CN117881693A - 用于激活Gq偶联信号传导和/或激活细胞的基于超光敏神经视蛋白的光遗传学工具 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于快速、可逆且精确地激活Gq信号传导和/或激活细胞的分离的光敏视蛋白。
Description
背景技术
G蛋白偶联受体(GPCR)调节许多细胞内的信号传导通路，并代表了一些最深入研究的药物靶点(Hauser等，2017)。在配体结合后，GPCR经历构象变化并将其传递给异三聚体G蛋白，后者是包含Gα和紧密结合的Gβγ亚基的多亚基复合物。Gq蛋白，为异三聚体Gα亚基的亚家族，与一类GPCR偶联，在全身各处介导细胞对神经递质、感觉刺激和激素的应答。它们的主要下游信号传导靶点包括磷脂酶Cβ(PLC-β)酶，其催化磷脂磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)水解成肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)。IP3触发细胞内储存的Ca2+释放到细胞质中，并且Ca2+与DAG一起激活蛋白激酶C(PKC)。已经开发了包括化学遗传学和可光活化小分子在内的几种工具，来研究Gq偶联的GPCR和细胞内Ca2+释放的信号传导机制和生理功能。
光遗传学利用光响应性蛋白，以遗传特异性和高时空精度来实现对细胞活动的光学控制的扰动。自从早期发现使用光敏性离子通道和转运蛋白的光遗传学工具以来，已开发了多种多样的技术，它们现在支持对细胞内第二信使、蛋白质相互作用和降解，以及基因转录进行光学干预。Opt-a1AR，一种创造性设计的Gq偶联的视紫红质-GPCR嵌合体，可以对长时间的光刺激(60s)做出响应，诱导细胞内Ca2+增加(Airan等，2009)。然而，这种工具尚未被广泛使用，可能是因为其与光敏性和响应动力学相关的局限性(Tichy等，2019)。大多数动物使用基于GPCR的光感受器来检测光，其中光感受器包含蛋白质部分(视蛋白)和既作为配体又作为发色团起作用的维生素A衍生物(视黄醛)。到目前为止已鉴定到几千种视蛋白。最近的两项研究报道了将来自蚊子和七鳃鳗的基于Gi的视蛋白用于神经元中的突触前末梢抑制，简要地证明了某些天然存在的光感受器适合用作高效的光遗传学工具。关于Gq信号传导，哺乳动物视网膜神经节细胞亚群中的视黑素(Opn4)是一种Gq偶联视蛋白，其介导不形成图像的视觉功能。然而，异源表达Opn4的HEK293或Neuro-2a细胞显示出弱的光响应，并且在培养基中需要额外的视黄醛。已报道许多脊椎动物中的Opn5(神经视蛋白(neuropsin))及其直系同源物是与Gi蛋白偶联的紫外(UV)敏感性视蛋白。
发明内容
本发明涉及一种分离的光敏视蛋白，其用于快速、可逆且精确地激活Gq信号传导和/或激活细胞。
第一方面，本发明涉及一种分离的光敏视蛋白，其用于激活Gq信号传导和/或激活细胞。
在某些实施方式中，所述光具有360nm-520nm、优选地450-500、更优选地460-480nm范围内的波长。
在某些实施方式中，所述分离的视蛋白是来自生物体的分离的视蛋白、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物、其片段或变体，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
在某些实施方式中，所述分离的视蛋白与所述生物体中的野生型视蛋白、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物、其片段或变体具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
在某些实施方式中，所述生物体是动物。
在某些实施方式中，所述分离的视蛋白是来自动物的分离的视蛋白5(Opn5)、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物、其片段或变体，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
在某些实施方式中，所述分离的视蛋白5(Opn5)与所述动物中的野生型视蛋白5(Opn5)、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物、其片段或变体具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
在某些实施方式中，所述动物是脊椎动物。
在某些实施方式中，所述动物是鸟类、爬行类或鱼类、两栖类或哺乳类动物。
在某些实施方式中，所述动物是鸟类，包括但不限于鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸸鹋、美洲鸵、鹬舵、鹤鸵、火鸡、鹌鹑、鸡、猎鹰、鹰、隼、鸽子、长尾小鹦鹉、凤头鹦鹉、金刚鹦鹉、鹦鹉、雀形目(例如鸣禽)、松鸦、乌鸫、雀类、啭鸟和麻雀。
在某些实施方式中，所述动物是爬行类，包括但不限于蜥蜴、蛇、短吻鳄、海龟、鳄和陆龟。
在某些实施方式中，所述动物是鱼类，包括但不限于鲶鱼、鳗鱼、鲨鱼和剑鱼。
在某些实施方式中，所述动物是两栖类，包括但不限于蟾蜍、蛙、蝾螈和火蜥蜴。
在某些实施方式中，所述分离的视蛋白5(Opn5)是来自鸡的分离的野生型视蛋白5(Opn5)或其片段或变体，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
在某些实施方式中，所述分离的视蛋白5(Opn5)与所述来自鸡的野生型视蛋白5(Opn5)具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
在某些实施方式中，所述分离的视蛋白5(Opn5)是来自海龟的分离的野生型视蛋白5(Opn5)或其片段或变体，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
在某些实施方式中，所述分离的视蛋白5(Opn5)与所述来自海龟的野生型视蛋白5(Opn5)具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
在某些实施方式中，所述分离的视蛋白5(Opn5)具有由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(cOpn5)或其片段或变体，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
在某些实施方式中，所述分离的视蛋白5(Opn5)与所述由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
在某些实施方式中，所述分离的视蛋白5(Opn5)具有由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(tOpn5)或其片段或变体，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
在某些实施方式中，所述分离的视蛋白5(Opn5)与所述由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(tOpn5)具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
所述分离的视蛋白5(Opn5)可以用作方便的光遗传学工具，精确地激活细胞内Gq信号传导和/或激活细胞。
第二方面，本发明涉及一种分离的核酸，其编码第一方面中所述的分离的视蛋白。
在某些实施方式中，所述分离的核酸编码生物体中的野生型视蛋白、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物、其片段或变体，它们具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
第三方面，本发明涉及一种嵌合基因，其包含第二方面中所述的分离的核酸序列，该核实序列与适合的调控序列可操作的连接。
第四方面，本发明涉及一种载体，其包含第二方面中所述的分离的核酸或第三方面中所述的嵌合基因。
所述载体是真核载体、原核表达载体、病毒载体或酵母载体。
在某些实施方式中，所述载体是单纯性疱疹病毒载体、痘苗病毒载体或腺病毒载体、腺相关病毒载体、反转录病毒载体或昆虫载体。
优选地，所述载体是重组AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVS、AAVO或AAV10。
