CN106456711A

CN106456711A - 使用基因疗法治疗视网膜退化

Info

Publication number: CN106456711A
Application number: CN201580015412.5A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·卢卡斯; 保罗·比肖普; 亚斯米娜·切哈伊奇-卡佩塔诺维奇
Original assignee: University of Manchester
Current assignee: University of Manchester
Priority date: 2014-02-25
Filing date: 2015-02-24
Publication date: 2017-02-22
Also published as: JP2019131590A; EP3110433A1; US20210330812A1; WO2015128624A1; BR112016019432A8; US20160361437A1; ES2742499T5; EP3110433B2; BR112016019432B1; US10912845B2; ES2742499T3; BR112016019432A2; EP3110433B1; EP3578197B1; GB201403260D0; JP6511066B2; JP2017507942A; EP3578197A1

Abstract

本发明涉及向细胞提供光感受器功能的改进的方法，所述方法例如用于在治疗视网膜退化中使用。本发明还涉及组合物和试剂盒，所述组合物和试剂盒特别是用于在此类方法中使用。

Description

使用基因疗法治疗视网膜退化

发明领域

背景

脊椎动物眼睛的视网膜充当与相机中的胶片相同的功能，接收由贯穿通过眼睛的晶状体和角膜的光产生的视觉图像。接收的图像被转化成经由视神经被传送到脑的化学信号和电信号。

视网膜是个复杂的结构，包含不同细胞类型的十个清楚的层。这些层中，光感受器层负责将进入的光转化成可被脑阅读并且解释成图像的化学信号和/或电信号。光感受器层包含被称为视杆细胞和视锥细胞的两种类型的光敏细胞。这些细胞类型二者都负责与进入的光反应并且产生电信号，但它们在视网膜内的定位以及与它们反应的光的类型是不同的。具体地，视杆细胞主要在弱光中发挥功能，并且主要在周边视网膜中发现。视锥细胞对强光(即白天视觉)更有反应，负责颜色视觉，并且被发现在中央视网膜中呈最高密度。视网膜还含有第三类较少数目的光感受器细胞-光敏神经节细胞，其负责测量背景光，但不负责图像处理。

视网膜的光感受器层的视杆细胞和视锥细胞能够与光反应，并且由于其中的光敏色素(被称为光色素)的存在能够将光转化成电信号，当细胞被暴露于光时，所述光敏色素经历化学变化。这些光色素是G蛋白偶联的受体。光色素包含与被称为视黄醛的发色团辅因子偶联的蛋白部分。暴露于光引起视黄醛辅因子从顺式视黄醛到反式视黄醛的异构化，其转而引起视蛋白中的构象变化，被称为光褪色。这是信号级联中的第一步，导致信号沿着视神经被传送。为了保持光敏性，视蛋白因此需要顺式视黄醛的持续的供应。视杆和视锥光感受器细胞二者自身均不能产生顺式视黄醛。视网膜中顺式视黄醛的主要来源是RPE(视网膜色素上皮)，其从褪色的视蛋白获取所有反式视黄醛并且产生顺式视黄醛。在完整的视网膜中，视杆和视锥细胞临近RPE，允许视杆和视锥细胞接近此再生的发色团。

人类中，存在若干密切相关的光色素，被称为视蛋白家族。人类中，这些光色素包含对不同波长(颜色视觉的来源)敏感的3种视锥视蛋白、在视杆细胞中发现的视紫红质、和在神经节细胞光感受器中发现的视黑素。视锥视蛋白包括用于黄绿色的LWS视蛋白、用于绿色的MWS视蛋白和用于蓝紫色的SWS视蛋白。这些视蛋白显示高度的序列同一性。

诸如视网膜营养不良的状况由于外部视网膜中的光感受器(即视锥和视杆)的破坏引起失明。这些状况可以是直接损伤光感受器的结果，或光感受器作为在视网膜色素上皮和/或脉络膜中的病理结果被间接破坏。在退化的晚期阶段常见严重视觉损伤。目前，这些状况是不可治愈的。视网膜营养不良可分成视杆视锥营养不良(也被称为视网膜色素变性)、视锥视杆营养不良和黄斑营养不良。在视杆视锥营养不良中，视杆光感受器退化，导致周边视觉和夜视觉的丧失，并且经常地此后是视锥破坏，导致中央视觉和颜色视觉的丧失。相反地，在视锥视杆营养不良中，最初存在视锥光感受器的丧失，导致精细的和颜色视觉的丧失，并且然后随后是视杆退化，导致周边视觉的丧失和夜盲症。两种形式可以导致伴随着视野的大范围的或完全的丧失的失明。另一种类型的被称为黄斑营养不良的视网膜营养不良导致中央视觉的丧失，但周边视觉被保留。

然而，尽管外部视网膜光感受器的丧失，包括双极细胞和视网膜神经节细胞的内视网膜神经元可以存活并且保持它们向脑发送视觉信息的能力。因此，这些神经元为新兴的光遗传(optogenetic)疗法提供了有希望的机会(niche)，所述光遗传疗法旨在直接地将内视网膜神经元转化成视觉光感受器并且重建已随着退化丧失的光敏感性。若干治疗策略已显示了试图替换或复活这些内视网膜神经元并且恢复视觉的有希望的结果。移植光感受器细胞或其前体细胞系在临床前的研究下是主要的方法，并且已经显示恢复在完全丧失光感受器后处于退化的晚期阶段的失明小鼠的视觉。在复活内视网膜神经元的尝试中，可移植的电子假体已通过外部相机触发视网膜神经节细胞(RGC)激发(firing)并且对至少一些患者已提供了粗略的空间区分(Zrenner E,等2011，Proc Biol Sci 278(1711):1489-1497；Humayun MS,等2012,Ophthalmology 119,779-788)。另一个策略使用微生物视蛋白作为神经元活性的光开关并且它们已被用于在退化的视网膜中引起光诱发的活性。在这种意义上，已经显示，在rd1小鼠中视网膜内注射携带通道视紫红质2基因(ChR2)的AAV-2载体导致光激活的去极化或在RGC中的“给光”响应以及在皮质中视觉上激发的潜能。由Bi等领导的此研究(Bi A,等2006,Neuron.2006；6；50(1):23-33.)提供了可使用光遗传学恢复视网膜功能(Lagali PS,等2008,Nat Neurosci.2008Jun；11(6):667-75；Cronin T,等2014,EMBO Mol Med.2014Aug 4；6(9):1175-90；MacéE等2014,Mol Ther.2015Jan；23(1):7-16)的第一个原理验证，并且视锥光感受器(Busskamp V,等2010,Science.2010Jul 23；329(5990):413-7.)已被成功地转化成人工光传感器，导致失明小鼠中视觉功能的部分恢复。另外，最近开发的合成的光开关在失明小鼠中已显示了挽救视力的有希望的结果。“一组分”基于偶氮苯的光开关使用小分子AAQ或DENAQ(Polosukhina A,等2012,Neuron.2012Jul26；75(2):271-82；Tochitsky I,等2014,Neuron.2014Feb 19；81(4):800-13.)，小分子AAQ或DENAQ直接地使神经元的天然的离子通道光敏感。“二组分”光开关LiGluR/MAG(CaporaleN,等2011,Mol Ther.2011Jul；19(7):1212-9；Gaub BM,等2014,Proc Natl Acad Sci U SA.2014Dec 23；111(51):E5574-83)首先在视网膜中遗传地表达合成地工程化的光学门控的离子型谷氨酸受体(LiGluR)，并且然后需要添加用于激活的光开关分子(MAG)。两种系统都已显示将光敏感性赋予失明的小鼠和犬(Gaub BM,等2014,Proc Natl Acad Sci U SA.2014Dec 23；111(51):E5574-83)视网膜以及恢复啮齿动物中的基础视觉功能。

然而，在这些状况的治疗中的改进仍是必需的。

本发明旨在克服或改善与治疗视网膜退化相关的问题。

发明概述

因此，在本发明的第一方面中，提供了向细胞提供光感受器功能的方法，所述方法包括向眼睛的玻璃体腔内引入i)编码光敏蛋白的核酸序列；和ii)细胞外基质降解酶。

在本发明的第二方面中，提供了组合物，所述组合物包含i)编码光敏蛋白的核酸序列；和ii)细胞外基质降解酶。优选地，所述组合物是治疗性的。

在本发明的第三方面中，提供了i)编码光敏蛋白的核酸序列；和ii)细胞外基质降解酶，用于在向细胞提供光感受器功能的方法中使用。

在本发明的第四方面中，提供了向细胞提供光感受器功能的方法，所述方法包括将包含编码人类光感受器蛋白的核酸的核酸载体引入到眼睛内。在该方面，优选地，引入载体而不施用细胞外基质降解酶(例如，引入载体而不共施用酶，其中共施用包括在同一治疗期间，单独的、顺序的或组合的施用)。方法还可包括在内层视网膜细胞中表达载体，其中人类光感受器蛋白的表达致使内层视网膜细胞感光。

在本发明的第五方面中，提供了包含编码人类光感受器蛋白的核酸的核酸载体。

附图说明

本发明的实施方案参考附图在下文被进一步描述，其中：

图1示出了眼内注射和经由AAV的基因递送；

图2示出了视紫红质治疗之后，瞳孔对光反射的恢复；

图3A-E示出了来自体内电生理记录的数据；F)来自Rd1小鼠(n＝5)的代表性的体内dLGN光响应的热图，其中一只眼睛已用视杆视蛋白CAG-hRho(B)处理，并且另一只眼睛用GFP CAG-GFP处理(C)，描绘了恢复响应的多样性：持续的、瞬时的、给光和撤光。根据在2秒光刺激展示(15.4log光子/cm²/s)的最初1秒期间的持续的响应的振幅将响应排序；G-J)代表性的刺激后时间直方图(PSTH)，显示针对持续的给光(G)、瞬时的给光(H)、撤光(I)和给光-撤光(J)对多个全视野闪光的展示(15.4log光子/cm²/s)的平均响应。相应的试验箱计数(trial bin counts，TBC)显示在每个PSTH的顶部。

图4示出了来自体外MEA记录的数据；

图5示出了光刺激之后，观察的响应与通常存在于rd1小鼠视网膜中的天然的光响应明显不同。

图6示出了在受到视杆视蛋白驱动的rd1小鼠中的dLGN响应，处理的眼睛在一系列的光强度下并且在光适应的条件中响应A)利用在不同光强(ND2＝13.4、ND1＝14.4和ND0＝15.4log光子/cm²/s)的全视野闪光展示的来自Rd1-CAG-hRho小鼠的五个代表性的dLGN单位的敏感度响应谱特征(PSTH和TBC)；B)在光适应的条件下记录的来自Rd1-CAG-hRho小鼠的四个代表性的dLGN单位的对比敏感度响应反应谱特征(PSTH和TBC)(迈克尔逊对比(Michelson contrast)96％，@ND0＝15.4log光子/cm2/s)。

图7示出了视杆视蛋白至给光双极细胞的靶向表达恢复了失明的rd1视网膜中的视觉响应：A)在Grm6启动子下AAV2载体DNA构建体驱动人类视杆视蛋白的靶向表达；B、C)在玻璃体内递送与分解细胞外基质(B)的糖苷酶联合的A中的病毒载体之后，贯穿小鼠视网膜的切片的示例荧光显微图像。高放大倍数的荧光图像描绘了在INL细胞的细胞体中的视杆视蛋白的膜定位(C)。用α-hRho抗体(红色)处理视网膜并且用DAPI(蓝色)染色细胞核。校正条＝50μm。GCL＝神经节细胞层，IPL＝内网层，INL＝内核层。

图8示出了代表性的刺激后时间直方图(PSTH)，其显示了对于给光(A)和撤光(B)响应，对@ND0＝15.4log光子/cm²/s的5秒全视野闪光的多个展示的平均响应。

图9示出了代表性的刺激后时间直方图(PSTH)，其显示了对@较低的光水平(ND2-13.4log光子/cm²/s)的2秒全视野闪光的多个展示的平均响应。

图10示出了代表性的刺激后时间直方图(PSTH)，其显示了在光适应的条件下-迈克尔逊对比96％，对5秒全视野闪光的多个展示的平均响应。

图11示出了视杆视蛋白的异位表达恢复了被处理的失明rd1小鼠中的视觉行为：A)在一定系列的光强(A)的10秒白光期间，对于最大瞳孔收缩的辐射照度响应曲线。用视杆视蛋白处理的rd1眼睛(非靶向CAG表达，红色)相比于注射GFP的rd1眼睛(绿色)示出了视觉敏感度的显著改进。对于靶向表达(Grm6，蓝色)，瞳孔对光反射仍然大部分受损。用PBS/酶混合物注射的野生型小鼠的数据被显示用于比较(黑色)。数据被对即将开始光之前的瞳孔尺寸标准化。数值是平均值±SEM，其中n指示检查的动物的数目；B)在暗中(基线)、在ND4(11.8log光子/cm²/s)和在ND0(15.8log光子/cm²/s)对WT、Rd1-GFP、Rd1-CAG-hRho、Rd1-grm6-hRho小鼠测量的瞳孔区域的代表性的远红外图像；C、D)在ND4(11.8log光子/cm2/s；C)和ND0(15.8log光子/cm²/s；D)所有四组小鼠群体中的平均最大瞳孔收缩。检查的动物的数目：WT n＝6；Rd1-GFP n＝16；Rd1-CAG-hRho n＝10；Rd1-grm6-hRho n＝6。误差条是SEM。

图12示出了对四组小鼠(WT n＝5；Rd1-GFP n＝6；Rd1-CAG-hRho n＝6；Rd1-grm6-hRho n＝5)从暗(深色阴影)到光(白色区域)的开放盒活性图。图中的数值是在前面的30秒盒中行进的距离的总体平均值±SEM。右边的直方图示出了对于从暗(临近光之前30秒；黑色条)到光(紧接在光之后30秒；白色条)的转变阶段，群体中经过的平均距离。误差条是SEM。*p<0.05，**p<0.005，配对的Student t-检验。

图13对于Rd1-grm6-hRho(n＝5)，从灰色屏幕光到4Hz闪烁光的开放盒活性图。数值是在前面的30秒盒中行进的距离的总体平均值±SEM。B)对Rd1-GFP(n＝6)、Rd1-CAG-hRho(n＝6)和Rd1-grm6-hRho(n＝5)小鼠的4Hz闪烁光响应。对于每组的小鼠示出了成对的直方图，仅描绘了来自整个活性图(如F中对于Rd1-grm6-hRho示出的)从灰色光(临近4Hz闪烁光之前30秒)到4Hz闪烁光(紧接在4Hz闪烁光之后30秒)的转变阶段。数据是行进的距离的总体平均值±SEM。**p<0.005，配对的Student t-检验。

图14示出了Rd1-grm6-hRho小鼠(n＝5)的对比敏感度响应，示出了在不同的迈克尔逊对比下，在4Hz闪烁光之前和之后行进的距离。对于每个对比性能，仅示出了来自活性图的转变阶段，描述了在闪烁光展示之前的30秒(白色条)和之后的30秒(网格条)中经过的距离。数据是行进的距离的总体平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.005，配对的Student t-检验。

