica para a rodopsina; e ii) as enzimas heparinase III e liase de hialuronano, na cavidade vítrea do olho. Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona uma única dose injetável compreendendo: i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível e ii) uma enzima de degradação da matriz extracelular para a introdução na cavidade vítrea do olho para fornecer uma função de fotorreceptores a uma célula, para exemplo, para restaurar a visão, de preferência para o tratamento de uma doença degenerativa da retina, por exemplo, uma distrofia da retina incluindo uma distrofia de bastonete, uma distrofia de bastonete-cone, uma distrofia de cone-bastonete, uma distrofia de cone e uma distrofia macular; mais formas de degeneração da retina ou macular, condições isquêmicas, uveíte e qualquer outra doença resultante de perda de capacidade de fotorreceptores. De preferência, a presente invenção proporciona uma única dose injetável compreendendo: i) uma sequência de ácido nucleico que codifica para a rodopsina; e ii) as enzimas heparinase III e liase de hialuronano, para introdução na cavidade vítrea do olho para fornecer uma função de fotorreceptores a uma célula, por exemplo, para restaurar a visão, de preferência para o tratamento de uma doença degenerativa da retina, por exemplo, uma distrofia da retina incluindo um distrofia de bastonete, uma distrofia de bastonete-cone, uma distrofia de cone-bastonete, uma distrofia de cone e uma distrofia macular; mais formas de degeneração da retina ou macular, uma condição isquêmica, uveíte e qualquer outra doença resultante de perda de capacidade de fotorreceptores.
[00116] Quando uma sequência de ácido nucleico e um ou mais enzimas são fornecidas em unidades múltiplas (duas ou mais) doses, estes podem ser separados por intervalos de tempo adequados, por exemplo, 30 segundos a várias horas ou 1 ou mais dias.
[00117] Cada dose pode compreender uma quantidade eficaz de uma sequência de ácido nucleico e/ou uma enzima. Uma dose eficaz de uma sequência de ácido nucleico pode variar desde 1x109 para 1x1014 ou 7,5 x1015, de preferência a 1x1011 7.5x1013 das sequências de ácidos nucleicos por meio do regime de tratamento (por exemplo, número de vetores ou partículas de vírus). Uma enzima pode ser fornecida em uma dose de 0.075-0.125 unidades por olho, ou mais.
[00118] Um método da presente invenção pode compreender uma etapa de diagnóstico de um indivíduo para uma doença degenerativa da retina, por exemplo, uma distrofia da retina incluindo uma distrofia de bastonete, uma distrofia de bastonete-cone, uma distrofia de cone- bastonete, uma distrofia de cone, uma distrofia macular; mais formas de degeneração da retina ou macular, condições isquêmicas, uveíte e qualquer outra doença resultante de perda de capacidade de fotorreceptores. A etapa de diagnóstico pode compreender um teste visual, por exemplo, um teste de reflexo pupilar (PLR), teste de acuidade visual (LogMAR), testes de diagnóstico clínico, por exemplo, biomicroscopia/lâmpada de fenda ocular exame clínico/retina; teste de visão de cores, testes de campo visual, contraste/sensibilidade de campo completo; testes eletrodiagnósticos incluindo, por exemplo, ovos, PEVs; imagem, fotografia de fundo da retina, OCT, e oftalmoscópio adaptativo óptico de varredura a laser (AOSLO). Outros ensaios adequados serão conhecidos por meio das pessoas que são versadas na técnica.
[00119] Um método da presente invenção pode compreender uma etapa de dilatar a pupila de um olho a ser tratado, por exemplo por meio da aplicação de midriático, por exemplo tropicamida e/ou fenilefrina e/ou ciclopentolato. Um método da presente invenção pode compreender uma etapa de aceder a retina, por exemplo, por cirurgia.
[00120] Um método da presente invenção pode compreender o controle da visão de um indivíduo que tenha sido tratado para qualquer melhoria na visão. Melhoria na visão pode ser qualquer um ou mais do seguinte: aumento de reflexo pupilar à luz (PLR), aumento da sensibilidade ao contraste, o aumento da resolução de cintilação de baixa ou alta frequência, e aumento da detecção de imagens em movimento. Além disso, o aumento da atividade locomotora induzida pela luz pode ser melhorado em animais tais como camundongos. Uma melhoria na visão pode ser uma habilidade para responder ou detectar a luz em 1015-1013 fóton/cm2/s da irradiância da córnea. Uma melhoria na visão pode compreender uma resposta ON-transitória, OFF- excitatória, ON-sustentada, OFF-inibitória ou ON-OFF. De preferência, monitorizar a melhoria pode compreender um método para quantificar os indivíduos com experiência visual subjetiva ou uma medida objetiva de resposta à luz, por exemplo, um teste de luz reflexo pupilar (PLR), acuidade visual LogMAR, biomicroscopia clínica exame com lâmpada de fenda; teste de visão de cores, testes de campo visual, contraste/sensibilidade campo completo; eletrodiagnósticos ERG, PEVs; imagem: fotografia de fundo da retina, OCT, oftalmoscópio adaptativo óptico de varredura a laser (AOSLO), ou tarefas de navegação labirinto.
[00121] Um indivíduo pode ser monitorado a cada 6, 8, 10, 12 ou 24 horas, ou a cada 2, 3, 4, 5 dias. Isso pode ser repetido após 1, 2, 3, 4, 5, 6 meses ou um ano ou mais.
[00122] O termo "in vivo" refere-se ao ambiente natural (por exemplo, em um animal ou uma célula) e a processos de reação ou que ocorre dentro desse ambiente natural (por exemplo, no corpo de um indivíduo).
[00123] A presente invenção baseia-se como alvo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível de células da retina, para compensar a degeneração das células fotorreceptoras da retina. As células em que a sequência de ácido nucleico é alvo são células da retina que estão vivas e capazes de expressar uma sequência de ácido nucleico estranho. Nisto, uma célula da retina é uma célula da retina, o qual é uma célula nervosa ou neuronal e é capaz de se tornar animada e transmissão de um sinal elétrico. De um modo preferido, uma célula da retina alvo será capaz de gerar um sinal elétrico e início da cascata de sinalização que conduz a transmissão de sinal para o nervo óptico. De preferência, as células retinais alvo são as células da retina interna. A célula alvo pode ser uma célula de bastonete ou cone, e/ou pode ser uma célula não fotorreceptores (isto é, uma célula da retina que na sua forma nativa não responde à luz). Uma célula da retina alvo pode incluir um ou mais tipos de células a serem selecionados a partir do grupo que consiste em bastonetes, cones, células bipolares ON-OFF, as células bipolares, células horizontais, as células ganglionares, células de Muller e/ou células amácrinas.
[00124] Dessa maneira, quando uma célula da retina alvo é dirigida para uma célula de bipolar ON, célula bipolar OFF, a célula horizontal, de células ganglionares e/ou célula amácrina da retina, a expressão do ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível pode ser referida como expressão ectópica.
[00125] Dessa maneira, a presente invenção inclui no seu âmbito um método para expressar ectopicamente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína em uma célula fotossensível não fotorreceptora. Tal expressão ectópica tem o efeito de proporcionar a função de fotorreceptores de uma célula, através da expressão de uma proteína heteróloga fotossensível nela. Isto serve para aumentar a capacidade da retina fotorreceptora, onde é observada a degeneração. A coadministração de enzimas de degradação da matriz extracelular com a sequência de ácido nucleico serve para melhorar a transdução da sequência de ácido nucleico nas células retinais alvo.
[00126] A célula pode ser um procariota ou eucariota. Ele pode ser uma célula bacteriana tal como E. coli, ou pode ser uma célula de mamífero ou de não mamíferos, por exemplo, uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma linhagem de célula ou uma célula livre dos sistemas de expressão, por exemplo, para utilização na geração de um vetor ou composição da presente invenção. Uma célula da retina alvo pode ser uma célula Bipolar ON, uma célula bipolar OFF, uma célula horizontal, uma de células ganglionares e/ou uma célula amácrina.
[00127] As células horizontais são células retina interna, envolvidas no processamento de sinais e retroalimentação para células fotorreceptoras; as células bipolares são células da retina interna e a comunicação entre as células de bastonetes/cone e as células de amácrina e/ou ganglionares; células amácrinas são encontradas na retina interna e permitir a comunicação entre as células ganglionares da via de fotorreceptores e; as células ganglionares da retina são células mais interiores que passa, o sinal a partir de células fotorreceptoras para o nervo óptico.
[00128] Referência a uma célula na presente invenção inclui progenia da célula. De preferência, as modificações a uma célula de acordo com a presente invenção também ocorrer em gerações sucessivas das células hospedeiras transformadas. As células descendentes que podem não ser idênticas à célula alvo inicial, mas de preferência também exibem expressão da proteína fotossensível não nativa.
[00129] A presente invenção pode ser utilizada para o tratamento de qualquer doença que é caracterizada por meio de uma degeneração das células fotorreceptoras no olho, tipicamente uma degeneração que é suficiente para resultar em uma perda parcial ou total da visão. Exemplos de condições que podem ser tratadas ou melhoradas pela presente invenção incluem uma distrofia da retina (pigmentar retiniana), incluindo uma distrofia de bastonete, uma distrofia de bastonete-cone, uma distrofia de cone-bastonete, uma distrofia de cone e uma distrofia macular; outras formas de degeneração da retina ou macular (por exemplo degeneração macular relacionada com a idade), uma condição de isquemia, edema (ou macular da retina), uveíte e qualquer outra doença resultante de perda de capacidade de fotorreceptores.
[00130] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "indivíduo" refere-se a qualquer mamífero ou não mamífero. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a seres humanos, vertebrados tais como roedores, primatas não humanos, vacas, cavalos, cães, gatos, porcos, ovelhas, cabras, girafas, Yak, veados, camelos, lamas, antílope, lebres, e coelhos.
[00131] Na presente invenção, a referência a "um" ou "uma" inclui no seu âmbito tanto o singular e o plural, isto é, um ou mais.
[00132] A menos que seja indicado de uma outra forma, as características e modalidades de cada aspecto aplica-se a outros aspectos da presente invenção, mutatis mutandis.
[00133] Ao longo da descrição e das reivindicações do presente relatório descritivo, as palavras "compreende" e "contém" e as variações dos mesmos significam "incluindo, mas não limitado a", e que não se destinam a (e não) excluam metades outros, aditivos, componentes, números inteiros ou passos. Ao longo da descrição e reivindicações do presente relatório descritivo, o singular inclui o plural a menos que o contexto exija o contrário. Em particular, quando o artigo indefinido é usado, a especificação deve ser entendida como contemplando a pluralidade, bem como a singularidade, a menos que o contexto exija de outra forma.
[00134] As características, números inteiros, compostos, radicais ou grupos químicos descritos em conjunto com um aspecto particular, modalidade ou exemplo da presente invenção são para ser entendidos para serem aplicáveis a qualquer outro aspecto, modalidade ou exemplo descrito na presente invenção, a menos que seja incompatível com este. Todas as características descritas no presente relatório descritivo (incluindo quaisquer reivindicações, resumo e desenhos), e/ou todas as etapas de qualquer método ou processo descritos dessa maneira, podem ser combinados em qualquer combinação, exceto as combinações onde pelo menos algumas de tais características e/ou etapas são mutuamente exclusivas. A presente invenção não está restringida aos detalhes de quaisquer modalidades anteriores. A presente invenção estende-se a qualquer uma nova, ou qualquer combinação nova, das características descritas no presente relatório descritivo (incluindo quaisquer reivindicações, resumo e desenhos), ou a qualquer uma nova, ou qualquer combinação nova, das etapas de qualquer método ou processo descritos dessa maneira.