在某些实施方式中，所述载体是表达载体。
在某些实施方式中，所述载体是基因治疗载体。
第五方面，本发明涉及一种分离的细胞或细胞培养物，其包含第二方面中所述的分离的核酸、第三方面中所述的嵌合基因或第四方面中所述的载体。
例如，在HEK 293T细胞中表达cOpn5有力地介导蓝光触发的Gq依赖性Ca2+从细胞内储存的增加。
例如，在小鼠脑中表达cOpn5的星形胶质细胞的光遗传学激活诱导大量的ATP释放。
第六方面，本发明涉及第一方面中所述的分离的视蛋白、第二方面中所述的分离的核酸、第三方面中所述的嵌合基因、第四方面中所述的载体或第五方面中所述的分离的细胞或细胞培养物的用途，其用于治疗由激活Gq信号传导和/或激活细胞所介导的疾病或病症，或涉及激活Gq信号传导和/或激活细胞的疾病或病症。
cOpn5介导的光遗传学可用于以回路依赖性方式激活神经元并控制动物行为。
第七方面，本发明涉及一种治疗由激活Gq信号传导和/或激活细胞所介导的疾病或病症，或涉及激活Gq信号传导和/或激活细胞的疾病或病症的方法，所述方法包括给药第一方面中所述的分离的视蛋白、第二方面中所述的分离的核酸、第三方面中所述的嵌合基因、第四方面中所述的载体或第五方面中所述的分离的细胞或细胞培养物。
在某些实施方式中，所述由激活Gq信号传导和/或激活细胞所介导的疾病或病症，或涉及激活Gq信号传导和/或激活细胞的疾病或病症包括但不限于从激活Gq信号传导和/或激活细胞获益，例如从星形胶质细胞的激活、强烈ATP释放或提高的神经元活性获益的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述由激活Gq信号传导和/或激活细胞所介导的或涉及激活Gq信号传导和/或激活细胞的疾病或病症包括但不限于从激活细胞例如胰岛细胞、免疫细胞、神经细胞例如中枢神经元、星形胶质细胞、神经胶质细胞、肌肉细胞、骨骼细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经系统细胞、皮肤细胞、肺细胞、肾细胞和肝细胞、心肌细胞或血管内皮细胞获益的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述疾病或病症包括但不限于糖尿病、免疫抑制性疾病、阿兹海默氏病、抑郁症、焦虑性神经症、脑溢血等。
在某些实施方式中，所述方法还包括施加波长范围为360nm-550nm、优选地450-500、更优选地460-480nm的蓝光。
在某些实施方式中，所述方法还包括使用长波长(≥920nm)的光进行双光子激活。
本发明中所述的分离的视蛋白对波长在360-550nm、优选地450-500、更优选地460-480nm范围内的光敏感。具体来说，470nm蓝光在细胞中引发最强的Ca2+瞬变，这意味着本发明中所述的分离的视蛋白对波长为470nm的光超敏感。
本发明涵盖了本文中叙述的特定实施方式的所有组合。
附图说明
图1示出了在HEK 293T细胞中cOpn5介导光诱导的Gq信号传导的强烈激活。
图2示出了cOpn5与Gq信号传导偶联但不与Gi信号传导偶联。
图3示出了cOpn5以高的时空分辨率灵敏地介导Gq信号传导的光学控制。
图4示出了cOpn5介导比opto-a1AR、hM3Dq或opn4对光更加快速和敏感的响应。
图5示出了cOpn5有效地介导星形胶质细胞的激活。
图6示出了cOpn5介导的星形胶质细胞的激活在体内诱导大量ATP闪光和神经元激活。
图7示出了cOpn5介导星形胶质细胞中持续可靠的ATP释放和周围神经元的激活。
图8示出了cOpn5介导的光遗传学以神经回路依赖性方式改变小鼠的行为。
图9示出了cOpn5介导的光遗传学可靠地激活神经元。
图10示出了光纤的注入位置和放置。
具体实施方式
在本发明中，测试了来自多个物种的视蛋白、特别是Opn5直系同源物的能力，并发现许多视蛋白敏感且强烈地介导光诱导的Gq信号传导激活和/或激活细胞。
优选地，所述Opn5直系同源物是鸡直系同源物(简称为cOpn5)或海龟直系同源物(简称为tOpn5)。
对Opn5、特别是cOpn5的详细表征揭示出，它对蓝光超灵敏(μW/mm2水平，比现有的基于Gq偶联视蛋白的工具opto-a1AR和opn4灵敏度高～3个数量级)，具有高的时间(响应于10ms光脉冲，比opto-a1AR或opn4快～3个数量级)和空间(亚细胞水平)分辨率，并且不需要添加发色团。具体来说，内源性视黄醛是足够的，不需要添加视黄醛。
本发明进一步证实了cOpn5光遗传学作为一种高效的方法，用于在体内激活星形胶质细胞以诱导大量ATP释放，以及用于激活神经元以在自由移动的小鼠中产生鲁棒性行为变化。这些发现确认，cOpn5和可能的其他Opn5直系同源物可用作有力的光遗传学工具，支持对非可兴奋性细胞和可兴奋性细胞中的与Gq信号传导和/或激活细胞相关的生理和行为功能进行实验研究。
cOpn5介导Gq信号传导的光遗传学激活和/或激活细胞
具体来说，在本发明中，测试了来自鸡、海龟、人和小鼠的Opn5直系同源物(它们彼此具有80～90％的蛋白质序列同一性)，以便确定它们是否具有介导HEK 293T细胞内蓝光诱导的Gq信号传导激活的能力。将用于刺激的蓝光和红色细胞内钙指示剂CalbryteTM630AM染料用于监测相对Ca2+响应。发现来自鸡(cOpn5)和海龟(tOpn5)的Opn5直系同源物介导即时且强烈的光诱导的Ca2+信号的增加(～3ΔF/F)，而在表达人或小鼠Opn5直系同源物的细胞中没有观察到光效应。正如由鸡直系同源物所示例的，cOpn5与EGFP-CAAX膜标志物共定位，表明它被有效运输到质膜上。不需要向培养基添加外源视黄素，这表明内源视黄素足以使cOpn5有功能。Ca2+信号对细胞外Ca2+的去除有抗性，因此表明Ca2+从细胞内储存中释放出来。在两种表达cOpn5的细胞中，Gq蛋白抑制剂(例如YM-254890，一种高选择性Gq蛋白抑制剂)的预孵育可逆地消除了光诱导的Ca2+瞬变。在表达cOpn5而不是表达人OPN5的细胞中，检测到IP3的快速降解产物肌醇磷酸酯(IP1)水平的光诱导的提高；此外，用YM-254890处理降低了这种提高的程度。在表达cOpn5的细胞(例如HEK 293T细胞)中，蓝光也以PKC活性依赖性方式触发了MARCKS蛋白(一种公认的PKC靶点)的磷酸化。相比之下，在有视黄醛的情况下，蓝光照射有效地降低了表达人和小鼠Opn5的细胞中的cAMP水平，但在没有视黄醛的情况下，蓝光照射在表达cOpn5的细胞中没有这种效应。总之，这些数据支持，在HEK 293T细胞中，蓝光照射能够使cOpn5与Gq信号传导通路偶联。
cOpn5介导的光遗传学是灵敏且精确的。
具体而言，在本发明中对cOpn5的光激活性质进行了表征。可以将cOpn5在细胞(例如HEK 293T细胞)中异源表达。尽管Opn5以前被认为是一种紫外(UV)敏感性光感受器，但在固定光强度(100μW/mm2)下用365～630nm范围内的一组波长作图揭示出470nm的蓝光引发最强的Ca2+瞬变，而UVA光(365和395nm)效率较低，更长波长的可见光(561nm或以上)则完全无效。测试了不同光照持续时间对表达cOpn5的HEK 293T细胞的影响，并且短暂光脉冲(1、5、10、20、50ms；16μW/mm2；470nm)进行刺激显示在光照持续时间超过10ms时Ca2+响应达到饱和模式。在该光照强度(16μW/mm2；470nm)下，更长的光照持续时间不会进一步提高Ca2+信号幅度。以不同强度投送470nm的光显示，～4.8μW/mm和16μW/mm的蓝光分别产生约半最数和最大响应。这些数据表明，cOpn5的光敏度比报告的常用的光遗传学工具通道视紫红质-2(ChR2)的数值高2～3个数量级。总之，本发明中的结果表明，cOpn5可以在没有额外视黄醛的情况下作为单组分光遗传学工具起作用，并且cOpn5对蓝光超敏感，它的完全激活需要低的光强度(16μW/mm2)和短的持续时间(10ms)。
将cOpn5的性能与opto-a1AR的性能进行比较，其中opto-a1AR是通过将视紫红质与Gq偶联的肾上腺素能受体混合而工程化改造的嵌合GPCR。按照以前报道的方案，发现需要非常长时间的暴露于强照射(60s；7mW/mm2)才能在表达opto-a1AR的HEK 293T细胞中触发缓慢且小(～0.5ΔF/F)的Ca2+信号增加，15s的照射无效。将cOpn5与opn4的性能进行比较，opn4是一种天然视蛋白，据报道是用于Gq信号传导激活的工具。发现需要长时间暴露于强照射(25s；40mW/mm2)和额外的视黄醛，才能在表达opn4的HEK 293T细胞中触发缓慢(～1ΔF/F)的Ca2+信号增加。因此，与现有的基于视蛋白的工具(opto-a1AR和opn4)相比，cOpn5的光敏性高得多(灵敏度高出～3个数量级)，需要短得多的暴露时间(10ms vs.60s)，并产生更强的响应。