图15示出了Rd1-grm6-hRho小鼠(n＝5)的闪烁光频率响应，示出了不同频率的全视野闪烁光展示之前和之后行进的距离。对于每个闪烁光响应，仅示出了来自活性图的转变阶段，比较在闪烁光展示之前的30秒中的距离(灰色条)与之后的30秒中的距离(网格条)。数据是行进的距离的总体平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.005，配对的Student t-检验。

图16示出了靶向的视杆视蛋白表达恢复了对自然电影场景的响应：A、B)来自Rd1-CAG-hRho(A)和Rd1-Grm6-hRho(B)小鼠的代表性的响应的dLGN单位的栅格图，Rd1-CAG-hRho(A)和Rd1-Grm6-hRho(B)小鼠暴露于30秒自然电影的多个展示(小鼠在水平视野的开放场地中移动)；C)Rd1-Grm6-hRho(n＝5)的从灰色屏幕光(粗糙的灰色)到隐约可见的猫头鹰电影(绿色阴影)的开放盒活性图。数据是在前面的30秒盒中行进的距离的总体平均值±SEM；

图17示出了Rd1-GFP(n＝6)、Rd1-CAG-hRho(n＝6)和Rd1-grm6-hRho(n＝5)小鼠的自然电影响应。示出了每组小鼠的成对直方图，仅描绘来自完整活性图的从灰色光(临近电影展示之前的30秒；白色条)到猫头鹰电影(紧接电影之后的30秒；黑色条)的转变阶段。数据是行进的距离的总体平均值±SEM。**p<0.005，配对的Student t-检验。

发明详述

本发明涉及人类光感受器蛋白用于向细胞提供光感受器功能，以恢复在退化的或部分退化的视网膜中的光敏感性的用途。此类天然的光感受器功能随着光感受器的退化丧失。本发明是基于以下惊人发现：内视网膜中人类光感受器蛋白的表达可以向内视网膜神经元细胞提供光感受器功能。内视网膜中人类光感受器蛋白的转基因表达分别与使用微生物视蛋白和电子阵列相对比，具有使潜在的免疫原性不利影响最小化的优势。另外，光感受器之外，此GPCR具有劫持细胞机器并且提供完全地自给的感光机制的潜能，能够自身支持光检测而无任何另外的干预，这与合成的光开关不同，该合成的光开关需要恒定的光开关外源供应用于激活。此外，视杆视蛋白需要可见光用于激活，并且通过天然的GPCR放大级联，视杆蛋白具有在低光强下发挥功能的潜能，与不能在蛋白水平放大信号的目前基于通道的或合成的光开关系统不同。

玻璃体内注射作为用于基因疗法的方法在以下的方面具有特别的优势：在接近视网膜方面在技术上是较低挑战性的，并且减少施用期间并发症的风险，特别是当视网膜经过退化已经变薄时。

本发明部分基于以下的发现：基因疗法中细胞外基质降解酶的共施用导致视网膜细胞的增加的传导，因此改进在增加的视力恢复方面的结果。本发明代表了优于之前的玻璃体内基因治疗方法的改进，借助于通过减少使外来的遗传材料与靶细胞接触的障碍使增加的传导成为可能。

基因疗法和细胞外基质降解酶的组合的应用已导致惊人的结果，特别是当基因疗法包括向眼睛的玻璃体引入编码视紫红质的核酸序列时。视紫红质需要在视觉传导之后产生的全反式视黄醛被运输到视网膜色素上皮(RPE)用于将全反式视黄醛转化成全顺式视黄醛，然后全顺式视黄醛被运输回视杆细胞用于另外的视觉响应。此循环已被认为依赖于视杆细胞和RPE间的紧密接触。内视网膜细胞，即使在其中视杆和视锥退化的视网膜营养不良的存在下，将不与RPE以相同的方式生理上相关。本发明人已出人意料地观察到，尽管缺少功能性内视网膜细胞和RPE间的接触，通过基因疗法向内视网膜细胞提供视紫红质产生视觉响应。另外，认为内视网膜细胞不具有与视紫红质协同工作以产生然后可经由神经节细胞向脑传送的电信号所需的细胞内机制。

结果是进一步惊人的，因为视紫红质通过响应光超极化细胞来工作(转换细胞“撤光(OFF)”的脑等价物)，其中可以设想，视觉将要求内视网膜细胞通过光被去极化(转换“给光(ON)”)。

本发明提供了与编码光敏蛋白的核酸序列组合施用细胞外基质降解酶，以对视网膜恢复光敏感功能。视网膜和玻璃体包含一系列细胞外基质分子，包括蛋白多糖(具有不同类别的糖胺聚糖(GAG)链)诸如硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)、硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)和硫酸皮肤素蛋白多糖(DSPG)；透明质酸、胶原诸如在视网膜内界膜中的IV型胶原；层粘连蛋白；巢蛋白1和2，以及多种本领域技术人员已知的其他蛋白和糖蛋白。

设想，本发明可利用任何能够降解存在于玻璃体内和/或视网膜内和/或内界膜中的细胞外基质蛋白或碳水化合物(诸如糖胺聚糖)、和/或视网膜细胞外基质的酶。特别地，用于在本发明中使用的酶可以是能够降解在视网膜中被提供的细胞外基质蛋白或碳水化合物、或在玻璃体与视网膜的细胞间的路径中被提供的细胞外基质蛋白或碳水化合物，并且因此可以影响核酸序列的转导的酶。优选的是降解糖胺聚糖(GAG)的酶。

细胞外基质降解蛋白可选自由以下组成的组：胶原酶、透明质酸裂解酶、肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III、软骨素ABC裂解酶、软骨素AC裂解酶、金属蛋白酶、ADAMTS、纤溶酶(丝氨酸蛋白酶纤溶酶或其截短的形式微纤溶酶(Ocriplasmin))、中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G、神经氨酸酶、N-聚糖酶、O-聚糖酶和链霉蛋白酶。特别优选的酶可选自由以下组成的组：来自透明质酸链霉菌(Streptomyces hyalurolyticus)的透明质酸裂解酶(EC4.2.2.1；在Genbank登录号CP003990中包含)；来自牛睾丸的透明质酸酶(EC 3.2.1.35)；来自普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的软骨素ABC裂解酶(EC 4.2.2.4)和来自肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的肝素酶III(EC 4.2.2.8；Genbank登录号L12534，优选地版本L12534.1)。用于在本发明中使用的酶从商业来源例如Sigma Aldritch可得。

“降解”或“降解酶”意指能够分解蛋白或碳水化合物的酶。蛋白通过例如肽键的水解可被分解成肽序列或氨基酸。碳水化合物可被分解成寡糖或单糖单位。蛋白和/或碳水化合物可被完全或部分降解，意指蛋白和/或碳水化合物的一部分可被分解成更小的片段，而蛋白和/或碳水化合物的其余部分可以呈其天然形式。优选地，降解的细胞外基质蛋白或碳水化合物丧失了一些向细胞提供结构和/或生化支持的能力，以使得被引入玻璃体内的核酸序列可以更好地接近视网膜细胞。特别地，降解的细胞外基质蛋白丧失了其阻碍玻璃体内的核酸序列(例如基因递送载体，诸如病毒载体)移动并且进入以及穿过视网膜的能力的一些或全部。细胞外基质功能中的任何丧失是足够地最低的，以使得其对眼睛或视力不具有任何显著的不利影响。

本文中，对细胞外基质降解酶的提及包括其的活性片段。活性片段可以是天然酶的一部分或较短版本，其保持了作为细胞外基质降解酶发挥功能的能力，即其保持了降解细胞外基质蛋白或碳水化合物的能力，如本文定义的。活性片段可以包含天然酶的序列的70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

本文中，对酶的提及包括一种或更多种酶。因此，本发明提供了单一酶或两种或更多种酶的组合的共施用。优选地，当提供两种或更多种酶时，它们每个均选自以上定义的组。当施用两种或更多种酶时，它们可以被单独地、顺序地提供，或两种或更多种可以以组合被提供。优选地，两种酶被组合施用。当两种或更多种单独剂量的酶被提供时，这些酶中的任何一种或更多种可以与核酸序列组合被提供。

用于在本发明中使用的酶可源自任何合适的来源。所述来源可以是哺乳动物或非哺乳动物。用于在本发明中使用的酶可以源自动物、植物、细菌或古细菌来源。当源自哺乳动物时，优选地，其是人类酶。其可以从此类来源中被分离或纯化。其可以作为重组蛋白产生。可选地，其可以被合成地产生。

用于在本发明中使用的酶的核酸和氨基酸序列是本领域已知的。

本文中，酶包括天然酶的片段和衍生物。优选地，片段或衍生物与天然酶沿着天然酶的长度的50％、60％、70％、80％、90％或至少95％的长度共有至少70％、75％、80％、85％或90％、至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。

序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法，使用计算机实现的数学算法，诸如ALIGN(版本2.0)、GAP、BESTFIT、BLAST(Altschul等J.Mol.Biol.215:403(1990))、FASTA和TFASTA(Wisconsin GeneticSoftware Package Version 8，从Genetics Computer Group,Accelrys Inc.San Diego,California可得)和CLUSTAL(Higgins等Gene 73:237-244(1998))，使用缺省参数。

用于在本发明中使用的酶可以以包括脱水的或冻干的形式的干燥形式被提供。通常地，酶将被以冻干的形式提供。可选地，酶可以作为水性溶液被提供，例如以预定的浓度和体积预溶解在水中。尽管设想本发明的产品或试剂盒可以适合供应干燥形式的酶，为了施用，水性形式是优选的，任选地带有用于溶解的说明书。因此，本发明的方法可以包括使用干燥的酶来产生酶溶液。优选地，这通过在水性或非水性溶剂中溶解或重构酶来实现。合适的溶剂是无毒的、并且适用于对人类或动物使用的那些溶剂。优选地，合适的溶剂是无菌的。合适的溶剂的一个实例是无菌的磷酸盐缓冲盐水。用于溶解干燥的蛋白的方法在本领域是已知的。

本发明提供了向视网膜施用编码光敏蛋白的核酸序列，以对视网膜恢复光感受能力。光敏蛋白是通过经历化学或物理变化与光反应的蛋白。光感受，意指光敏或包含光敏蛋白的细胞。术语光感受或光感受器和光敏可互换地使用。

用于在本发明中使用的核酸序列可编码任何光敏蛋白。优选地，本发明的核酸序列编码哺乳动物或非哺乳动物光敏蛋白。其可以是哺乳动物、非哺乳动物、植物、细菌或古细菌来源的。当是哺乳动物来源的时，其优选地编码人类蛋白。用于在本发明中使用的核酸序列可选自由以下组成的组：视紫红质、视黑素、视椎视蛋白(特别是LWS视蛋白、MW视蛋白和SWS视蛋白)、神经视蛋白(Opn5)、脑视蛋白(Opn3)、松果体旁的视蛋白、VA视蛋白、parapinopsin；parietopsin、pinopsin、TMT视蛋白、水母视蛋白、C-视蛋白、隐花色素和任何无脊椎动物视网膜视蛋白和/或通常支持动物中视网膜外的光敏性的视蛋白。

取决于要被治疗的受试者，可以选择用于在本发明中使用的核酸序列，以使得核酸序列编码对要被治疗的受试者的视网膜是天然的光敏蛋白。因此，例如，当受试者是人类时，核酸序列将优选地编码人类光敏蛋白，例如视紫红质。然而，设想在某些实施方案中，可以提供编码光敏蛋白的核酸序列，所述光敏蛋白对要被治疗的受试者不是天然的，但优选地其不引起受试者中的免疫反应。

许多光敏蛋白的核酸序列和氨基酸序列在本领域是已知的。例如，优选的光敏蛋白的核酸序列提供如下：

视黑素：智人视蛋白4(OPN4)、mRNA(cDNA克隆MGC：142118IMAGE:8322610)、GenBank：BC113558、版本BC113558.1；

视紫红质：智人视紫红质(RHO)、GenBank：BC111451.3、登录号NM_000539、版本NM_000539.3GI：169808383；

视锥智人视蛋白1：智人视蛋白1，长波敏感，OPN1LW-NCBI参考序列：登录号：NM_020061、版本NM_020061.5；

智人视蛋白1，中波敏感OPN1MW-NM_000513，版本NM_000513.2；

智人视蛋白1短波敏感(OPN1SW)NM_001708，版本NM_001708.2。

parapinopsin(Genbank登录号NM_001200073，版本NM_001200073.1GI:318056020)；

parietopsin(Genbank登录号DQ100320，版本DQ100320.1GI:73666459)；

pinopsin(Genbank登录号AF487546，版本AF487546.1GI:20805654)；

VA视蛋白(Genbank登录号AF233520，版本AF233520.1GI:8272567)；

TMT视蛋白(Genbank登录号AH011520AF349943AF349944AF349945，版本AH011520.2GI:339511123)；

水母视蛋白(Genbank登录号AB435549，版本AB435549.1GI:210049957)；

OPN3(Genbank登录号NM_014322，版本NM_014322.2GI:71999130)；

OPN5(Genbank登录号AY377391，版本AY377391.1GI:38482095)；

C-视蛋白(Genbank登录号HF566407，版本HF566407.1GI：543581059)；和

隐花色素(Genbank登录号NM_169852，版本NM_169852.1GI:24648151)。

在以上描述的发明的第四或第五方面，光感受器蛋白是人类光感受器蛋白。人类光感受器蛋白可以是人类视紫红质(还被称作Rh1、OPN2、RHO)或光视蛋白。光视蛋白可以选自由以下组成的组：长波敏感(OPN1LW)视蛋白、中波敏感(OPN1MW)视蛋白和短波敏感(OPN1SW)视蛋白。

长波敏感(OPN1LW)视蛋白具有在电磁光谱的黄-绿色区域的560nm的λ_最大。长波敏感(OPN1LW)视蛋白还被称作“红色视蛋白”、“L视蛋白”或“LWS视蛋白”。中波敏感(OPN1MW)视蛋白具有在电磁光谱的绿色区域的530nm的λ_最大。中波敏感(OPN1MW)视蛋白还被称作“绿色视蛋白”、“M视蛋白”或“MWS视蛋白”。短波敏感(OPN1SW)视蛋白具有在电磁光谱的蓝色区域的430nm的λ_最大。短波敏感(OPN1SW)视蛋白还被称作“蓝色视蛋白”、“S视蛋白”或“SWS视蛋白”。

编码人类光感受器蛋白的核酸序列可以是智人视紫红质(RHO)基因(GenBank：BC111451.3，登录号NM_000539，版本NM_000539.3GI:169808383)或其片段或衍生物。

编码人类光感受器蛋白的核酸序列可以是视锥智人视蛋白1，长波敏感OPN1LW基因(NCBI参考序列：登录号：NM_020061，版本NM_020061.5)或其片段或衍生物。

编码人类光感受器蛋白的核酸序列可以是视锥智人视蛋白1：中波敏感OPN1MW(NCBI参考序列：登录号：NM_000513.2；(Science 232(4747)，193-202(1986))或其片段或衍生物。

