CN107530449A

CN107530449A - 改善视觉的基因疗法

Info

Publication number: CN107530449A
Application number: CN201680023264.6A
Authority: CN
Inventors: M·瑞兹; R·阿里; A·史密斯; K·西口
Original assignee: UCL Biomedica PLC
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2015-02-23
Filing date: 2016-02-19
Publication date: 2018-01-02
Also published as: HK1248595A1; GB201503008D0; AU2022201553A1; IL254066B; AU2016225277A1; SI3261679T1; US20200377907A1; AU2016225277B2; CA2977464C; MX2017010772A; PL3261679T3; MY186444A; WO2016135457A1; PT3261679T; LT3261679T; HUE062319T2; NZ735735A; EP3261679A1; ES2947308T3; KR20180012737A

Abstract

本发明涉及基因疗法载体改善视觉的用途，所述改善视觉如下进行：通过将编码感光细胞中光敏性基因产物和/或调节内源性光敏性信号传导的基因产物引入到患有视锥细胞功能障碍和/或变性的患者的健康视杆细胞中，从而扩大视杆细胞响应的光强度的范围和/或提高视杆细胞响应光的速度。

Description

改善视觉的基因疗法

技术领域

本发明涉及基因治疗载体用于改善患者的视觉的用途。

背景技术

在许多哺乳动物物种(包括小鼠和人)中，在暗光下调节视觉的视杆细胞(rodphotoreceptor)的数目远超过视锥细胞(cone photoreceptor)的数目(Curcio et al,2000)。然而，在照明使视锥整日运作的工业化世界中，视杆介导的视觉的重要性降低。许多从出生起缺少视杆功能的患者只是偶然被发现，实际上无法识别出他们异常的视觉(Dryja,2000)。相反，当存在视锥功能障碍时，患者总是具有症状，并且通常患有视觉障碍(取决于他们的视锥功能障碍的程度)。然而在一些情况下，仅(或主要是)视锥损失或功能障碍，视杆相对被保留。例如，全色盲是严重的遗传性视网膜营养不良，患者从出生时视锥功能完全丧失，但是可能具有正常的视杆功能(Hess et al,1986；Nishiguchi et al,2005)。多种基因(包括CNGA3(Kohl et al 1998)和PDE6C(Chang et al,2009；Thiadens etal,2009))中的突变与该疾病相关。每一种致病基因编码视锥光转导级联的必需组分，所述视锥光转导级联通过引起感光细胞的超极化而将光转化为电信号。在年龄相关性黄斑变性(AMD)中，视觉损伤主要是由富含视锥的黄斑中央凹的变性引起的。因此，患者丧失中心视觉和敏锐度，但是通常具有相对保存良好的外周斑，因此具有一些有用的受限于缺乏中央凹外部视锥的残余视觉。

视杆对光高度灵敏，这使视杆在昏暗条件下感知少量的光。相反，视锥的灵敏度较低，但是能够在日光中处理大量光并连续传导视觉信号。这种功能差异部分是由于光信号传导的失活机制——由RGS9、R9AP(也称为RGS9BP)和Gβ5组成的GTPase复合物——的效率导致的。RGS9是水解与G蛋白偶联的GTP的催化组分，而R9AP和Gβ5是必需组成型亚基(Burnset al,2009；Burns et al,2010)。重要的是，R9AP将所述复合物连接到光感受器外段(在那里还发生光转导信号传导)处的圆盘膜(Baseler et al,2002)。R9AP的表达决定了GTPase复合物的水平，以使超出R9AP而产生的任何RGS9可能快速被降解(Martyemyanov et al,2009)。鼠视杆中R9AP的过表达足以增加GTPase活性，并且足以大幅加快它们的失活动力学，如单细胞记录所证明的(Krispel et al,2006)。据估计，视锥中RGS9表达比视杆中的RGS9表达高约10倍(Cowan et al,1998；Zhang et al,2003)。这为视锥从曝光中快速恢复并因此保持对连续光刺激的功能性的能力提供了基础。这还使视锥响应于更快速的刺激。实际上，在临床上，具有由RGS9或R9AP中的遗传缺陷引起的光转导级联的延迟失活或具有缓慢的视觉(bradyopsia)的患者具有严重的视锥介导的视觉损伤，包括昼盲症和看见移动物体的能力下降(Nishiguchi et al,2004；Michaelides et al,2010)。同时，视杆介导的视觉受到相同突变的影响较小。

一些黄斑变性病症，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)和遗传性黄斑变性病症也表现出视锥功能障碍，但是正常或损伤更少的视杆功能。在发达国家，黄斑变性是失明最主要的原因，并且因为AMD的发病率在生命中每10年就会变为原来的4倍，预期未来AMD病例将随着寿命的增加而增多。用于治疗AMD的药物已经占英国国家卫生服务部的全部药物预算的1％以上。尽管晚期AMD患者可接受训练以将视线移向中央凹外，然而视杆细胞的低更新率和低漂白阈值限制了所产生的视觉质量。

发明内容

使用缺少视锥功能的小鼠，我们证明了AAV介导的Rgs9锚定蛋白(R9AP)——介导光转导级联失活的GTPase复合物的关键组分——的过表达导致视杆驱动的视网膜电图的脱敏和“明视偏移(photopic shift)”。治疗在损失暗视(更低的光水平)功能的情况下使视杆比未经治疗的细胞响应于更亮的光(最高达约2.0log)。使用经治疗的视网膜的多电极阵列测量表明，视网膜神经节细胞通过表现出明视光水平的分级响应，也反映出视杆的“明视偏移”。通过对响应于旋转正旋光栅的头部追踪移动进行定量来测量的对比敏感度函数表明，在室内光条件下敏感度提高最多达25倍，并且更快响应于反复的刺激。此外，在这些小鼠中可漂白的视紫红质水平的生化测量表明，视循环没有限制视杆功能。

本发明人还在视杆细胞中表达了快速光驱动质子泵ArchT(Han et al,2011)。将携带视紫红质启动子(Rho)控制下的ArchT-EGFP的AAV8粒子经视网膜下注射到成年小鼠中。Rho-ArchT-EGFP的表达局限于视杆细胞膜。ArchT的表达允许非常快的光响应，而固有的视杆响应被保留并且与在非转导的视杆细胞中观察到的响应相当。总的来说，ArchT表达并未改变视杆细胞对暗视刺激的响应能力，但是它确实赋予了额外的以对更高水平的照明的快速非漂白响应作出响应的能力。本发明人还发现，经转导的视杆能够可靠地保持这种快速“类似于视锥的”传输，因为表达ArchT的视锥使维持的视网膜神经节细胞(RGC)在高光强度下和与视锥细胞的频率接近的频率下产生脉冲(spike)。在缺少视锥介导的视觉的CNGA3-^/-和PDE6C-^/-小鼠中Rho-ArchT-EGFP的表达还扩大了这些小鼠对亮光刺激的敏感度，并且赋予这些小鼠敏捷的视觉。表达ArchT的小鼠能够跟随的刺激的最大频率类似于视锥细胞的频率。

这些结果共同表明，在用编码视锥所特有的光敏蛋白的基因或编码提高内源性视杆信号传导机制速度的分子的基因转导健康视杆细胞之后，视杆表现得更像视锥，并因此能够补偿视锥的功能障碍。这可用于治疗许多视觉疾病，在这些疾病中，视锥功能降低，但是至少保留一些健康的视杆。这与之前的目的在于恢复视锥丧失的功能的方法不同(Busskamp et al,2010；美国专利申请No.2012258530)。以本发明的方法改变视杆功能的优势在于，视锥具有功能障碍但是能够被修复的病症(例如在视网膜变性的早期，当感光细胞功能丧失但是感光细胞至双极突触完整时)是罕见的，而视锥功能障碍更严重或进入晚期并且无法被修复，或视锥完全丧失，但是至少保留一些健康的视杆细胞的病症是常见的(参见上文)。此外，本发明使得能够产生“假中央凹”——在中央凹视锥丧失或功能障碍的病症中改善视觉的一小片类似视锥的视杆。

因此，本发明提供了包含编码感光细胞中光敏性基因产物和/或调节内源性光敏性信号传导的基因产物的核酸的载体，其用于在具有视锥细胞功能障碍和/或变性的患者中改善视觉的方法，所述方法通过将所述核酸引入到所述患者的视网膜中的健康视杆细胞中并在其中表达所述基因产物，从而扩大视杆细胞响应的光强度的范围和/或提高视杆细胞响应光的速度。