此外，将cOpn5的性能与流行的Gq偶联的化学遗传学工具hM3Dq的性能进行比较，其中hM3Dq通过添加外源小分子配体氯氮平-N-氧化物(CNO)来激活。表达cOpn5的HEK 293T细胞的光诱导的激活，与表达hM3Dq的HEK 293T细胞的CNO诱导的激活具有相近的Ca2+信号的峰值响应幅度。同时，与表达hM3Dq的HEK 293T细胞相比，表达cOpn5的HEK 293T细胞具有更快和时间上更精确的响应，以及更快的恢复时间。这些结果表明，cOpn5介导的光遗传学在时间准确性方面比hM3Dq更加可控。
cOpn5光遗传学允许对细胞活动进行空间上精确的控制。将短暂的光刺激(63ms)限制到单个表达cOpn5的HEK 293T细胞的亚细胞区域中，导致单个细胞的立即激活。有趣的是，在细胞高度汇集的区域中，Ca2+信号传播到周围细胞，从而表明HEK 293T细胞之间存在通过一种尚未确定的机制进行的细胞间通讯。在从新生小鼠脑制备的原代星形胶质细胞培养物中，使用用于cOpn5和EGFP标志物蛋白双顺反子表达的AAV载体表达cOpn5。使用Calbryte 630AM染料监测Ca2+水平，发现用蓝光照射表达cOpn5的星形胶质细胞产生强烈的Ca2+瞬变(～8ΔF/F)。当光刺激(63ms)被精确地仅仅限制到单个表达cOpn5的星形胶质细胞的亚细胞区域时，观察到Ca2+信号在单个细胞内传播。与HEK 293T细胞中的测试类似，观察到Ca2+信号从受刺激的星形胶质细胞逐渐向更远端、未受刺激的星形胶质细胞的波状传播。因此，这些实验证实了，cOpn5光遗传学允许精确的空间控制，并表明研究最初使用神经化学和机械刺激发现的星形细胞网络的动力学可能是有用的。
星形胶质细胞的cOpn5光遗传学激活在体内诱导大量的ATP释放和神经元激活
测试了cOpn5介导的光遗传学在体内的性能。星形胶质细胞代表了中枢神经系统中非可兴奋性细胞的重要群体，迄今为止光遗传学工具在该群体中仅获得了有限的成功。已知ATP是星形胶质细胞间的通讯信使；然而，细胞内Ca2+对ATP释放的实时影响尚未被可视化。利用了最近报道的基于GPCR激活的超灵敏ATP传感器GRABATP，来监测细胞外ATP水平的变化。具体而言，在注入含GfaABC1D启动子(其通常用于在星形胶质细胞中的驱动基因表达)的AAV载体后，在小鼠S1感觉皮层中表达了cOpn5和GRABATP传感器。
对来自头部固定的清醒、行为正常的小鼠的GRABATP信号进行双光子成像。引人注目的是，所投送的用于成像的920nm的光本身，在表达cOpn5和GRABATP的小鼠中触发了大量的ATP闪光，但在表达ATP传感器但缺乏cOps5表达的小鼠中却没有。不需要蓝光脉冲来刺激ATP信号。单个ATP闪光的直径通常在20-100μm的范围内，并持续～1min。在～1min的最初静止期后，闪光频率逐渐增加，在～5min内达到峰值，在成像区域(640×640μm2)内达到～50次闪光/min的水平。此外，在重复试验中也出现了高频ATP闪光。在单独表达GRABATP的小鼠中，观察到零星的ATP事件(在成像区域内～0.3次闪光/min)；在腹膜内注射脂多糖(LPS)进行促炎性处理后8小时，ATP闪光事件增加到基础条件(～2次闪光/min)的近6倍，但表现出相当稳定的频率，这证实了炎症诱导大脑中ATP的释放。鉴于在表达cOpn5的小鼠中观察到的ATP闪光频率是不表达Opn5的小鼠经促炎性处理后的闪光频率的～25倍，证实了cOpn5介导的星形胶质细胞的光激活在体内诱导连续大量的ATP释放。
星形胶质细胞释放ATP，并且其他神经胶质递质也作用于神经元受体，以调节神经元活性。使用cOpn5介导的星形胶质细胞活化，对头部固定的、清醒且行为正常的小鼠的神经元Ca2+信号进行双光子成像。表达cOpn5的细胞(n＝406)与GFAP染色(n＝397)共定位，但不与表达GCaMP7b的神经元共定位。原始追踪实例和组群数据显示，15-20min与0-5min相比，cOpn5介导的星形胶质细胞活化显著提高了神经元活性。cOpn5严格地在星形胶质细胞中表达，这通过表达cOpn5的细胞和GFAP染色信号(其不同于神经元的GCaMP7b信号)共定位得到了证实。证实了cOpn5介导的星形胶质细胞的光激活在体内提高了周围神经元的活性。此外，本发明显示，用于双光子成像的脉冲激光中的长波长(920nm)光能够激活cOpn5，表明cOpn5可能具有双光子光遗传学。
cOpn5光遗传学激活神经元并调节动物行为
探讨了cOpn5介导的光遗传学在神经元中的应用。首先检查了cOpn5是否能够介导光诱导的Ca2+信号。使用AAV和泛神经元SYN启动子，在小鼠皮层神经元中表达了cOpn5和遗传编码的Ca2+传感器jRGECO1a(图8a)。在脑切片样本中，施加蓝光脉冲(10s；100μW/mm2；473nm)可靠地诱发神经元中的Ca2+瞬变(图8b、图8c)。因此，cOpn5也能够在神经元中进行光诱导的激活。
研究了光诱导的cOpn5激活对运动皮层、海马体和背侧纹状体的切片样本中神经元的电生理性质的影响(图8d)。观察到两种类型的激活模式。在大多数记录的神经元中，蓝光脉冲以电压钳模式诱导小的去极化电流(～20pA)，并以电流钳模式诱导动作电位的延迟但剧烈的放电(图8e，左侧，n＝12个神经元)。在较高频率的光脉冲下，cOpn5在初始光脉冲后驱动更多的锋电位，具有更短的潜伏期(～5s至～3s)，而内向电流没有受到显著影响(图9a)。在另一个神经元亚群中，短暂的光脉冲迅速唤起强烈的内向电流(100-1000pA)，并驱动动作电位的簇状爆发(bursting firing)(图8e，右侧，n＝6个神经元)。神经元经10Hz、10ms/脉冲的重复刺激，在光刺激的重复试验中表现出发放率(firing rate)的非衰减模式(图9b)。值得注意的是，与ChR2光遗传学所产生的不同，由cOpn5光刺激唤起的动作电位不与光脉冲在时间上同步。
最后，评估了cOpn5介导的光遗传学在调节动物行为中的用途。外侧下丘脑(LH)是已知在奖赏处理和进食行为中具有功能的大脑中心。我们在VGAT-Cre小鼠的LH GABA能神经元中表达cOpn5，并植入光纤，将光脉冲输送到行为自由的小鼠的LH中(图8g)。与在先发现的激活LH GABA神经元驱动进食行为56一致，光刺激(20Hz；5ms/脉冲；473nm；0.75mW，从纤维尖端输出)在表达cOpn5的小鼠中引发了食物摄入的显著增加，但没有在表达EGFP的对照小鼠中引发食物摄入的显著增加(图8h)。还使用觅食行为任务，测试了在未定带(ZI)中的cOpn5介导的GABA神经元的光遗传学激活的作用(图8i)，其中未定带是已知驱动强迫性进食的区域。与表达EGFP的小鼠相比，表达cOpn5的小鼠在重复的光刺激后，觅食高脂肪食物颗粒的时间显著增加(图8j)。对LH和ZI的表达cOpn5的神经元进行电生理记录，以表征响应谱。通过全脑切片，确认了光纤的注入部位和放置(图10a-10c)。值得注意的是，小鼠在开灯时保持所述行为(进食行为或高脂肪食物觅食行为)，并在关灯时立即停止这种行为。因此，cOpn5有效地快速、准确且可逆地调节动物的行为状态。
在这里，本发明证实了，本发明的Opn5作为用于激活Gq信号传导和/或激活细胞的极其有效的光遗传学工具的用途。先前的研究将哺乳动物Opn5表征为UV敏感的Gi偶联视蛋白；我们呈现了令人吃惊的发现，即在表达Opn5(例如表达cOpn5或表达tOpn5)的哺乳动物细胞中，可见蓝光可以诱导快速的Ca2+瞬变、IP1积累和PKC激活。本发明的Opn5(特别是cOpn5)在小鼠星形胶质细胞中，在体内有效地介导光唤起的强烈的ATP释放，并提高神经元活性。本发明还表明，Opn5、特别是cOpn5允许神经元发生快速、稳健和可逆的光学激活，并将其应用于动物行为的选择性调节。重要的是，本发明中的Opn5(例如cOpn5)是一种强大且易于使用的单组分系统，不需要外源发色团。本发明设想，基于Opn5的光遗传学，例如基于cOpn5光遗传学，将是一种能用于在非可兴奋性和可兴奋性细胞中研究由Gq偶联的信号传导和/或激活细胞调节的重要生理和行为功能的技术。