编码人类光感受器蛋白的核酸序列可以是视锥智人视蛋白1：短波敏感(OPN1SW)NM_001708，版本NM_001708.2或其片段或衍生物。

对编码光敏蛋白的核酸序列的提及包括核酸序列，所述核酸序列是本文描述的序列的衍生物或编码光敏蛋白的较短的版本或片段，其中所述衍生物或片段保持与天然光敏蛋白大体上相同的光敏感功能。大体上相同意指天然蛋白的光敏感功能的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。片段可以包含天然蛋白的序列的70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

优选地，核酸序列的片段或衍生物与参考核酸序列沿着参考核酸序列的长度的50％、60％、70％、80％、90％或至少95％的长度，共有至少70％、75％、80％、85％或90％、至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。衍生物优选地是活性的，并且相比于天然序列可以包括取代和/或缺失和/或添加。衍生物还可以包括向光敏蛋白提供期望的活性或功能的其他基因序列的一部分。

核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。核酸序列可以是基因组的、重组的或合成的。核酸序列可以是分离的或纯化的。核酸序列可以是单链或双链的。优选地，核酸序列将编码如本文描述的光敏蛋白。核酸序列可以通过克隆衍生，例如使用包括限制性酶切、连接、凝胶电泳的标准的分子克隆技术，例如如在Sambrook等Molecular Cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbour laboratory Press)中描述的。核酸序列可是分离的，例如使用PCR技术分离的。此类技术可以采用基于要被扩增的核酸序列的序列的引物。分离意指从任何杂质和从被自然地发现与其来源中的核酸序列缔合的其他核酸序列和/或蛋白中分离核酸序列。因此可以从侧翼核酸序列，或从染色体材料或序列中分离核酸序列。优选地，其还将不含细胞材料、培养基或来自纯化/生产过程的其他化学物质。核酸序列可以是合成的，例如通过直接的化学合成产生，例如使用磷酸三酯的方法(Narang等MethEnzymol 68:109-151 1979)。核酸序列可以作为裸露的核酸被提供，或可与蛋白或脂质复合提供。

序列可被改变(例如通过截短C-末端或引入靶向基序)以改进表达效率，或以改变光反应的特征(例如通过移除或添加作为信号终止过程的一部分的被视紫红质激酶靶向的残基)。

通过提供的序列信息，熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的核酸序列或载体。

优选地，编码光敏蛋白的核酸序列作为载体，优选地表达载体被提供。优选地，其可作为优选地适用于在靶视网膜细胞中转导和表达的基因治疗载体被提供。载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体：腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。优选地，病毒载体是复制缺陷的(replicationdefective)，尽管设想其可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶视网膜细胞的基因组。用于向视网膜靶细胞引入编码光敏蛋白的核酸序列的优选的病毒载体是AAV载体，例如自身互补的腺相关病毒(scAAV)。使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8载体)可以实现选择性靶向。在通过玻璃体内施用提供载体的本发明的方面中，载体可以是已被修饰以使得其不与一个或更多个ECM蛋白结合的载体。例如，优选的载体可以包含修饰的硫酸肝素结合位点，以使得其具有减少的硫酸肝素结合或不能与硫酸肝素结合，诸如AAV 7m8(Dalkara D等Sci TranslMed 2013；5:189ra76)。

病毒载体可被修饰以缺失任何非必需的序列。例如，AAV中，病毒可被修饰以缺失全部或部分的IX基因、E1a和/或E1b基因。对于野生型AAV，没有辅助病毒诸如腺病毒的存在，复制是非常低效率的。对于重组的腺相关病毒，优选地，复制基因和衣壳基因以反式被提供(在pRep/Cap质粒中)，并且仅AAV基因组的2ITR被保留并且包装进入病毒体，同时需要的腺病毒基因被被腺病毒或另一个质粒提供。也可对慢病毒载体做出类似的修饰。

病毒载体具有进入细胞的能力。然而，非病毒载体诸如质粒可与剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类剂包括聚阳离子剂。可选地，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。

用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用，并且优选地适于在人类中使用。

载体将优选地包含一个或更多个调节序列以指导核酸序列在靶视网膜细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在靶视网膜细胞中的表达。

“可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。

启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导在内视网膜细胞中遍在的表达，或神经元特异的表达。在后一种情况中，启动子可以指导细胞类型特异的表达，例如对给光双极细胞或撤光双极细胞。合适的启动子将是本领域技术人员已知的。例如，合适的启动子可以选自由以下组成的组：L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子-SV40融合蛋白。使用细胞特异的启动子可以实现靶向，例如例如Grm6-SV40用于选择性靶向给光双极细胞。Grm6启动子是Grm6基因的200碱基对增强子序列和SV40真核启动子的融合体，Grm6基因编码给光双极细胞特异的代谢型谷氨酸受体mGluR6。Grm6基因的优选的来源是小鼠和人类。使用泛-神经元的启动子可以实现遍在的表达，其的实例在本领域是已知的并且可得的。一个此类实例是CAG。CAG启动子是CMV早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子的融合体。

本发明提供了治疗组合物，所述治疗组合物包含i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶。组合物可被提供于药学上可接受的赋形剂中。

本发明还提供了包含编码人类光感受器蛋白的核酸的核酸载体。人类光感受器蛋白可以是人类视紫红质(还被称作Rh1、OPN2、RHO)或光视蛋白。光视蛋白可以选自由以下组成的组：长波敏感(OPN1LW)视蛋白、中波敏感(OPN1MW)视蛋白和短波敏感(OPN1SW)视蛋白。载体可作为组合物被提供用于向受试者施用。

组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员已知的。

在本发明的涉及施用包含编码人类光感受器蛋白的核酸的核酸载体的第四和第五方面中，所述载体可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，优选地，载体作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。在此方面，优选地，引入核酸而不施用如本文定义的细胞外基质降解酶(即引入核酸而不共施用酶，其中共施用包括在同一治疗期间单独的、顺序的或组合的施用)。在此方面，优选地，可注射液体不包含细胞外基质降解酶。

在本发明的包含施用细胞外基质降解酶的方面中，酶可被单独地或与核酸序列组合即作为单一的组合物施用。当单独地提供时，酶和核酸序列可在相同的赋形剂中或在不同的赋形剂中被提供。在此类实施方案中，酶和核酸序列可被单独地保存，例如在单独的微胶囊中。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了组合物，所述组合物包含i)第一可注射液体，所述第一可注射液体包含编码光敏蛋白的核酸序列；和ii)第二可注射液体，所述第二可注射液体包含细胞外基质降解酶。优选地，第一和第二可注射液体被提供在单独的容器中，诸如胶囊或注射器，优选地，在同一包装内。

优选地，本发明的第一、第二和第三方面的组合物被提供用于向受试者单独的、顺序的或组合的施用核酸和酶。

本发明的组合物可被提供用于在向细胞提供光感受器功能的方法中使用。在一个实施方案中，本发明的组合物可被提供用于在对视网膜恢复光感受器功能的方法中使用。在一个实施方案中，本发明的组合物可被提供用于在对受试者恢复视力的方法中使用。在一个实施方案中，本发明的组合物可被提供用于在治疗视网膜退化的状况的方法中使用，所述视网膜退化的状况例如视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；其他形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病，例如视网膜色素变性。

本发明提供了包含核酸载体的试剂盒，所述核酸载体包含编码人类光感受器蛋白的核酸。人类光感受器蛋白可以如以上描述的。核酸载体可作为组合物被提供，如本文描述的。组合物可以是可注射液体。在此方面，优选地，试剂盒不包含细胞外基质降解酶。

本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含i)编码光敏蛋白的核酸序列；和ii)细胞外基质降解酶。在本发明的试剂盒中，细胞外基质降解酶和核酸序列可被单独的或组合提供。它们每个可以独立地作为组合物被提供，例如如本文描述的。因此，本发明的试剂盒可包含i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶，其中核酸序列和/或酶作为组合物被提供。核酸序列和酶可被组合提供、以单一组合物提供或可作为单独的组合物被提供。当单独地提供时，酶和核酸序列可被提供在相同的赋形剂中或在不同的赋形剂中。在此类实施方案中，酶和核酸序列可被单独地保存，例如在单独的微胶囊中。

在优选的实施方案中，试剂盒可包含i)第一可注射液体，所述第一可注射液体包含编码光敏蛋白的核酸序列；和ii)第二可注射液体，所述第二可注射液体包含细胞外基质降解酶。优选地，第一和第二可注射液体被提供在单独的容器中，诸如胶囊或注射器，优选地，在同一包装内。

本发明的试剂盒还可包含使用说明、给药方案、一个或更多个细针、一个或更多个注射器和溶剂。

本发明的试剂盒可被提供用于在向细胞提供光感受器功能的方法中使用。在一个实施方案中，本发明的试剂盒可被提供用于在对视网膜恢复光感受器功能的方法中使用。在一个实施方案中，本发明的试剂盒可被提供用于在对受试者恢复视力的方法中使用。在一个实施方案中，本发明的试剂盒可被提供用于在治疗视网膜退化的状况的方法中使用，所述视网膜退化的状况例如视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；其他形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。

本发明提供了向细胞提供光感受器功能的方法，所述方法包括将包含编码人类光感受器蛋白的核酸的核酸载体引入到眼睛内。人类光感受器蛋白可以如以上描述的。所述方法可包括向眼睛的内视网膜细胞视网膜下或玻璃体内施用核酸载体。在此方面，优选地，所述方法不包括施用细胞外基质降解酶。本发明提供了用于通过向细胞提供光感受器功能在治疗视网膜退化的方法中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码人类光感受器蛋白的核酸。在此方面，优选地，不使用细胞外基质降解酶(即引入核酸而不共施用酶，其中共施用包括在同一治疗期间单独的、顺序的或组合的施用)。

本发明提供了向细胞提供光感受器功能的方法，所述方法包括将以下引入到眼睛的玻璃体腔内：i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶。本发明提供了i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶，用于在向细胞提供光感受器功能的方法中使用。

本发明还提供了扩大视网膜中的光感受器功能的方法，特别是在视杆和/或视锥细胞退化之后扩大视网膜中的光感受器功能的方法，所述方法包括将核酸载体引入到眼睛的玻璃体腔内，所述核酸载体包含编码人类光感受器蛋白的核酸。人类光感受器蛋白可如以上描述的。所述方法可包括向眼睛的内视网膜细胞，视网膜下或玻璃体内施用核酸载体。在此方面，优选地，所述方法不包括施用细胞外基质降解酶。本发明提供了用于通过扩大视网膜中的光感受器功能在治疗视网膜退化中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码人类光感受器蛋白的核酸。人类光感受器蛋白可如以上描述的。在此方面，优选地，不使用细胞外基质降解酶(即，引入核酸而不共施用酶，其中共施用包括在同一治疗期间单独的、顺序的或组合的施用)。

本发明还提供了扩大视网膜中的光感受器功能的方法，特别是在视杆和/或视锥细胞退化之后扩大视网膜中的光感受器功能的方法，所述方法包括如本文描述的向细胞提供光感受器功能。本发明提供i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶，用于在扩大视网膜中的光感受器功能的方法中使用，特别是在视杆和/或视锥细胞退化之后扩大视网膜中的光感受器功能的方法中使用，其中所述方法包括如本文描述的向细胞提供光感受器功能。

本发明还提供了对受试者恢复视力的方法，所述方法包括将包含编码人类光感受器蛋白的核酸的核酸载体引入到眼睛内。人类光感受器蛋白可如以上描述的。方法可包括视网膜下或玻璃体内施用核酸载体到眼睛的内视网膜细胞。在此方面，优选地，方法不包括施用细胞外基质降解酶。本发明提供了用于在对受试者恢复视力中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码人类光感受器蛋白的核酸。人类光感受器蛋白可如以上描述的。在此方面，优选地，不使用细胞外基质降解酶(即，引入核酸而不共施用酶，其中共施用包括在同一治疗期间单独的、顺序的或组合的施用)。

本发明还提供了对受试者恢复视力的方法，所述方法包括如本文描述的向细胞提供光感受器功能。本发明提供i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶，用于在对受试者恢复视力的方法中使用，其中所述方法包括如本文描述的向细胞提供光感受器功能。

本发明还提供了治疗受试者中的视网膜疾病的方法，所述方法包括将包含编码人类光感受器蛋白的核酸的核酸载体引入到眼睛内。人类光感受器蛋白可如以上描述的。方法可包括视网膜下或玻璃体内施用核酸载体到眼睛的内视网膜细胞。在此方面，优选地，方法不包括施用细胞外基质降解酶。本发明提供了用于在治疗受试者中的视网膜疾病中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码人类光感受器蛋白的核酸。人类光感受器蛋白可如以上描述的。在此方面，优选地，不使用细胞外基质降解酶(即，引入核酸而不共施用酶，其中共施用包括在同一治疗期间单独的、顺序的或组合的施用)。疾病可以是视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；其他形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。

本发明还提供了治疗视网膜退化性疾病的方法，所述方法包括如本文描述的向细胞提供光感受器功能。因此，本发明提供了i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶，用于在治疗如本文定义的疾病的方法中使用。疾病可以是视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；其他形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。

向细胞提供光感受器功能意指，之前不具有光感受器能力或其的光感受器能力已经完全地或部分地退化的细胞，在其中表达编码光敏蛋白的外来核酸序列后，变成感光的。此类细胞在本文中可被称作转化的细胞，因为其在其中包含非天然的核酸。优选地，转化的视网膜细胞展现天然的感光细胞的一些或全部的光感受器能力。优选地，转化的细胞展现天然的视网膜光感受器细胞的至少相同或大体上相同的感光能力。优选地，转化的细胞展现比患病的或正在退化的天然的视网膜光感受器细胞高的感光能力。因此，转化的细胞相比于来自同一来源、保持在同一条件下、未经处理的退化的或患病的细胞，将优选地具有增加的光感受器。转化的细胞通过其中的外源核酸的存在可与天然的细胞区分。

扩大光感受器功能意指通过增加光感受器细胞诸如视杆或视锥细胞中的功能和/或通过向细胞提供光感受器功能，增加视网膜的光感受器功能。因此，视网膜相比于未用如本文描述的方法处理的视网膜，将具有增加的接收光信号并且传送此类信号的能力。增加可以是任何量，优选地到野生型水平。

恢复受试者中的视力意指，受试者相比于治疗之前，例如使用如本文描述的视力测试，显示改进的视力。恢复包括任何程度的改进，包括视力的完全恢复到完美的或接近完美的视力。

治疗疾病意指施用如本文描述的核酸和细胞外降解酶以改善或减轻疾病的一种或更多种症状，所述疾病选自由以下组成的组：视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。改善或减轻可导致外周或中央视力、和/或白天或夜间视力的改善。

本发明的方法包括将编码光敏蛋白的核酸序列引入到眼睛的玻璃体腔内。优选地，方法包括使细胞与编码光敏蛋白的核酸序列接触。优选地，细胞是视网膜细胞，优选地给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞。