EXEMPLOS
[00135] Neste estudo, foi investigada a possibilidade de restaurar a capacidade de resposta a luz das retinas RD1 cegos expressando opsina de bastonete humana em neurônios sobreviventes interiores da retina utilizando terapia genética de AAV intravítrea. Ambas as entregas não direcionadas (neurônio não seletivo) e direcionadas (seletiva ON para células BP) foram estudadas. Além disso, as propriedades de respostas restauradas in vivo e a capacidade dos camundongos cegos tratados para resolver processamento de imagem mais sofisticada, incluindo a cintilação completa de campo, detecção de contraste, e as cenas naturalistas foram examinadas.
[00136] Ambas as opsinas de bastonete ectópicas não direcionadas ou direcionadas recuperam com sucesso a visão através de um código visual diversificado envolvendo tanto as vias ON quanto OFF foram encontradas. As respostas restauradas são transmitidas para além da retina em vias visuais CNS e função sob a faixa de intensidade de luz de visão de cone normal (e bastonete), bem como sob condições de luz adaptadas. As respostas são robustas o suficiente para levar a um comportamento locomotor induzido pela luz em camundongos tratados sob iluminação equivalente a iluminação do ambiente interior. Além disso, os resultados mostram que os camundongos com células especificamente direcionadas bipolares ON, são capazes de resolver as funções visuais mais complexas, incluindo a cintilação de campo completa, detecção de contraste e cenas de filmes naturalistas com mudanças nos padrões espaciais e objetos em movimento.
1. Injeções intraoculares e entrega de genes por meio de AAV (Figura 1)
[00137] Os camundongos C3H/HeJ (RD1) adultos foram utilizados neste estudo. Especificamente, uma mutação pde65b nula em camundongos RD1 leva a uma completa perda de fotorreceptores por p90 (cratera-Dawson et al, 1978, Farber dB et al 1994). (Importante notar que a mutação não afeta rodopsina em si). A fim de responder se opsina de bastonete pode expressar fotorreceptores fora in vivo, o cassete de expressão do gene foi injetado (Figura 1A) intra-intravítrea em camundongos RD1 adultos. Tendo em mente o potencial translacional desta abordagem foi utilizada um vetor AAV2/2 clinicamente seguro e uma versão humanizada da opsina de bastonete. A injeção intravítrea foi empregue a fim de alcançar transdução da retina mais generalizada e minimizar as potenciais complicações associadas com um fornecimento alternativo sub-retiniano de vetores. A abordagem sub-retiniana normalmente leva a transdução localizada no local da injeção. Uma combinação optimizada de enzimas glicosídicas foi co- injetada, a fim de aumentar a transdução e permitir o vetor para penetrar mais profundamente na retina. Desconhece-se que os tipos de células, se for o caso, os fotorreceptores nativos de fora expressariam opsina de bastonete. A expressão não direcionada foi estudada pela primeira vez, usando um promotor pan-neuronal forte, CAG.
[00138] As retinas foram colhidas quatro a seis meses após a injeção e crio-seções da retina foram marcadas com imuno com anticorpo contra opsina de bastonete humano. A expressão foi confirmada por meio da microscopia fluorescente. Opsina de bastonete expressa fotorreceptores bem fora como foi confirmado por meio da soma de células fortemente marcadas (Figura 1B). A expressão foi localizada na membrana de plasma e foi observada em ambas as camadas RGC (Figura 1C) e INL (Figura 1 D). É provável que um promotor não seletivo com vários tipos de células diferentes em INL foi transduzido, incluindo algumas células horizontais e amácrinas, embora por grandes corpos celulares transduzidas no INL tinha características de células bipolares (Figura 1 D). A expressão de opsina de bastonete era pan-retiniano, embora no INL foi irregular, com profundidades variáveis de penetração. Em comparação, a ausência de fluorescência foi vista no presente controle PBS de grupo injetado. Além disso, as retinas injetadas de tipo selvagem não tratadas com o anticorpo contra a opsina de bastonete mostrou fluorescência clara em segmentos externos de fotorreceptores, indicando que o anticorpo é específico para opsina de bastonete sem marcação fora do alvo.
Resultados: Pupilometria:
[00139] Figura 2. Restauração do reflexo pupilar à luz após o tratamento de rodopsina. As curvas de irradiância-resposta para a constrição pupilar máxima durante 10 s de luz branca em neutro filtros de densidade ND4 (mais opaco) para NDO (mais brilhante). Os olhos tratados com Rodopsina (Rd RHO) mostram uma melhoria acentuada na sensibilidade visual em comparação com olhos injetados com GFP (Rd GFP). Dados para os camundongos C57 do tipo selvagem injetados com PBS/mistura de enzimas estão apresentados para comparação (WT PBS). Os dados estão normalizados para o tamanho da pupila imediatamente anterior ao aparecimento de luz. Os valores são média ± SEM, com n indicando o número de olhos examinados.
Eletrofisiologia In vivo:
[00140] Figura 3. Os dados foram gravados in vivo em eletrofisiologia. A amostra representativa de histogramas de peri- eventos para um número de canais de gravação (SIGs) mostra a taxa de disparo médio de células LGN ao estímulo 2s de luz 405nm apresentado a um rodopsina olho tratado contralateral aumentando a intensidade (Figura 3a ND2, B- ND1, C -NDO; ND2 = mais opaco, ND0 = mais brilhante). Um número de canais (por exemplo, sig 50, sig 52 no NDO e ND1) apresentaram respostas claras 'fast-onset "robustas com um "pico ON" após a luz ter sido ligada, e um" pico OFF "quando a luz é desligada. As respostas observadas são claramente distintas das respostas leves nativas normalmente presentes em camundongo RD1 LGN após a estimulação do olho contralateral (Figura 3). Estas respostas nativas foram observadas a partir olhos tanto tratados com rodopsina quanto tratados com GFP e mostra típicas respostas 'slow- onset’ sustentadas, (a partir de células ganglionares da retina melanopsina, Figura 3D) e respostas rápidas muito transitórias (a partir da sobrevivência de cones fotorreceptores, Figura 3E). As respostas “restauradas" (Figura 3A-C), portanto, vem a partir de células da retina (ganglionares da retina ou células bipolares) com propriedades fotorreceptoras induzidas de expressão ectópica da rodopsina.
Gravações MEA in vitro:
[00141] Figura 4. Os dados de vitro em gravações MEA. A amostra representativa de histogramas peri-evento para um certo número de canais de gravação (SIGs), mostrando a média taxa de disparo de células ganglionares da retina para estímulo de luz 2s 405nm aplicado a retinas isoladas aumenta a intensidade (Figura 4A- ND2, B- ND1, C - NDO; ND2 = mais opaco, ND0 = mais brilhante). Um número de canais apresentaram respostas claras 'fast-onset' robustas com alguns canais (por exemplo, sig 35, sig 36 no NDO e ND1) mostrando um "pico O" após a luz ter sido ligada, e um "pico OFF" quando a luz foi desligada. As respostas observadas são claramente distintas das respostas leves nativas normalmente presentes na retina de camundongo RD1 seguintes ao estímulo de luz (Figura 5). Estas respostas nativas foram observadas a partir de olhos tanto tratados com rodopsina quanto com os olhos tratados com GFP e mostra respostas típicas 'slow-onset' sofridas (a partir de células ganglionares da retina melanopsina, por exemplo, a Figura 5, sig 37). As respostas novas (Figura 4A-C), portanto, se originam a partir de células da retina com propriedades fotorreceptoras prestadas de expressão ectópica da rodopsina.
Restauração da atividade evocada pela luz em células ganglionares da retina - avaliação funcional de respostas opsina de bastonete in vitro
[00142] Em seguida, foi pretendido confirmar que a opsina de bastonete ectopicamente expressa poderia dirigir respostas funcionais de luz na retina cega. Os explantes de retina foram montados em um conjunto de multieletrodo para testar a atividade evocada pela luz. As retinas de camundongos RD1 (4-6m de idade) com Opsina de bastonete injetado (CAG-hRho) mostrou células que respondem a luz com taxa de disparo inicial robusta após estimulação com dois segundos de campo total dos flashes de luz branca em um amplo espectro de 15,4 fótons log/cm2/s. No entanto, depois de algumas apresentações repetidas, a atividade evocada pela luz diminuiu para baixo a frequência de espetamento, o que sugere um efeito de branqueamento. Isso não foi surpreendente para as preparações in vitro onde as fontes endógenas de 9-cis são rapidamente esgotadas. No entanto, a adição de 9-cis para a preparação evocou a atividade neuronal robusta com respostas altamente reprodutíveis. Além disso, os perfis de resposta diversos foram observados entre a população de células que respondem a luz (n = 6), incluindo as retinas sustentadas ON, em respostas transientes e OFF. Em contraste, as retinas de controle da mesma idade injetadas com GFP (CAG-GFP) não mostraram nenhuma atividade evocada pela luz após a apresentação do mesmo estímulo de luz consistente com a ausência de fotorreceptores (n = 2 retinas). (Foi também possível dirigir respostas claras na opsina de bastonete de retinas tratadas em intensidades de luz mais baixas (14,4 fótons log/cm2/s Figura 1 H e 13,4 fótons log/cm2/s)), representando uma melhoria significativa na sensibilidade à luz em comparação com outras estratégias optogenéticas que utilizam, pelo menos, 5-6 unidades logarítmicas de intensidades de luz maiores do que o necessário para ativar visão cone nativa (Gaub, Lagali etc).
Respostas mediadas de opsina de bastonete ectópica são transmitidas para o LGN - caracterização de respostas restauradas in vivo (Figura 3)
[00143] Uma vez que o branqueamento de opsina de bastonete, sem fontes exógenas constantes de cromóforo (retina 9-cis), era um problema para as experiências in vitro, a atividade neuronal foi testada in vivo a fim de determinar se haveria retina suficiente em retinas intactas para permitir que a reciclagem do cromóforo e prevenir o branqueamento. Além disso, se as respostas restauradas são robustas o suficiente para ativar os centros visuais superiores no contexto da degeneração e a remodelação retina foi investigada. respostas neuronais a partir do núcleo geniculado lateral dorsal, dLGN, foram registradas a partir de ambas as hemi-esferas em simultâneo, em que um olho foi previamente tratado com opsina de bastonete e o outro, injetado com GFP, serviu como um controle interno. O dLGN é a maior parte do cérebro retino recipiente e contém os neurônios que transmitem sinais para o córtex visual. As respostas do dLGN, a primeira conexão sináptica para os RGCs, foram estudadas para obter a melhor ideia das propriedades de respostas restauradas. Um aumento significativo do número de respostas leves em todo o dLGN (157) foi encontrado em relação aos controles internos (4) Na sequência de dois segundos de campo total de flashes de luz 410nm em 15,4 log fótons/cm2/s. As células que respondem a luz foram identificadas de acordo com critérios objetivos usando a análise peri-estímulo de tempo de histograma (PSTH) nos Neuroexplorer (Nex Technologies) onde a taxa de queima média teve de atravessar IC 95% após o início do estímulo ou compensados, em comparação com a linha de base. O intervalo de tempo PSTH para 2s estímulo foi -2DP para 5s, e 250ms tamanho bin. Foram excluídos os artefatos claros que conduziram a falsos positivos. Os ‘mapas de aquecimento' foram gerados para incluir todas as células que respondem a luz a partir de cada grupo e as respostas ordem de acordo com a amplitude da resposta mantida durante 1 segundo inicial de uma apresentação do estímulo de 2 segundos. As cores verde (+1) representam altas taxas de disparo e as cores rosa/roxo (-1) as taxas de disparo baixos. A figura 3F mostra claramente a natureza diversa das respostas restauradas incluindo as respostas sustentadas, transitórios, ON e OFF, como são normalmente encontradas em retinas WT. Em contraste, as células que respondem à luz (n = 4) que foram encontradas no grupo de controle estavam todas em aparecimento lento, sustentado, susceptíveis de originar de ipRGCs nativas. O branqueamento não foi encontrado para ser um problema para as respostas de luz in vivo, que demonstraram disparo robusto em muitos ensaios repetidos.