表6通过将cOpn5与其他光遗传学工具的响应幅度、光敏感性、时间分辨率以及对额外发色团的需求进行直接比较，列出了cOpn5的赋能特点。对于表达cOpn5的细胞来说，仅仅16μW/mm2强度的10ms蓝光脉冲即可唤起Ca2+信号的快速增加，峰值振幅为3～8ΔF/F。相比之下，在本发明之前，已揭示了opto-a1AR或哺乳动物Opn4(两种被提出用于Gq信号传导的光遗传学工具)的激活，需要～3倍高的光强度(7～40mW/mm2)和持久的光暴露(20～60s)，并且仅产生弱Ca2+信号(0.25～0.5ΔF/F)。因此，opto-a1AR或哺乳动物Opn4不能模拟内源性Gq偶联受体的快速激活谱，其中内源性Gq偶联受体通常在施加其相应配体亚秒后触发强Gq信号传导。在体内响应于cOpn5介导的星形胶质细胞和神经元的光学激活所显示出的惊人的生理和行为效应，证实了cOps5光遗传学的能力。相比之下，最近的系统性表征显示，opto-a1A和Opn4介导的光遗传学刺激不增加Ca2+信号的幅度，并且即使在长时间照射后也只轻微地调节Ca2+瞬变和突触事件的频率(Gerasimov等，2021；Mederos等，2019)。通过克服与opto-a1AR和Opn4介导的光遗传学相关的光敏感性、时间分辨率和响应幅度上的限制，本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)将在研究大量细胞和组织中的Gq信号传导和/或激活细胞的机制和功能中具有广泛的适用性。
基于本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)的光遗传学也具有安全性和便利性的优点。尽管据报道来自许多物种的Opn5是UV响应性的(Kojima等，2011)，但cOpn5最适宜被470nm的蓝光激活，蓝光的穿透性比UV更好，并避免了与UV相关的细胞毒性。它对光的超敏感性也将潜在的加热伪影(heating artifact)降至最低。它可使用长波长(≥920nm)光进行双光子激活，这表明它适于使用脉冲激光进行更深层的组织激活。cOpn5或tOpn5被光强烈且可重复地激活，不需要外源性视黄醛，这可能是因为cOpn5或tOpn5是一种与内源视黄醛共价结合的双稳态视蛋白，因此对光漂白具有抗性(Koyanagi和Terakita，2014；Tsukamoto和Terakita，2010)。相比之下，Opn4的哺乳动物实验需要额外的视黄醛，并且响应时间长且光敏感性低。本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)作为单组分系统对体内研究特别有用，因为它避免了在实验期间将化合物递送到组织中的负担。
与化学遗传学和解笼(uncaging)工具相比，本发明的Opn5的光遗传学(特别是cOpn5或tOpn5的光遗传学)还提供了一些重要优点。它在时间上要精确得多，并提供单细胞甚至亚细胞的空间分辨率。尽管CNO/hM3Dq介导的化学遗传学已被用于研究非可兴奋性细胞例(如大脑中的星形胶质细胞)的生理和行为功能(Agulhon等，2013；Shen等，2021)，但它在体内的使用通常需要几分钟才能使CNO到达其靶细胞和组织。化合物的扩散本质表明，以细胞和亚细胞的分辨率对Gq信号传导进行化学遗传学刺激是几乎不可能的。本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)也不同于基于笼锁化合物的“解笼”工具(例如笼锁钙和笼锁IP3)，因为这些工具需要化合物预装载，并且仅部分模拟与Gq信号传导和/或激活细胞相关的Ca2+相关通路。还存在其他“解笼”工具，例如靶向内源性GPCR的笼锁谷氨酸盐和笼锁ATP(Ellis-Davies，2007；Lezmy等，2021)。然而，这些笼锁化合物需要将其引入到细胞外的介质或细胞内的胞质中，这限制了它们在行为动物中的应用(Adams和Tsien，1993b)。本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)相对于“解笼”工具的优势通过实验得到了清楚的证明，本发明的Opn5(特别是cOps5或tOpn5)类似于现有的基于ChR2的工具，能同样方便地用于调节动物行为。
本发明的Opn5(特别是cOps5或tOpn5)的光遗传学特别适用于精确激活细胞内的Gq信号传导和/或激活细胞，其随后触发细胞内储存的Ca2+释放并激活PKC。本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)不同于当前基于通道的光遗传学工具，例如跨质膜转移阳离子的ChR2或其变体。通过控制细胞膜电位，从而控制动作电位放电，ChR2及其变体对剖析神经回路具有巨大贡献；然而，它们的成功在研究缺乏产生动作电位的活性离子通道的非可兴奋性细胞方面受到更多的限制(Gourine等，2010)。除了应用于非可兴奋性细胞之外，本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)的光遗传学还可以刺激神经元中的Gq信号传导和/或激活神经元，并以回路依赖性方式控制动物行为。值得注意的是，Gq偶联GPCR可能不加区分地招募G蛋白，并以受体和细胞特异性方式产生可变的下游信号传导。事实上，我们观察到相同的光照参数在不同的神经元中产生不同的激活模式。本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)介导的光遗传学激活，不会像ChR2那样在神经元中精确地产生严格时间锁定的动作电位爆发(firing)。这可能是有用的，因为它避免了人为的同步神经元激活。然而，如果需要对动作电位爆发进行时间上的精确控制，我们建议使用基于离子通道的光遗传学工具。
除了技术进步外，我们的发现对体内星形胶质细胞的信号传导和/或激活也有一些功能上的作用。尽管ATP被认为是一种重要的神经胶质递质，但以前的研究揭示了多种释放机制，这些释放机制取决于处理方法，细胞外Ca2+的存在，以及细胞和组织制备样本的确切形式(Figueiredo等，2014；Hamilton和Attwell，2010)。此外，通常间接监测ATP释放的存在。尚不清楚激活星形胶质细胞是否触发ATP释放，如果是的话，这种释放在体内是如何表现的。在这里，我们首次证明了，刺激星形胶质细胞内的Gq信号传导通路以ATP闪光的形式触发大量的ATP释放。本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)的光遗传学提供了一种研究ATP释放的分子和细胞机制的理想技术。除了ATP之外，星形胶质细胞的激活还导致其他神经胶质递质例如D-丝氨酸、谷氨酸和GABA的释放。ATP也可以被转化为其他代谢产物，例如腺苷。神经胶质递质及其代谢产物可以对神经元的可兴奋性和突触强度发挥复杂的调节作用。例如，尽管ATP可以通过各种P2X和P2Y受体激活神经元，但腺苷通过A1受体强烈抑制神经元(Lezmy等，2021；Zhang等，2003)。尚不清楚这些不同的作用是如何整合在一起，在体内调节神经元活动的。在这里，我们揭示了表达cOpn5的星形胶质细胞的光遗传学激活显著刺激小鼠S1皮层中的神经元。因此，本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)的光遗传学为剖析星形胶质细胞与神经元之间的复杂相互作用的分子、细胞和回路机制奠定了基础。体内实验还表明，本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)与光遗传学探针和成像传感器(例如遗传编码的Ca2+指示剂和基于GPCR的神经递质传感器)具有相容性。本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)与这些传感器一起，潜在地允许全光学方法瞬时激活Gq信号传导和/或激活细胞，并同时监测相关效应。
总之，本发明证明了本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)作为蓝色光敏视蛋白，用于快速、可逆且精确地激活Gq信号传导和/或激活细胞。本发明还将本发明的Opn5(特别是cOpn5或tOpn5)确立为，用于激活非可兴奋性细胞和神经元的强大且易于使用的光遗传学工具。鉴于Gq偶联的GPCR的重要性，预计cOpn5将在剖析所有主要细胞类型和组织中的Gq信号传导的机制和功能方面具有广泛的应用。
作为说明而非限制，提供了特定实施方式和实施例的描述。本领域技术人员将会容易地认识到，可以对各种非关键参数进行改变或修改以产生基本相似的结果。
实施例
材料和方法：
表1：用于克隆的引物
表2：重组DNA
| pcDNA3.1-opto-a1AR-EYFP | Addgene质粒#20947 |
| EGFP-CAAX | 来自李毓龙的馈赠 |
| pLJM1-EGFP | Addgene质粒#19319 |