优选地，本发明的方法包括靶向编码光敏蛋白的核酸序列到眼睛的视网膜，优选地到视网膜的非感光细胞，优选地到给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞。因此，接触细胞包括细胞的转染和/或转导。

当施用酶时，酶不必内化进入视网膜细胞，但可保持在玻璃体腔中或在视网膜中，在玻璃体腔中或在视网膜中酶降解细胞外基质蛋白以改进核酸序列对视网膜细胞的接近。

本发明的方法优选地在体内进行。

编码光敏蛋白的核酸序列和酶可被单独地或顺序地或组合地提供。当同时提供时(即组合地)，核酸序列和酶可作为被引入到玻璃体腔内的单一的组合物被提供，或可作为单独的组合物被提供但同时向玻璃体腔提供。如果单独地提供，核酸序列和酶可被提供在单独的组合物中，并且可被同时或顺序提供。当顺序提供时，可在核酸序列之前或之后提供酶，优选地之前提供。在第四和第五方面中，酶不通过以上描述的方法被共施用。

当提供两种或更多种酶时，它们可以以组合的单一剂量或以多种剂量被引入。酶剂量可以与核酸序列组合或另外单独地被提供。当引入多种酶剂量时，任何一个或更多个剂量可以是组合的酶/核酸序列剂量。优选的方法包括引入以下：i)组合的酶剂量和ii)核酸序列的顺序剂量。在优选的实施方案中，酶剂量包含肝素酶III和透明质酸裂解酶。

任何合适的方法可被用于将核酸序列和酶引入到视网膜下或玻璃体腔。优选的方法是注射。因此，核酸序列和/或酶的剂量可作为注射剂被提供。本发明的方法可包括将包含编码人类光感受器蛋白的核酸序列的核酸载体视网膜下注射或注射进入玻璃体腔内。优选地，方法向细胞提供光感受器功能，例如以恢复视力，优选地用于治疗视网膜退化性状况，例如视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎、和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。

方法可包括单独地、同时地或顺序地将以下注射进入玻璃体腔内：i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶。在优选的实施方案中，本发明的方法包括注射包含以下的单一剂量进入眼睛的玻璃体腔内：i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶。优选地，方法包括注射包含以下的单一剂量进入眼睛的玻璃体腔内：i)编码视紫红质的核酸序列；和ii)酶肝素酶III和透明质酸裂解酶。在优选的实施方案中，本发明提供了单一可注射剂量，所述单一可注射剂量包含i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶，用于引入眼睛的玻璃体腔内以向细胞提供光感受器功能，例如以恢复视力，优选地用于治疗视网膜退化性状况例如视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。优选地，本发明提供单一可注射剂量，所述单一可注射剂量包含i)编码视紫红质的核酸序列；和ii)酶肝素酶III和透明质酸裂解酶，用于引入眼睛的玻璃体腔内以向细胞提供光感受器功能，例如以恢复视力，优选地用于治疗视网膜退化性状况例如视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。

当核酸序列和一种或更多种酶以多个(两个或更多个)剂量被提供时，这些剂量可分隔合适的时间间隔，例如30秒到若干小时或1天或更多天。

每个剂量可包含有效量的核酸序列和/或酶。核酸序列的有效剂量可以在每治疗方案1×10⁹到1×10¹⁴或7.5×10¹⁵，优选地1×10¹¹到7.5×10¹³核酸序列(例如载体或病毒颗粒的数目)的范围。酶可以以每只眼睛0.075-0.125单位或更多的剂量被提供。

本发明的方法可以包括诊断受试者视网膜退化性状况，例如视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良、黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病的步骤。诊断步骤可包括视觉测试，例如瞳孔对光反射(PLR)测试、视敏度测试(LogMAR)、临床诊断测试例如活组织显微术/裂隙灯眼睛/视网膜临床检查；颜色视力测试、视野测试、对比/全磁场敏感度；电诊法测试，包括例如EGG、VEP；成像、视网膜眼底照相、OCT和自适应光学激光扫描检眼镜(AOSLO)。其他合适的测试将是本领域技术人员已知的。

本发明的方法可包括扩散要被治疗的眼睛的瞳孔的步骤，例如通过施用扩瞳剂，例如托品酰胺和/或苯肾上腺素和/或环戊通。本发明的方法可包括接近视网膜的步骤，例如通过手术。

本发明的方法可包括监测已为了视力的任何改善被治疗的受试者的视力。视力的改善可以是以下的任何一个或更多个：增加的瞳孔对光反射(PLR)、增加的对比敏感度、增加的低频或高频闪光的分辨率和增加的移动图像的检测。另外，增加的光诱导的运动活性在动物诸如小鼠中可被改善。视力的改善可以是响应或检测为10¹⁵-10¹³光子/cm²/s角膜辐射照度的光的能力。视力的改善可以包括给光持续的、给光瞬时的、撤光兴奋的、撤光抑制的或给光-撤光响应。优选地，监测改善可以包括定量受试者主观视觉经历或光反应的客观量度的方法，例如瞳孔对光反射(PLR)测试、LogMAR视敏度、临床检查裂隙灯活组织显微术；颜色视力测试、视野测试、对比/全磁场敏感度；电诊法-ERG、VEP；成像：视网膜眼底照相、OCT、自适应光学激光扫描检眼镜(AOSLO)或迷宫导航任务。

可以每6小时、8小时、10小时、12小时或24小时，或每2天、3天、4天、5天监测受试者。这可在1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或一年或更长时间之后被重复。

术语“体内”指自然环境(例如，动物或细胞中)和在所述自然环境(例如在受试者的身体上)中发生的过程或反应。

本发明是基于靶向编码光敏蛋白的核酸序列到视网膜细胞，以补偿视网膜中光感受器细胞的退化。核酸序列被靶向至的细胞是视网膜的细胞，其是活的并且能够表达外来核酸序列。本文，视网膜细胞是视网膜的细胞，其是神经或神经元细胞并且能够变兴奋并传送电信号。优选地，靶视网膜细胞将能够产生电信号并且起始信号级联，导致信号向视神经的传送。优选地，靶视网膜细胞是内视网膜的细胞。靶细胞可以是视杆或视锥细胞，和/或可以是非光感受器细胞(即呈其天然形式的对光不响应的视网膜细胞)。靶视网膜细胞可以包括一种或更多种细胞类型，所述细胞类型选自由以下组成的组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、米勒细胞和/或无长突细胞。

因此，当靶视网膜细胞是靶向视网膜的给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞时，编码光敏蛋白的核酸的表达可以被称作异位表达。因此，本发明在其范围内包括在非光感受器细胞中异位表达编码光敏蛋白的核酸序列的方法。此类异位表达通过其中的异源光敏蛋白的表达，具有向细胞提供光感受器功能的作用。这用于增加观察到退化的视网膜的感光能力。细胞外基质降解酶与核酸序列的共施用用于改进核酸序列进入靶视网膜细胞的转导。

细胞可以是原核的或真核的。其可以是细菌细胞诸如大肠杆菌(E.coli)，或可以是哺乳动物或非哺乳动物细胞，例如昆虫细胞、酵母细胞、细胞系或无细胞表达系统，例如用于在产生本发明的载体或组合物中使用。靶视网膜细胞可以是给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞。

水平细胞是内视网膜细胞，参与信号加工和反馈到光感受器细胞；双极细胞是内视网膜细胞并且在视杆/视锥细胞和无长突和/或神经节细胞间通信；无长突细胞发现于内视网膜并且允许在光感受器途径和神经节细胞间的通信；神经节细胞是最内部的视网膜细胞，其将信号从光感受器细胞传递到视神经。

本文对细胞的提及包括细胞的后代。优选地，根据本发明的对细胞的修饰还发生在转化的宿主细胞以后的代中。后代细胞可以不与最初的靶向细胞一致，但优选地将也展现非天然的光敏蛋白的表达。

本发明可被用于治疗特征在于眼睛中的光感受器细胞的退化的任何紊乱，通常所述退化足以导致视力的部分或完全丧失。可被本发明治疗或改善的状况的实例包括视网膜营养不良(视网膜色素变性)，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；其他形式的视网膜或黄斑退化(例如年龄相关的黄斑退化)、缺血性状况、水肿(黄斑的或视网膜的)、葡萄膜炎、和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。

如本文使用的，术语“受试者”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊、长颈鹿、牦牛、鹿、骆驼、美洲鸵(llama)、羚羊、野兔和家兔。

本文对“一个(a)”或“一个(an)”的提及在其范围内包括单数和复数二者，即一个或更多个。

除非另外说明，每方面的特征和实施方案加以必要修改适用于本发明的其他方面。

遍及本说明书的说明和权利要求，单词“包括”和“包含”和其的变化形式意指“包括但不限于”并且其不意图(并且不)排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。遍及本说明书的说明和权利要求，单数涵盖复数，除非上下文另外要求。特别地，当使用不定冠词时，说明书被理解为预期复数以及单数，除非上下文另外要求。

与本发明的特定的方面、实施方案或实例联合描述的特征(feature)、整数、特性(characteristic)、化合物、化学部分或基团要理解为适用于本文描述的任何其他方面、实施方案或实例，除非与其不相容。本说明书(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)中公开的全部的特征、和/或如此公开的任何方法或过程的全部的步骤，可以组合成任何组合，除了至少一些此类特征和/或步骤是互相排斥的组合之外。本发明不限于任何前述的实施方案的细节。本发明扩展到本说明书(包括任何伴随的权利要求、摘要和附图)中公开的特征的新的任何一个、或新的任何组合，或到如此公开的任何方法或过程的步骤的新的任何一个、或新的任何组合。

实施例

在本研究中，研究了通过使用玻璃体内AAV基因治疗，在存活的内视网膜神经元中表达人类视杆视蛋白，对失明的rd1视网膜恢复光响应性的可行性。研究了非靶向的(神经元非选择性的)和靶向的(对ONBP细胞选择性的)递送二者。此外，检查了体内恢复的响应的性质和经治疗的失明小鼠解析更复杂的图像处理的能力，该图像处理包括全视野闪光、对比检测和自然场景。发现非靶向的和靶向的异位视杆视蛋白二者通过包括给光和撤光途径二者的多种视觉编码，成功地恢复了视力。恢复的响应被传送越过视网膜进入CNS视觉途径，并且在正常视锥(和视杆)视力的光强范围下以及在光适应条件下发挥功能。响应是足够稳健的以在室内空间照明的等效照度下引起经治疗的小鼠的光诱导的运动行为。此外，结果显示，具有特异地靶向的给光双极细胞的小鼠能够解析更复杂的视觉功能，包括全视野闪光、对比检测和自然电影场景的空间模式和物体运动的特征变化。

1、眼内注射和经由AAV的基因递送(图1)

本研究中使用了成年C3H/HeJ(rd1)小鼠。具体地，rd1小鼠中的无义突变pe65b导致通过p90的光感受器的完全丧失(Crater-Dawson等,1978,Farber db等1994)。(重要提示，突变不影响视紫红质自身)。为了回答视杆视蛋白是否能够在体内在光感受器外部表达，将基因表达盒玻璃体内注射进入成年rd1小鼠(图1A)。考虑到此方法的转化潜能，使用了临床安全的AAV2/2载体和视杆视蛋白的人源化版本。采用玻璃体内注射以实现更广泛的视网膜转导并且使与载体的可选的视网膜下递送相关的可能的并发症最小化。视网膜下方法通常导致转导定位在注射位点。共注射优化的糖苷酶组合以增强转导并且允许载体更深地透入视网膜。天然光感受器外部的哪种细胞类型(如果存在)将表达视杆视蛋白是未知的。首先使用强的泛-神经元启动子CAG研究了非靶向的表达。

注射后四到六个月收获视网膜，并且用针对人类视杆视蛋白的抗体免疫标记视网膜冷冻切片。使用荧光显微术证实表达。视杆视蛋白在光感受器外部表达良好，如由强烈标记的细胞体证实的(图1B)。表达定位到质膜并且在RGC层(图1C)和INL(图1D)二者中观察到。可能通过非选择性启动子，INL中的若干不同的细胞类型被转导，包括一些水平和无长突细胞，尽管INL中转导的细胞体大体上具有双极细胞的特征(图1D)。视杆视蛋白的表达是泛-视网膜的，虽然在INL中由于可变深度的透入，其是不完整的。相比之下，在我们的对照PBS注射组，未看到荧光。另外，用针对视杆视蛋白的抗体处理的未注射的野生型视网膜在光感受器外部切片中显示清楚的荧光，指示抗体对视杆视蛋白特异，而无脱靶标记。

结果：

瞳孔测量法：

图2.视紫红质处理之后瞳孔对光反射的恢复。以中性密度滤光片ND4(最暗)到ND0(最亮)在10秒白光期间最大瞳孔收缩的辐射照度响应曲线。视紫红质处理的眼睛(Rd RHO)相比于GFP注射的眼睛(Rd GFP)，显示视觉敏感度的显著改进。显示用PBS/酶混合物注射的野生型C57小鼠的数据(WT PBS)用于比较。数据被对即将开始光之前的瞳孔尺寸标准化。数值是平均值±SEM，其中n指示检查的眼睛的数目。

体内电生理学：

图3.来自体内电生理学记录的数据。许多记录通道(sig)的事件后直方图的代表性样品，显示LGN细胞对2秒的405nm光的刺激的平均激发率，该刺激以递增的强度呈递到对侧的视紫红质处理的眼睛(图3A-ND2、B-ND1、C-ND0；ND2＝最暗、ND0＝最亮)。许多通道(例如sig50、sig52在ND0和ND1)显示稳健的“快速开始”光响应，当打开光后，具有“给光峰”且当关闭光时具有“撤光峰”。刺激对侧的眼睛后，观察到的响应明显地与通常存在于rd1小鼠LGN中的天然的光响应不同(图3)。这些天然的响应从视紫红质或GFP处理的眼睛二者观察到，并且显示典型的“慢开始”持续的响应(来自视黑素视网膜神经节细胞，图3D)和非常瞬时的快速响应(来自存活的视锥光感受器，图3E)。因此，“恢复的”响应(图3A-C)来自具有诱导的感光性质的视网膜细胞(视网膜神经节或双极细胞)，所述诱导的感光性质来自视紫红质的异位表达。

MEA体外记录：

图4.来自体外MEA记录的数据。许多记录通道(sig)的事件后直方图的代表性样品，显示视网膜神经节细胞对2秒的405nm光的刺激的平均激发率，该刺激以递增的强度应用到分离的视网膜(图4A-ND2、B-ND1、C-ND0；ND2＝最暗、ND0＝最亮)。许多通道显示稳健的“快速开始”光响应，一些通道(例如sig35、sig36在ND0和ND1)当打开光后显示“给光峰”且当关闭光时显示“撤光峰”。光刺激之后，观察到的响应明显地与通常存在于rd1小鼠视网膜中的天然的光响应不同(图5)。这些天然的响应从视紫红质或GFP处理的眼睛二者观察到，并且显示典型的“慢开始”持续响应(来自视黑素视网膜神经节细胞，例如图5，sig37)。因此，新的响应(图4A-C)来自具有导致的感光性质的视网膜细胞，所述感光性质来自视紫红质的异位表达。