本发明还提供了如上文定义的载体，包含所述载体的宿主细胞，以及使用所述载体进行治疗的方法。

附图说明

图1：视杆细胞中ArchT的表达产生快速光驱动的电流。

(a)上方的图：在视紫红质启动子控制下的ArchT-EGFP的AAV8介导的转导(绿色，参见左图)。未观察到视锥的重叠(紫色：视锥抑制蛋白，参见中图；白色：DAPI，参见右图)。下方的图：还可在突触水平上观察到表达特异性。(b)ArchT-EGFP定位于视杆细胞膜，包括内段和外段。(c)在表达ArchT-EGFP的视杆末端(绿色，左峰)和视锥抑制蛋白阳性的视锥末端(紫色，右峰)中的荧光定量显示出两个独特的带，其分别对应于视杆和视锥突触定位的亚层(n＝22)。(d)来自表达ArchT的视杆细胞的细胞体的单细胞记录。保存了响应于10ms530nm光脉冲(绿色，参见垂直条)的固有的视杆光转导介导的电流(上方的迹线)。ArchT产生的电流更快(下方的迹线)。比例尺：(a)上方的图：50μm；(a)下方的图和(b)：10μm。

图2：ArchT表达驱动视杆中的高频率响应并快速传输到视网膜神经节细胞。

(a)未经注射的C57BL6视网膜中固有的视杆光引起的电流。(b)ArchT介导的电流能够跟随高得多的刺激频率。(c)响应对刺激呈现(presentation)是时间锁定的(绿色垂直条)。(d)表达ArchT的视杆稳定地响应最高达80Hz的频率刺激，而固有的视杆响应在约20Hz下降低。(e)显示出ArchT表达的总结数据并未改变视杆细胞的固有响应，而ArchT响应在更亮的光水平下开始。(f)来自PDE6C^-/-表达ArchT的视网膜的多电极阵列记录。固有的视杆响应无法引发20Hz以上的可靠视网膜神经节细胞脉冲。相反，ArchT介导的视杆激活促使视网膜神经节细胞的快速脉冲至与视锥细胞相当的水平。

图3：ArchT介导的视杆激活促使对快速高光强度刺激的行为响应

(a)上方的图：恐惧条件反射行为的示意图。简言之，视觉刺激与点击成对出现。24小时后，在新环境中检验冻结行为。下方的图：未经注射的CNGA3^-/-和PDE6C^-/-小鼠无法学会任务(各图中左侧柱组)。然而，ArchT表达成功促使小鼠中的冻结行为(各图中右侧柱组)。(b)视动测试。表达ArchT的小鼠能够在与视锥可靠地跟随的频率相当的频率下跟随刺激。

图4：Cnga3-/-小鼠中视杆中AAV介导的R9AP过表达和加速的a波失活。

A.用rRAAV2/8.Rho.mR9ap处理的Cnga3-/-眼中RGS9表达增加。与未经处理的眼(右)相比，在经处理的眼(左)中，R9AP过表达导致整个光感受器层中针对RGS9的免疫反应性增加(红)。蛋白质印迹表明，在过表达R9AP的眼中，视网膜和视网膜色素上皮(RPE)中RGS9表达均增加(下图)。在经处理的眼的RPE中还检测到少量RGS9蛋白。这可能反映了吞噬细胞圆盘膜内包含的过量蛋白的“溢出”。比例尺表示25μm。

B.用rAAV2/8.Rho.mR9ap和rAAV2/8.CMV.mR9ap处理的Cnga3-/-眼中a波振幅恢复的速度增加。来自相同动物的经处理(上)和未经处理的(下)眼的探测闪光的代表性ERG迹线(黑色迹线，参见在时程中间具有峰的迹线)和第二闪光的代表性ERG迹线(红色迹线)以2秒的刺激间时距(ISI)展示。注意到，在经处理的眼中，第二闪光产生的小a波(箭头)是清晰可见的，而在未经处理的另一只眼中a波是不可见的(箭头)。在经处理和未经处理的眼中，不同ISI下a波恢复的图。用rAAV2/8.CMV.mR9ap(n＝5)或rAAV2/8.Rho.mR9ap(n＝7)注射的眼比未经处理的眼(n＝5)具有更快的恢复动力学，所述未经处理的眼在更短的ISI下是最可见的。数据表示为平均值±平均值的标准误差。OE：过表达。

图5：在Cnga3-/-小鼠中通过R9AP的过表达从视杆获得明视功能

A.在Cnga3-/-小鼠的视杆中，通过R9AP的过表达而导致的响应阈值的升高和6HzERG的明视偏移。来自Cnga3-/-小鼠的代表性6Hz ERG迹线，所述小鼠的一只眼用rAAV2/8.CMV.mR9ap处理，另一只眼未处理(上图)。ERG迹线以0.5log.cd.s/m²梯度从上至下从针对最暗闪光(-6.0log cd.s/m²)的响应到针对最亮闪光(2.0log cd.s/m²；底部)的响应而进行比对。注意到，响应出现的低阈值闪光强度增大，与之相联系的是对更亮闪光的响应阈值升高。这导致在用rAAV2/8.CMV.mR9ap处理的眼中视网膜功能的“明视偏移”。总结6Hz ERG结果，其证明了在用rAAV2/8.CMV.mR9ap或rAAV2/8.Rho.mR9ap(下图)处理之后视网膜功能的明视偏移。来自视杆功能缺陷的Gnat1-/-小鼠的ERG响应代表视锥介导的功能。同时，来自C57BL6小鼠的响应源自视杆细胞和视锥细胞。数据表示为相对于最大响应的％振幅，并且表示为平均值±平均值的标准误差。从用rAAV2/8.CMV.mR9ap处理的Cnga3-/-小鼠(Cnga3-/-CMV.R9ap；N＝8)、用rAAV2/8.Rho.mR9ap处理的Cnga3-/-小鼠(Cnga3-/-Rho.R9ap；N＝6)、未处理的Cnga3-/-小鼠(Cnga3-/-未处理的；N＝8)、未处理的Gnat1-/-小鼠(Gnat1-/-未处理的；N＝6)和未处理的C57BL6小鼠(C57BL6未处理的；N＝6)记录ERG。

B.在用rAAV2/8.CMV.mR9ap处理的Cnga3-/-眼中，对长闪光的视网膜响应增加。空心矩形表示闪光的持续时间。注意到在用rAAV2/8.CMV.mR9ap处理的眼中，光刺激的持续时间增加时，响应是可检测的。相反，当在相同条件下同时记录时，未经处理的对侧眼显示出很少的响应或没有响应。

C.在用rAAV2/8.CMV.mR9ap处理的Cnga3-/-眼中，在明视条件下视网膜功能的增强。注意到经处理的眼在明视记录条件(20cd/m²的白色背景光)下表现出响应，而同时记录的未经处理的对侧眼保持未响应。

图6：在过表达R9AP的眼中，改变的光感受器信号向双极细胞的有效传输。

A.代表性的ERG迹线。使用饱和闪光(1.9log cd.s/m²)，在Cnga3-/-小鼠中注射rAAV2/8.CMV.mR9ap之后，记录ERG(红色迹线，下方的迹线)。将对侧眼用作未经处理的对照(黑色迹线，上方的迹线)。

B.闪光对双极细胞的延迟激活。在经处理的和未经处理的眼中，测量从ERG响应到饱和闪光(1.9log cd.s/m²)的a波和b波隐含期。

C.从一只眼用rAAV2/8.CMV.mR9ap处理(红色曲线)，另一只眼未处理(黑色曲线)的Cnga3-/-小鼠记录的a波和b波振幅的强度响应曲线。所有数据表示为平均值±平均值的标准误差。OE：过表达。

图7：在Cnga3-/-小鼠中R9AP过表达之后，可持续的视觉感知的增加。

A.通过光动力学响应测量的改善的对比敏感度函数。在用rAAV2/8.Rho.mR9ap处理的Cnga3-/-小鼠的左眼中，差异化地测量针对正弦光栅的顺时针(代表经处理的左眼)和逆时针(代表未经处理的右眼)头部追踪移动的对比敏感度函数(CSF)。经处理的眼(红色曲线)的CSF比未经处理的眼(蓝色曲线)的CSF更好，所述未经处理的眼的CSF类似于未受影响的Cnga3-/-小鼠的CSF(黑色曲线；两只眼的平均值)。注意到经处理的眼的CSF等于(如果不是稍微好于)未受影响的野生型对照的CSF(绿色；两只眼的平均值)。对于全部组，N＝5。所有数据表示为平均值±平均值的标准误差。OE：过表达。