| pAAV-GfaABC1D-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene质粒#50478 |
| pAAV-EF1a-DIO-eGFP-WPRE-pA | N/A |
| pAAV-hSyn-GOI | N/A |
| pLJM1-cmv-cOpn5 | N/A |
| pLJM1-cmv-tOpn5 | N/A |
| pLJM1-cmv-hOPN5 | N/A |
| pLJM1-cmv-mOpn5 | N/A |
| pLJM1-cmv-V5-Opn5 | N/A |
| pLJM1-cmv-cOpn5-T2A-eGFP | N/A |
| PAAV-hSyn-cOpn5-T2A-eGFP-WPR-pA | N/A |
| PAAV-GfaABC1D-cOpn5-T2A-eGFP-WPR-pA | N/A |
| pAAV-EF1a-DIO-cOpn5-T2A-eGFP-WPRE-pA | N/A |
| PAAV-GfaABC1D-cOpn5-T2A-mCherry-WPR-pA | N/A |
表3：病毒株
表4：光激发源
表5：显微镜设备
表6：统计分析
实施例1.cOpn5介导Gq信号传导的光遗传学激活
测试了来自鸡、海龟(turtle)、人和小鼠的Opn5直系同源物(它们彼此具有80～90％的蛋白质序列同一性)的异源表达是否具有在HEK 293T细胞内介导蓝光诱导的Gq信号传导激活的能力(图1a和表7)。使用蓝光进行刺激，使用红色细胞内钙指示剂CalbryteTM630AM染料来监测相对的Ca2+响应(图1b)。来自鸡(cOpn5)和海龟(tOpn5)的Opn5直系同源物介导Ca2+信号的即时且强烈的光诱导的增加(～3ΔF/F)，而表达人或小鼠Opn5直系同源物的细胞没有观察到光效应(图1d和图2a、图2b)。正如由鸡直系同源物所示例的，cOpn5与EGFP-CAAX膜标志物共定位，表明它被高效运输到质膜(图1c)。没有向培养基添加外源视黄素，表明内源视黄素足以使cOpn5有功能。Ca2+信号对细胞外Ca2+的去除有耐受性，因此表明Ca2+从细胞内储存中释放(图2c)。YM-254890(高选择性Gq蛋白抑制剂33)的预孵育，可逆地废除了两种表达cOpn5的细胞中的光诱导的Ca2+瞬变(图1e)。在表达cOpn5(而不是人OPN5)的细胞中，检测到IP3快速降解产物肌醇磷酸盐(IP1)水平的光诱导的提高；此外，用YM-254890处理降低了该提高的程度(图1f和图2d)。在表达cOpn5的HEK 293T细胞中，蓝光也以PKC活性依赖的方式，触发MARCKS蛋白(PKC的公认靶点34)的磷酸化(图1g和图2e)。相比之下，在有视黄醛的表达人和小鼠Opn5的细胞中，蓝光照射有效地降低了cAMP水平，但在没有视黄醛的表达cOpn5的细胞中没有这种效应(图2f)。总之，这些数据支持，在HEK 293T细胞中，蓝光照射能够使cOpn5与Gq信号传导通路偶联。
表7：视蛋白和物种
| 别名 | 物种 | ||
| 鸡Opn5 | cOpn5 | 原鸡(Gallus gallus) | GenBank NM_001130743.1 |
| 海龟Opn5 | tOpn5 | 绿海龟(Chelonia mydas) | GenBank XM_007068312.4 |
| 人Opn5 | hOPN5 | 智人(Homo sapiens) | GenBank AY377391.1 |
| 小鼠Opn5 | mOpn5 | 小鼠(Mus musculus) | GenBank NM_181753.4 |
图1示出了cOpn5在HEK 293T细胞中介导光诱导的Gq信号传导的强激活。
a，假定的响应于光诱导的cOpn5激活的细胞内信号传导示意图。PLC：磷脂酶C；PIP2：磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸；IP3：肌醇-1,4,5-三磷酸；IP1：肌醇单磷酸；DAG：二酰基甘油；PKC：蛋白激酶C；YM-254890：一种选择性Gq蛋白抑制剂。
b，在表达三个物种(原鸡(Gallus gallus)、智人(Homo sapiens)和小鼠(Musmusculus))的Opn5的HEK 293T细胞中，在蓝光刺激(10s；100μW/mm2；488nm)之前和之后Ca2+信号的伪彩色图像。比例尺，10μm。
c，在HEK 293T细胞中，Cy3复染的V5-cOpn5融合蛋白(红色)与膜标签EGFP-CAAX(绿色)共定位。DAPI复染(蓝色)指示细胞核。比例尺，10μm。
d，c中示出细胞的光唤起的Ca2+信号的时程变化。
e，Gq蛋白抑制剂YM-254890(10nM)可逆地阻断cOpn5介导的光诱导的Ca2+信号。
f，在表达cOpn5的HEK 293T细胞中，YM抑制由连续光刺激(3min；100μW/mm2；470nm)唤起的IP1积累(左)。***P<0.0001，*P＝0.0128；Tukey's多重比较检验。
g，在对照组(无光刺激)、光刺激组和光+星孢菌素(ST，PKC抑制剂)组中，表达cOpn5的HEK 293T细胞中MARCKS的磷酸化。将同一级分中p-MARCKS的量相对于α-微管蛋白的量进行标准化。**P＝0.0096，***P＝0.0004；Tukey's多重比较检验。
图2示出了cOpn5偶联到Gq信号传导，但不偶联到Gi信号传导
a，在表达来自海龟物种(绿海龟(Chelonia mydas))的Opn5的HEK 293T细胞中，在蓝光刺激(10s；100μW/mm2；488nm)之前和之后Ca2+信号的伪彩色图像。比例尺，10μm(左)；响应细胞中的光唤起的Ca2+信号的时程变化(右)。
b，Gq蛋白抑制剂YM-254890(10nM)可逆地阻断cOpn5和海龟Opn5介导的光诱导的Ca2+信号的组数据。****P<0.0001，单向ANOVA。误差条表示S.E.M.。
c，在没有细胞外Ca2+的情况下，使用光刺激(10ms；16μW/mm2；470nm)产生的Ca2+信号的时程变化。
d，在有或没有光刺激的情况下，表达人Opn5的HEK 293T细胞中的IP1积累(右)。n.s.，无显著差异；非配对t检验。
e，在对照组(无光刺激)、光刺激组和光+星孢菌素组中，表达cOpn5的HEK 293T细胞中MARCKS的磷酸化的一个代表性结果。将同一级分中p-MARCKS的量相对于α-微管蛋白的量进行标准化。
f，在培养基中没有附加视黄醛的情况下，光对表达cOpn5的HEK 293T细胞中的cAMP水平没有影响(10μM毛喉素预孵育)(左图)。右图显示了，在10μM视黄醛预孵育后，光刺激对表达四个不同物种的Opn5的HEK 293T细胞中的cAMP浓度的影响。
d和f中的误差条表示S.E.M.。
实施例2.cOpn5介导的光遗传学是灵敏且精确的
对在HEK 293T细胞中异源表达的cOpn5的光激活性质进行了表征。尽管Opn5以前被认为是一种紫外(UV)敏感性光感受器27，但在固定光强度(100μW/mm2)下用365～630nm范围内的一组波长作图揭示出470nm的蓝光引发最强的Ca2+瞬变，而UVA光(365和395nm)效率较低，更长波长的可见光(561nm或以上)则完全无效(图3a)。测试了不同光照持续时间，对表达cOpn5的HEK 293T细胞的影响。用短暂光脉冲(1、5、10、20、50ms；16μW/mm2；470nm)刺激，显示在光照持续时间超过10ms时Ca2+响应达到饱和模式(图3b)。在该光照强度(16μW/mm2；470nm)下，更长的光照持续时间没有进一步提高Ca2+信号幅度(图4a)。以不同强度投送470nm的光显示，～4.8μW/mm2和16μW/mm2的蓝光分别产生约半数和最大响应(图3c和图4b)。因此，cOpn5的光敏度比报告的光敏性Gq偶联GPCR的数值高3～4个数量级，甚至比常用的光遗传学工具通道视紫红质-2(ChR2)的数值高2～3个数量级(Lin，2011；Zhang等，2006)(表8)。总之，这些结果表明，cOpn5可以在没有额外视黄醛的情况下，作为单组分光遗传学工具起作用，并且cOpn5对蓝光超敏感，因为它的完全激活需要低光强度(16μW/mm2)和短的持续时间(10ms)。
表8：cOpn5与其他光遗传学工具的比较