[00144] Para capturar a diversidade de respostas restauradas atendidas em um único nível de unidade (mas encontradas em todas as retinas testadas) as respostas individuais foram estudadas sistematicamente através de seus histogramas peri-estímulo de tempo (PSTH) e contagens bin de julgamento correspondentes (TBC). A média de toda a população de células seria difícil, dado que algumas células são excitadas por luz ON (respostas ON) algumas inibidas pela luz ON (respostas OFF inibitórias), algumas animadas pela luz OFF (OFF excitatório) e algumas animadas por luz ON e OFF (células on-off). Ambos as respostas sustentadas (etapa luz de 10s e 2s, Figura 3G) e as respostas transientes (etapa luz de 2s, Figura 3H) foram evocadas nos olhos tratados, comparáveis aos de retinas WT (Insert). Além disso, para as respostas ON também foram encontradas muitas respostas OFF (Figura 3I) e algumas respostas on-off (Figura 3J). Do outro lado da população de células que respondem a luz, 99/157 (63,1%) das células ON, 46/157 (29,3%) de células OFF e 12/157 (7,6%) de células ON-OFF (Figura 3E) foram encontrados. Estes foram classificados em células sustentadas ON (51/157; 32,5%), células transitórias ON (48/157; 30,6%), células OFF excitatórias (29/157; 18,5%), células OFF inibitórias (17/157; 10,8%) e células ON-OFF (12/157; 7,6%). A média de taxa de disparo variou entre 20-100Hz através das respostas restaurados. As respostas foram encontradas com latências curtas (início dentro 50- 100ms - 2D, células 1; 2E celH), bem como mais longos (latências de início dentro 500ms -2D, Cell 3). taxa de disparo para respostas mais sustentadas devolvidos rapidamente de volta à linha de base (centenas de milissegundos de transformar o estímulo luminoso desligado, celular 2D 3) embora tenha sido encontrado algumas células com queima mais persistente (segundos após a luz apagada, células 2D 2). (Similar a outros estudos, lagali, Flannery, respostas peso)
Recursos de sensibilidade e contraste de respostas LGN restauradas
[00145] As estratégias atuais optogenéticas com base em Chr (10151017 fótons/cm2/s) e interruptores fotossintéticos (1015-1018 fótons/cm2/s) exigem altas intensidades de luz para ativação e longo prazo a exposição dessas intensidades de luz pode ser prejudicial para a retina. Nos presentes experimentos, os neurônios restaurados operam sob uma gama dinâmica de intensidades de luz equivalente a iluminação luz natural (1013-1015 fótons/cm2/s) (Figura 6). Importantes respostas robustas e reproduzíveis sustentadas e transitórias, ON e OFF, foram encontradas através destas intensidades de luz, indicando quão sensível é o sistema. Algumas respostas de luz também foram encontradas em intensidades de luz mais baixas (1012 e 1011, embora estes não eram tão prontamente/bem/pouco reprodutível (dados não mostrados). Nenhuma resposta clara convincente foi registrada a níveis inferiores a 1015 fótons/cm2/s, quando as retinas RD1 não tratadas foram estimuladas.
[00146] Até agora, os estudos sobre novas ferramentas optogenética tem todas as respostas restauradas caracterizadas em condições de adaptação ao escuro, usando etapas leves de campo completo de escuridão. Embora isso aumenta a possibilidade de provocar fortes respostas neuronais, estas condições são raramente presentes em cenários da vida real. O sistema foi testado em condições mais naturais, em situações de luz adaptada. Respostas robustas, de alta amplitude e repetíveis, foram registradas sob condições de luz adaptado, contraste Michelson 96% (Figura 6B). Nenhum contraste de detecção das células foi encontrado em resposta estimulação adaptada à luz de retinas de controle RD1.
[00147] (contrastes mais baixos (66% e 33%,) também evocaram respostas mensuráveis, embora estes não eram tão altamente reprodutíveis em todos os ensaios repetidos (vide suplementar/ou não mostrar).
Restrição da expressão ectópica da opsina de bastonete usando um promotor específico de célula
[00148] A diversidade do código visual gerado com a expressão ectópica irrestrita de opsina de bastonete foi encorajadora. No entanto, decidiu-se investigar se haveria quaisquer alterações a este código se a expressão opsina de bastonete se restringiu a " via ON " apenas. Portanto, a opsina de bastonete foi expressa em células bipolares ON usando um promotor Grm6 específica de células (Figura 7A-C).
[00149] As Figuras 8-10 mostram as respostas claras de dLGN restauradas sob diferentes condições de luz para os camundongos que foram tratados com opsina de bastonete alvo a células BP ON. A sensibilidade foi demonstrada para baixo para condições normais de iluminação. Os números relativos à irradiância apresentados são para medições de córnea. A irradiância retina será de aproximadamente uma ordem de grandeza menor.
[00150] As gravações LGN in vivo destes camundongos também mostram um aumento significativo do número de respostas de luz (n = 100) quando comparados com os controles internos (n = 6) no seguimento da estimulação com campos completos de flashes (2S) de luz 410nm em 15,4 log fótons/cm2/s. Mais uma vez, observou-se uma gama de perfis de resposta - sustentada, transiente, ON e OFF (excitatória e inibidora) no grupo tratado com opsina de bastonete. Em comparação com as respostas irrelevantes, as respostas de luz de alvo de células ON-BP foram mais uniformemente distribuídas entre os tipos de ON e OFF. Do outro lado da população de células que respondem a luz, foi observado que 48/84 (57,1%) nas respostas ON e 36/84 (42,9%) nas respostas OFF. Estes foram amplamente subdivididos em células sustentadas ON (34/84; 40,5%), células transitórias ON (14/84; 16,6%), as células excitatórias (6/84; 7,1%) e células inibitórias Off (30/84; 35,7%). caracterização mais detalhada das respostas claras restauradas mostrou resposta rápida transitória ON, resposta sustentada ON (início dentro de centenas de ms) e resposta OFF- transitória e respostas OFF inibitória mais lenta (início em poucos segundos). Estas respostas inibidoras OFF robustas atrasadas eram uma característica específica de expressão opsina de bastonete alvo (célula 4G 2 e 3).
[00151] Foi em seguida investigado se a sensibilidade e contraste de detecção de respostas impulsionadas Bipolares ON é semelhante ao presente grupo não segmentado. O perfil de sensibilidade comparável de respostas impulsionadas Bipolares ON foi encontrado com as respostas não seletivas/grupo não segmentado e leves em 13,4 log fótons/cm2/s (Figura 4H) foram registrados. Da mesma forma, tendo em vista adaptar as condições, também foram encontradas as células que respondem ao nível de Michelson de contraste (96%, Figura 4I).
[00152] (Menor amplitude e respostas menos reprodutíveis foram registradas a níveis mais baixos de contraste (66% e 33%), semelhantes àqueles observadas nas retinas não alvo (dados não apresentados))
Respostas comportamentais induzidos por luz
[00153] Em seguida, investigou-se se a informação visual transmitida ao cérebro, impulsionada por ambas a transdução opsina de bastonete ectópica não segmentada e direcionada, a mesma poderia restaurar as funções visuais perdidas em camundongos RD1 cegos. Em primeiro lugar, uma resposta de comportamento simples de luz, o reflexo pupilar à luz (PLR) foi testado. Este reflexo é normalmente mediado por melanopsina expressando ipRGCs (Lucas RJ.et al Science de 2003 janeiro 10; 299 (5604):. 245 a 7.) E é mantido em alto nível em camundongos RD1 após degeneração de fotorreceptores (Lucas RJ, et al Nat Neurosci junho 2001; 4 (6): 621 a 6, Lin B, Proc Natl Acad Sci US A. 2008 14 de outubro; 105 (41): 16009 a 14). A irradiância de curvas da resposta foram registradas para a constrição pupilar máxima durante dez segundos de luz branca em uma gama de intensidades de luz (Figura 11 A). Prejudicada PLR foi encontrado em camundongos de controle injetados com GFP, confirmando achados anteriores. Irrestrita expressão de opsina de bastonete restaurado PLR comparável a um comportamento de tipo selvagem (Figura 11A-D). No entanto, com a expressão alvo, o DCP permaneceu em grande parte diminuída (Figura 11A-C).
[00154] Foi, então, perguntado se o código visual optogenético restaurado poderia apoiar discriminação visual mais complexa a nível comportamental. Motivado por testes clássicos de campo aberto de luz clara/caixa escura (Bourin M, Hascoet M (2003), Eur J Pharmacol 463 (1-3):. 55 a 65. O comportamento locomotor em resposta a vários estímulos de luz artificial e natural foi medido. Os camundongos foram colocados em caixa de luz modificado/obscuridade um campo aberto e permitidos a livre circulação entre duas arenas através de uma abertura na parede de separação. Os monitores de computador de tela plana fora de cada arena foram usados para exibir uma variedade de estímulos visuais. As intensidades de luz dos presentes estímulos eram equivalentes dos níveis de iluminação interior (variando de 0,00132 W/m2 para a tela preta para 0,1 16 W/m2 para a tela branca). A simples discriminação escuro-claro foi testada pela primeira vez. Depois de habituação inicial para o novo ambiente (3min), os camundongos foram autorizados a explorar a caixa por 5 minutos no escuro (luminosidade tela escura = 0,004072 WSR '2; irradiância = 0,00132 W/m2), seguido por 5 minutos em luz branca (tela branca radiância = 0,06526 WSR "1m" 2; irradiância = 0,116 \ N/m2) - O ensaio locomotor foi avaliado pela primeira vez em camundongos selvagens, onde a atividade mostra um aumento significativo na locomoção nos primeiros 30 anos de transição da escuridão para a luz (Figura 12, a média distância em escuro = 24,46 ± 7,00 centímetros; distância em luz = 147,5 ± 5,09 centímetros dizer; p = 0,0066). Os camundongos RD1 cegos não mostraram nenhuma mudança significativa na atividade durante esta transição claro-escuro (média distância em escuro = 91,75 ± 7,70 centímetros; distância média à luz = 100,2 ± 8,145 centímetros p = 0,5541). No entanto, as partes da atividade para os grupos tratados, RD1-hRho-CAG e RD1-hRho-grm6, exibem uma diminuição repentina da atividade motora quando a luz está ligada. Este comportamento de 'congelamento' induzido pela luz foi significativo nos primeiros 30 anos de transição da obscuridade à luz (para RD1-hRho-CAG, a distância no escuro = 98,40 ± 16,12 centímetros dizer, a distância média à luz = 69,73 ± 13,32 centímetros; p = 0,0070; para RD1 -hRho-grm6 média distância em escuro = 1 12,9 ± 21,47 centímetros, média distância na luz = 68,37 ± 16,81 cm; p = 0,0224).