恢复视网膜神经节细胞中的光引起的活性-体外视杆视蛋白响应的功能评价

下一步，期望证实，异位地表达的视杆视蛋白能够驱动失明视网膜中的功能性光响应。将视网膜移植物安装到多电极阵列上以测试光引起的活性。来自rd1小鼠(4-6月龄)的视杆视蛋白注射的(CAG-hRho)视网膜显示光响应细胞，所述光响应细胞当用广谱白光的以15.4log光子/cm2/s 2秒全视野闪光刺激后，具有稳健的初始激发率。然而，若干重复的展示后，光引起的活性减少到低频尖峰，表明了褪色效应。对于9-顺式的内源供应被快速耗尽的体外制品，这不令人惊奇。然而，向制品中添加9-顺式引起稳健的神经元活性伴随强的可重复的响应。另外，在光响应细胞的群体中(n＝6视网膜)注意到多种响应谱，包括给光持续的、给光瞬时的和撤光响应。与之相比，GFP注射的(CAG-GFP)年龄匹配的对照视网膜显示在展示相同的光刺激之后，无光引起的活性，与不存在光感受器一致(n＝2视网膜)。(在视杆视蛋白处理的视网膜中以较低的光强度(14.4log光子/cm2/s图1H和13.4log光子/cm2/s)驱动光反应也是可能的)相比于使用比激活天然的视锥视力必需的光强高至少5-6log单位的其他光遗传策略(Gaub,Lagali等)，代表光敏感性的显著的改进。

异位的视杆视蛋白介导的响应被传送到LGN-体内恢复的响应的表征(图3)

由于视杆视蛋白褪色，体外实验没有发色团(9-顺式视黄醛)的恒定的外源供应是问题，在体内测试神经元活性以确定在完整的视网膜中是否将存在足够的视黄醛以允许发色团再循环并且防止褪色。另外，研究了恢复的响应是否足够稳健以激活在正在退化和重塑视网膜的情况下的较高的视觉中心。来自背外侧膝状核dLGN的神经元响应被同时记录自两个半球，其中一只眼睛之前用视杆视蛋白处理而另一只用GFP注射充当内部对照。dLGN是脑的主要视网膜接受部分并且包含向视觉皮层分程传递信号的神经元。研究来自dLGN(RGC的第一个突触连接)的响应，以获得恢复的响应的性质的最好想法。以15.4log光子/cm2/s的410nm光的2秒全视野闪光之后，相比于内部对照(4)，发现dLGN中的光响应的数目(157)的显著地增加。根据客观标准，在Neuroexplorer(Nex Technologies)中使用刺激后时间直方图(PSTH)分析鉴定光响应细胞，其中在刺激起始或抵消之后，相比于基线，平均激发率必须跨95％CI。用于2秒刺激的PSTH时间间隔是-2秒到5秒，并且箱(bin)尺寸250ms。排除导致假阳性的明显的伪迹。生成“热图”以包括来自每个组的全部的光响应细胞，并且根据在2秒刺激展示的最初1秒期间持续的响应的幅度将响应排序。绿色(+1)代表高激发率且粉色/紫色(-1)代表低激发率。图3F清楚地描绘了恢复的响应的多种性质，包括持续的、瞬时的、给光和撤光响应，如在WT视网膜中通常发现的。与之相比，在对照组中发现的光响应细胞(n＝4)都是低起始给光持续的，可能起源于天然的ipRGC。发现褪色对于体内光响应不是问题，其在许多重复的试验间显示稳健的激发。

为了捕获在单一的单位水平上看到的(但测试的全部的视网膜中发现)恢复的响应的多样性，单独的响应通过其刺激后时间直方图(PSTH)和相应的试验箱计数(TBC)被系统地研究。考虑到一些细胞被光打开激发(给光响应)，一些被光打开抑制(撤光抑制响应)，一些被光关闭激发(撤光兴奋的)且一些被光打开和关闭二者兴奋(给光-撤光细胞)，在细胞群体中的平均将是困难的。在治疗的眼睛中引起持续的(10秒和2秒光步骤，图3G)和更瞬时的响应(2秒光步骤，图3H)二者，与那些来自WT视网膜的相当(插图)。除了给光响应，我们还发现许多撤光响应(图3I)和一些给光-撤光响应(图3J)。在光响应细胞的群体中，发现99/157(63.1％)的给光细胞、46/157(29.3％)的撤光细胞和(7.6％)的给光-撤光细胞(图3E)。这些细胞被宽泛地分类成给光持续的细胞(51/157；32.5％)、给光瞬时的细胞(48/157；30.6％)、撤光兴奋的细胞(29/157；18.5％)、撤光抑制的细胞(17/157；10.8％)和给光-撤光细胞(12/157；7.6％)。在恢复的响应中，平均激发率范围在20-100Hz。发现响应具有短潜伏期(在50-100ms内开始-2D，细胞1；2E细胞1)和较长的潜伏期(在500ms内开始-2D，细胞3)。对于大多数持续的响应，激发率快速地返回到基线(关掉光刺激的几百毫秒，2D细胞3)，尽管发现一些细胞具有更持久的激发(关掉光之后几秒，2D细胞2)。(与其他研究相似，lagali，flannery，wt响应)

恢复的LGN响应的敏感度和对比特征

目前基于ChR(10¹⁵-10¹⁷光子/cm²/s)的光遗传策略和光合成的开关(10¹⁵-10¹⁸光子/cm²/s)需要高光强用于激发，并且这些光强的长期暴露对视网膜可能是有害的。在我们的实验中，恢复的神经元在动态范围的等价于自然日光照度(10¹³-10¹⁵光子/cm²/s)的光强下操作(图6)。重要地，在这些光强度中发现稳健的、可重复的持续的和瞬时的、给光和撤光响应，指示系统是多么敏感。在较低的光强(10¹²和10¹¹)也发现一些光响应，尽管这些光响应是不容易/良好/不太可重现的(数据未显示)。当刺激未处理的rd1视网膜时，在低于10¹⁵光子/cm²/s的水平，未记录到令人信服的光响应。

到目前为止，对新的光遗传工具的研究使用来自黑暗的全视野光步骤都表征了在暗适应条件下恢复的响应。尽管这增加了引起强的神经元响应的可能性，这些条件在真实的生活场景中很少存在。在更加自然的条件下在光适应状态测试系统。在光适应条件、迈克尔逊对比96％下，记录了稳健的、高振幅、可重复的响应(图6B)。未发现响应于对照rd1视网膜光适应刺激的对比检测细胞。

(低对比(66％和33％))，也引起可测量的响应，尽管这些响应在重复的试验中不是高度可重现的(参见补充/或未显示)。

使用细胞特异的启动子限制视杆视蛋白的异位表达

用视杆视蛋白的未限制的异位表达生成的视觉编码的多样性是令人鼓舞的。然而，决定研究，如果视杆视蛋白的表达仅限于“给光途径”，是否将存在对此编码的任何变化。因此，使用细胞特异的Grm6启动子在给光双极细胞中表达视杆视蛋白(图7A-C)。

图8-10显示了已用靶向ONBP细胞的视杆视蛋白处理的小鼠在多种光条件下恢复的dLGN光响应。表明敏感度下降到正常光条件。引用的辐射照度的图用于角膜测量。视网膜辐射照度将低大约一个数量级。

在用410nm的光以15.4log光子/cm²/s全视野闪光(2秒)刺激之后，相比于内部对照(n＝6)，来自这些小鼠的体内LGN记录还显示光响应的数目显著增加(n＝100)。再次，在视杆视蛋白处理组中观察到一系列的响应谱-持续的、瞬时的、给光和撤光(兴奋的和抑制的)。相比于非靶向的响应，来自靶向的ON-BP细胞的光响应更均匀地分布在给光和撤光类型之间。在光响应细胞的群体中，我们观察到48/84(57.1％)的给光响应和36/84(42.9％)的撤光响应。这些细胞被宽泛地细分成给光持续的细胞(34/84；40.5％)、给光瞬时的细胞(14/84；16.6％)、撤光兴奋的细胞(6/84；7.1％)和撤光抑制的细胞(30/84；35.7％)。恢复的光响应的更详细的表征显示快的给光瞬时的、给光持续的和撤光瞬时的响应(在几百毫秒内起始)和较慢的撤光抑制响应(在几秒内起始)。这些延迟的稳健的撤光抑制响应是靶向的视杆视蛋白表达的特异性特征(4G细胞2和3)。

下一步研究给光双极驱动响应的敏感度和对比检测是否与我们的非靶向组类似。发现给光双极驱动响应的敏感度谱与非选择性/非靶向组相当并且在13.4log光子/cm²/s的水平记录光响应(图4H)。类似的，在光适应条件中，我们还发现细胞对迈克尔逊对比水平(96％，图4I)的响应。

(在较低的对比水平(66％和33％)记录了较低的振幅和较少的可重现的响应，类似于从非靶向的视网膜观察到的那些(数据未显示))。

光诱导的行为响应

下一步，研究被非靶向的和靶向的异位视杆视蛋白二者的转导驱动的、传送到脑的视觉信息是否能够恢复失明的rd1小鼠中丧失的视觉功能。首先，测试了对光的简单的行为响应，瞳孔对光反射(PLR)。此反射通常由表达视黑素的ipRGC介导(Lucas RJ等Science.2003Jan 10；299(5604):245-7.)并且在在光感受器退化之后的rd1小鼠中保持高阈值(Lucas RJ,等Nat Neurosci.2001Jun；4(6):621-6.，Lin B,Proc Natl Acad Sci U SA.2008Oct 14；105(41):16009-14.)。在以一系列光强的10秒白光期间，记录用于最大瞳孔收缩的辐射照度响应曲线(图11A)。在注射GFP的对照小鼠中发现受损的PLR，确定了之前的发现。非限制的视杆视蛋白的表达恢复PLR至与野生型行为相当(图11A-D)。然而，对于靶向的表达，PLR仍然大大受损(图11A-C)。

然后，对恢复的光遗传视觉编码是否能够在行为水平支持更复杂的视觉区分提出疑问。通过经典的开放视野光/暗盒测试激发(Bourin M,M(2003),Eur JPharmacol 463(1-3):55-65.)，测量响应多种人工和自然光刺激的运动行为。将小鼠放置在开放视野的改进的光/暗盒中，并且允许在两个场地之间经由在分隔墙中的开口自由移动。每个场地外部的平面屏幕计算机显示器被用于显示多种视觉刺激。我们的刺激的光强等同于室内光照水平(范围从对于黑屏的0.00132W/m2到对于白屏的0.1 16W/m2)。首先测试简单的暗-光区分。在初始适应于新的环境(3min)之后，允许小鼠在暗中探索盒子持续5分钟(黑屏辐射亮度＝0.004072Wsr^-1m^-2；辐射照度＝0.00132W/m2)，随后在白光中5分钟(白屏辐射亮度＝0.06526Ws r^-1m^-2；辐射照度＝0.116W/m2)。首先在野生型小鼠中评价运动测定，其中活性图显示在从暗到光转变的最初30秒中运动显著增加(图12，暗中的平均距离＝24.46±7.00cm；光中的平均距离＝147.5±5.09cm；p＝0.0066)。在此暗-光转变期间，失明的rd1小鼠未显示显著的活动变化(暗中的平均距离＝91.75±7.70cm；光中的平均距离＝100.2±8.145cm；p＝0.5541)。然而，对于处理组rd1-hRho-CAG和rd1-hRho-grm6，活性图显示了当打开光时，运动活性的突然减少。此光诱导的“冻结”行为在从暗到光转变的最初30秒中是显著的(对于rd1-hRho-CAG，暗中的平均距离＝98.40±16.12cm；光中的平均距离＝69.73±13.32cm；p＝0.0070；对于rd1-hRho-grm6，暗中的平均距离＝112.9±21.47cm；光中的平均距离＝68.37±16.81cm；p＝0.0224)。

在确定处理的小鼠能够区分光和暗之后，测试它们响应于更动态的视觉刺激的行为。将在光适应条件(暴露于灰色屏幕光5分钟，辐射亮度＝0.03342Wsr^-1m^-2；辐射照度＝0.0663W/m2)中的运动活性与在4Hz的全视野闪光比较(图13A)。Rd1-hRho-grm6组能够解析此闪光频率(灰色中的平均距离＝151.3±34.95cm；闪光中的平均距离＝83.7±13.76cm；p＝0.0466)，而rd1-hRho-CAG和未处理的失明小鼠未显示行为变化(图13B)。然后，我们在较低的频率以2Hz测试rd1-hRho-CAG，并且发现它们确实响应(此系统的可能限值)(数据未显示)。

由于靶向的Rd1-hRho-grm6小鼠具有以全视野闪光的最好响应，此组被进一步测试，以观察小鼠是否能够区分更细微的光变化并且检测对比。实际上，显示小鼠以不同的迈克尔逊对比响应(图14；以68.6％对比，灰色中的平均距离＝179.3±17.34cm；闪光中的平均距离＝127.2±16.29cm；p＝0.0238和以100％对比，灰色中的平均距离＝151.3±34.95cm；闪光中的平均距离＝83.7±13.76cm；p＝0.0466)。

在Rd1-hRho-grm6小鼠中还在10Hz和20Hz的较高的闪光频率观察。在20Hz未发现响应，但在10Hz有令人信服的响应(图15，在10Hz，灰色中的平均距离＝93.64±26.39cm；闪光中的平均距离＝162.6±18.57cm；p＝0.039)。

对自然场景的响应

已经描述了使用多种人工刺激的恢复的响应的特征，开始要确定在具有空间性质的更自然的场景下，异位视杆视蛋白是否能够在脑水平驱动视觉响应。为了这个目的，向Rd1-CAG-hRho和Rd1-grm6-hRho麻醉的小鼠投射自然电影(小鼠围绕开放的场地移动)，并且记录来自LGN的体内响应。30秒的电影被重复地呈现超过30分钟阶段，允许鉴定经许多展示具有可重现的激发模式的细胞。在刺激非靶向和靶向的视网膜之后，观察到激发率被电影场景的特定特征调节的单独的神经元(图16A到C)；无来自对照眼睛的“电影响应”神经元。

然后，研究小鼠是否能够看到自然场景？在开放视野行为运动测定中，向测试盒中的小鼠呈现特征为隐约可见的猫头鹰的自然电影。实际上，发现rd1-hRho-grm6小鼠对隐约可见的猫头鹰响应(图6C)，在从均匀光到电影场景的30秒转变中，显示运动行为的显著变化(图14；灰色中的平均距离＝67.68±22.05；自然电影中的平均距离＝110.2±19.44；p＝0.0079)。有趣的是，它们不展现冻结行为，但确实增加它们的运动活性，可能试图逃脱捕食者。在失明的Rd1小鼠或Rd1-hRho-CAG小鼠中，未发现响应电影的行为变化。

材料和方法

动物

这些小鼠是重度和快速形式的视网膜退化的模型，类似于人类中的一些形式的视网膜色素变性(McLaughlin等,1993)。全部的动物实验根据英国内政部针对实验动物的护理和使用条例、英国动物法案(科学程序)和曼彻斯特大学的动物福利团体进行。在12小时光：暗循环下保持动物，并且任意供应食物和水。