B.在延长暴露于验光学测试之后，持续的视紫红质水平。使用扫描式分光光度计(绿色虚线框中的左图)的眼样品光吸收的代表性记录。从完全光漂白之前测量的眼样品的吸收(红色迹线)减去之后测量的眼样品的吸收(蓝色迹线，300和400nm之间的上方迹线)表示约380nm处的λmin峰值(对应于释放的光产物)，以及约500nm处的λmax峰值(代表样品中可漂白的视紫红质的量)(绿色虚线框中的右图)。暴露于7.0mW白光5分钟之后，通过测量Cnga3-/-小鼠中用rAAV2/8.Rho.mR9ap处理或未处理的瞳孔完全放大的眼中的差异光谱(λmax)来评估视紫红质漂白速度(左下图；平均值±平均值的标准误差)。还在rAAV2/8.Rho.mR9ap的单侧注射之后Cnga3-/-小鼠暴露于验光学测试最多达120分钟之后，测量视紫红质水平(右下图；各时间点N＝3)。灰色面积表示过夜暗适应之后从未受影响的Cnga3-/-小鼠(N＝8)记录的视紫红质水平(平均值±标准差)。点状线表示平均值。注意到在Cnga3-/-小鼠的用rAAV2/8.Rho.mR9ap处理的眼和未经处理的眼中，视紫红质水平保持稳定持续至少2小时。具有误差棒的数据表示为平均值±平均值的标准误差。

图8：在Pde6c-/-小鼠中，R9AP的过表达增大了视杆光响应的恢复速率。

与未经处理的对侧眼(σ＝约 11.46秒)相比，用rAAV2/8.CMV.mR9ap注射的Pde6c-/-眼(σ＝约5.75秒)中a波振幅50％恢复的时间常数(σ)降低约50％，这与治疗后光转导的加速失活一致。N＝6。具有误差棒的数据表示为平均值±平均值的标准误差。

图9：在Pde6c-/-小鼠中，R9AP过表达导致强度响应曲线的“明视偏移”。

在Pde6c-/-小鼠(N＝6)中，与未经处理的对侧眼相比，用rAAV2/8.CMV.mR9ap注射的眼表现出对增加的闪光强度的6HzERG响应的明视偏移。数据表示为相对于最大响应的％振幅，并且表示为平均值±平均值的标准误差。

图10：在Cnga3-/-小鼠中，rAAV2/8.CMV.mR9ap注射后5个月时R9AP过表达的持续影响，没有清楚的视网膜变性的证据。

针对最大振幅归一化的响应特征证明了对6Hz闪光的强度响应曲线的“明视偏移”(上图)。没有归一化的相同数据未示出在经处理的眼中振幅减小的证据(下图)。N＝5。数据表示为平均值±平均值的标准误差。

图11：用rAAV2/8.Rho.mR9ap处理野生小鼠未显示出对6HzERG强度响应曲线的明显影响。

在C57BL6小鼠(N＝5)中，与未经处理的对侧眼相比，用rAAV2/8.Rho.mR9ap处理的眼在6Hz ERG强度响应曲线中显示出没有偏移。数据表示为平均值±平均值的标准误差。

图12：在C57BL6小鼠中，R9AP过表达之后视觉感知未增强。

在仅用rAAV2/8.Rho.mR9ap处理左眼的C57BL6小鼠中，差异化地测量针对旋转正弦光栅的顺时针(代表经处理的左眼)和逆时针(代表未经处理的右眼)头部追踪移动的对比敏感度函数(CSF)。经处理的眼的CSF(粉色曲线)和未经处理的眼的CSF(浅蓝色曲线)显示出类似的结果，类似于未受影响的C57BL6小鼠的结果(绿色曲线；两只眼的平均值)。对于全部组，N＝5。数据表示为平均值±平均值的标准误差。OE：过表达。

具体实施方式

本发明的载体包含这样的核酸，其表达产生基因产物(通常是蛋白质)，该基因产物将影响本文所述的眼病症的治疗，所述核酸与启动子可操作地连接以形成表达盒。

核酸和基因产物

本发明的载体包含编码基因产物的核酸，所述基因产物是光敏性的和/或在感光细胞中调节内源性光敏性信号传导，并且通过扩大视杆细胞响应的光强度范围和/或提高视杆细胞响应光的速度，使用本发明的核酸转导的视杆的性能更像视锥。因此，蛋白质本身可以是直接光敏性的，例如，它可以以导致光刺激后的超极化(外向电流)的方式改变视杆中的膜电导。这样的蛋白质例如为光敏性或光门控G偶联膜蛋白、离子通道、离子泵或离子转运蛋白。优选的光敏性蛋白包括ArchT、Jaws(cruxhalorhodopsin)(Chuong et al,2014)和iC1C2。或者，蛋白可自身不是直接光敏性的，但是可间接调节视杆感光细胞中的光敏性信号传导。这样的蛋白的实例为RGS9复合物成员，特别是R9AP(还称为RGS9BP)和Gβ5。或者，核酸可编码提高内源性视杆信号传导机制速度的任何其他基因产物。在所有这些情况下，序列可编码野生型蛋白或保留野生型蛋白活性的突变体或变体或截短形式。核酸也可以是为在靶细胞型中表达而经密码子优化的。

在基因产物表达之后，视杆将以比普通强度更高的强度，表现出比未转导的视杆更强和/或更快的对光刺激的调节。实例包括提高的调节强度和/或更快的激活/失活动力学。因此，相对于未转导的视杆，根据本发明转导的视杆对中间视觉和/或明视觉范围中的照明反应更强和/或更快。优选地，视杆对暗视照明条件的响应未受影响或未受到实质影响，即视杆获得对更亮的光的强烈和/或快速响应的能力而不丧失对暗光响应的能力。

启动子和其他调控元件

在表达构建体中，编码基因产物的核酸通常可操作地连接至启动子。启动子可以是组成型的，但是优选为感光细胞特异性的或感光细胞优选的启动子，更优选为视杆特异性启动子或视杆优选的启动子，例如视紫红质(Rho)、神经视网膜特异性的亮氨酸拉链蛋白(NRL)或磷酸二酯酶6B(PDE6B)启动子。纳入于表达盒中的启动子区可以为任何长度，只要它有效驱动基因产物的表达，优选感光细胞特异性的表达或感光细胞优选的表达，或视杆特异性的表达或视杆优选的表达。

感光细胞特异性启动子意指驱动仅在或基本上仅在感光细胞中表达的启动子，例如驱动在感光细胞中比在任何其他细胞型中强至少100倍的表达的启动子。视杆特异性启动子意指驱动仅在或基本上仅在视杆中表达的启动子，例如驱动在视杆中比在任何其他细胞型(包括视锥)中强至少100倍的表达的启动子。感光细胞优选的启动子意指优选在感光细胞中表达，但是也可在其他组织中驱动一定程度的表达的启动子，例如驱动在感光细胞中比在任何其他细胞类型中强至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少50倍的表达的启动子。视杆优选的启动子意指优选在视杆中表达，但是也可在其他组织中驱动一定程度的表达的启动子，例如驱动在视杆中比在任何其他细胞类型(包括视锥)中强至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少50倍的表达的启动子。

除启动子之外，还可存在一种或多种其他调控元件，例如增强子。

载体

本发明的载体可以为任何类型，例如可以为质粒载体或微环DNA。

然而，本发明的载体通常是病毒载体。病毒载体可例如基于单纯疱疹病毒、腺病毒或慢病毒。病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)载体或其衍生物。病毒载体衍生物可以是嵌合、改组或衣壳修饰的衍生物。

病毒载体可包含来自AAV天然来源的血清型、分离株或进化枝的AAV基因组。血清型可例如为AAV2、AAV5或AAV8。

基因疗法的功效通常取决于供体DNA的充分而有效的递送。该过程通常由病毒载体介导。腺相关病毒(AAV)——细小病毒家族成员——通常用于基因疗法。包含病毒基因的野生型AAV将它们的基因组物质插入到宿主细胞的19号染色体中。AAV单链DNA基因组包含两个反向末端重复(ITR)和两个开放阅读框，包含结构(cap)和包装(rep)基因。

对于治疗目的，除治疗性基因之外仅需要的顺式序列为ITR。因此，AAV病毒是被修饰的：从基因组除去病毒基因，产生重组AAV(rAAV)。这仅包含治疗性基因，两个ITR。病毒基因的去除使rAAV不能主动地将其基因组插入到宿主细胞DNA中。相反，rAAV基因组经由ITR融合，形成环状、游离的结构，或插入到预先存在的染色体断裂中。对于病毒产生，以辅助质粒的形式，反式提供已从rAAV去除的结构基因和包装基因。AAV是特别引人注意的载体，因为它通常是非致病性的；大多数人在他们生命过程中被这种病毒感染而未受到有害影响。