[00155] Depois de estabelecer que os camundongos tratados poderiam distinguir a luz da escuridão, o seu comportamento em resposta a estímulos visuais mais dinâmicos foi testado. A atividade locomotora à luz adaptada sobre estas condições (5 minutos de exposição à luz cinza, radiância = 0,03342 WSR '2; irradiância = 0,0663 W/m2) foi comparada com a cintilação de campo completo de 4 Hz (Figura 13A). O grupo RD1-hRho-grm6 foi capaz de resolver esta frequência de cintilação (distância em cinza = 151,3 ± 34,95 centímetros, a distância em cintilação média = 83,7 ± 13,76 centímetros; p = 0,0466), enquanto que RD1-hRho-CAG e camundongos cegos não tratados mostraram nenhuma mudança no comportamento (Figura 13B). Em seguida, testou-RD1 hRho-CAG com uma frequência menor, a 2Hz e descobriu-se que eles respondem (limite de probabilidade de este sistema) (dados não mostrados).
[00156] Como os camundongos RD1-hRho-grm6 alvo tiveram a melhor resposta com cintilação de campo completo desse grupo foi ainda testado para ver se os camundongos poderiam discriminar as mudanças mais sutis na luz e detectar contraste. Na verdade, foi mostrado que os camundongos responderam em diferentes contrastes Michelson (Figura 14, a distância média em cinza = 179,3 ± 17,34 centímetros; a distância no cintilação média = 127,2 ± 16,29 centímetros; p = 0,0238 Em contraste 68,6% e média distância em cinza = 151,3 ± 34,95 centímetros, média distância em cintilação = 83,7 ± 13,76 centímetros; p = 0,0466 em contraste 100%).
[00157] As frequências mais elevadas de cintilação em camundongos RD1-hRho-grm6 também foram olhadas, 10Hz e 20Hz. Nenhum recebimento de resposta de 20Hz foi encontrado, mas a resposta convincente a 10 Hz (Figura 15; distância média em cinza = 93,64 ± 26,39 centímetros, média distância em cintilação = 162,6 ± 18,57 centímetros; p = 0,039 a 10 Hz).
As respostas a cenas naturalistas
[00158] Com as características descritas de respostas restauradas usando uma variedade de estímulos artificiais, foi estabelecido para determinar se a opsina de bastonete ectópica poderia dirigir respostas visuais a nível cerebral sob cenas mais naturalistas com propriedades espaciais. Para este fim, um filme naturalista foi projetado (camundongos que se deslocam em torno de uma arena aberta) para camundongos Rd1-CAG-hRho e Rd1-grm6-hRho anestesiados e gravaram-se in vivo as respostas do LGN. O filme de 30 segundos foi apresentado várias vezes ao longo de um período de 30 minutos permitindo a identificação de células com padrões de disparo reprodutíveis ao longo de muitas apresentações. Os neurônios individuais cuja taxa de disparo é modulada por características particulares da cena do filme após a estimulação de ambas as retinas não segmentados e direcionados (Figura 16A a C) foram observados; há neurônios de ‘resposta ao filme’ dos olhos de controle.
[00159] Em seguida, investigou-se se os camundongos podem ver as cenas naturalistas? Em um ensaio comportamental locomotor de campo aberto, um filme naturalista caracteriza uma coruja iminente que foi apresentada para os camundongos na caixa de teste. Com efeito, verificou-se que os camundongos RD1-hRho-grm6 responderam a uma coruja iminente (Figura 6C), mostrando uma mudança significativa no comportamento locomotor em uma transição 30s da luz uniforme a uma cena do filme (Figura 14, a distância média em cinza = 67,68 ± 22.05; distância em filmes naturais média = 110,2 ± 19,44; p = 0,0079). Curiosamente eles não exibiram o comportamento de congelamento, mas, na verdade aumentaram sua atividade motora, provavelmente em uma tentativa de escapar do predador. Não foram encontradas alterações no comportamento em resposta a um filme em camundongos RD1 cegos ou camundongos Rd1-hRho-CAG.
Materiais e métodos Animais
[00160] Estes camundongos são um modelo de forma grave e rápida de degeneração da retina, semelhante a algumas formas de retinite pigmentosa em seres humanos (McLaughlin et al., 1993). Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com os regulamentos UK Home Office para o cuidado e uso de animais de laboratório, os animais do Reino Unido (Scientific Procedures) Act e o bem-estar do corpo animal, da Universidade de Manchester. Os animais foram mantidos sob 12 horas de luz: ciclo escuro e fornecidos com comida e água ad libitum.
Entrega de genes através de AAV
[00161] As injeções intraoculares foram realizadas em camundongos com seis semanas de idade sob anestesia geral, utilizando isofluorano. Antes de injeções, as pupilas estavam dilatadas com tropicamida e fenilefrina. Uma agulha ultrafina customizada (Hamilton RN agulha 34 gauge, fornecido pela ESSLAB) foi ligada a uma seringa de vidro 5μl Hamilton e foi aprovada em 45 graus através de pares planos na cavidade vítrea, evitando cuidadosamente os vasos de lentes e de sangue. A injeção foi realizada sob uma visualização direta da ponta da agulha através dos olhos cobertos sob o microscópio cirúrgico. Os vetores, rAAV sorotipo 2 (rAAV2/2, ou simplesmente AAV2) expressando opsina de bastonete ou GFP sob o controle de um forte promotor pan-neuronal ubíquo (CAG) ou através de promotor específico de células Bipolares ON (Grm6) foram obtidos a partir do vetor Biolabs, Filadélfia, EUA. O promotor CAG é uma fusão de CMV precoce e promotor de frango β-actina. O promotor Grm6 é uma fusão de 200 pares de bases da sequência potenciadora do camundongo do gene Grm6 que codifica para o receptor na célula bipolar de glutamato metabotrópico específico, mGluR6, e um promotor eucariótico de SV40. O gene de interesse em cada caso foi flanqueado por meio da repetição terminal invertida (ITR) e estabilizada por meio dos domínios sequência de sinal de poliadenilação (poli A) e um elemento regulador da hepatite das marmotas pós-transcricional (WPRE).
[00162] Um olho de cada camundongo foi injetado com construto de expressão de opsina de bastonete (ou AAV2-ITR-CAG-hRho-poli- WPRE-ITR para a expressão não alvo ou AAV2-ITR-grm6-hRho-poli- WPRE-ITR para a expressão alvo) e o outro com o construto de expressão GFP (ou AAV2-ITR-CAG-GFP-poli-WPRE-ITR para a expressão não alvo ou AAV2-ITR-grm6-GFP-poli-WPRE-ITR para a expressão alvo). Cada olho recebeu 3μl de construto viral contendo 1x1013 contagens genômicas, em combinação com 0.5μl de solução de enzima glicosídica contendo 0,125 unidades de heparinise III (EC 4.2.2.8) e hialuronano liase (EC 4.2.2.1) obtidos a partir de Sigma- Aldrich, Dorset, REINO UNIDO. As soluções de enzima foram feitas frescas no dia da injeção, dissolvendo as enzimas em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). O vetor e enzimas foram misturadas em uma seringa imediatamente antes de uma injeção do olho e foram dadas em uma única injeção combinada.
Processamento de tecidos, imunohistoquímica e bioimagem
[00163] Para o processamento do tecido, os oculares recuperados (> 6 semanas após a injeção de vetor) foram fixados em paraformaldeído a 4% (PFA) durante 24 horas a 4 ° C. O tecido foi depois lavado em PBS e fixado em mais de 30% de sacarose em PBS durante a noite a 4 ° C. Os olhos fixos foram protegidos em meio a temperatura de corte ideal (Raymond a Lamb Ltd., Eastbourne, Reino Unido) e congeladas a -80 ° C até posterior processamento. A seção da retina crio-protegido foi cortada em um criostato (Leica, Microsystems) horizontalmente através da espessura ocular @ de 8 a 10μm a partir do ventral dorsal para o lado, de modo que cada seção contém uma nasal completa para a seção transversal temporal da retina. Dez e doze seções foram coletadas em cada fatia contendo as seções representativa de toda a retina. As lâminas foram armazenadas a -80 ° C.
[00164] Para imuno-histoquímica, as lâminas foram removidas do congelador e deixadas secar ao ar à temperatura ambiente durante 1 hora. As seções foram permeabilizadas imergindo as lâminas em PBS com 0,2% de Triton durante 20 minutos à temperatura ambiente. Na sequência deste fundo, as seções foram bloqueadas com PBS com 0,2% de Triton X-100 contendo 10% de soro de burro (D9663, Sigma, Reino Unido) durante 1 hora à temperatura ambiente. O anticorpo primário (rodopsina de coelho anti-humano, Abcam, Ab112576) foi aplicado em diluição de 1: 200 em tampão de bloqueio (PBS com 0,2% de Triton X-100 e soro de burro a 2,5%) durante 3 horas à temperatura ambiente. Após lavagem em PBS Tween 0,05%, quatro vezes durante 10 minutos, as seções foram incubadas com anticorpo secundário (Alexa 546 Fluor® burro IgG anti-coelho (H + L), anticorpo, Life technologies, lote: 1504518) diluído 1: 200 em PBS com 0,2% de Triton X-100 e 2,5% de soro de burro, durante 2 horas à temperatura ambiente. As lâminas foram em seguida lavadas quatro vezes durante 10 minutos em 0,05% de Tween PBS seguido de uma lavagem final com dH20. Depois de retirar o excesso de líquido, as lâminas foram montadas com meios de montagem fluorescentes contendo DAPI (Vectashield, Vetor Laboratories Ltd., Peterborough, Reino Unido) para corar os núcleos das células.
[00165] Para bioimagem, os cortes foram analisados sob um microscópio vertical Olympus BX51 usando objetivos x4, x10, x20 Plano Fin e capturado usando uma câmera CoolSnap ES (FOTOMETRIAS, Tucson, AZ) através MetaVue Software (Molecular Devices Ltd. Wokingham, UK). As imagens foram tomadas no âmbito de conjuntos de filtros de passagem específicos e imagens combinadas de cores foram usadas para processamento adicional usando ImageJ.