将cOpn5的性能与opto-a1AR的性能进行比较，其中opto-a1AR是通过将视紫红质与Gq偶联的肾上腺素能受体混合而工程化改造的嵌合GPCR。按照以前报道的方案14，发现需要非常长时间的暴露于强照射(60s；7mW/mm2)才能在表达opto-a1AR的HEK 293T细胞中触发缓慢且小(～0.5ΔF/F)的Ca2+信号增加，15s的照射无效(图4c、图4d)。将cOpn5与opn4的性能进行比较，其中opn4是一种天然视蛋白，据报道是用于Gq信号传导激活的工具。发现需要长时间的暴露于强照射(25s；40mW/mm2)和额外的视黄醛才能在表达opn4的HEK 293T细胞中触发缓慢(～1ΔF/F)的Ca2+信号增加(图4e、图4f)。因此，与现有的基于视蛋白的工具(opto-a1AR和opn4)相比，cOpn5的光敏性高得多(灵敏度高出～3个数量级)，需要短得多的暴露时间(10ms相比于60s)，并产生更强的响应。
此外，将cOpn5的性能与流行的Gq偶联的化学遗传学工具hM3Dq的性能进行比较，后者通过添加外源小分子配体氯氮平-N-氧化物(CNO)来激活37-39。表达cOpn5的HEK 293T细胞的光诱导的激活与表达hM3Dq的HEK 293T细胞的CNO诱导的激活具有相近的Ca2+信号的峰值响应幅度。同时，与表达hM3Dq的HEK 293T细胞相比，表达cOpn5的HEK 293T细胞具有更快和时间上更精确的响应，以及更快的恢复时间(图4g～图4i)。这些结果表明cOpn5介导的光遗传学在时间准确性方面比hM3Dq更加可控。
cOpn5光遗传学允许对细胞活动在空间上进行精确的控制。将短暂的光刺激(63ms)限制到单个表达cOpn5的HEK 293T细胞的亚细胞区域中，导致单个细胞的立即激活。有趣的是，在细胞高度汇集的区域中，Ca2+信号传播到周围细胞，从而表明HEK 293T细胞之间存在通过一种尚未确定的机制进行的细胞间通讯(图3d、图3e)。所述发现被扩展到原代细胞培养物中。在从新生小鼠脑制备的原代星形胶质细胞培养物中，使用用于cOpn5和EGFP标志物蛋白双顺反子表达的AAV载体表达cOpn5(图5a)。使用Calbryte 630AM染料监测Ca2+水平，发现用蓝光照射表达cOpn5的星形胶质细胞产生强烈的Ca2+瞬变(～8ΔF/F)(图5b、图5c)。当光刺激(63ms)被精确地仅限制到单个表达cOpn5的星形胶质细胞的亚细胞区域时，观察到Ca2+信号在单个细胞内传播(图3f)。与HEK 293T细胞中的测试类似，观察到Ca2+信号从受刺激的星形胶质细胞逐渐向更远端、未受刺激的星形胶质细胞的波状传播(图3g、图3h)。因此，这些实验证实了cOpn5光遗传学允许精确的空间控制，并表明研究最初使用神经化学和机械刺激发现的星形细胞网络的动力学40,41可能是有用的。
图3显示cOpn5以高时间和空间分辨率敏感地介导Gq信号传导的光学控制。
a，所选波长(365、395、470、515、561、590和630nm；左图)和表达cOpn5的HEK 293T细胞对不同波长的光刺激做出响应的Ca2+信号的幅度(2s；100μW/mm2；右图)的示意图。误差条表示S.E.M.。
b，在不同光刺激持续时间(1、5、10、20或50ms；16μW/mm2；470nm)下的响应幅度。误差条表示S.E.M.。
c，在不同光强度下cOpn5介导的Ca2+信号的时程变化(0、4.8、8、16或32μW/mm2；10ms；470nm；对于10ms 16μW/mm2刺激来说，10％峰值激活＝1.36±0.55s；90％峰值激活＝2.37±0.87s；衰减时间τ＝18.66±4.98s，平均值±S.E.M.；n＝10个细胞)。
d，在表达cOpn5的HEK 293T细胞中光诱导(63ms；17μW；箭头指向刺激区)的Ca2+信号传播的图像。比例尺，10μm。
e，示出了d的Ca2+信号跨时间传播过程的伪彩色图像(帧N/(N-1)>1)。帧间隔为500ms，每帧计数一次。
f，在亚细胞区域中受到刺激的单个表达cOpn5的原代星形胶质细胞中光诱导的Ca2+信号传播的图像(刺激尺寸为4×4μm2，帧间隔为300ms)。比例尺，10μm。
g，在表达cOpn5的原代星形胶质细胞中光诱导的Ca2+信号传播的图像。比例尺，10μm。
h，示出了g的Ca2+信号跨时间传播过程的伪彩色图像(帧N/(N-1)>1)。帧间隔为500ms，每帧计数一次。
图4示出了cOpn5介导比opto-a1AR、hM3Dq或opn4对光更快速和敏感的响应。
a，使用光脉冲(16μW/mm2；470nm；1、5、10、20或50ms)时Ca2+信号的时程变化。
b，在10ms、470nm的不同光强度(0、4.8、8、16或32μW/mm2)下的响应幅度。
c，在表达opto-a1AR的HEK 293T细胞中，基线和峰值Ca2+信号(ΔF/F0)的伪彩色图像。培养基缓冲液含有10μM全反式视黄醛。比例尺，30μm。
d，在表达opto-a1AR的HEK 293T细胞中，60s光刺激对Ca2+的影响(n＝15个细胞；上图)，15s光刺激对Ca2+信号没有影响(下图)。
e，在表达人OPN4的HEK 293T细胞中，基线和峰值Ca2+信号(ΔF/F0)的伪彩色图像。培养基缓冲液含有10μM全反式视黄醛。比例尺，30μm。
f，在表达OPN4的HEK 293T细胞中，在10uM ATR下25s光刺激对Ca2+的影响(n＝12个细胞；红线)，在没有ATR的情况下对Ca2+信号没有影响(黑色图)。
g，在表达cOpn5的HEK 293T细胞中光刺激对Ca2+信号的影响。上图示出了基线和峰值响应的伪彩色图像。下图示出了横跨5个连续试验，在表达cOpn5的HEK 293T细胞中由cOpn5介导的光遗传学刺激唤起的Ca2+信号的热图。比例尺，20μm。
h，在表达hM3Dq的HEK 293T细胞中，化学遗传学刺激对Ca2+信号的影响。
i，分别由cOpn5介导的光遗传学刺激(10s)和hM3Dq介导的使用少量CNO的化学遗传学刺激(100nM；10s)唤起的Ca2+信号的时程变化。
图5示出了cOpn5有效地介导星形胶质细胞的激活。
a，使用AAV-cOpn5-T2A-EGFP(绿色)在培养的原代星形胶质细胞中表达cOpn5。通过GFAP免疫染色(红色)确认星形胶质细胞的身份。比例尺，20μm。
b，表达cOpn5的星形胶质细胞在光刺激后的基线和峰值Ca2+信号的伪彩色图像。比例尺，20μm。
c，Ca2+信号的图和遍及试验的Ca2+信号的热图图谱(n＝25个细胞)。
实施例3星形胶质细胞的cOpn5光遗传学激活在体内诱导大量的ATP释放和神经元激活
测试了cOpn5介导的光遗传学在体内的性能。星形胶质细胞代表了中枢神经系统中非可兴奋性细胞的重要群体，迄今为止光遗传学工具在该群体中仅获得了有限的成功42。已知ATP是星形胶质细胞间的通讯信使；然而，细胞内Ca2+对ATP释放的实时影响尚未被可视化。利用了基于GPCR激活的超灵敏ATP传感器GRABATP，来监测细胞外的ATP水平的变化。具体而言，在注入含GfaABC1D启动子(其通常用于在星形胶质细胞中的驱动基因表达)的AAV载体后，在小鼠S1感觉皮层中表达了cOpn5和GRABATP传感器(图6a)。
对来自头部固定的清醒、行为正常的小鼠的GRABATP信号进行双光子成像(图6a)。最初预计，除了用于双光子成像的脉冲激光的920nm光之外，刺激ATP信号还需要蓝光脉冲。引人注目的是，所投送的用于成像的920nm的光本身在表达cOpn5和GRABATP的小鼠中触发了大量的ATP闪光，但在表达ATP传感器但缺乏cOps5表达的小鼠中却没有触发ATP闪光。单个ATP闪光的直径通常在20-100μm的范围内，并持续～1min。在～1min的最初静止期后，闪光频率逐渐增加，并在～5min内达到峰值，在成像区域(640×640μm2)内达到～50次闪光/min的水平(图6b、图6c和图7a)。此外，在重复试验中也出现了高频ATP闪光(图7b)。在单独表达GRABATP的小鼠中，观察到零星的ATP事件(在成像区域内～0.3次闪光/min)；在腹膜内注射脂多糖(LPS)进行促炎性处理后8小时，ATP闪光事件增加到基础条件(～2次闪光/min)的近6倍，但表现出相当稳定的频率，这证实了炎症诱导大脑中ATP的释放。鉴于在表达cOpn5的小鼠中观察到的ATP闪光频率是不表达Opn5的小鼠经促炎性处理后的闪光频率的～25倍(图6d、图7c)，证实了cOpn5介导的星形胶质细胞的光激活在体内诱导连续大量的ATP释放。