经由AAV的基因递送

在使用异氟烷的一般麻醉下，在六周龄的小鼠中进行眼内注射。在注射之前，用托品酰胺和苯肾上腺素扩散瞳孔。将客户定制的超细针(Hamilton RN针34gauge，由ESSLAB供应)附接到5μl Hamilton玻璃注射器，并且以45度传递通过平坦部进入玻璃体腔，小心地避开晶状体和血管。在手术显微镜下通过封片眼睛直接查看针尖，进行注射。在强的遍在的泛-神经元启动子(CAG)或给光双极细胞特异的(Grm6)启动子的控制下表达视杆视蛋白或GFP的rAAV血清型2(rAAV2/2，或简单的AAV2)载体从Vector Biolabs,Philadelphia,USA获得。CAG启动子是CMV早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子的融合体。Grm6启动子是小鼠的Grm6基因的200个碱基对的增强子序列和SV40真核启动子的融合体，所述Grm6基因编码给光双极细胞特异的代谢型谷氨酸受体mGluR6。每种情况中，感兴趣的基因侧翼为反向末端重复(ITR)结构域且被多腺苷酸化信号序列(polyA)和土拨鼠肝炎转录后调节元件(WPRE)稳定。

每只小鼠的一只眼睛用视杆视蛋白表达构建体(用于非靶向表达的AAV2-ITR-CAG-hRho-polyA-WPRE-ITR或用于靶向表达的AAV2-ITR-grm6-hRho-polyA-WPRE-ITR)注射，且另一只用GFP表达构建体(用于非靶向表达的AAV2-ITR-CAG-GFP-polyA-WPRE-ITR或用于靶向表达的AAV2-ITR-grm6-GFP-polyA-WPRE-ITR)注射。每只眼睛接收含有1×10¹³基因组计数的3μl的病毒构建体与含有0.125单位的肝素酶III(E.C.4.2.2.8)和透明质酸裂解酶(E.C.4.2.2.1)的0.5μl的糖苷酶溶液的组合，所述肝素酶III(E.C.4.2.2.8)和透明质酸裂解酶(E.C.4.2.2.1)从Sigma-Aldrich,Dorset,UK获得。在注射当天通过将酶溶解在无菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中新鲜配制酶溶液。在临近眼睛注射前在注射器中混合载体和酶，并且以单一的组合的注射液提供。

组织处理、免疫组织化学和生物成像

对于组织处理，将取回的视杯(retrieved eyecup)(载体注射后>6周)在4℃固定在4％的多聚甲醛(PFA)中持续24小时。然后，在PBS中洗涤组织，并且在4℃进一步固定在PBS中的30％蔗糖中过夜。将固定的眼睛冷冻保护在最佳切片温度培养基(Raymond A LambLtd.,Eastbourne,UK)中并且在-80℃冷冻直到进一步处理。在恒冷切片机(Leica,Microsystems)上水平地通过眼杯以8-10μm厚从腹侧向背侧切冷冻保护的视网膜部分，以使得每个切片含有完整的视网膜的鼻颞横截面。在每个载玻片上收集10到12个含有整个视网膜的代表性截面的切片。将载玻片储存在-80℃。

关于免疫组织化学，将载玻片从冰箱取出并且允许在室温空气干燥持续1小时。通过在室温将载玻片浸没在具有0.2％Triton的PBS中持续20分钟，使切片被透化处理。这之后，将切片在室温用含有10％驴血清(D9663；Sigma,UK)的具有0.2％Triton X-100的PBS背景封闭持续1小时。在室温施加在封闭缓冲液(具有0.2％Triton X-100和2.5％驴血清的PBS)中1:200稀释的一抗(兔抗人视紫红质，Abcam,Ab112576)持续3小时。在tween 0.05％PBS中洗涤四次持续10分钟之后，在室温将切片与在具有0.2％Triton X-100和2.5％驴血清的PBS中1:200稀释的二抗(Alexa546驴抗兔IgG(H+L)抗体,Life technologies,货号:1504518)孵育持续2小时。然后，在0.05％tween PBS中洗涤载玻片四次持续10分钟，随后是用dH₂O的一次最后洗涤。当移除过量的液体之后，用含有DAPI的荧光封固培养基(Vectashield,Vector Laboratories Ltd.,Peterborough,UK)封固载玻片来染色细胞核。

关于生物成像，在Olympus BX51直立显微镜下使用×4、×10和×20Plan Fln物镜分析切片，并且使用Coolsnap ES相机(Photometries,Tucson,AZ)通过MetaVue软件(Molecular Devices Ltd.Wokingham,UK)捕获。在特定的带通滤波器组下获取图像，并且颜色组合的图像被用于使用ImageJ的进一步处理。

多电极阵列记录

对视杆视蛋白处理的rd1小鼠(n＝6)和GFP注射的rd1对照(n＝2)进行多电极阵列记录。将摘除的眼睛放置在由碳氧化的(carboxygenated)(95％CO₂/5％CO₂)aCSF(人工脑脊液，浓度以nM计：118NaCl、25NaHCO₃、1NaH₂PO₄、3KCl、1MgCl₂、2CaCl₂、10C₆H₁₂O₆、0.5L-谷氨酰胺)填充的皮氏培养皿中。然后在漫射红光中在解剖显微镜下小心地分离视网膜，并且以神经节细胞在下安装到60通道或256通道多电极阵列上(Multi Channel Systems,Reutlingen,Germany)。视网膜移植物在适当的位置与加重的(weighted)透析膜偶联，并且使用蠕动泵(SCI400,Watson Marlow,UK)以2.2ml每分钟用碳氧化的aCSF持续灌注，并且使用调节用于aCSF流入的内联加热器的Universal Serial Bus温度控制器被保持在32℃。通过定制的光引擎源(Lumencor,USA)呈现光刺激(白光)。在最亮强度，LED为@15Log光子/cm²/s。被写在LabVIEW(版本8.6,National Instruments,TX,USA)中的程序控制的National Instruments卡(USB-6229)通过改变LED输出和调整含有中性密度滤光片(CairnResearch Ltd)的滤光轮，被用于控制刺激持续时间和强度。以具有20秒刺激间间隔的2秒的光脉冲递送ND0(15Log光子/cm²/s)到ND4的刺激持续20-30个重复。在获得自发的和引起的活性二者期间，在25kHz频率对数据取样并且记录该数据用于使用Offline Sorter(Plexon)离线分选。移除全部通道共同的明显的伪迹后，主组分分析被用于区分单一单位，所述单一单位被鉴定为主组分空间内的尖峰的不同的簇，在峰间间隔分布中具有明显的休复期。分选尖峰，然后使用Neuroexplorer(Nex Technologies)和MATLAB R2010a(TheMathworks Inc.)进一步分析单一单位数据。

瞳孔测量法：

对注射后六到八周的野生小鼠(6)、rd1-CAG-GFP小鼠(n＝16)、rd1-CAG-hRho小鼠(n＝10)和rd1-grm6-hRho小鼠(n＝6)进行瞳孔对光反射(PLR)。记录之前，使小鼠暗适应持续1小时。光刺激通过石英卤素灯提供并且沿着光纤束传送到整合的反射球，该整合的反射球在小鼠角膜提供均匀的光。在远红外条件下用配备有10×微距镜头和远红外滤光片的远红外敏感的CCD相机，在未麻醉的轻轻握持颈部的小鼠中记录交感PLR。介入快门控制刺激时机。单一试验持续20秒：5秒撤光、10秒给光、5秒撤光。光的强度被中性密度(ND)滤光片控制，并且小鼠经历以递增强度系列的白光暴露，其中单独的试验被间隔至少5分钟。用于ND的光子发射值的log光子/cm²/s范围为在ND0的15.85到在ND5的10.85。通过使用VirtualDub和ImageJ软件将瞳孔响应从视频图像定量，并且数据被对即将开始光之前的瞳孔区域标准化。

体内电生理学：

对野生型小鼠(n＝2)、rd1-CAG-hRho小鼠(n＝7)和rd1-grm6-hRho(n＝5)进行体内电生理学。注射后六周并且测量PLR之后，用尿烷麻醉小鼠(腹膜内注射1.7g/kg；30％w/v；Sigma Aldrich,Poole,UK)。将动物约束在立体定位架上(SR-15M；NarishigeInternational Ltd,London,UK)，并且经由恒温加热毯(Harvard Apparatus,Edenbridge,UK)使核心身体温度保持在37℃。用阿托品扩散瞳孔，并且施加矿物油(Sigma Aldrich)来保持角膜湿度。根据小鼠地图集(Paxinos和Franklin,2001；孔中心＝前囱:-2.46mm；中线:-2.8)，使用立体定位坐标直接地在每个外侧膝状体核(LGN)上方进行小的穿颅术和硬脑膜切开(～1mm²)。32通道电极(NeuroNexus Technologies Inc.,Ml,USA)被引入到孔中心的每个LGN(中间柄：相对于中线-2.5mm；深度：以18度角相对于脑表面-2.6mm)用于从两个LGN同时记录。在记录之前，使小鼠保持30min来暗适应，并且以允许神经元活性在电极插入后稳定。由UV LED(Thorlabλmax:405nm)提供视觉刺激，并且视觉刺激经由光纤向递送至为特定目的制作的紧密定位到每个眼睛上的眼睛视锥以使任何潜在的光泄露最小化。被写在LabVIEW(版本8.6,National Instruments,TX,USA)中的程序控制的NationalInstruments卡(USB-6229)通过改变LED输出和调整含有中性密度(ND)滤光片(CairnResearch Ltd)的滤光轮，被用于控制刺激持续时间和强度。在最亮强度(ND0)，LED是在47W/m2或15.4log光子/cm²/s的用于视杆视蛋白的有效流量。使用具有被20×增益AC偶联的探头(Plexon,TX)信号放大，随后提供3500×总增益的预放大条件的Recorder64系统(Plexon,TX,USA)，获得数据。数据被高通(300Hz)过滤，并且时间标记的神经波形被同时从全部的通道以40kHz的频率数字化。然后，储存多单位数据用于离线分选和分析，如以上对MEA数据描述的。最亮强度LED是～15Log光子/cm²/s。根据由2部分组成的光方案递送刺激。部分1包括来自暗的闪光：2秒给光、20秒撤光，每只眼睛之间具有10秒的偏差(offset)。此范例被在范围从最暗(ND3＝12.4log光子/cm²/s)到最亮(ND0＝15.4log光子/cm²/s)的每个ND滤光片重复30×。较长的刺激长度还被用于更持续的响应：10秒给光、30秒撤光，每只眼睛之间具有15秒偏差。此范例在ND3到ND0被重复10-20×。

光方案的部分2包括在光适应条件中记录，在该光适应条件中5秒的光步骤被应用于96％的迈克尔逊对比的稳定的背景照明。存在20秒的刺激间间隔和在两只眼睛之间10秒的偏差。此范例被重复10次。

(光方案的部分2包括在光适应条件中记录，在该光适应条件中递增的光对比被应用于稳定的背景照明。33％、66％和96％的迈克尔逊对比被应用于具有20秒刺激间间隔和两只眼睛间10秒偏差的5秒步骤。此范例循环被重复10次。)

还记录了对自然电影的响应。为此，从视杆视蛋白处理的眼睛对侧的dLGN获得了单独的记录集(rd1-CAG-hRho小鼠；n＝2和rd1-grm6-hRho；n＝3)。为了使使用的波长和电影的强度最大化，使用了不同的实验装备，包括数字镜装置投影机(LightCommanderTM；Logic PD Inc.)。用含有四个独立控制的LED(λmax为405nm、455nm、525nm和630nm；Phlatlight PT-120Series(Luminus Devices))的多光谱LED光源代替投影机的内在光引擎。来自LED的光与一系列的二向色镜(Thorlabs)组合并且指向投影机上。使用Python running PsychoPy Version 1.70.00软件展示电影。它的特征是小鼠围绕包括移动和隐约可见的不同尺寸的物体(对向视觉角度范围从0.5°到36°)以一系列的方向、速度和对比(最大迈克尔逊对比＝96％)的行动场地移动。电影缺少颜色差异，并且跨时间的辐射照度变化最小(辐射照度的标准偏差＝5.94％)。野生型小鼠中之前的验证已显示对于散焦的版本的展示的不可检测的响应，指示大多数活性由空间模式的变化和物体运动引起。

使用具有被20×增益AC偶联的探头(Plexon,TX)信号放大，随后提供3500×总增益的预放大条件的Recorder64系统(Plexon,TX,USA)，获得数据。数据被高通(300Hz)过滤，和时间标记的神经波形被同时从全部的通道以40kHz的频率数字化，并且被储存用于离线分析。

为了证实记录位点的位置，在插入脑中之前将记录电极浸入荧光染料里(CellTracker CM-Dil；Invitrogen)。体内记录之后，将小鼠的脑取出并且在4％多聚甲醛中后固定过夜，随后在30％蔗糖中冷冻保护持续24小时。然后使用滑动式切片机，切出100μm冠状切片，将所述冠状切片安装到玻璃载玻片上并且使用Vectashield(Vector Laboratories,Inc.)封片。

多电极阵列(MEA)记录：

紧随体内电生理学记录之后，将小鼠安乐死并且摘出眼球。将眼睛放置在由碳氧化(95％CO₂/5％CO₂)aCSF(人工脑脊液，浓度以nM计：118NaCl、25NaHCO₃、1NaH₂PO₄、3KCl、1MgCl₂、2CaCl₂、10C₆H₁₂O₆、0.5L-谷氨酰胺)填充的皮氏培养皿中。然后在漫射红光中在解剖显微镜下小心地分离视网膜，并且以神经节细胞在下地安装到60通道多电极阵列上(MultiChannel Systems,Reutlingen,Germany)。视网膜移植物在适当的位置与加重的透析膜偶联，并且使用蠕动泵(SCI400,Watson Marlow,UK)以2.2ml/分钟用碳氧化的aCSF持续灌注，并且使用调节用于aCSF流入的内联加热器的Universal Serial Bus温度控制器被保持在32℃。通过呈现UV光(λmax:405nm)的定制的光引擎(Lumencor,USA)提供光刺激。在最亮强度，LED是～15Log光子/cm²/s。被写在LabVIEW(版本8.6,National Instruments,TX,USA)中的程序控制的National Instruments卡(USB-6229)通过改变LED输出和调整含有中性密度滤光片(Cairn Research Ltd)的滤光轮，被用于控制刺激持续时间和强度。根据光方案递送刺激，如以上对体内电生理学数据描述的。在获得自发的和引起的活性二者期间，在25kHz频率对数据取样并且记录该数据用于离线分析。