Gravações de matriz multieletrodo
[00166] As gravações de matriz de multieletrodos foram realizadas em camundongos RD1tratados com opsina de bastonete (n = 6) e controles injetados GFP RD1 (n = 2). Os olhos foram enucleados e colocados em uma placa de petri cheia com (/5% de C02 a 95% de C02) aCSF carboxigenado (fluido cérebro-espinhal artificial, a concentração em RTIM: 118 NaCl, 25 NaHC03, 1 NaH2P04, 3 de KCl, 1 MgCl2, 2 CaCI2, 10 C6H1206, 0,5 L-Glutamina). As retinas foram então cuidadosamente isoladas na luz vermelha difusa sob um microscópio de dissecação e montadas, de células ganglionares para baixo, para uma matriz multieletrodo 60 de canal ou canal 256 (Canal Sistemas Multi, Reutlingen, Alemanha). Os explantes de retina foram acoplados no lugar com uma membrana de diálise ponderada, e continuamente perfundidos com aCSF carboxigenado a 2,2 ml por minuto utilizando uma bomba peristáltica (SCI400, Watson Marlow, RU), e mantida a 32 ° C por meio de um controlador de regulação Universal Serial Bus de um aquecedor embutido para o ingresso de aCSF. Os estímulos de luz (luz branca) foram apresentados por uma fonte motor de luz personalizada (Lumencor, EUA). LEDs de intensidade mais brilhantes eram de @ 15 Log fótons/cm2/s. Um cartão de National Instruments (USB-6229) controlado por programas escritos em LabVIEW (Versão 8.6, National Instruments, TX, EUA) foi utilizado para controlar a duração do estímulo e a intensidade alterando o LED de saída e ajustando a roda de filtros contendo os filtros de densidade neutra (Research Cairn Ltd). Os estímulos foram entregues em 2 segundos pulsos de luz com intervalos interestímulos de 20s por 20-30 repetições em NDO (15 fótons Entrar/cm2/s) para ND4. Os dados foram amostrados a 25 kHz durante a aquisição de tanto a atividade espontânea quanto evocada e gravado para armazenamento off-line usando Offline Sorter (Plexon). Depois de remover os artefatos claros comuns a todos os canais, principais análises de componentes foram usadas para distinguir unidades individuais, identificados como grupos distintos de picos dentro do espaço principal componente, com um período refratário claro na distribuição de intervalo interponto. Os dados da unidade únicos, classificados no ponto foram, então, analisados utilizando Neuroexplorer (Nex Technologies) e MATLAB R2010a (The Mathworks Inc.).
Pupilometria:
[00167] O reflexo pupilar de luz (DCP) foi medido nos camundongos de tipo selvagem (6), os camundongos RD1-CAG-GFP (n = 16), camundongos RD1-CAG-hRho (n = 10) e RD1-grm6-hRho (n = 6) em seis a oito semanas depois das injeções. Os camundongos foram adaptados ao escuro para 1 hora antes das gravações. Os estímulos luminosos foram fornecidos por uma lâmpada de halogênio de quartzo e foram transmitidos ao longo de um feixe de fibras ópticas a uma esfera reflexiva de integração, que forneceu luz uniforme na córnea do camundongo. PLR Consensual foi gravado em camundongos não anestesiados, levemente no pescoço, em condições infravermelhos com uma câmera CCD infravermelho sensível equipada com lente 10x macro e um filtro infravermelho. Um obturador de intervenção controlou o estímulo temporização. Um único julgamento durou 20 segundos: 5 segundos com luz apagada, 10 segundos com luz acesa, 5 segundos com a luz apagada. A intensidade da luz foi controlada por meio da densidade neutra (ND) os filtros e os camundongos foram sujeitos a uma exposição de luz branca através de uma série de intensidade crescente, com ensaios individuais separadas por, pelo menos, 5 minutos. valores de emissão de fótons para NDS no log fótons/cm2/s variou de 15,85 a NDO para 10,85 em ND5. As respostas pupilares foram quantificadas a partir das imagens de vídeo, usando Dub virtual e software ImageJ e os dados foram normalizados para a área da pupila imediatamente anterior ao aparecimento de luz.
Eletrofisiologia In vivo:
[00168] A eletrofisiologia in vivo foi realizada em camundongos de tipo selvagem (n = 2), os camundongos RD1-CAG-hRho (n = 7) e RD1- grm6-hRho (n = 5). Seis semanas após as injeções e após a medição de PLR, os camundongos foram anestesiados com uretano (injeção intraperitoneal de 1,7 g/kg; 30% w/v; Sigma Aldrich, Poole, Reino Unido). Os animais foram mantidos em uma estrutura estereotáxica (SR-15M; Narishige International Ltd, Londres, UK) e a temperatura corporal foi mantida a 37 ° C por meio de um tapete de calor homeotérmica (Harvard Apparatus, Edenbridge, Reino Unido). As pupilas foram dilatadas com atropina e óleo mineral (Sigma Aldrich) foi aplicado a reter a umidade da córnea. Uma pequena craniotomia e durotomia (~ 1 mm2) foram realizadas diretamente acima de cada núcleo geniculado lateral (LGN) usando coordenadas estereotáxicas de acordo com atlas do camundongo (Paxinos e Franklin, 2001; centro do furo = bregma: -2,46 mm; linha média: -2,8). Um eletrodo de 32 canais (NeuroNexus Technologies Inc., Ml, EUA) foi introduzida para cada LGN no centro do orifício (bastonete medial: -2,5 mm em relação à linha média; profundidade: -2,6 mm relativamente à superfície do cérebro em ângulo de 18 graus) para a gravação simultânea de ambos os LGNs. Os camundongos foram deixados por 30min antes da gravação, para adaptarem-se ao escuro e permitir que a atividade neuronal viesse a estabilizar após a inserção do eletrodo. Os estímulos visuais foram fornecidos por UV LED (Thorlab Amax: 405 nm) e entregues via fibra óptica para o bastonete de olho feito de propósito firmemente posicionado em cada olho para minimizar qualquer vazamento de luz potencial. Um cartão National Instruments (USB-6229) controlado por programas escritos em LabVIEW (Versão 8.6, National Instruments, TX, EUA) foi utilizado para controlar a duração do estímulo e intensidade alterando o LED de saída e ajustar a roda de filtros contendo a densidade neutra dos filtros (ND) (Cairn Research Ltd). Em intensidade mais brilhante (ND0), os LEDs eram @ 47 W/m2 ou 15,4 log fótons/cm2/s de fluxo eficaz para opsina de bastonete. Os dados foram adquiridos utilizando um sistema Recorder64 (Plexon, TX, EUA) com uma amplificação de sinal por um ganho de 20x headstage AC-acoplado (Plexon, TX), seguido de pré-amplificador de condicionamento proporcionando um ganho total de 3500x. Os dados foram de alta passagem (300Hz) filtrados e as formas de onda neurais com carimbo de tempo foram digitalizadas simultaneamente de todos os canais a uma taxa de 40 kHz. Os dados de multiunidade foram então armazenados para a triagem off-line e análise, como para os dados MEA descritos acima. No mais brilhantes LEDs de intensidade foram ~ 15 fótons log/cm2/s. Os estímulos foram fornecidos de acordo com um protocolo de luz constituída por 2 partes. A Parte 1 incluído os flashes de escuridão: 2s luz acesa, 20s luz apagada com 10s de deslocamento entre cada olho. Este paradigma foi repetido 30x em cada filtro ND variando de mais obtuso (ND3 = 12.4 log fótons/cm2/s) a mais brilhante (ND0 = 15.4 log fótons/cm2/s). Comprimento de maior estímulo também foi usado para as respostas mais prolongadas: 10s ON, 30s OFF com 15s de deslocamento entre cada olho. O paradigma foi repetido 10-20x em ND3 para ND0.
[00169] A Parte 2 do protocolo de luz envolveu o registro à luz adaptado às condições em que etapas de 5 segundos de luzas quais foram aplicadas a um fundo constante de iluminação em contraste Michelson de 96%. Houve um intervalo de 20 segundos de interestímulo e uma compensação entre dois olhos de 10 segundos. Este paradigma foi repetido dez vezes.
[00170] (Parte 2 do protocolo de luz envolveu o registro à luz adaptado às condições onde crescentes contrastes de luz as quais foram aplicadas a um fundo constante de iluminação. Os contrastes Michelson, 33%, 66% e 96% foram aplicados em etapas de 5 segundos, com 20 segundos entre intervalo interestímulo e um deslocamento entre dois olhos de 10 segundos. Este paradigma ciclo foi repetido dez vezes).
[00171] As respostas a um filme naturalista também foi registrada. Para isso, um conjunto separado de camundongos gravações (RD1- CAG-hRho; n = 2 e RD1-grm6-hRho; n = 3) foi obtido a partir de dLGN contralateral ao olho tratado com opsina de bastonete. Um conjunto experimental diferente foi utilizado, envolvendo um projetor dispositivo de espelho digital (DLP ® LightCommanderTM; Logic PD Inc.), a fim de maximizar os comprimentos de onda utilizados e a intensidade do filme. O motor de luz intrínseca do projetor foi substituído por uma fonte de luz LED multiespectral contendo quatro LEDs controlados de forma independente (Amax a 405nm, 455nm, 525nm e 630nm; PhlatLight série PT-120 (Luminus Devices)). Luz dos LEDs foi combinada por uma série de espelhos dicróicos (Thorlabs), e dirigida para o projetor. O filme foi apresentado utilizando Python rodando PsychoPy Versão 1.70.00 software. Ele apresentava camundongos se movendo em torno de uma arena comportamental incluindo o movimento e se aproximando de diferentes objetos de tamanho (subtendem ângulos visuais que variam de 0,5 ° a 36 °) a uma série de orientações, velocidades e contrastes (máximo contraste Michelson = 96%). O filme não tinha diferenças de cor, e as mudanças na irradiância ao longo do tempo foram mínimos (desvio padrão de irradiância = 5,94%). As validações prévias em camundongos selvagens têm demonstrado respostas indetectáveis para apresentações de versões centrais, indicando que a maioria das atividades foi provocada por mudanças nos padrões espaciais e movimento do objeto.
[00172] Os dados foram adquiridos utilizando um sistema Recorder64 (Plexon, TX, EUA) com uma amplificação de sinal por um ganho de 20x headstage AC-acoplado (Plexon, TX), seguido de pré- amplificador de condicionamento proporcionando um ganho total de 3500x. Os dados foram de alta passagem (300 Hz) e as formas de onda neurais estampadas em tempo foram digitalizadas a partir de todos os canais simultaneamente, a uma taxa de 40 kHz, e armazenados para análise off-line.
[00173] Para confirmar a localização dos locais de gravação, o eletrodo de gravação foi mergulhado em corante fluorescente (Cell Rastreador CM-Dil; Invitrogen) antes da inserção no cérebro. Após gravações in-vivo, os cérebros dos camundongos foram removidos e pós-fixados durante a noite em paraformaldeído a 4%, antes da crioprotecção durante 24 horas em 30% de sacarose. As seções coronais de 100μm foram então cortados com um micrótomo, montadas em lâminas de vidro e a tampa deslizado utilizando Vectashield (Vetor Laboratories, Inc.).