眼组织的免疫赦免——解剖学屏障和免疫调控因子的结果——使眼在很大程度上免于AAV可在其他组织中引发的有害免疫应答(Taylor 2009)。

AAV载体受限于相对小的包装能力(约4.8kb)和转导后缓慢开始的表达。尽管存在这些小缺陷，AAV已成为视网膜基因疗法中最常使用的病毒载体。

大多数病毒构建体基于AAV血清型2(AAV2)。AAV2通过硫酸肝素蛋白聚糖受体结合于靶细胞。类似于全部AAV血清型的基因组，AAV2基因组能够被包封于多种不同的衣壳蛋白中。AAV2可被包装在它的天然AAV2衣壳(AAV2/2)中或可与其他衣壳进行假型化(例如，AAV2基因组于AAV1衣壳中；AAV2/1、AAV2基因组于AAV5衣壳中；AAV2/5和AAV2基因组于AAV8衣壳中；AAV2/8)。

rAAV通过血清型特异性的受体介导的内吞作用而转导细胞。影响rAAV转基因表达动力学的主要因素是病毒粒子在内体内部脱壳的速率。这进一步取决于包封遗传物质的衣壳的类型(Ibid.)。脱壳之后，经由互补链的从头合成，通过形成双链分子而稳定线性单链rAAV基因组。使用自身互补的DNA可通过产生双链转基因DNA而绕过这一阶段。Natkunarajah et al(2008)发现，与单链AAV2/8相比，自身互补的AAV2/8基因表达起始更快并且表达量更高。因此，当与标准单链构建体的转基因表达相比时，通过避开与第二链合成相关的时间延迟，提高了基因表达水平。随后的调查其他AAV假型(例如AAV2/5)中自身互补的DNA的作用的研究产生了类似的结果。该技术的一个限制是，由于AAV具有约4.8kb的包装能力，自身互补的重组基因组必须是适当大小的(即约2.3kb或更小)。

除了修饰包装能力，AAV2基因组与其他AAV衣壳的假型化能够改变细胞特异性和转基因表达的动力学。据报道，AAV2/8比AAV2/2或AAV2/5更有效地转导感光细胞(Natkunarajah et al.2008)。

因此，本发明的载体可包含腺相关病毒(AAV)基因组或其衍生物。

AAV基因组是编码产生AAV病毒粒子所需的功能的多聚核苷酸序列。这些功能包括AAV在宿主细胞中复制和包装周期中运行的那些，包括将AAV基因组包入AAV病毒粒子的衣壳内。天然存在的AAV病毒是复制缺陷的并且依赖于提供的反式辅助功能以完成复制和包装周期。因此，在另外除去AAV rep和cap基因的情况下，本发明的载体的AAV基因组是复制缺陷型的。

AAV基因组可以是正义或反义单链形式，或者是双链形式。双链形式的使用使得避开靶细胞中的DNA复制步骤，因此能够加速转基因表达。AAV基因组可以来自任何天然来源的AAV血清型或分离株或进化枝。如本领域技术人员已知的，可根据各种生物系统对天然存在的AAV病毒进行分类。

通常，按照AAV病毒的血清型来提及它们。血清型对应于AAV的变异亚种，其由于衣壳表面抗原的表达特征而具有独特的反应性，这可用于将其与其他变异亚种区分开。通常，具有特定AAV血清型的病毒无法有效地与特异性针对任何其他AAV亚型的中和抗体进行交叉反应。AAV亚型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11，以及重组血清型，例如最近从灵长类动物脑鉴定的Rec2和Rec3。在本发明的载体中，基因组可源自任何AAV血清型。衣壳也可源自任何AAV血清型。基因组和衣壳可源自相同血清型或不同血清型。

在本发明的载体中，优选基因组源自AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)或AAV血清型8(AAV8)。最优选基因组源自AAV2，但是其他特别适用于本发明的血清型包括AAV4、AAV5和AAV8，其有效转导眼中的组织，例如视网膜色素上皮。优选衣壳源自AAV5或AAV8，特别是AAV8。

对AAV血清型的综述可参见Choi et al(Curr Gene Ther.2005；5(3)；299-310)和Wu et al(Molecular Therapy.2006；14(3),316-327)。用于本发明的AAV基因组序列或AAV基因组元件的序列(包括ITR序列、rep或cap基因)可源自以下AAV全基因组序列的登录号：腺相关病毒1 NC_002077、AF063497；腺相关病毒2 NC_001401；腺相关病毒3 NC_001729；腺相关病毒3B NC_001863；腺相关病毒4 NC_001829；腺相关病毒5 Y18065、AF085716；腺相关病毒6 NC_001862；鸟类AAV ATCC VR-865AY186198、AY629583、NC_004828；鸟类AAV毒株DA-1 NC_006263、AY629583；牛AAV NC_005889、AY388617。

AAV病毒也可按照进化枝或克隆来提及它们。这是指天然来源的AAV病毒的系统发生关系，通常是指可追溯到共同祖先的AAV病毒的系统发生群，并且包括其所有后代。另外，AAV病毒可按照具体的分离株(即在自然界发现的具体AAV病毒的遗传分离株)来提及。术语遗传分离株描述了这样的AAV病毒群体，其与其他天然存在的AAV病毒进行了有限的遗传混合，从而在遗传水平上定义了可识别的独特的群体。

可用于本发明的AAV的进化枝和分离株的实例包括：

进化枝A：AAV1 NC_002077、AF063497、AAV6 NC_001862、Hu.48 AY530611、Hu43AY530606、Hu 44AY530607、Hu 46AY530609；

进化枝B：Hu.19 AY530584、Hu.20 AY530586、Hu 23AY530589、Hu22 AY530588、Hu24 AY530590、Hu21 AY530587、Hu27AY530592、Hu28 AY530593、Hu 29AY530594、Hu63AY530624、Hu64 AY530625、Hu13 AY530578、Hu56 AY530618、Hu57AY530619、Hu49AY530612、Hu58 AY530620、Hu34 AY530598、Hu35AY530599、AAV2 NC_001401、Hu45AY530608、Hu47 AY530610、Hu51 AY530613、Hu52 AY530614、Hu T41 AY695378、Hu S17AY695376、Hu T88 AY695375、Hu T71 AY695374、Hu T70 AY695373、Hu T40AY695372、HuT32AY695371、Hu T17 AY695370、Hu LG15 AY695377；

进化枝C：Hu9 AY530629、Hu10 AY530576、Hu11 AY530577、Hu53 AY530615、Hu55AY530617、Hu54 AY530616、Hu7 AY530628、Hu18 AY530583、Hu15 AY530580、Hu16AY530581、Hu25 AY530591、Hu60 AY530622、Ch5 AY243021、Hu3 AY530595、Hu1 AY530575、Hu4 AY530602 Hu2、AY530585、Hu61 AY530623；

进化枝D：Rh62 AY530573、Rh48 AY530561、Rh54 AY530567、Rh55 AY530568、Cy2AY243020、AAV7 AF513851、Rh35 AY243000、Rh37 AY242998、Rh36 AY242999、Cy6AY243016、Cy4 AY243018、Cy3 AY243019、Cy5 AY243017、Rh13 AY243013；

进化枝E：Rh38 AY530558、Hu66 AY530626、Hu42 AY530605、Hu67 AY530627、Hu40AY530603、Hu41 AY530604、Hu37 AY530600、Rh40 AY530559、Rh2 AY243007、Bb1 AY243023、Bb2 AY243022、Rh10 AY243015、Hu17 AY530582、Hu6 AY530621、Rh25 AY530557、Pi2AY530554、Pi1 AY530553、Pi3 AY530555、Rh57 AY530569、Rh50 AY530563、Rh49 AY530562、Hu39 AY530601、Rh58 AY530570、Rh61 AY530572、Rh52 AY530565、Rh53 AY530566、Rh51AY530564、Rh64 AY530574、Rh43 AY530560、AAV8 AF513852、Rh8 AY242997、Rh1 AY530556；

进化枝F：Hu14(AAV9)AY530579、Hu31 AY530596、Hu32 AY530597、克隆分离株AAV5Y18065、AF085716、AAV 3NC_001729、AAV 3B NC_001863、AAV4 NC_001829、Rh34 AY243001、Rh33 AY243002、Rh32 AY243003。

技术人员能够根据他们的公知常识选择用于本发明的适当的AAV血清型、进化枝、克隆或分离株。然而，应理解，本发明还涵盖了可能尚未被鉴定或表征的其他血清型的AAV基因组的用途。AAV血清型决定了AAV病毒感染的组织特异性(或趋向性)。因此，根据本发明用于给予患者的AAV病毒的优选的AAV血清型为对视杆细胞具有天然趋向性或具有视杆细胞高效感染率的那些。

通常，天然来源的AAV血清型或分离株或进化枝的AAV基因组包含至少一个反向末端重复序列(ITR)。本发明的载体通常包含两个ITR，优选在基因组的每个末端各一个。ITR序列顺式发挥作用以提供复制的功能起点并且允许载体与细胞基因组的整合和从细胞基因组的切除。优选的ITR序列为AAV2及其变体的那些。AAV基因组通常包含包装基因，例如编码AAV病毒粒子的包装功能的rep和/或cap基因。Rep基因编码蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40或其变体中的一种或多种。Cap基因编码一种或多种衣壳蛋白，例如VP1、VP2和VP3或其变体。这些蛋白组成AAV病毒粒子的衣壳。在下文中讨论衣壳变体。

优选地，AAV基因组将为给予患者而被衍生化。这样的衍生化是本领域标准的，并且本发明涵盖了任何已知的AAV基因组衍生物和可通过利用本领域已知的技术而产生的衍生物的用途。AAV基因组的衍生化和AAV衣壳的衍生化参见例如上文中引用的Choi et al和Wu et al。