行为

目前，通常使用的视觉区分任务需要大量的训练、压力环境或是基于反射而不是目标导向的行为。为了解决这些不足，已经开发了评价基于自发行为的视力的简单、基于开放视野的方法。使用修改的光/暗盒(尺寸：长＝40cm宽＝40cm和高＝30cm，顶部开口)，允许小鼠经由分隔墙中的开口在两个相等的场地(东半边和西半边)之间自由移动。盒由Perspex玻璃制成并且盒的壁被漆成白色，除了每个场地的两个长边保持透明之外。将两个相同的远红灯放置在每个场地中心之上，以允许在黑暗条件下的查看。视觉刺激显示自两个17寸平面屏幕计算机监视器，其面向每个场地的透明的壁，使用DualHead2Go DigitalEdition外部多显示适配器(Matrox Graphics Inc.)。这允许对照和测试刺激二者同时显示在单独的显示器上。显示了多种视觉刺激，包括全视野均匀光(黑色、灰色和白色)、全视野闪光和自然电影。使用自定义编写的程序创建这些刺激，允许同时在两个不同的窗口中形成两个不同的刺激，同时保持二者单独地操作的能力。程序允许刺激的白色(255)、黑色(0)和灰色(128)组分的值改变以实现期望的亮度和对比水平。

对野生型小鼠(5)、rd1-CAG-GFP小鼠(n＝6)、rd1-CAG-hRho小鼠(n＝6)和rd1-grm6-hRho(n＝5)进行行为实验。在实验阶段之前，小鼠被处理并且经5天，每天在相同的时间，以以下的方式习惯其新环境：将动物带到在其居住笼中的测试房间中，放置进入实验盒内，并且允许与其的同窝仔畜一起自由移动持续30分钟。

习惯阶段之后，每天在相同的时间在完全黑暗的房间进行行为实验若干周。允许每组的小鼠每天仅经历一个测试条件。在每个测试日，将小鼠带到在其居住笼中的测试房间中，允许适应测试房间条件持续30分钟，并且然后单独地测试每只小鼠。将小鼠放置进入开放视野盒内(随机地到东半边或西半边)并且允许在两个场地之间自由移动。在远红光条件下通过装备有远红光过滤片(λ＝665nm)的摄录像机记录全部的测试试验。在每个测试试验之后，用70％乙醇将盒彻底清洁，并且在将下一只小鼠放置进盒内之前允许空气干燥。

3分钟的习惯之后开始记录试验。每个试验运行由5分钟的对照刺激、之后的测试刺激组成，所述每个试验运行呈现在面对在此时间点含有小鼠的场地的屏上。对于暗适应实验，对照刺激由5分钟在暗中(屏开到暗；辐射亮度＝0.004072Wsr^-1m^-2，辐射照度＝0.00132W/m2)、随后5分钟在光中(白屏；辐射亮度＝0.06526Wsr^-1m^-2，辐射照度＝0.116W/m2)并且然后1分钟回到暗中组成。对于光适应实验，对照刺激由5分钟在均匀灰屏光中(灰色屏；辐射亮度＝0.03342Wsr^-1m^-2，辐射照度＝0.0663W/m2)、随后5分钟的全视野闪光(闪光屏；辐射亮度＝0.03342Wsr^-1m^-2，辐射照度＝0.0663W/m2)随后1分钟在均匀光中组成。对于对比敏感性实验，调整屏输出以允许在2个场地间的不同的测试对比(迈克尔逊对比：100％、68.6％、37.3％、13.7％和0％对比)。对于自然电影实验，对照刺激由5分钟的均匀灰色光、随后1分钟的电影呈现和1分钟回到对照条件组成。(彩色)电影以隐约可见的猫头鹰为特征。

储存记录的试验用于使用视频跟踪软件装置(EthoXT 10.1Noldus,Tracksys Ltd.,UK)离线分析。我们分析了整个盒中每只小鼠行进的距离并且输出结果在30秒箱中。小鼠看到视觉刺激的能力被评价为在从对照到测试刺激的1分钟转变阶段期间运动活性的变化(即我们分析了临近测试刺激之前在对照条件下30秒中行进的距离和紧接测试刺激之后30秒中行进的距离)。双向配对t检验被用于在1分钟转变阶段期间在测试刺激呈现之前和之后同一组小鼠的比较。

总之，将人类视紫红质引入由于重度视网膜退化和视杆和视锥光感受器的丧失导致失明的小鼠的内视网膜细胞中导致视力的恢复，如由瞳孔响应以及脑(外侧膝状体核)和视网膜中视觉响应的恢复证明的。

讨论

此研究中，表明人类视杆视蛋白的表达能够通过包括给光、撤光、瞬时的和持续的途径的多种视觉编码，将光敏感性赋予失明的视网膜。在内源的视锥/PR视力等同的光强下，在体外和体内观察到稳健的视觉响应，并且能够驱动复杂的视网膜回路功能诸如对比检测。处理的失明小鼠在自然室内环境典型的照明下显示恢复的光诱导的运动活性，并且能够解析光适应条件中的低频闪光。另外，随着靶向的视杆视蛋白处理，小鼠检测到较低对比，能够解析较高频率全视野闪光并且检测自然电影场景。

将微生物视蛋白通道和泵以及化学光开关引入到存活的视网膜神经元能够恢复光敏感性。此处，基因治疗可被用于向失明小鼠递送人类视杆视蛋白。然而，光遗传治疗中的主要挑战之一是在视网膜中通过临床相关递送方法实现稳定和有效水平的视蛋白表达。目前，病毒递送方法需要侵入性视网膜下注射，其中转导限于在注射位点处的一小部分视网膜。通过注射进入玻璃体内可以实现更全面的转导，进入玻璃体内是通常在常规眼科实践中使用的更为安全的技术。然而，由视网膜细胞的细胞外基质产生的生理屏障限制了从此途径的病毒转导。已经出现了具有更深地透入视网膜组织的能力的若干新的突变的AAV载体(4YF和7m8)，但目前需要非常高的病毒效价(10¹⁴)，以及着潜在的高的免疫源性和脱靶效应。在本方法中，使用了AAV2载体的玻璃体内递送，其在临床试验中已被证明是安全的。另外，已经鉴定了靶向细胞外基质蛋白的酶的组合，所述酶的组合破坏病毒颗粒从玻璃体到达视网膜的物理屏障。共注射这些酶大大地增加了被病毒感染的神经元的数目和空间扩展。

在完整的视网膜中，哺乳动物视杆视蛋白通常发现于特化的视杆光感受器中。其属于通过信号级联中间体起作用的G蛋白偶联的受体(GPCR)家族。光激活后，视杆视蛋白与转导蛋白(Gt；Gi/o亚家族的成员)偶联用于体内视觉信号的传导(Palczewski,K.G.Annu.Rev.Biochem.(2006)75,743-767)，导致K+电流的增加、膜超极化和神经递质释放的抑制。光感受器和其二级神经元、双极细胞间的符号转化突触(sign invertingsynapse)将此抑制响应转化成正电信号，该正电信号经由神经节向脑传送用于视觉认知。

视蛋白通道(ChR)和泵(HaloR)已经在失明的视网膜中功能性地表达，分别导致去极化和超极化。另外，脊椎动物视杆视蛋白已经表达于细胞培养物和体内视网膜外部(小脑浦肯野细胞)，并且显示当被光激活时，抑制神经元的兴奋性(Li X,等Proc Natl Acad SciU S A.2005Dec 6；102(49):17816-21；Gutierrez DV,等J Biol Chem.2011Jul 22；286(29):25848-58.)。然而，现在已知当直接地在二级或三级神经元(RGC)中表达时，GPCR类视杆视蛋白将能够在天然的光感受器外部发挥功能，并且施加其抑制作用以产生视觉信号。推断，在去掉了正常的光感受器输入的失明的视网膜，中，存活的输出神经元的基础活性存在整体增加，并且视杆视蛋白能够起作用抑制此“超活化”并且改进信噪比，以支持视觉区分。

这里，显示异位的视杆视蛋白能够在内视网膜细胞中表达并且在天然的光感受器外部发挥功能。实际上，如预测的，在靶向的(全部光响应的35.7％)和非靶向的(10.8％)视杆视蛋白处理二者中在体内观察到抑制性撤光响应(激发率随着给光刺激减少)。这些通常不在WT响应中观察到，并且在我们的体外制品中我们还没有观察到此类响应。然而，出人意外地，在体外和体内，均发现许多正“正响应”。实际上，对于非靶向的和靶向的处理二者，均发现多种的响应集，包括给光持续的、给光瞬时的和撤光兴奋的(激发率随着撤光增加)响应、以及体内撤光抑制信号。另外，对于非靶向的处理，在体内观察到小量的给光撤光响应。这将表明，视杆视蛋白能够以去极化和超极化光依赖方式二者调节细胞行为。这将表明，给光双极细胞中视杆视蛋白的表达足够强以驱动突触后三级神经元并且刺激无长突抑制环(全部细胞)，导致撤光双极细胞的激活并且因此导致双抑制或兴奋的给光响应。

在完整的系统中，通过两条平行的途径，给光途径和撤光途径视觉视觉信息。在给光途径中，细胞对光增加响应，而在撤光途径中，细胞对光减少响应。在失明视网膜中我们的给光和撤光途径的恢复支持之前已经特异地靶向ChR和LiGluR到ON-BP细胞的其他研究。然而，使用遍在的启动子(Lin B,等Proc Natl Acad Sci U S A.2008Oct 14；105(41):16009-14)或仅特异地靶向RGC的之前的研究，已经报道电生理上更均匀的信号(例如对于异位视黑素持续的给光)并且没有给光和撤光途径二者的同时恢复(RGC中的ChR仅驱动给光途径，而RGC中的HaloR仅驱动撤光途径)。可能仅RGC中的表达不够强至直接地激活对细胞的正常的兴奋性和抑制性输出。除了此情况之外，甚至用非靶向处理，在INL细胞中(可能的BP细胞)发现视杆视蛋白的表达，这可以解释全部环的二级激活和将响应分成抑制性和兴奋性信号二者。

使用视杆视蛋白作为光遗传工具来恢复视力的主要优势之一在于其提供自身含有的光感受作用的简单性和其使用内源的发色团(视黄醛或顺式视黄醛)作为天然的光开关的能力。然而，对于视觉响应，视杆视蛋白需要通常被光褪色的视黄醛的恒定的再循环。认为此再循环依赖于视杆和RPE间的紧密接触。实际上，与之前的研究一致(Li X,等ProcNatl Acad Sci U S A.2005Dec 6；102(49):17816-21；Gutierrez DV,等J BiolChem.2011Jul 22；286(29):25848-58)，发现在体外光刺激后视杆视蛋白易于褪色，并且其需要发色团(9-顺式视黄醛)的恒定的外源供应以维持光依赖的响应。然而在体内未发现褪色成为明显的问题。重要的是，许多光响应是稳健的并且经多次试验可重复的。因此，可能退化的视网膜提供了视黄醛的良好的内源供应，并且在通常吸收视黄醛的光感受器的不存在下，在内视网膜细胞中的视杆视蛋白接近通过RPE或穆勒式细胞再循环的发色团，以产生视觉响应。

视杆视蛋白治疗的另一个重要的方面是其的在生理光条件下发挥功能的能力，与目前的需要非常高的光强用于激活的基于微生物视蛋白和合成的光开关的策略不同。发现给光和撤光、瞬时的和持续的细胞类型在落入内源的视锥敏感度范围下的动态范围的测试光强下(10¹³-10¹⁵光子/cm²/s)在体内发挥功能。之前报道的研究使用高的多的光强用于激活：LiGluR>1.7×10¹⁷光子/cm²/s(Gaub BM,等2014,Proc Natl Acad Sci U S A.2014Dec23；111(51):E5574-83)、ChR>3×10¹⁵-10¹⁷光子/cm²/s(Lagali PS,等2008,NatNeurosci.2008Jun；11(6):667-75；)、RGC中的HaloR>5.1×10¹⁸光子/cm²/s(Zhang Y,等JNeurosci.2009Jul 22；29(29):9186-96)和在视锥内部部分中的HaloR>10¹⁶光子/cm²/s(Busskamp V,等2010,Science.2010Jul 23；329(5990):413-7.)。敏感性是细胞内机制的一个因素并且我们的数据表明，视杆视蛋白能够通过GPCR光放大级联在低光强下发挥功能。这与微生物离子通道(ChR2)、泵(HaloR)或光开关(LiGluR)不同，离子通道(ChR2)、泵(HaloR)或光开关(LiGluR)不能在蛋白水平放大信号。

体内恢复的响应的动力学的另外的表征显示，对于非靶向的和靶向的方法二者，光响应的开始、结束和持续时间在细胞类型之间变化。发现等待时间不同的响应；一些快一些较慢，与之前的研究一致(Caporale N,等2011,Mol Ther.2011Jul；19(7):1212-9；GaubBM,等2014,Proc Natl Acad Sci U S A.2014Dec 23；111(51):E5574-83)。视杆视蛋白光开关本质上是快的并且较慢的光响应可能是细胞内信号级联的动力学的作用，并且依赖于表达视杆视蛋白的天然的细胞类型。另外，较慢的响应开始可能是由于不饱和的光输入和一些细胞中视杆视蛋白的较低水平的表达(一些快的视杆视蛋白响应可能是通过ONBP细胞中的天然的mgluR6受体级联的快速动力学)。

眼睛对从暗(晚上)视力到光(白天)视力的宽范围的光强是敏感的。此敏感性可通过引起视力必需的最小阈值强度来测量。我们的视力的重要方面之一是亮光暴露之后眼睛多快恢复其在暗中的敏感性(暗适应)或更重要的，眼睛多快适应背景照明以能够区分在此背景中的物体(光适应)。到目前为止，大多数光遗传研究已经研究了简单的视觉刺激，包括来自黑暗的光步骤。这当然是非自然的场景，并且在真实世界中物体具有对比，这是恒定的并且不依赖于环境照明。因此，提出了异位的视杆视蛋白是否能够在光适应的条件下工作，并且针对辐射照度的改变保持恢复的视觉编码的疑问。实际上，在与背景照明相比增加的测试光刺激呈现之后，发现稳健的dLGN响应。(可能的是观察的分为给光和撤光途径的稳健的分隔能够有利于此光适应并且增强对比敏感度)。

研究了非靶向的和靶向的表达两者。首先，使用强的泛-神经元的启动子CAG的非选择性非靶向的方法穿过存活的内视网膜递送基因。哪种神经元(如果存在)将表达视杆视蛋白，并且是否其将在一种特定类型的神经元中表达多于另一种，或对给光或撤光途径具有偏好性或同样地靶向二者是未知的。希望给光和撤光途径间表达的不平衡将意味着，即使一些信号将彼此取消，传送到脑的视觉信息将存在整体增加。此方法的优势还将意味着，存活最久的视网膜神经节细胞(Mazzoni F,)J Neurosci 28(52):14282-14292)也被靶向，并且此方法可以在双极细胞变得妥协的(cronin)晚期退化中使用。第二，测试将表达限制到仅“给光”途径是否将导致电生理和行为二者上视觉信号的改善。使用最小细胞特异启动子Grm6，视杆视蛋白特异地靶向视网膜给光双极细胞(Masu M等,Cell 1995)。

在非靶向的和靶向的视杆视蛋白处理之间观察到惊人的电生理相似性。恢复的编码同样地复杂和多样。对于两种处理，响应动力学、敏感度和对比响应是类似的。有趣的是，靶向的处理导致更多的撤光响应(主要是撤光抑制)。