Gravações da matriz de multieletrodos (MEA):
[00174] Imediatamente após as gravações de eletrofisiologia in vivo os camundongos foram eutanasiados e enucleados. Os olhos foram colocados em uma placa de petri cheia com aCSF carboxigenado (95%/5% de C02 C02) (fluido cérebro-espinhal artificial, a concentração em mM: 118 NaCl, 25 NaHC03, 1 NaH2P04, 3 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCI2, 10 C6H1206, 0,5 L-Glutamina). Retinas foram, então, cuidadosamente isoladas na luz vermelha difusa sob um microscópio de dissecação e montado, de células ganglionares para baixo, em um conjunto multieletrodo de 60 canais (Canal Sistemas Multi, Reutlingen, Alemanha). Os explantes de retina foram acoplados no lugar com uma membrana de diálise ponderada, e continuamente perfundidos com aCSF carboxigenado em 2,2 mL/minuto utilizando uma bomba peristáltica (SCI400, Watson Marlow, RU), e mantida a 32 ° C por meio de um controlador de temperatura Universal Serie Bus Universal de regulação de aquecedor embutido para o ingresso de aCSF. Os estímulos luminosos foram fornecidos por um motor de luz personalizado (Lumencor, EUA) para apresentar a luz UV (Amax: 405 nm). Os LEDs de intensidade mais brilhantes foram -15 Logfótons/cm2/s. Um cartão National Instruments (USB-6229) controlado por programas escritos em LabVIEW (Versão 8.6, National Instruments, TX, EUA) foi utilizado para controlar a duração do estímulo e intensidade alterando LED de saída e ajustando a roda de filtros contendo os filtros de densidade neutra (Research Cairn Ltd). Os estímulos foram fornecidos de acordo com um protocolo de luz como para os dados in vivo eletrofisiologia descrito acima. Os dados foram amostrados a 25 kHz durante a aquisição de tanto a atividade espontânea quanto evocada e gravados para análise off-line.
Comportamento
[00175] Atualmente, comumente usada, as tarefas de discriminação visual exigem treinamento extensivo, ambientes estressantes, ou são baseadas em reflexos em vez de comportamento orientado objetivo. Para lidar com esses déficits, um campo aberto de método simples, com base de avaliar a visão baseada em comportamento espontâneo tem sido desenvolvido. Usando uma modificação da caixa de luz/escuridão (dimensões: comprimento = 40 centímetros largura = 40 centímetros e altura = 30 centímetros, a parte superior aberta) os camundongos foram autorizados a livre circulação entre as duas arenas iguais (metades leste e oeste) através de uma abertura na parede de separação. A caixa era feita de perspex vidro e suas paredes foram pintadas de branco, exceto para os dois lados longos de cada arena, que foram mantidas limpas. Duas lâmpadas de infravermelho idênticas foram colocadas centralmente por cima de cada arena, para permitir a visualização sob condições de escuridão.
[00176] Os estímulos visuais foram exibidos a partir de dois monitores de computador de tela plana de 43 cm (17 polegadas), de frente para paredes claras de cada arena, usando um adaptador multimonitor externo DualHead2Go Digital Edition (Matrox Graphics Inc.). Isto permitiu a ambos os estímulos de teste e de controle a serem mostrados em monitores separados, ao mesmo tempo. Uma variedade de estímulos visuais foi exibida, incluindo uma luz campo completo uniforme (preto, cinza e branco), cintilação de campo completo e um filme naturalista. Estes estímulos foram criados utilizando um programa escrito personalizado que permitiu a formação de dois estímulos diferentes em duas janelas diferentes ao mesmo tempo, mantendo ao mesmo tempo a capacidade de operar tanto individualmente. O programa permitiu que os valores dos componentes dos estímulos branco (255), preto (0) e cinza (128) viesse a ser alterados para atingir níveis de brilho e contraste desejados.
[00177] As experiências comportamentais foram realizados em camundongos de tipo selvagem (5), os camundongos RD1-CAG-GFP (n = 6), os camundongos RD1-CAG-hRho (n = 6) e RD1-grm6-hRho (n = 5). Antes do período experimental, os camundongos foram manipulados e habituaram-se ao seu novo ambiente durante 5 dias, à mesma hora do dia, do modo seguinte: Os animais foram levados para a sala de ensaio nas suas gaiolas, colocados na caixa experimental e deixados mover-se livremente com as suas crias da mesma ninhada durante 30 minutos.
[00178] Após o período de habituação, foram conduzidas experiências de comportamento ao longo de várias semanas em uma sala completamente escura, ao mesmo tempo em cada dia. Cada grupo de camundongos foi deixado a ser submetido a uma condição de teste por dia. Em cada dia de teste, os camundongos foram introduzidos no local de ensaio nas suas gaiolas, deixados acomodaram-se às condições da sala de testes durante 30 minutos e, em seguida, cada camundongo foi testado individualmente. Os camundongos foram colocados na caixa de campo aberto (aleatoriamente para leste ou metade oeste) e autorizados a circular livremente entre as duas arenas. Todos os ensaios de teste foram gravados em condições infravermelhos através de uma câmara de vídeo equipado com um filtro infravermelho (A = 665 nm). A caixa foi totalmente limpa com etanol a 70% depois de cada ensaio de teste e deixada secar ao ar antes do próximo camundongo foi colocado na caixa.
[00179] Um ensaio de gravação começou após 3 minutos de habituação. Cada período experimental consistiu em 5 minutos de estímulo controle, após o que um estímulo teste foi apresentado em uma tela de frente para uma arena que continha um camundongo neste ponto do tempo. Para experiências de adaptação ao escuro, o controle de estímulo consistiu em 5 minutos no escuro (telas ligado escuro; radiância = 0,004072 WSR "1m" 2, irradiância = 0,00132 W/m2), seguido por 5 minutos na tela branca luz (radiância = 0,06526 WSR '2, irradiância = 0,116 W/m2) e, em seguida, um minuto de volta no escuro. Para luz adaptada experimentos, o controle de estímulo consistiu em 5 minutos em luz tela cinza uniforme (tela cinza; radiância = 0,03342 WSR '2, irradiância = 0,0663 W/m2), seguido de 5 minutos de cintilação de campo completo (tela de cintilação; radiância = 0.03342 WSR "1M" 2, irradiância = 0,0663 W/m2) seguido por 1 minuto na luz uniforme. Para as experiências de sensibilidade ao contraste, as saídas de tela foram ajustados para permitir testes de diferentes contrastes entre 2 arenas (Michelson contrasta: 100%, 68,6%, 37,3%, 13,7% e 0% de contraste). Para o experimento do filme naturalista, o controle de estímulo consistiu em 5 minutos de luz uniforme cinza, seguido por 1 minuto de apresentação do filme e um minuto de volta para a condição de controle. O (cor) filme contou com uma coruja que se aproximava.
[00180] Os ensaios gravados foram armazenados para análise off line usando um dispositivo de software de monitoramento de vídeo (EthoVision® XT 10,1 Noldus, Tracksys Ltd., UK). Foram analisadas a distância percorrida por cada camundongo em toda a caixa e emitidos os resultados em 30 caixas de segundo. A capacidade do camundongo para ver o estímulo visual foi avaliada como uma alteração na atividade locomotora durante um período de transição de 1 minuto a partir de um controle para o estímulo de ensaio (isto é, analisou-se a distância percorrida nos 30 sob a condição de controle imediatamente antes do estímulo de ensaio, e a distância percorrida em 30 apenas após o estímulo de ensaio). Duas vias teste de t emparelhado foram utilizadas para comparação no mesmo grupo de camundongos antes e depois de um teste de apresentação de estímulo, durante um período de transição de 1 minuto.
[00181] Em resumo, a introdução de rodopsina humana nas células da retina interna dos camundongos que eram cegos de uma degeneração da retina grave e perda de bastonetes e cones fotorreceptores resultou na restauração da visão como evidenciado por meio de uma restauração nas respostas das pupilas e as respostas visuais no cérebro (núcleo geniculado lateral) e retina.
Discussão
[00182] Neste estudo, foi demonstrado que a expressão de opsina de bastonete humano pode conferir sensibilidade à luz para retinas cegas através de um código visual diversificado envolvendo as vias ON, OFF, transitórias e sustentadas. As respostas visuais robustas foram observadas in vitro e in vivo sob intensidades de luz equivalentes de cone visão endógena/PR e foram capazes de conduzir funções do circuito da retina sofisticados, tais como detecção de contraste. Os camundongos cegos tratados apresentaram atividade locomotora induzida pela luz restaurada sob iluminação típica de ambientes interiores naturais e foram capazes de resolver baixa cintilação de frequência em condições de luz adaptadas. Além disso, com o tratamento de opsina de bastonete alvo, o camundongo detectou contrastes mais baixos, foram capazes de resolver maior frequência de campo completo de cintilação e detectou as cenas de filmes naturalistas.
[00183] Introdução de canais de opsina microbiana e bombas e fototrocas químicas para sobreviver os neurônios da retina pode restaurar a sensibilidade à luz. Na presente invenção, a terapia gênica pode ser utilizada para entregar opsina de bastonete humano para camundongos cegos. No entanto, um dos principais desafios na terapia optogenética está em atingir o nível estável e eficaz da expressão de opsina na retina por meio de um método de entrega clinicamente relevante. Os métodos de entrega virais atuais requerem injeções sub- retiniana invasivas, onde a transdução é limitada a uma pequena porção da retina no local da injeção. Mais transdução global pode ser conseguida por injeção para dentro do vítreo, uma técnica muito mais segura do que é normalmente utilizado na prática oftálmica rotina. No entanto, as barreiras físicas criadas pela matriz extracelular de células da retina limitam a transdução viral deste percurso. Vários novos vetores de AAV mutantes surgiram (4YF e 7M8), com capacidade de penetrar mais profundamente no tecido da retina, mas atualmente exigem muito altos títulos virais (1014), com elevado potencial de imunogenicidade e fora efeitos alvo. Na presente abordagem, a entrega intravítrea de vetor AAV2 foi utilizada, o que já foi demonstrado ser seguro em ensaios clínicos. Além disso, foi identificada uma combinação das enzimas de segmentação das proteínas da matriz extracelular que rompem as barreiras físicas para as partículas virais que atinge a retina a partir do vítreo. A coinjeção de estas enzimas aumenta grandemente o número e espacial propagação de neurônios infectadas pelo vírus.
[00184] Na retina intacta de mamífero opsina de bastonete é normalmente encontrada em bastonetes fotorreceptores especializados. Ela pertence a uma família de uma proteína G de receptores acoplados (GPCRs) que funciona por meio de sinalização em cascata intermediária. Em fotoativação, opsina de bastonete acopla- se para transducina (gt; um membro de Gi/o da subfamília). Para a transdução de sinal visual (Palczewski, KG Annu Rev. Biochem (2006) 75, 743-767 in vivo, levando a um aumento nas correntes K +, hiperpolarização da membrana e inibição da liberação de neurotransmissores. Um sinal de inversão sinapse entre fotorreceptores e as suas segundas ordens de neurônios, células bipolares, converte esta resposta inibitória em sinal elétrico positivo que é transmitida através das células ganglionares para o cérebro para percepções visuais.