星形胶质细胞释放ATP，并且其他神经胶质递质也作用于神经元受体以调节神经元活性。使用cOpn5介导的星形胶质细胞活化，对头部固定的、清醒且行为正常的小鼠的神经元Ca2+信号进行双光子成像(图6e)。表达cOpn5的细胞(n＝406)与GFAP染色(n＝397)共定位，但不与表达GCaMP7b的神经元共定位(图6f)。原始追踪实例和组群数据显示，15-20min与0-5min相比，cOpn5介导的星形胶质细胞活化显著提高了神经元活性(图6g、图6h和图7d)。cOpn5严格地在星形胶质细胞中表达，这通过表达cOpn5的细胞和GFAP染色信号(其不同于神经元的GCaMP7b信号)共定位得到了证实。我们证实了cOpn5介导的星形胶质细胞的光激活在体内提高了周围神经元的活性。此外，我们的数据表明，用于双光子成像的脉冲激光中的长波长(920nm)光能够激活cOpn5，表明cOpn5可能具有双光子光遗传学。
图6显示了cOpn5介导的星形胶质细胞的激活在体内诱导了大量的ATP闪光和神经元激活。
a，用于在cOpn5介导的星形胶质细胞激活后，进行ATP释放的体内双光子成像(920nm)的实验设置的示意图。图像示出了在小鼠S1皮层内，cOpn5(红色)在星形胶质细胞中的表达和GRABATP传感器(绿色)在星形胶质细胞中的表达。比例尺，100μm。
b，在对照小鼠(无cOpn5表达)、LPS处理的小鼠(无cOpn5表达)和表达cOpn5的小鼠(右侧)中星形细胞ATP闪光事件数随时间的变化(0～10min)。
c，在对照小鼠(无cOpn5表达)、LPS处理的小鼠(无cOpn5表达)和表达cOpn5的小鼠中的总ATP闪光事件。左列显示了在基础水平时(光递送之前)的原始GRABATP图像，中间列显示了在5min时的GRABATP信号，右列显示了在0-20min期间累积的伪彩色编码的ATP闪光事件。
d，对应c中示出的数据，星形细胞ATP闪光事件随时间推移的光栅图。
e，用于在cOpn5介导的星形胶质细胞激活后，对神经元钙成像进行体内双光子成像(920nm)的实验设置的示意图。图像示出了在小鼠S1皮层内，cOpn5(红色)在星形胶质细胞中的表达和GCaMP7b(绿色)在星形胶质细胞中的表达。比例尺，100μm。
f，表达cOpn5的细胞(红色)与经647nm染料复染的GFAP细胞(紫色)共定位，表达GCaMP7b的细胞(绿色)是神经元。406个红色细胞和397个紫色细胞，比例尺，100μm。
g，10个表达GCaMP7b的神经元在0～5min和15～20min内的时间迹线，与cOpn5介导的星形胶质细胞激活相偶联。
h，表达GCaMP7b的神经元在0～5min和15～20min内的钙事件分析，与cOpn5介导的星形胶质细胞激活相偶联。N＝193个神经元，****P<0.0001，非配对t检验。
图7显示了cOpn5介导星形胶质细胞中持续可靠的ATP释放和周围神经元的激活。
a，在表达cOpn5的小鼠中检测到的星形细胞ATP闪光事件的实例，不同颜色指示单个闪光。
b，在1小时后的重复试验中，表达cOpn5的小鼠中的ATP闪光事件(0～20min)。
c，对照、LPS和cOpn5组的ATP闪光事件数的量化。对照-LPS比较，**P＝0.0066；LPS-cOpn5比较，**P＝0.0031；对照-cOpn5比较，***P＝0.0002，非配对t检验。
d，表达GCaMP7b的神经元在0～5min和15～20min内的解码锋电位发放率分析，与cOpn5介导的星形胶质细胞激活相偶联。N＝193个神经元，***P<0.0001，非配对t检验。
实施例4光遗传学激活神经元并调节动物行为
探讨了cOpn5介导的光遗传学在神经元中的应用。首先检查了cOpn5是否能够介导光诱导的Ca2+信号。使用AAV和泛神经元SYN启动子，在小鼠皮层神经元中表达了cOpn5和遗传编码的Ca2+传感器jRGECO1a(图8a)。在脑切片样本中，施加蓝光脉冲(10s；100μW/mm2；473nm)可靠地诱发神经元中的Ca2+瞬变(图8b、图8c)。因此，cOpn5也能够在神经元中进行光诱导的激活。
接下来研究了光诱导的cOpn5激活对运动皮层、海马体和背侧纹状体的切片样本中神经元的电生理性质的影响(图8d)。观察到两种类型的激活模式。在大多数记录的神经元中，蓝光脉冲以电压钳模式诱导小的去极化电流(～20pA)，并以电流钳模式诱导动作电位的延迟但剧烈的放电(图8e，左侧，n＝12个神经元)。在较高频率的光脉冲下，cOpn5在初始光脉冲后驱动更多的锋电位，具有更短的潜伏期(～5s至～3s)，而内向电流没有受到显著影响(图9a)。在另一个神经元亚群中，短暂的光脉冲迅速唤起强烈的内向电流(100-1000pA)，并驱动动作电位的簇状爆发(图8e，右侧，n＝6个神经元)。神经元经10Hz的、10ms/脉冲的重复刺激，在光刺激的重复试验中表现出发放率的非衰减模式(图9b)。值得注意的是，与ChR2光遗传学53所产生的不同，由cOpn5光刺激唤起的动作电位不与光脉冲在时间上同步。
最后，评估了cOpn5介导的光遗传学在调节动物行为中的效用。外侧下丘脑(LH)是已知在奖赏处理和进食行为中具有功能的大脑中心54,55。在VGAT-Cre小鼠的LH GABA能神经元中表达cOpn5，并植入光纤，将光脉冲输送到行为自由的小鼠的LH中(图8g)。与在先发现的激活LH GABA神经元驱动进食行为56一致，光刺激(20Hz；5ms/脉冲；473nm；0.75mW，从纤维尖端输出)在表达cOpn5的小鼠中引发了食物摄入的显著增加，但没有在表达EGFP的对照小鼠中引发食物摄入的显著增加(图8h)。还使用觅食行为任务，测试了在未定带(ZI)中的cOpn5介导的GABA神经元的光遗传学激活的作用(图8i)，其中未定带是已知驱动强迫性进食的区域57。与表达EGFP的小鼠相比，表达cOpn5的小鼠在重复的光刺激后，表现出觅食高脂肪食物颗粒的时间显著增加(图8j)。对LH和ZI的表达cOpn5的神经元进行电生理记录，以表征响应谱。通过全脑切片，确认了光纤的注入部位和放置(图10a～图10c)。值得注意的是，小鼠在开灯时保持所述行为(进食行为或高脂肪食物觅食行为)，并在关灯时立即停止这种行为。因此，cOpn5可以有效地快速、准确且可逆地调节动物的行为状态。
图8显示了cOpn5介导的光遗传学以神经回路依赖性方式改变小鼠的行为。
a，显示了用于光遗传学刺激和Ca2+成像的实验设置的示意图。
b，显示了在光刺激(10s；100μW/mm2；473nm)之前和之后的Ca2+信号的伪彩色图像。比例尺，10μm。
c，显示了b的6个神经元的Ca2+信号迹线图。
d，描绘了皮层、纹状体和海马中表达cOpn5的神经元的光遗传学刺激和全细胞膜片钳记录的示意图。
e，两种神经元的代表图，其中一种响应于光脉冲(1Hz，5s，10ms/脉冲)，表现出强烈、延迟的动作电位爆发，以及小的持续的内向电流；另一种表现出快速的膜电位去极化和大的内向电流。
f，在施加473nm光刺激的脉冲信号(1Hz，5s)后，神经元的发放率增加(***P＝0.0005，n＝18，非配对t检验)。
g，用于光遗传学和食物摄入测定的实验设置的示意图。在VGAT-Cre小鼠的外侧下丘脑(LH)内的GABA能神经元中表达cOpn5-EGFP。表达EGFP作为对照。
h，光诱导(20Hz；5ms/脉冲；473nm；0.75mW，从纤维尖端输出)的cOpn5介导的进食行为的激活的总结。***P＝0.0003；n.s.，不显著；n＝6只小鼠；非配对t检验。误差条表示S.E.M。
i，用于觅食行为的实验设置的示意图。使用高脂肪食物颗粒。在小鼠的未定带(ZI)内的GABA能神经元中表达cOpn5-EGFP。表达EGFP作为对照。
j，cOpn5介导的觅食行为的总结。在接受光刺激后，直至小鼠发现隐藏的食物之前，计算觅食时间的百分率。****P<0.0001；n＝6只小鼠；非配对t检验。误差条表示S.E.M.。
图9显示了cOpn5介导的光遗传学可靠地激活神经元。
a，对1、10和20Hz的光脉冲(5s；10ms/脉冲)做出响应的一个代表性神经元。
b，显示了cOpn5介导的可靠且可重复的神经元光激活的原始迹线。
c，光刺激重复试验中的发放率的总结。
图10示出了光纤的注入位置和放置。
a，显示了LH中EGFP对照的表达和cOpn5的双顺反子表达(白色虚线)的图像。病损部位和蓝色虚线指示光纤的放置。比例尺，500μm。
b，ZI中的注入位置和光纤放置。比例尺，500μm。
c，LH和ZI的表达cOpn5的神经元的电生理记录，表征了cOpn5介导的光激活。
实施例5
实验描述：下面的表9是本发明中测试的来自脊椎动物亚门的cOpn5直系同源物的部分列表。合成了来自脊椎动物亚门(脊椎动物亚门，包括圆尾目(rotundia)、软骨鱼类、硬骨鱼类、两栖纲、爬行纲、鸟纲和哺乳纲)的所有报道的视蛋白5直系同源物的全基因，并在HEK 293T细胞中进行了表达。在使用或不使用470nm蓝光刺激情况下进行钙成像，以测试视蛋白5直系同源物响应于光的敏感性。光诱导的钙信号时程变化，揭示了Gq信号传导通路的激活程度和这些直系同源物的敏感性。
表9：