然而，行为上存在重要的差别。首先，观察到简单的视觉功能PLR的恢复差别。非选择性表达的视杆视蛋白恢复了对RGC途径的驱动，介导PLR到接近WT水平。这与视黑素和RGC中的第一代LiGluR一致，其导致PLR的接近完全的(Lin B,Proc Natl Acad Sci U SA.2008Oct 14；105(41):16009-14.)或部分的恢复(Caporale N,等2011,MolTher.2011Jul；19(7):1212-9；)。有趣的是，当表达被限制到ON-BP细胞时，此途径仍然大部分被损坏。可能视杆视蛋白的非靶向表达直接地激活ipRGC(与Gs/Gq级联偶联)，导致刺激，而ON-BP细胞中的选择性表达绕开了途径的直接激活和此非视觉反射的恢复。

图像形成途径如何？我们创造的此视觉编码可在生理光水平下被用于改进图像形成视力吗？特异地靶向更远的视网膜神经元的优势之一将是保持内视网膜加工、细调恢复的响应成更连贯的信号以及实现更好质量的视力。到目前为止，光遗传研究已解决了简单的视觉任务包括暗光区分，并且没有报道系统是否能够追踪相对于背景照明或响应自然场景的变化。发现以两种处理，在等同于室内光的照明下恢复的体内响应能够支持简单的暗光区分。另外，以非靶向的和靶向的视杆视蛋白处理处理的小鼠能够相对于均匀的背景照明解析在2Hz的全视野闪光。另外，发现靶向处理的小鼠相对于均匀的背景照明解析较高频率的闪光，包括4Hz和10Hz。此外，具有ONBP细胞中视杆视蛋白的特异表达的小鼠能够在相对于背景照明的较低对比水平检测4Hz闪光(迈克尔逊对比66.7％)。

人类擅长自然视觉场景的加工。尽管时常地改变视觉场景，我们的脑能够在几百毫秒内将落在我们视网膜上的复杂模式的光和准确的相关信息转化成连贯的感知。考虑到转化潜能，提出了异位视杆视蛋白是否能够足够稳健地驱动信号来保存许多水平的视觉加工，产生小鼠能够在室内照明典型的水平的光强中用以追踪自然时空调节的视觉编码的疑问。电生理上，以两种处理，开始鉴定单独的能够追踪在自然电影场景中发生的空间和时间上的光水平变化的神经元。这表明，视觉系统(具有其可塑性)能够开发时间和空间上汇集的恢复的响应，携带关于给光和撤光信号以及对比的简单信息，以加工真实的自然场景。另外，我们发现，靶向的视杆视蛋白处理后的小鼠增加了它们响应于自然电影场景的运动行为。这表明，相比于非靶向处理，用靶向处理改进了感知视力的质量，这可能由于从双极细胞到RGC的更连贯的信号会聚，这对于更复杂的时空区分是必需的。

总之，结果显示，存活的内视网膜神经元中的人类视杆视蛋白是有希望恢复由于光感受器的丧失所致的视网膜退化中的视力和反转晚期失明的策略。作为人类蛋白，其在伦理和安全性考虑方面提供了优于目前基于微生物治疗的优势。其提供了自身含有的光感受策略，该策略通过细胞内级联放大信号并且相比于目前的光遗传策略能够给予改进的敏感性。当在内视网膜神经元中异位表达时，其产生基于给光和撤光响应的多种视觉编码，能够追踪高于背景照明和在自然电影场景中的光强度的变化。行为上，处理的失明小鼠能够区分暗和光并且在室内光典型的照明下，能够解析光适应的条件下的2Hz全视野闪光。另外，将表达限制到ONBP细胞，导致体内视觉感知的改进，并且处理的小鼠能够解析较高频率的闪光，检测较低的对比和解析自然场景。

Claims

1.一种治疗组合物，所述治疗组合物包含i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶。

2.根据权利要求1所述的治疗组合物，所述治疗组合物包含i)第一可注射液体，所述第一可注射液体包含编码光敏蛋白的核酸序列；和ii)第二可注射液体，所述第二可注射液体包含细胞外基质降解酶。

3.根据权利要求2所述的治疗组合物，其中所述第一可注射液体和所述第二可注射液体在单独的容器中提供，所述单独的容器优选地在同一包装内。

4.根据权利要求1所述的治疗组合物，所述治疗组合物包含单一可注射剂量，所述单一可注射剂量包含i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶。

5.根据权利要求4所述的治疗组合物，其中所述单一可注射剂量包含编码视紫红质的核酸序列和肝素酶III以及透明质酸裂解酶。

6.根据前述权利要求中任一项所述的治疗组合物，其中i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶被提供用于在向细胞提供光感受器功能的方法中单独、同时或顺序使用。

7.根据权利要求6所述的治疗组合物，所述治疗组合物用于在恢复视网膜的光感受器功能的方法中使用。

8.根据权利要求6所述的治疗组合物，所述治疗组合物用于在对受试者恢复视力的方法中使用。

9.根据权利要求6所述的治疗组合物，所述治疗组合物用于在治疗视网膜退化性疾病的方法中使用。

10.根据权利要求9所述的治疗组合物，所述治疗组合物用于在治疗以下的方法中使用：视网膜退化性状况，例如视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎、水肿和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。

11.一种向细胞提供光感受器功能的方法，所述方法包括向眼睛的玻璃体腔引入i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶。

12.根据权利要求11所述的方法，所述方法用于恢复视网膜的光感受器功能。

13.根据权利要求11所述的方法，所述方法用于对受试者恢复视力。

14.根据权利要求11所述的方法，所述方法用于治疗视网膜退化性状况，例如视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎、水肿和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，所述方法包括单独地、顺序地或组合地引入两种或更多种酶。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，所述方法包括引入与核酸序列组合的细胞外基质降解酶。

17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，所述方法包括引入包含i)编码视紫红质的核酸序列、和ii)肝素酶III以及透明质酸裂解酶的单一剂量进入到眼睛的玻璃体腔。

18.根据权利要求11至17中任一项所述的方法，其中核酸序列和/或酶通过玻璃体内注射被引入。

19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法，所述方法包括诊断受试者的视网膜退化性状况，例如视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎、水肿和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病的步骤。

20.根据权利要求11至19中任一项所述的方法，所述方法包括通过施用合适的扩瞳剂诸如托品酰胺和/或苯肾上腺素，扩散要被治疗的眼睛的瞳孔的步骤。

21.根据权利要求11至20中任一项所述的方法，所述方法包括监测已为了视力上的任何改进被治疗的受试者的视力。

22.一种试剂盒，所述试剂盒包含i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶。

23.根据权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒包含i)第一可注射液体，所述第一可注射液体包含编码光敏蛋白的核酸序列和ii)第二可注射液体，所述第二可注射液体包含细胞外基质降解酶。

24.根据权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒包含单一可注射剂量，所述单一可注射剂量包含i)编码光敏蛋白的核酸序列和ii)细胞外基质降解酶。

25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述单一可注射剂量包含i)编码视紫红质的核酸序列和ii)肝素酶III以及透明质酸裂解酶。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含使用说明、给药方案、一个或更多个细针、一个或更多个注射器和溶剂。

27.根据权利要求22至26中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒用于在向细胞提供光感受器功能的方法中使用。

28.根据权利要求27所述的试剂盒，所述试剂盒用于在恢复视网膜的光感受器功能的方法中使用。

29.根据权利要求27所述的试剂盒，所述试剂盒用于在对受试者恢复视力的方法中使用。

30.根据权利要求29所述的试剂盒，所述试剂盒用于在治疗以下的方法中使用：视网膜退化性状况，例如视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎、水肿和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。

31.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、方法或试剂盒，其中细胞是视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞。

32.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、方法或试剂盒，其中酶能够降解一种或更多种细胞外基质蛋白或碳水化合物，所述一种或更多种细胞外基质蛋白或碳水化合物选自由以下组成的组：蛋白多糖(具有不同类别的葡糖氨基葡聚糖(GAG)链，诸如硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)、硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)和硫酸皮肤素蛋白多糖(DSPG))；透明质酸、胶原，诸如在内界膜中的IV型胶原；层粘连蛋白；以及巢蛋白1和2。

33.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、方法或试剂盒，其中酶选自由以下组成的组：胶原酶、透明质酸裂解酶、肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III、软骨素ABC裂解酶、软骨素AC裂解酶、金属蛋白酶、ADAMTS、纤溶酶(丝氨酸蛋白酶纤溶酶或其截短的形式微纤溶酶(Ocriplasmin))、中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G、神经氨酸酶、N-聚糖酶、O-聚糖酶和链霉蛋白酶。

34.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、方法或试剂盒，其中酶包含透明质酸裂解酶；和肝素酶III的组合。

35.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、方法或试剂盒，其中核酸序列编码选自由以下组成的组的光敏蛋白：视紫红质、视黑素、视椎视蛋白(特别是LWS视蛋白、MW视蛋白和SWS视蛋白)、神经视蛋白(Opn5)、脑视蛋白(Opn3)、松果体旁的视蛋白、VA视蛋白、parapinopsin；parietopsin、pinopsin、TMT视蛋白、水母视蛋白、C-视蛋白、隐花色素和任何无脊椎动物视网膜视蛋白和/或通常支持动物中视网膜外的光敏性的视蛋白。

36.根据权利要求35所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述核酸序列编码视紫红质。

37.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、方法或试剂盒，其中编码光敏蛋白的所述核酸序列作为载体被提供。

38.根据权利要求37所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述载体是病毒载体。

39.根据权利要求38所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述载体是AAV载体，优选地是AAV血清型2载体。

40.根据权利要求37至39所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述载体包含一个或更多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

41.根据权利要求40所述的组合物、方法或试剂盒，其中启动子选自由以下组成的组：L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、Grm6、Grm6增强子-SV40融合蛋白。

42.一种治疗组合物，所述治疗组合物包含核酸载体，所述核酸载体包含编码人类光感受器蛋白的核酸。

43.根据权利要求42所述的治疗组合物，所述治疗组合物被提供为可注射液体。

44.根据权利要求41或42所述的治疗组合物，其中包含编码人类光感受器蛋白的核酸的核酸被提供用于在向细胞提供光感受器功能的方法中使用。

45.根据权利要求44所述的治疗组合物，所述治疗组合物用于在扩大或恢复视网膜的光感受器功能的方法中使用。

46.根据权利要求44所述的治疗组合物，所述治疗组合物用于在对恢复受试者视力的方法中使用。

47.根据权利要求44所述的治疗组合物，所述治疗组合物用于在治疗视网膜退化性疾病的方法中使用。

48.根据权利要求47所述的治疗组合物，所述治疗组合物用于在治疗视网膜退化性状况的方法中使用。

49.根据权利要求48所述的治疗组合物，其中所述视网膜退化性状况选自由以下组成的组：视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎、水肿和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。

50.一种向细胞提供光感受器功能的方法，所述方法包括将核酸载体引入到眼睛内，所述核酸载体包含编码人类光感受器蛋白的核酸。

51.根据权利要求50所述的方法，所述方法用于扩大或恢复视网膜的光感受器功能。

52.根据权利要求50所述的方法，所述方法用于对受试者恢复视力。

53.根据权利要求50所述的方法，所述方法用于治疗视网膜退化性状况。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述视网膜退化性状况选自由以下组成的组：视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎、水肿和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。

55.根据权利要求50至54中任一项所述的方法，其中核酸序列通过视网膜下或玻璃体内注射被引入。

56.根据权利要求50至55中任一项所述的方法，所述方法包括诊断受试者视网膜退化性状况，例如视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎、水肿和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病的步骤。

57.根据权利要求50至56中任一项所述的方法，所述方法包括例如通过施用扩瞳剂诸如托品酰胺和/或苯肾上腺素，扩散要被治疗的眼睛的瞳孔的步骤。

58.根据权利要求50至57中任一项所述的方法，所述方法包括监测已为了视力上的任何改进被治疗的受试者的视力。

59.一种试剂盒，所述试剂盒包含核酸载体，所述核酸载体包含编码人类光感受器蛋白的核酸。

60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中所述核酸载体被提供为可注射液体。

61.根据权利要求59至60中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含使用说明、给药方案、一个或更多个细针、一个或更多个注射器和溶剂。

62.根据权利要求59至61中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒用于在向细胞提供光感受器功能的方法中使用。

63.根据权利要求62所述的试剂盒，所述试剂盒用于在扩大或恢复视网膜的光感受器功能的方法中使用。

64.根据权利要求62所述的试剂盒，所述试剂盒用于在对受试者恢复视力的方法中使用。

65.根据权利要求62所述的试剂盒，所述试剂盒用于在治疗以下的方法中使用：视网膜退化性状况，例如视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、葡萄膜炎、水肿和由光感受器能力的丧失导致的任何其他疾病。

66.根据权利要求42至65中任一项所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述细胞是视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞。

67.根据权利要求42至66中任一项所述的组合物、方法或试剂盒，其中编码人类光感受器蛋白的所述核酸序列选自由人类视紫红质或光视蛋白组成的组。

68.根据权利要求67所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述光视蛋白选自由以下组成的组：长波长敏感(OPN1LW)视蛋白、中波长敏感(OPN1MW)视蛋白和短波长敏感(OPN1SW)视蛋白。

69.根据权利要求67所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述核酸序列包含所述视紫红质(RHO)基因(GenBank:BC111451.3,登录号NM_000539，版本NM_000539.3GI:169808383)或其片段或衍生物。

70.根据权利要求68所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述核酸序列包含视锥智人视蛋白1、长波长敏感OPN1LW基因(NCBI参考序列：登录号:NM_020061，版本NM_020061.5)或其片段或衍生物。

71.根据权利要求68所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述核酸序列包含视锥智人视蛋白1、长波长敏感OPN1LW基因(NCBI参考序列：登录号:NM_020061，版本NM_020061.5)或其片段或衍生物。

72.根据权利要求68所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述核酸序列包含视锥智人视蛋白1、中波长敏感OPN1MW(NCBI参考序列：登录号:NM_000513，版本NM_000513.2或其片段或衍生物。

73.根据权利要求68所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述核酸序列包含视锥智人视蛋白1、短波长敏感(OPN1SW)NM_001708，版本NM_001708.2或其片段或衍生物。

74.根据权利要求42至73中任一项所述的组合物、方法或试剂盒，其中编码光敏蛋白的所述核酸序列被提供为载体。

75.根据权利要求74所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述载体是病毒载体。

76.根据权利要求74所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述载体是AAV载体，优选地是AAV血清型2载体，优选地是4YF或7m8。

77.根据权利要求74至76所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述载体包含一个或更多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

78.根据权利要求77所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述启动子是遍在的或细胞特异的。

79.根据权利要求78所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述启动子选自由以下组成的组：L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。

80.根据权利要求79所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述启动子是细胞特异启动子Grm6-SV40，所述细胞特异启动子Grm6-SV40用于选择性靶向给光双极细胞。

81.根据权利要求79所述的组合物、方法或试剂盒，其中所述启动子是遍在启动子CAG。