[00185] Os canais opsina (CDH) e bombas (HaloR) foram funcionalmente expressos em retina cego conduzindo à despolarização e hiperpolarização respectivamente. Além disso, a opsina de bastonete de vertebrados, foi expressa em cultura de células e in vivo fora da retina (células de Purkinje do cerebelo) e foi demonstrado que inibe a excitabilidade neuronal, quando ativada pela luz (Li X, et al Proc Natl Acad Sci US A. dez 2005 6; 102 (49):. 17816-21; Gutierrez DV, et al J Biol Chem 201 01 julho 22; 286 (29): 25848-58). No entanto, foi agora conhecido que um GPCR como opsina de bastonete seria capaz de funcionar fora dos fotorreceptores nativos quando expressas diretamente em segunda ou terceira ordem de neurônios (CGR) e exercem a sua ação inibitória para a produção de sinal visual. Foi fundamentado que, em retinas cegas, dissociados da entrada normal de fotorreceptores, há um aumento global da atividade basal de sobrevivência dos neurônios de saída e que a opsina de bastonete poderia agir para suprimir esta 'hiperativação' e melhorar a relação sinal- ruído, a fim de apoiar a discriminação visual.
[00186] Na presente invenção, mostra-se que a opsina de bastonete ectópica pode expressar nas células da retina interna e funciona fora dos fotorreceptores nativos. Na verdade, como previsto, observou-se que as respostas inibitórias OFF in vivo (disparando a diminuição das taxas de luz na estimulação) em ambos tratamentos de opsina de bastonete alvo (35,7% de todas as respostas claras) e não alvo (10,8%). Estes não são normalmente vistos com respostas ON e os presentes inventores também não observaram tais respostas nas presentes preparações in vitro. No entanto, surpreendentemente, muitas 'respostas ON’ positivas foram encontradas tanto in vitro quanto in vivo. Na verdade, um conjunto diversificado de respostas foram encontrados com tratamentos tanto irrelevantes quanto orientados, incluindo as respostas ON sustentadas, ON transitórias, e OFF excitatórias (disparando a taxa de aumento com a luz apagada), bem como in vivo sinais inibidores OFF. Além disso, um pequeno número de respostas on-off in vivo foram observadas com o tratamento não alvo. Isto sugere que a opsina de bastonete pode modular o comportamento das células, tanto a hiperporalização despolarizante quanto leve de forma dependente. Isto sugere que a expressão da opsina de bastonete em células bipolares EM é forte o suficiente para conduzir pós-sinápticos de neurônios de terceira ordem e estimular laços inibitórios amácrinos (todas as células), levando à ativação de células bipolares OFF e, portanto, a inibição dupla ou excitatória sobre as respostas.
[00187] Em sistemas intactos, a informação visual é processada através de duas vias paralelas, na via ON e OFF. Na via ON, as células respondem a incrementos de luz, enquanto que as vias OFF respondem aos decréscimos de luz. A presente restauração das vias ON e OFF em retinas cegas é em apoio a outros estudos que anteriormente especificamente tiveram como alvo ChR e LiGluR às células ON-BP. No entanto, estudos anteriores usando promotores ubíquos (Lin B, et al Proc Natl Acad Sci US A. 2008 14 de outubro; 105 (41): 16009-14) ou visando especificamente RGC somente, relataram sinais eletrofisiologicamente mais uniformes (por exemplo, sustentada ON com melanopsina ectópica) e nenhuma restauração simultânea de ambas as vias ON e OFF (CHR em RGC dirigiu apenas em vias, enquanto HaloR no RGC única via OFF). É possível a expressão em RGCs só que não era forte o suficiente para ativar diretamente o excitatório normal e entradas inibitórios para as células. Além disso, neste caso, mesmo com o tratamento não segmentado, verificou-se que a expressão em células de opsina de bastonete INL (células BP susceptíveis), o que poderia explicar a ativação secundária dos Todos os loops e disseção de respostas em ambos os sinais inibitórios e excitatórios.
[00188] Uma das principais vantagens de usar opsina de bastonete como uma ferramenta optogenética para restaurar a visão reside na sua simplicidade de fornecer fotorrecepção autocontida com a sua capacidade de usar cromóforo endógeno (ou cis-retiniana retinaldeído) como a fototroca natural. No entanto, para as respostas visuais, opsina de bastonete requer constante reciclagem da retina, o qual é normalmente branqueada pela luz. Esta reciclagem é pensada ser dependente do contato íntimo entre os bastonetes e o RPE. Com efeito, de acordo com estudos anteriores (Li X, et al Proc Natl Acad Sci US A. 06 de dezembro 2005; 102 (49): 17816-21; Gutierrez DV, et al J Biol Chem 2011 22 jul; 286 (29).: 25848-58), verificou-se que branqueadores in vitro de opsina de bastonete prontamente após a estimulação pela luz e requerem constante fornecimento exógeno de cromóforo (9-cis- retinal), a fim de sustentar as respostas dependentes de luz. No entanto, in vivo, não foi encontrado que o branqueamento é um problema significativo. É importante ressaltar que muitas respostas leves foram robustas e repetíveis ao longo de vários ensaios. Portanto, é provável que a retina degenerando fornece uma boa fonte endógena de retina, e na ausência de fotorreceptores que normalmente o levaria para cima, a opsina de bastonete em células da retina interna tem acesso à reciclagem cromóforo pela RPE ou células Muller para produzir respostas visuais.
[00189] Outro aspecto importante da terapia vara de opsina é a sua capacidade para funcionar sob condições de luz fisiológicas, ao contrário de estratégias atuais baseadas em opsinas microbianas e fototrocas sintéticas que requerem extremamente altas intensidades de luz para ativação. Verificou-se que ON e OFF, os tipos de células transitórias e sustentadas funcionam in vivo sob uma gama dinâmica de intensidades luminosas testadas (1013-1015 fótons/cm2/s) que caem sob uma gama de sensibilidade cone endógeno. Anteriormente relatados estudos utilizaram intensidades de luz muito mais elevadas para ativação: LiGluR> 1.7x1017 fótons/cm2/s (Gaub BM, et al 2014, Proc Natl Acad Sci US A. 2014 23 de dezembro; 1 11 (51): E5574-83), ChR> 3x1015 - 1017 fótons/cm2/s (. Lagali PS, et al 2008, Nat Neurosci junho 2008; 1 1 (6): 667-75;) HaloR em RGCs> 5.1x1018 fótons /cm2/s (Zhang Y, et al. J Neurosci 2009 Jul 22; 29 (29): 9186-96) e HaloR no cone de segmentos internos > 1016 fótons/cm2/s (Busskamp V, et al 2010, Science 2010 23 Jul; 329 (5990.): 413- 7.). A sensibilidade é um fator de mecanismos intracelular e os presentes dados sugerem que a opsina de bastonete pode funcionar através da cascata amplificação GPCR de luz sob intensidades de luz fraca. Isto está em contraste com os canais de íons microbianos (CHR2), bombas (HaloR) ou (fototrocas LiGluR), que são incapazes de amplificar sinais ao nível da proteína.
[00190] A caracterização adicional da cinética da resposta restaurada in vivo mostrou que o início, offset e a duração da resposta à luz variou entre tipos de células não alvo para ambas as abordagens e orientadas. Verificou-se que as respostas de latências variadas; alguns estudos rápidos alguns mais lentos consistentes com anteriores (Caporale N, et al 201 1, Mol Ther Jul 2011; 19 (7): 1212-9.; Gaub BM, et al 2014, Proc Natl Acad Sci US A. 2014 23 de dezembro; 111 (51): E5574-83). O interruptor de luz de opsina de bastonete é intrinsecamente rápido e as respostas mais lentas de luz podem ser um efeito da dinâmica da cascata de sinalização intracelular e depende do tipo de célula nativa expressando a opsina de bastonete. Além disso, o início de resposta mais lento é provável que seja devido à entrada de luz não saturante e menor nível de expressão de opsina de bastonete em algumas células. (Algumas respostas de opsina de bastonete rápidas podem ser através de cinética rápida da cascata de receptor mGluR6 nativo em células ON BP).
[00191] O olho humano é sensível sobre uma ampla gama de intensidades de luz a partir da visão escotópica (noite) a fotópica (dia). Esta sensibilidade pode ser medida pela intensidade limiar mínima necessária para evocar visão. Um dos aspectos importantes da nossa visão é a rapidez com que o olho recupera a sua sensibilidade no escuro após exposições de luz intensa (adaptação ao escuro) ou mais importante a rapidez com que ele se adapta a iluminação de fundo para ser capaz de discriminar objetos neste fundo (adaptação de luz). Até agora, a maioria dos estudos optogenéticos estudaram estímulos visuais simples que envolvem etapas de luz da escuridão. Isto é bastante um cenário não natural e no mundo real, os objetos têm contraste, que é constante e independente da iluminação do ambiente. Por conseguinte, foi questionado se a opsina de bastonete ectópica poderia trabalhar sob luz condições adaptadas e conservar o código visual restaurado contra as mudanças na irradiância. Com efeito, as respostas dLGN robustas foram encontradas após apresentações de luz de teste de incremento de estímulo contra a iluminação de fundo. (É possível que a segregação robusta observada em vias ON e OFF é capaz de facilitar esta adaptação à luz e aumentar a sensibilidade ao contraste).
[00192] Ambas as expressões não alvo e alvo foi investigada. Em primeiro lugar, uma abordagem não alvo não seletivo com o promotor forte pan-neuronal, CAG foi usado para entregar genes através da sobrevivência retina interna. Não se sabia que os neurônios, caso presente, expressariam opsina de bastonete e se expressaria em um tipo específico de neurônio mais que o outro ou teriam preferência para a via ON ou OFF ou alvo tanto de forma igual. Esperava-se que o desequilíbrio na expressão entre as vias ON e OFF significaria que, apesar de alguns sinais que se anulam mutuamente, haveria um aumento global da informação visual transmitida ao cérebro. A vantagem desta abordagem também significa que as células ganglionares da retina, que sobrevivem mais tempo (Mazzoni F,) J Neurosci 28 (52): 14282-14292), são também visadas e esta abordagem podendo ser utilizadas na degeneração tardia, onde as células bipolares tornam-se comprometida (Cronin). Em segundo lugar, testou-se se restringindo a expressão de apenas a via "ON" a qual iria conduzir a uma melhoria no sinal visual tanto electrofisiologicamente e comportamentalmente. Opsina de bastonete foi especificamente alvejado a retina em células bipolares, utilizando um promotor mínimo específico de células Grm6 (Masu M et al., Cell 1995).
[00193] Observou-se similaridade eletrofisiológica marcante entre os tratamentos não alvo e alvo de opsina de bastonete. O código recuperado foi igualmente complexo e diversificado. A cinética de resposta, a sensibilidade e a resposta contraste foram semelhantes para os dois tratamentos. Curiosamente, o tratamento alvo levou a respostas mais OFF (basicamente de inibidor).
[00194] No entanto, houve diferenças importantes comportamentalmente. Em primeiro lugar, foram observadas as diferenças na restauração da função visual simples, PLR. A opsina de bastonete não seletivamente expressa a unidade restaurada para a via RGC mediação da PLR para o nível WT próximo. Isto é consistente com melanopsina e LiGluR de primeira geração em RGC, que levam a quase completa (Lin B, Proc Natl Acad Sci US A. 14 de outubro 2008; 105 (41): 16009-14.) Ou parcial (Caporale N, et al. 2011, Mol Ther 2011 julho; 19 (7): 1212-9;) restauração da PLR. Curiosamente, quando a expressão foi restringida às células ON-BP esta via permaneceu em grande parte prejudicada. É possível que a expressão não alvo de opsina de bastonete diretamente ativado ipRGCs (acoplamento à cascata Gs/Gq), levando à estimulação, enquanto a expressão seletiva em células ON- BP ultrapassou rapidamente a ativação direta da via e recuperação desse reflexo não visual.