AAV基因组的衍生物包括允许在体内从本发明的载体表达Rep-1转基因的任何截短或修饰形式的AAV基因组。通常，可显著截短AAV基因组以包含最小病毒序列但仍然保留以上功能。这优选是为了安全性原因以降低载体与野生型病毒重组的风险，同时避免由靶细胞中存在的病毒基因蛋白引起细胞免疫应答。

通常，衍生物将包含至少一种反向末端重复序列(ITR)，优选多于一种ITR，例如两种ITR或多种。一种或多种ITR可源自具有不同血清型的AAV基因组，或可以是嵌合或突变ITR。优选的突变ITR具有trs(末端分解位点)缺失。该缺失允许基因组持续复制以产生包含编码序列和互补序列的单链基因组(即自身互补的AAV基因组)。这使得避开靶细胞中的DNA复制，并因此能够加速转基因表达。

一种或多种ITR优选在本发明的包含启动子和转基因的表达构建体盒的侧翼。包含的一种或多种ITR优选辅助将本发明的载体包装到病毒粒子中。在优选的实施方案中，ITR元件将是从衍生物的天然AAV基因组中保留的唯一序列。因此，衍生物将优选不包含天然基因组的rep和/或cap基因和天然基因组的任何其他序列。这优选由于上述原因，以及为了降低载体整合到宿主细胞基因组中的可能性。此外，减小AAV基因组的大小使得能够增大将转基因以外的其他序列元件(例如调控元件)纳入到载体中的灵活性。关于AAV2基因组，因此在本发明的衍生物中可除去以下部分：一个反向末端重复(ITR)序列、复制(rep)和衣壳(cap)基因。然而，在一些实施方案中，包括体外实施方案中，衍生物可另外包含一个或多个rep和/或cap基因或AAV基因组的其他病毒序列。

衍生物可以是一种或多种天然存在的AAV病毒的嵌合、改组或衣壳修饰的衍生物。本发明涵盖了提供在相同载体内的来自AAV的不同血清型、进化枝或分离株的衣壳蛋白序列。本发明涵盖了将一种血清型的基因组包装到另一种血清型的衣壳中，即假型化。

通常选择嵌合、改组或衣壳修饰的衍生物以提供病毒载体的一种或多种所需功能。因此，与包含天然存在的AAV基因组(例如AAV2的基因组)的AAV病毒载体相比，这些衍生物可表现出增加的基因递送效率、降低的免疫原性(体液或细胞)、改变的趋向性范围和/或改善的对特定细胞型的靶向。增加的基因递送效率可受到改善的细胞表面受体或共受体结合、改善的内化作用、改善的细胞内和到细胞核中的运输、改善的病毒离子脱壳和改善的单链基因组向双链形式的转化的影响。增加的效率也可涉及改变的趋向性范围或特定细胞群靶向，以使载体剂量未因给予至不需要载体的组织而被稀释。

嵌合的衣壳蛋白包括通过两种或多种天然存在的AAV血清型的衣壳编码序列之间的重组而产生的那些。这可例如通过标记获救法来实施，在标记获救法中，用不同血清型的衣壳序列共转染非传染性的一种血清型的衣壳序列，并且使用定向选择来正选择具有所需特性的衣壳序列。不同血清型的衣壳序列可通过细胞内的同源重组来改变，以产生新型嵌合衣壳蛋白。嵌合的衣壳蛋白也包括通过改造衣壳蛋白序列以将特定的衣壳蛋白结构域、表面环或特定的氨基酸残基转移到两种或多种衣壳蛋白之间(例如两种或多种不同血清型的衣壳蛋白之间)而产生的那些。

改组或嵌合的衣壳蛋白也可通过DNA改组或通过易错PCR产生。杂合的AAV衣壳基因可通过以下方法产生：随机使相关AAV基因(例如编码多种不同血清型的衣壳蛋白的那些)的序列片段化，然后在自引发聚合酶反应中重新组装片段，这也可导致序列同源区中的交换。可对以这种方式、通过改组若干血清型的衣壳基因而产生的杂合AAV基因文库进行筛选以鉴定具有所需功能的病毒克隆。类似地，易错PCR可用于使AAV衣壳基因随机突变以产生多种变体文库，然后在文库中正选择所需特性。

也可对衣壳基因的序列进行遗传修饰以引入相对于天然野生型序列的特定的缺失、置换或插入。具体地，可通过在衣壳编码序列的开放阅读框内或在衣壳编码序列的N端和/或C端插入非相关蛋白或肽的序列来修饰衣壳基因。

非相关蛋白或肽可有利地作为特定细胞型的配体而起作用，从而赋予对靶细胞改善的结合或改善载体靶向至特定细胞群的特异性。

非相关蛋白也可以是辅助病毒粒子的纯化(作为产生过程的一部分)的蛋白，即表位或亲和标签。通常将选择插入位点以不影响病毒粒子的其他功能，例如内摄作用、病毒粒子的运输。技术人员能够根据他们的公知常识鉴定适合的插入位点。特定的位点公开于上文引用的Choi et al中。

本发明另外涵盖了以与天然AAV基因组不同的次序和构型提供AAV基因组序列。本发明还涵盖了用来自另一种病毒的序列或用由多于一种病毒的序列组成的嵌合基因置换一种或多种AAV序列或基因。这样的嵌合基因可由来自两种或多种不同病毒物种的相关病毒蛋白的序列组成。

本发明的载体为病毒载体形式，其包含本发明的启动子和表达构建体。

本发明还提供了包含本发明的载体的AAV病毒粒子。本发明的AAV粒子包括转衣壳形式，其中具有一种血清型的ITR的AAV基因组或衍生物被包装到不同血清型的衣壳中。本发明的AAV粒子还包括嵌合形式，其中来自两种或多种不同血清型的未经修饰的衣壳蛋白混合物组成病毒包膜。AAV粒子还包括经化学修饰的形式，其具有被吸附到衣壳表面的配体。例如，所述配体可包括靶向特定细胞表面受体的抗体。

本发明另外提供了包含本发明的载体或AAV病毒粒子的宿主细胞。

本发明的载体可通过本领域已知的用于提供基因疗法载体的标准方法来制备。因此，明确确定的公开的结构域转染、包装和纯化方法可用于制备适合的载体制品。

如上文所讨论的，本发明的载体除本发明的启动子以外还可包含天然存在的AAV病毒的全基因组或其变体。然而，通常使用衍生基因组，例如具有至少一个反向末端重复序列(ITR)，但是可缺少任何AAV基因(例如rep或cap)的衍生物。

在这样的实施方案中，为了将衍生基因组组装到AAV病毒粒子中，在宿主细胞中与衍生基因组组合提供另外的遗传构建体(提供AAV和/或辅助病毒功能)。这些另外的构建体通常包含编码结构AAV衣壳蛋白(即cap、VP1、VP2、VP3)的基因和编码AAV生命周期所需的其他功能的基因(例如rep)。在另外的构建体上提供的结构衣壳蛋白的选择将决定所包装的病毒载体的血清型。

用于本发明的特别优选的包装的病毒载体包含与AAV5或AAV8衣壳蛋白组合的衍生的AAV2基因组。

如上文提及，AAV病毒无法进行复制，因此通常还在一种或多种另外的构建体上提供辅助病毒功能，优选腺病毒辅助功能以允许AAV复制。

在宿主细胞中，全部上述另外的构建体可提供为质粒或其他游离元件，或者可将一种或多种构建体整合到宿主细胞基因组中。

药物组合物、剂量和治疗

可将本发明的载体配制成药物组合物。这些组合物除载体以外还可包括可药用的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。这样的材料应当是无毒的，并且不应当影响活性成分的功效。技术人员根据给药途径(即，本文中的直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射)可确定载体或其他材料的准确性质。

药物组合物通常为液体形式。液体药物组合物通常包括液体载体，例如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水、氯化镁、右旋糖或其他糖溶液或二醇类，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。在一些情况下，可使用表面活性剂，例如普流尼克酸(PF68)0.001％。

对于在患处的注射，活性成分为水溶液形式，其无热原并且具有适合的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗载体(例如氯化钠注射剂、林格氏注射剂、乳酸林格氏注射剂、哈特曼注射剂)来制备适合的溶液。根据需要，可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

对于延迟释放，药物组合物中可包括为了缓释而配制的载体，例如根据本领域已知的方法在从生物相容性聚合物形成的微囊中或在脂质体载体系统中。本发明的载体和/或药物组合物可包装成试剂盒。

通常，优选本发明的载体的直接视网膜递送、视网膜下递送或玻璃体内递送，通常是通过注射。因此优选递送到视网膜、视网膜下空间或玻璃体内空间。也可在体外将载体引入视杆细胞后将细胞移植到视网膜。