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Claims (26)
1.一种分离的光敏视蛋白，其用于激活Gq信号传导和/或激活细胞。
2.根据权利要求1所述的分离的视蛋白，其是来自生物体的分离的视蛋白、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物、其片段或变体，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
3.根据权利要求1所述的分离的视蛋白，其与所述生物体中的野生型视蛋白、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物、其片段或变体具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
4.根据权利要求1所述的分离的视蛋白，其是来自动物的分离的视蛋白5(Opn5)、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物、其片段或变体，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
5.根据权利要求4所述的分离的视蛋白，其与所述动物中的野生型视蛋白5(Opn5)、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物、其片段或变体具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
6.根据权利要求2所述的分离的视蛋，其中所述生物体是脊椎动物。
7.根据权利要求6所述的分离的视蛋白，其中所述脊椎动物是鸟类、爬行类、鱼类、两栖类或哺乳类动物，
优选地，所述动物是鸟类，包括但不限于鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸸鹋、美洲鸵、鹬舵、鹤鸵、火鸡、鹌鹑、鸡、猎鹰、鹰、隼、鸽子、长尾小鹦鹉、凤头鹦鹉、金刚鹦鹉、鹦鹉、雀形目(例如鸣禽)、松鸦、乌鸫、雀类、啭鸟和麻雀；或者
优选地，所述动物是爬行类，包括但不限于蜥蜴、蛇、短吻鳄、海龟、鳄和陆龟；或者
优选地，所述动物是鱼类，包括但不限于鲶鱼、鳗鱼、鲨鱼和剑鱼；或者
优选地，所述动物是两栖类，包括但不限于蟾蜍、蛙、蝾螈和火蜥蜴。
8.根据权利要求4所述的分离的视蛋白，其中所述分离的视蛋白5(Opn5)是来自鸡的分离的野生型视蛋白5(Opn5)或其片段或变体，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性；或者
所述分离的视蛋白5(Opn5)与来自鸡的野生型视蛋白5(Opn5)具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
9.根据权利要求4所述的分离的视蛋白，其中所述分离的视蛋白5(Opn5)是来自海龟的分离的野生型视蛋白5(Opn5)或其片段或变体，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性；或者
所述分离的视蛋白5(Opn5)与来自海龟的野生型视蛋白5(Opn5)具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
10.根据权利要求4所述的分离的视蛋白，其中所述分离的视蛋白5(Opn5)具有由SEQID NO：1所示的氨基酸序列(cOpn5)或其片段或变体，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性；或者
所述分离的视蛋白5(Opn5)与由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(cOpn5)具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
11.根据权利要求4所述的分离的视蛋白，其中所述分离的视蛋白5(Opn5)具有由SEQID NO：2所示的氨基酸序列(tOpn5)或其片段或变体，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性；或者
所述分离的视蛋白5(Opn5)与由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(tOpn5)具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并具有激活Gq信号传导和/或激活细胞的活性。
12.根据权利要求4所述的分离的视蛋白，其中所述光具有360nm-520nm、优选地450-500、更优选地460-480nm的范围内，特别是470nm的波长。
13.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1～12中任一项所述的分离的视蛋白。
14.一种嵌合基因，其包含权利要求13所述的分离的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接到适合的调控序列。
15.一种载体，其包含根据权利要求13所述的分离的核酸或根据权利要求14所述的嵌合基因。
16.根据权利要求15所述的载体，其是真核载体、原核表达载体、病毒载体或酵母载体。
17.根据权利要求16所述的载体，其是单纯性疱疹病毒载体、痘苗病毒载体或腺病毒载体、腺相关病毒载体、反转录病毒载体或昆虫载体，优选地，其中所述载体是重组的AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVS、AAVO或AAV10。
18.根据权利要求17所述的载体，其是表达载体或基因治疗载体。
19.一种分离的细胞或细胞培养物，其包含根据权利要求13所述的分离的核酸、根据权利要求14所述的嵌合基因或根据权利要求15～18中任一项所述的载体。
20.根据权利要求1～12中任一项所述的分离的视蛋白、根据权利要求13所述的分离的核酸、根据权利要求14所述的嵌合基因、根据权利要求15～18中任一项所述的载体或根据权利要求19所述的分离的细胞或细胞培养物的用途，其用于治疗由激活Gq信号传导和/或激活细胞所介导的疾病或病症，或涉及激活Gq信号传导和/或激活细胞的疾病或病症。
21.一种在受试者中治疗由激活Gq信号传导和/或激活细胞所介导的疾病或病症，或涉及激活Gq信号传导和/或激活细胞的疾病或病症的方法，所述方法包括给药根据权利要求1～12中任一项所述的分离的视蛋白、根据权利要求13所述的分离的核酸、根据权利要求14所述的嵌合基因、根据权利要求15～18中任一项所述的载体或根据权利要求19所述的分离的细胞或细胞培养物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述由激活Gq信号传导和/或激活细胞所介导的疾病或病症，或涉及激活Gq信号传导和/或激活细胞的疾病或病症包括但不限于从激活Gq信号传导和/或激活细胞获益，例如从星形胶质细胞的激活、强烈ATP释放或提高的神经元活性获益的疾病或病症。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述由激活Gq信号传导和/或激活细胞所介导的疾病或病症，或涉及激活Gq信号传导和/或激活细胞的疾病或病症包括但不限于，从激活细胞，例如胰岛细胞，免疫细胞，神经细胞例如中枢神经元、星形胶质细胞、神经胶质细胞，肌肉细胞，骨骼细胞，内皮细胞，上皮细胞，神经系统细胞，皮肤细胞，肺细胞，肾细胞和肝细胞，心肌细胞或血管内皮细胞获益的疾病或病症。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述疾病或病症是自身免疫疾病、发育疾病、代谢疾病、精神疾病、呼吸系统疾病或心血管疾病。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法还包括施加波长范围为360nm-550nm、优选地450-500、更优选地460-480nm、特别是470nm的蓝光。
26.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法还包括使用波长≥920nm的光进行双光子激活。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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