[00195] E sobre a formação de imagem de caminhos? Pode este código visual que os presentes inventores criaram ser usado para melhorar a visão de formação de imagem com níveis de luz fisiológica? Uma das vantagens de que vise especificamente a neurônios da retina mais distais seria preservar as respostas restauradas do processamento da retina interna, aperfeiçoada em sinais mais coerentes e alcançando uma melhor qualidade de visão. Até agora, os estudos têm abordado tarefas visuais simples optogenéticas que envolvem a discriminação claro-escuro e nenhum informou se o sistema poderia controlar as alterações de encontro a uma iluminação de fundo ou em resposta a cenas naturalistas. Verificou-se que as respostas in vivo restauradas poderiam apoiar a discriminação claro-escuro simples com ambos os tratamentos sob iluminação equivalente de iluminação interna. Além disso, os camundongos tratados com o tratamento não alvo e alvo de opsina de bastonete poderia resolver a cintilação completa à luz gravada em 2Hz contra o fundo uniforme de iluminação. Além disso, verificou-se que os camundongos com o tratamento alvo resolveram maior frequência de cintilação incluindo 4 Hz e 10 Hz contra o fundo uniforme de iluminação. Além disso, os camundongos com expressão específica da opsina de bastonete em células ONBP foram capazes de detectar 4 Hz de cintilação em um nível de contraste mais baixo contra a luz de fundo (contraste Michelson 66,7%).
[00196] Os seres humanos se destacam em processamento de cenas visuais naturais. Apesar de constante mudança das cenas visuais nosso cérebro é capaz de transforma padrões complexos de luz que incide na nossa retina, e extrair informações relevantes para uma percepção coerente dentro de algumas centenas de milissegundos. Com potencial translacional em mente, ele foi questionado se ectópica opsina de bastonete poderia conduzir aos sinais robustos o suficiente para preservar muitos níveis de processamento visual, criando um código visual que os camundongos poderiam usar para acompanhar as modulações espaço-temporais naturais na intensidade da luz em níveis típicos de iluminação interior. Eletrofisiologicamente, com ambos os tratamentos, foi estabelecido identificar neurônios individuais que podem rastrear as alterações nos níveis de luz no espaço e no tempo que ocorrem em cenas de filmes naturais. Isto sugere que o sistema visual (com sua plasticidade) é capaz de explorar as respostas restaurados temporal e espacialmente agrupados transportando simples informações sobre sinais e contraste ON e OFF a fim de processar cenas naturais reais. Além disso, os presentes inventores descobriam que os camundongos após o tratamento opsina de bastonete alvo aumentaram seu comportamento locomotor em resposta a cenas de filmes naturais. Isto sugere que a qualidade da visão perceptual é melhorada com alvo comparado ao tratamento irrelevante talvez devido à convergência de sinal mais coerente a partir de células bipolares para RGCs necessários para uma mais complexa discriminação temporo-espacial.
[00197] Em resumo, os resultados mostram que a opsina de bastonete humana em neurônios sobreviventes interiores da retina é uma estratégia promissora para restaurar a visão na degeneração da retina devido a perda de fotorreceptores e estágios avançados reversos de cegueira. Como uma proteína humana que oferece vantagens sobre terapias baseadas microbianas atuais em termos de preocupações éticas e de segurança. Ele fornece uma estratégia fotorreceptora autocontida, que amplifica o sinal por meio de cascata intracelular e é capaz de conferir sensibilidade melhorada em comparação com as estratégias atuais optogenéticas. Quando ectopicamente expressa em neurônios da retina interna, ele gera um código visual diversificado baseado em ambas as respostas ON e OFF capazes de controlar as alterações em intensidades de luz mais de iluminação de fundo e, em cenas de filmes naturais. Comportamentalmente, os camundongos cegos tratados são capazes de discriminar luz e sombra e pode resolver cintilação de campo completo de luz de 2Hz adequada em condições de iluminação típica da iluminação do ambiente interior. Além disso, restringir a expressão para ONBP células, levou a melhorias em percepções visuais in vivo e os camundongos tratados eram capazes de resolver cintilações de frequência mais alta, detectando contraste menor e resolvendo as cenas naturais.

Claims (20)

1. Composição terapêutica, caracterizada pelo fato de que compreende i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma rodopsina ou fotopsina humana compreendendo o gene da rodopsina (RHO) de SEQ ID NO: 1 (GenBank: BC111451.3), SEQ ID NO: 2 (Acesso NM_000539, Versão NM_000539.3 GI: 169808383), opsina 1 de cone de Homo sapiens, gene OPN1LW sensível ao comprimento de onda longo de SEQ ID NO: 3 (Sequência de Referência NCBI: Acesso: NM_020061, Versão NM_020061.5), ou opsina 1 de cone de Homo sapiens sensível ao comprimento de onda médio OPN1MW de SEQ ID NO 4, (Sequência de Referência NCBI: Acesso: NM_000513, Versão NM_000513.2, ou opsina 1 de cone de Homo sapiens, NM_001708 sensível ao comprimento de onda curto (OPN1SW) de SEQ ID NO: 5 (versão NM_001708.2, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a mesma sequência de aminoácidos, ii) uma enzima de degradação da matriz extracelular, e iii) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
2. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma rodopsina ou fotopsina humana compreendendo o gene da rodopsina (RHO) de SEQ ID NO: 1 (GenBank: BC111451.3), SEQ ID NO: 2 (Acesso NM_000539, Versão NM_000539.3 GI: 169808383), opsina 1 de cone de Homo sapiens, gene OPN1LW sensível ao comprimento de onda longo de SEQ ID NO: 3 (Sequência de Referência NCBI: Acesso: NM_020061, Versão NM_020061.5), ou opsina 1 de cone de Homo sapiens sensível ao comprimento de onda médio OPN1MW de SEQ ID NO 4, (Sequência de Referência NCBI: Acesso: NM_000513, Versão NM_000513.2, ou opsina 1 de cone de Homo sapiens, NM_001708 sensível ao comprimento de onda curto (OPN1SW) de SEQ ID NO: 5 (versão NM_001708.2, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a mesma sequência de aminoácidos, ii) uma enzima de degradação da matriz extracelular, e iii) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
3. Kit, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda instruções para utilização, um regime de dosagem, uma ou mais agulhas finas, uma ou mais seringas, e solvente.
4. Composição ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado(a) pelo fato de que uma célula é bastonete, um cone, uma célula bipolar ON, uma célula bipolar OFF, uma célula horizontal, uma célula ganglionar e/ou uma célula amácrina.
5. Composição ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado(a) pelo fato de que uma enzima é capaz de degradar uma ou mais proteínas da matriz extracelular ou carboidratos e é selecionada a partir do grupo que consiste em um proteoglicano (com diferentes classes de cadeias de glicosaminoglicanos (GAG) tais como proteoglicanos de heparan sulfato (HSPGs), proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG), e proteoglicanos de dermatan sulfato (DSPGs); hialuronano, um colágeno tal como o colágeno do tipo IV na lâmina limitante interna; uma laminina; e nidogênio 1 e 2.
6. Composição ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado(a) pelo fato de que uma enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em uma colagenase, hialuronano liase, heparinase I, heparinase II, heparinase III, condroitina ABC liase, condroitina AC liase, uma metaloproteinase, uma ADAMTS, uma plasmina (serino protease plasmina ou a sua forma truncada microplasmina (Ocriplasmina)), elastase de neutrófilos e catepsina G, neuraminidase, N-glicanase, O-glicanase e pronase.
7. Composição ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado(a) pelo fato de que uma enzima compreende uma combinação de hialuronano liase e heparinase III.
8. Composição ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado(a) pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica uma rodopsina humana é fornecida como um vetor, preferencialmente um vetor viral, preferencialmente um vetor de AAV, preferencialmente um vetor do sorotipo 2 ou um vetor de AAV modificado, por exemplo, AAV 4YF ou AAV 7M8.
9. Composição ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado(a) pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica uma rodopsina ou fotopsina humana é fornecida em um vetor, preferencialmente um vetor viral, preferencialmente um vetor de AAV, preferencialmente um vetor do sorotipo 2 ou um vetor de AAV modificado, por exemplo, AAV 4YF ou AAV 7m8.
10. Uso de um vetor de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma rodopsina ou fotopsina humana compreendendo o gene da rodopsina (RHO) de SEQ ID NO: 1 (GenBank: BC111451.3), SEQ ID NO: 2 (Acesso NM_000539, Versão NM_000539.3 GI: 169808383), opsina 1 de cone de Homo sapiens, gene OPN1LW sensível ao comprimento de onda longo de SEQ ID NO: 3 (Sequência de Referência NCBI: Acesso: NM_020061, Versão NM_020061.5), ou opsina 1 de cone de Homo sapiens sensível ao comprimento de onda médio OPN1MW de SEQ ID NO 4, (Sequência de Referência NCBI: Acesso: NM_000513, Versão NM_000513.2, ou opsina 1 de cone de Homo sapiens, NM_001708 sensível ao comprimento de onda curto (OPN1SW) de SEQ ID NO: 5 (versão NM_001708.2, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a mesma sequência de aminoácidos, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de uma composição terapêutica para fornecer a função de fotorreceptor a uma célula da retina interna, em que o vetor compreende um promotor que dirige a expressão em células internas da retina e em que as células internas da retina compreendem células bipolares ON ou células bipolares OFF.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a composição é um líquido injetável.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução de uma sequência de ácido nucleico por meio de injeção, preferencialmente uma injeção intraocular, preferencialmente, uma injeção sub-retiniana ou intravítrea.
13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico está sob o controle de um promotor ubíquo ou um promotor que dirige a expressão para as células da retina interna.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o promotor é específico para a expressão em células bipolares ON ou OFF.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o promotor é selecionado a partir do grupo que consiste em L7, Thy-1, recoverina, calbindina, GAD-67, Grm6, e potenciador Grm6 de proteína de fusão SV40; preferencialmente, o promotor é um promotor específico de células Grm6-SV40 para direcionamento seletivo de células bipolares ON.
16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende aumentar ou restaurar a função de fotorreceptor de uma retina, restaurar a visão a um indivíduo, e/ou o tratamento de uma doença degenerativa ou condição da retina.
17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a doença degenerativa da retina é selecionada a partir do grupo que consiste em distrofia da retina incluindo uma distrofia de bastonete, uma distrofia de bastonete-cone, uma distrofia de cone-bastonete, uma distrofia de cone e uma distrofia macular; uma outra forma de degeneração da retina ou macular, uma condição isquêmica, uveíte, edema, e qualquer outra doença resultante de perda de capacidade do fotorreceptor.
18. Uso, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de dilatar a pupila de um olho a ser tratado, por exemplo, por meio da aplicação de um agente midriático, tal como tropicamida e/ou fenilefrina.
19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que o método compreende monitorar a visão de um indivíduo que tenha sido tratado para qualquer melhoria na visão.
20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 19, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fotossensível é fornecida em um vetor, preferencialmente um vetor viral, preferencialmente um vetor de AAV, preferencialmente um vetor do sorotipo 2 ou um vetor de AAV modificado, por exemplo, AAV 4YF ou AAV 7m8.
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