本发明的载体和/或药物组合物也可与任何其他用于治疗或预防视觉障碍的疗法结合使用。例如，它们可与已知的使用VEGF拮抗剂(例如抗VEGF抗体如贝伐珠单抗(Bevacizumab)或雷珠单抗(Ranibizumab))或可溶性受体拮抗剂(例如阿柏西普(Aflibercept))的治疗结合使用，用于治疗如本文讨论的AMD或其他眼病。

剂量和剂量方案可在负责给予组合物的医学从业者的常规技术范围内确定。本发明的载体的剂量可根据多个参数来确定，特别是根据待被治疗的患者的年龄、体重和病症；给药途径和所需的方案来确定。同样，医生能够确定任何特定患者所需的给药途径和剂量。

根据需要转导的视网膜组织的量，典型的单剂量为10¹⁰至10¹²个基因组粒子。基因组粒子在本文中被定义为包含单链DNA分子的AAV衣壳，所述DNA分子可用序列特异性方法(例如实时PCR)来定量。该剂量可被提供为单剂量，但是对于对侧眼或在由于任何原因(例如手术并发症)载体可能未靶向到正确的视网膜区的情况下，可重复该剂量。治疗优选为针对每只眼的单一永久性治疗，但是可以考虑重复注射，例如在未来若干年中和/或使用不同的AAV血清型。

治疗

本发明的载体可用于治疗任何眼病，其中存在视锥功能障碍、变性或缺失，但是至少保留了一些健康的视杆。视锥功能可全部缺失或部分缺失，例如至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％或更多缺失。健康的视杆是在感知暗视水平的光方面能够实现正常或部分视杆功能，例如至少10％、至少25％、至少50％、至少75％或至少90％的正常视杆功能的视杆。

可使用本发明的载体来治疗的病症因此包括黄斑变性、全色盲和利伯先天性黑矇。黄斑变性可以是年龄相关性黄斑变性(AMD)，例如湿性或新生血管性AMD或地图状萎缩、遗传性黄斑变性病症或遗传性视锥营养不良。在一些实施方案中，本发明将导致产生“假中央凹”——一小片类似于视锥的视杆，其在中央凹视锥丧失或功能障碍的病症中改善视觉。

通常，待用本发明的载体治疗的患者为人类患者。他们可以是任何年龄的男性或女性。

以下实施例说明本发明。

实施例

实施例1——ArchT实验方法

动物

从Harlan实验室(英国Blackthorn)购买野生型小鼠(C57BL/6J)。圈养CNGA3-/-和PDE6C-/-小鼠。将全部小鼠维持在周期光(12h光照-黑暗)条件下；在光周期中笼照明为7英尺-烛光。所有实验获得当地机构动物护理和使用委员会(英国伦敦，UCL)的批准，并且符合神经科学学会和视觉和眼科学研究协会(Rockville,MD)采用的动物护理和使用准则。

质粒构建、病毒产生和注射步骤

转基因构建体(ArchT-EGFP)由Prof Ed Boyden(MIT,USA)惠赠，并且包含与荧光蛋白EGFP融合的ArchT基因的cDNA序列。将质粒包装成AAV8以产生重组AAV病毒载体AAV8.hRho.ArchT-EGFP。通过如之前所述的三重瞬时转染法产生重组的AAV8载体。将质粒构建体、AAV血清型特异性包装质粒和辅助质粒与聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)混合以形成转染复合物，然后将该转染复合物添加到293T细胞并放置72h。收集细胞、浓缩并裂解以释放载体。使用AVB Sepharose柱(GE Healthcare)来纯化AAV8。将二者在1X PBS中洗涤并浓缩至体积100-150μL。通过比较从纯化的病毒原种制备的斑点印迹DNA和确定的质粒对照来确定病毒粒子滴度。用于所有实验的纯化的载体浓度为5×10¹²病毒粒子/mL。如我们组之前所述进行视网膜下注射，其由两次注射组成，每次2μL。

免疫组织化学

对动物施安乐死术，摘除眼球并取出角膜、晶状体和虹膜。对于视网膜切片，室温下在4％多聚甲醛(PFA)中固定眼杯(eyecup)，然后包埋于最适切割温度(OCT)培养基中。径向切出30μm冷冻切片，在PBS中冲洗，并在10％正常山羊血清(NGS)、3％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％Triton-X100中封闭。4℃下使用兔抗视锥抑制蛋白(1:500稀释)，在封闭液中用一级抗体过夜孵育各样品。PBS洗涤之后，二级抗体(全部1:500稀释，life technologies)(包括山羊抗兔Alexa Fluor 546(#A11035)、山羊抗小鼠Alexa Fluor 633(#A21052)和链霉亲和素、Alexa Fluor 633缀合物(#S21375))的各结合物用于标记样品，然后将这些用DAPI进行反染色，并用DAKO荧光封固剂(DAKO,S3023,Denmark)封固。通过共焦显微镜(LeicaDM5500Q)获取图像。

单光感受器吸入记录

使动物在暗处适应12h，然后开始实验。经由腹膜腔给予小鼠过量的氯胺酮-dormitor麻醉混合物以诱导终端手术级麻醉。然后通过颈椎脱位术处死小鼠并摘除眼球。将眼在弱远红外照明下解剖。将分离的视网膜包埋于1％低熔解琼脂糖溶液中，然后使用vibrotome(leica)切成230μm厚面对面(en face)的切片。将切片封固在记录室中并用包含100μM 9-顺式视黄醛(Sigma)和0.2％BSA(Sigma)的卡波金(95％O₂，5％CO₂)饱和的Ames培养基灌注。在反馈控制(Scientifica)下使用线内加热元件将灌注液的温度保持在37℃。使用Narishige PC-10垂直拉制器从丝状硼硅酸盐玻璃毛细管(Harvard Apparatus Ltd)制造电阻非常低(1-2MΩ)的膜片吸管(patch pipette)。将吸管用外部溶液填充，放置到探头(headstage)上并在尖端施加较小的压力(约30mbar)。使用红外照明，将辅助看见吸管的显微镜放置到视网膜表面，然后降低约50μm到切片中，直到光感受器段显现出完整且整齐的排列。随着吸管尖端缓慢穿过视网膜组织，在吸管尖端施加轻微的负压，使用100ms，10mV测试脉冲以监测经过吸管尖端的阻抗。当阻抗升至约20-30MΩ时，检测光引发的响应。将来自与液芯光导管偶联的LED光源的光刺激(峰波长530nm)传递通过显微镜物镜(Olympus)。使用中性密度滤波器准确控制光刺激的密度。光刺激由方形波脉冲组成，该方形波脉冲用P-Clamp软件(Molecular Devices)编程并经由DAC板(Axon Instruments)(与LED驱动器(Thorlabs)连接)传递。使用Multiclamp 700B放大器(Molecular Devices)进行电生理记录。在20kHz下将数据数字化。

MEA记录

使动物在暗处适应12h，然后开始实验。经由腹膜腔给予小鼠过量的氯胺酮-dormitor麻醉混合物以诱导终端手术级麻醉。然后通过颈椎脱位术处死小鼠并摘除眼球。在弱红光下，将眼在卡波金(95％O₂，5％CO₂)饱和的Ames培养基(Sigma)中解剖。小心取出角膜和晶状体以从视网膜表面除去尽可能多的玻璃体。从视网膜分离RPE，并且从视网膜“杯”切除横向1-3mm的平瓣(flat petal)。将该视网膜瓣放置在多电极阵列表面上下方的神经节细胞一侧，使用由惰性铂丝(Sigma)和尼龙构成的环形harm以将瓣保持在原位。在记录过程中，将组织用卡波金饱和的Ames培养基(Sigma)灌注，保持在36.5℃的温度下。对于包括暗视或中间视觉条件的记录，制备灌注培养基以包括0.2％BSA(Sigma)中的浓度为100μM的9-顺式视黄醛(Sigma)。使用多孔的60电极记录阵列——由间隔100μm的钨电极(MultiChannel Systems)组成——记录神经节细胞的胞外电势。使用MC Rack软件(MultiChannel Systems)，通过MC Card系统将电压改变放大并在50kHz下数字化。

电生理数据分析

使用IgorPro 6中的定制手写宏指令来分析电生理数据。使用振幅阈值算法来检测突触电流和电势，在该算法中将事件检测的阈值设定为基线噪声(通常约10pA)的标准差的2倍。通过仔细检查所有电生理数据来手动确认检测的电流和电势。

恐惧条件反射

使用市售的恐惧条件反射系统(Med Associates)训练和测试小鼠。为了确保盲条件，进行训练和测试的实验者始终不知晓小鼠品种和处理条件。简言之，装备由调节箱(20×30cm)组成，所述箱具有被放置在减音隔间内部的不锈钢格栅地板。在训练和测试期间，通过内装的红外数字视频摄像机(采集速率30帧/秒)和红外照明来持续监测小鼠行为。视频冻结软件(Med Associates)用于控制光刺激和电击的传递。光刺激由单次LED(530nm,Thorlabs)5Hz 50ms完全亮度闪光组成，该闪光由放置在调节箱侧板上的Arduino界面(Arduino软件)产生。为了确保训练和测试发生的背景不同，对于测试期，将地板和弧形墙板插入到箱中。将背景用于降低视杆激活的概率，用托吡卡胺(Tropicamide)滴剂使瞳孔放大以增加到达小鼠视网膜的光的量。

将小鼠放置到箱内并使其经历一个调节期，该调节期由6对都以2s、0.65mA足部点击结束的5s光刺激组成。试验之间的间隔是假随机的(平均间隔90s)。在训练期之后，使小鼠返回到原来的笼中。训练后24小时，测试小鼠的视觉线索记忆回忆。将小鼠放置在测试箱中并监测共360s。在测试期最后的120s中连续给予调节光刺激。获取所有数据并自动通过VideoFreeze软件(Med Associates)记录。简言之，在将动物放置到箱中之前校准软件。然后软件测量每个视频帧之间发生的像素变化。将移动阈值设定得尽可能低(20个移动指数单位)，将连续冻结计数设置为帧率以确保最灵敏的移动读出。为了评估光线索记忆回忆，在光刺激开始之前和开始后的2分钟，求冻结行为的时间百分数的平均值。使用单因素ANOVA来评估统计学显著性。结果表示为平均值±S.E.M。

验光学(Optomotry)

通过观察小鼠对旋转正旋光栅(OptoMotry,Cerebral Mechanics)的视动反应来测量视敏度。由于只有颞部到鼻方向上的移动引起追踪反应，根据两只眼对图案旋转的不同敏感度，使用的方案产生右眼和左眼敏感度的独立测量。因此，右眼和左眼分别对逆时针方向(CCW)和顺时针方向(CW)的旋转最敏感。使用不同时间频率的刺激确定反应存在的阈值。使用双盲两次替代性强制选择步骤，其中观察者对图案旋转的方向、对是否是经ArchT处理的或未经处理的CNGA3-/-或PDE6C-/-小鼠或年龄匹配的野生型对照动物(C57BL6)是“不知晓”的。在单独的4天进行4次试验之后，测量测试动物两只眼的视敏度，求平均值或单独分析每只眼的视敏度。在与年龄匹配的等基因对照共同处理之后3-10周，对经注射的小鼠进行测量。

实施例2——视杆细胞中的ArchT表达赋予了以快速非漂白响应作出响应的能力

优化低光水平的视杆介导的视觉，包括单光子检测。然而，视杆比不上视锥对光反应的快速发生和恢复(Fu et al.,2007,Pugh et al.,1999)。当在病症中(例如在年龄相关性黄斑变性中)视锥介导的视觉丧失时、在中央凹中紧密堆叠的视锥变性时(de Jong2006)，这种用于确保在不同环境中的可靠视觉的功能差异减弱。研究了视杆是否能够对刺激更快地响应和恢复，这有助于缓解由视锥丧失引起的功能损伤。

在视杆细胞中表达快速光驱动的质子泵(Han et al.,2011)。将携带视紫红质启动子(Rho)控制下的ArchT-EGFP的AAV8粒子经视网膜下注射到成年小鼠中。Rho-ArchT-EGFP的表达限于视杆细胞膜(图1a-b)。通过免疫组织化学能够容易地区分表达Rho-ArchT-EGFP的视杆的突触末端和视锥(图1c)。对视锥的分类群进行的定量PCR证实Rho-ArchT-EGFP表达是视杆群特异性的，并且在AAV8注射后最长达6个月未观察到任何明显的毒性征象。ArchT表达允许极其快速的光响应，而固有的视锥响应被保留并且与在非转导的视杆细胞中观察到的响应相当(图1d)。在所有测试小鼠模型中，从表达ArchT的视杆记录的光引发的电流证明了比固有的视杆电流快得多的动力学(图2a-b)。这些动力学使光引发的电流被调整到最高达80Hz，远高于视杆(约为20Hz)(图2a-c)和视锥的极限(Fu et al.,2007)。

出乎意料的是，ArchT表达并未改变视杆细胞的特性，然而赋予了以快速非漂白响应作出响应的能力(图2e)。

实施例3——表达ArchT的视杆在高光强度下和与视锥细胞的频率接近的频率下驱动持续的RGC脉冲

接下来研究了视杆驱动的电路能否跟随比正常更快的视杆驱动的视觉。视杆和视锥途径表现出一些相似性和一些显著差异，因此不清楚视杆电路能否可靠地维持快速的“类似于视锥的”传输(et al.,2004)。视杆已显示出直接接触OFF“视锥”双极细胞(Soucy et al.,1998和Hack et al.,1999)，成对脉冲刺激表明该旁路途径可以与视锥至OFF双极途径一样快(Li et al.,2010)。然而，不清楚该响应如何持续以及视杆(ON)双极细胞能否也保持快速传输。此外，与视锥相比，视杆突触末端具有不同大小和超结构组织，视杆双极细胞不与视网膜神经节细胞(RGC)直接接触，但是仅通过涉及AII无长突细胞的途径接触(et al.,2004)。为了研究视杆途径能够达到的最大速度，进行来自缺少视锥功能的小鼠模型中的RGC的多电极记录，以分离视杆介导的RGC输出。非转导的视网膜中的RGC中的视锥驱动的响应在高光水平下被漂白，并且无法跟随高于约20Hz的刺激频率(图2f)。

相反，表达ArchT的视杆在高光强度下和与视锥细胞的频率接近的频率下驱动持续的RGC脉冲(图2f)。

实施例4——Rho-ArchT-EGFP的表达扩大了缺少视锥介导的视觉的小鼠对亮光刺激的灵敏度

为了使这种快于正常的视杆视觉有用，推断小鼠应当能够使用ArchT介导的电流以可靠地响应于明亮且快速的刺激。缺少视锥介导的视觉的CNGA3^-/-和PDE6C^-/-小鼠(Bielet al.,1999和Change et al.,2009)无法学习恐惧条件反射范式，其中亮光刺激是成对的并且共同以中度足部电击结束(图3a)。然而，Rho-ArchT-EGFP表达扩大了这些小鼠对亮光刺激的敏感度，使小鼠学习视觉刺激和电击之间的关联(图3a)。最终，测试ArchT表达是否赋予CNGA3^-/-和PDE6C^-/-小鼠快速视觉。通过视动测试(Umino et al.,2008)对视觉速度的评估表明，表达ArchT的小鼠与没有经历视网膜下病毒注射的小鼠和仅接受GFP载体的小鼠相比，能够更快地追随刺激(图3b)。表达ArchT的小鼠能够追随的刺激的最大频率类似于视锥细胞的频率(图3b)。

这些结果共同表明，相对于通过视杆固有的光转导级联，能够更快地驱动视杆，并且视杆驱动的电路能够维持更快的信号传导。重要的是，从视杆的突触释放不需要大电压波动，但是小电流反而能够导致充分的电压变化而显著改变它们的突触传输(Cangiano etal.,2012)。这将本发明的用途扩大到比大多数其他神经元中的活动的光遗传操控所需的平均光水平低若干倍的光水平(Han et al.,2011)。

实施例5——RPAP实验方法

动物

将C57BL6(英国Harlan)、Cnga3-/-(密歇根大学，J.R.Heckenlively)、Pde6c-/-(密歇根州密歇根大学，J.R.Heckenlively)(Chang et al.,2009)和Gnat1-/-(马萨诸塞州，塔夫茨大学医学院，J.Lem)(Calvert et al.,2000)小鼠维持在伦敦大学学院的动物设备中。病毒注射时成年雄性和雌性动物为6-12周龄，并且在注射后至少2周用于实验以使R9AP充分表达。所有使用的小鼠为2至6月龄，并且在给定实验组之间的月龄匹配。全部实验根据神经科学研究中的动物和人类使用政策以及眼和视觉研究中动物使用的ARVO声明进行。将动物维持在标准12/12小时光照-黑暗周期。

质粒构建和重组AAV8的产生

使用被设计以涵盖全部编码区的引物从鼠视网膜cDNA PCR扩增出鼠R9ap cDNA。在启动子(CMV启动子或牛视紫红质启动子)和SV40多聚腺苷酸化位点之间克隆R9ap cDNA。这些质粒用于产生两种假型化的AAV2/8病毒载体rAAV2/8.CMV.mR9ap和rAAV2/8.Rho.mR9ap，如以下所述。

通过之前所述的三次瞬时转染法来产生重组AAV2/8载体(Gao et al.,2002)。将质粒构建体、AAV血清型特异性包装质粒和辅助质粒与聚乙烯亚胺混合以形成转染复合物，然后将该复合物添加到293T细胞并放置72h。收集细胞、浓缩并裂解以释放载体。通过亲和色谱法纯化AAV2/8并使用超滤柱(Sartorius Stedim Biotech,Goettingen,Germany)浓缩，在PBS中洗涤并浓缩至体积100-150μL。通过斑点印迹法或通过实时PCR来确定病毒粒子滴度。使用的纯化的载体浓度为1-2×10¹²个病毒粒子/mL。

视网膜电图(ERG)

使用市售的系统(Espion E2,Diagnosys LLC,Lowell,MA)，在使小鼠进行过夜黑暗适应之后从两只眼记录ERG。记录前使用比例为5:3:42的盐酸美托咪啶(1mg/ml)、氯胺酮(100mg/ml)和水的0.007ml/g混合物的腹膜内注射剂来麻醉动物。使用2.5％苯肾上腺素和1.0％托吡卡胺，使瞳孔完全放大。首先放置中线皮下接地(ground)电极和口腔参照电极，然后放置阳性银电极，使其在弱红光照明下轻触角膜中心。将一滴Viscotears 0.2％液体凝胶(Dr.Robert Winzer Pharma/OPD Laboratories,Watford,UK)放置在阳极上方以在记录期间保持角膜润湿，并使小鼠进一步适应黑暗5分钟。带通滤波器截止频率为0.312Hz和1000Hz。使用成对闪光范式来测量光响应的恢复速度，在该范式中呈现了具有相同饱和强度(1.8log.cd.s/m²)的闪光对，其以不同的刺激间时距(ISI；0.5、1、2、4、8、16、32、64秒)分隔开。在该范式中，第一闪光完全抑制了视杆机制的电响应，这允许通过呈现具有不同ISI的第二闪光来观察视杆功能的功能性恢复的速度。在闪光对之间提供足量的时间(150秒)以允许第一闪光的恢复。然后观察到的a波振幅的恢复应当反映缺乏视锥功能的动物中视杆失活的速度，因为闪光应当仅漂白视紫红质的一部分(0.02％)(Lyubarsky et al.,2004和Weymouth,A.E.&Vingrys 2008)。在之前报道的基础上进行一些修改，来进行暗视6Hz闪光强度系列(Seeliger et al.,2001)。使用17级闪光强度，范围为-6至2log.cd.s/m²，每级以0.5log单位分隔。对于每一级，适应10秒之后，使用相同的闪光条件，将600毫秒扫射(sweep)平均20次。使用全部为83.3cd/m²的持续时间为20、100和200毫秒的更长的闪光，也获得了暗适应的响应系列。在以下逐渐增加的光强度下从暗适应的动物获得标准单闪光暗视记录：-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、1.0、1.5和1.9log.cd.s/m²。在20cd/m²的背景光强度(也用作记录期间的背景光)下，按照5min光适应间隔进行明视闪光记录。使用的明视光强度为-2、-1、0、1、1.5和1.9log.cd.s/m²。

组织学

rAAV2/8.Rho.mR9ap单侧视网膜下注射后6周，快速摘除Cnga3-/-小鼠的两只眼并快速冷冻于液氮中。将眼冷冻包埋于OCT(RA Lamb,Eastborne,UK)中之后，将眼切成15μm厚的横向切片并在空气中干燥15-30分钟。对于免疫组织化学，将切片预封闭在包含正常驴血清(2％)、牛血清白蛋白(2％)的PBS中1小时，然后在室温下用抗RGS9抗体(1:500；SantaCruz Biotechnology,SantaCruz,CA)孵育2小时。用PBS冲洗2×15min之后，在室温(RT)下将切片用适合的Alexa 546标记的二级抗体(Invitrogen,Carlsbad,CA)孵育2小时，冲洗并用Hoechst 33342(Sigma-Aldrich,Gillingham,UK)反染色。在共焦显微镜(Leica TCSSP2,Leica Microsystems；Wetzlar,Germany)上观察视网膜切片。

蛋白质印迹

在rAAV2/8.Rho.mR9ap单侧视网膜下注射后4周，从Cnga3-/-小鼠收集眼。从RPE/脉络膜/巩膜复合物分离神经视网膜之后，使组织在RIPA缓冲液中均质化并在冰上放置20分钟。4℃、16,000g离心样品30分钟并贮存于-20℃直至使用。使用已知方案来进行蛋白质印迹。

视动响应和对比敏感度函数

通过观察小鼠对旋转正弦光栅(OptoMotry^TM,Cerebral Mechanics,Lethbridge,AB Canada)的视动响应来测量处理的和未处理的眼的对比敏感度和视敏度。根据两只眼对图案旋转的不同敏感度，使用的方案产生了右眼和左眼敏锐度的独立测量：右眼和左眼分别主要由逆时针和顺时针旋转驱动(Douglas et al.,2005)。将小鼠放置在封闭空间中与地板隔离的小岛上，所述封闭空间被4个具有平均照明度为62cd/m²的旋转正弦光栅的监控器围绕。使用双盲两次替代性强制选择步骤，其中观察者对图案旋转的方向、对是否是经处理的或未经处理的Cnga3-/-小鼠或年龄匹配的野生型对照动物(C57BL6)是“不知晓”的。将6Hz下呈现的0.128、0.256、0.383、0.511周/度下测量的对比敏感度定义为100除以产生阈值响应的最低对比百分数。在独立的天中对每只小鼠的两只眼进行4次测试。将数据展示于Campbell-Robson对比敏感度图表上，正弦光栅代表相对空间频率。

视紫红质测量

在过夜使小鼠完全适应黑暗之后，麻醉小鼠并使瞳孔完全放大以评估视色素漂白的速度。然后将小鼠放置在光盒中，该光盒中的光源(7.0mW)直接照射眼5分钟，然后收集眼。在另一个实验中，将小鼠暴露于与测量各种持续时间(0、30、60、120分钟)的对比敏感度的条件相同的条件。在各时间点摘除小鼠眼并放置于250μL磷酸缓冲盐水中，快速冷冻于不透光管中的液氮中，并保持在-20℃直到使用。在过夜使小鼠适应黑暗之后，在红光照明下于黑暗中收集一些眼。在之前报道(Douglas et al.,1995)的基础上进行一些修改，来进行视紫红质的分光光度法测量。简言之，在室温下融化样品并均质化。此操作和所有随后的操作在使视色素漂白最少的暗红光照明下进行。将50μL正十二烷基β-D-麦芽糖苷(200mM；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)添加到各样品中，并在室温下将所得混合物旋转2h，然后4℃下离心(23,000g)10分钟。除去上清液并放置在Shimadzu UV-2101PC分光光度计(Shimadzu,Kyoto,Japan)中的石英杯中。在对未漂白提取物进行从300nm至700nm的初始扫描之后，将样品暴露于单色光(502nm)3分钟——已表明其足以完全漂白视紫红质(Longbottom et al.,2009)，并进行重新扫描。全部吸收光谱在700nm归零。使用漂白前曲线和漂白后曲线来构建差异光谱，并确定约500nm下的最大光密度，代表所提取的视色素的量。

实施例6——视杆中的R9AP过表达盒和增加的光感受器失活速度

RGS9、Gβ5和R9AP是调控的GTPase复合物的必要成员。为了研究在视杆中AAV介导的R9AP过表达对GTPase复合物的影响，在Cnga3-/-小鼠中检查rAAV2/8.Rho.mR9ap视网膜下注射之后RGS9的水平和分布。这些小鼠具有正常视杆功能，但是缺乏视锥功能，并充当全色盲的模型。4周之后，与未经治疗的视网膜相比，经治疗的视网膜在整个光感受器层中显示出增加的针对RGS9的免疫反应性(图4A)。蛋白质印迹分析进一步确认了在经治疗的视网膜中RGS9蛋白表达增加(图4B)。这些结果表明，使用AAV2/8的R9AP的过表达有效增加了催化组分RGS9和GTPase复合物的水平。

接下来通过运用成对闪光ERG(Lyubarsky and Pugh 1996)，研究了AAV2/8介导的R9AP过表达对视杆光转导的功能影响。在该范式中，以可变的刺激间时距传递一对相同的闪光强度，并且测量第二响应相对于第一响应的恢复。在视杆细胞途径中，a波(源自光感受器)恢复的速度取决于失活的速度。发现与未经处理的眼(σ＝约7.38秒)相比，用rAAV2/8.CMV.mR9ap注射的Cnga3-/-眼中a波振幅50％恢复的时间常数(σ)减小约60％(σ＝约2.99秒)(图4C)。类似地，在相同小鼠系(Cnga3-/-)中使用视紫红质启动子(rAAV2/8.Rho.mR9ap；σ＝约2.74秒；图4C)或在另一视锥缺陷的小鼠系(Pde6c-/-；图8)中使用相同病毒(rAAV2/8.CMV.mR9ap)观察到a波恢复的速度增加。这些观察表明，rRAAV2/8.CMV.mR9ap或rAAV2/8.Rho.mR9ap的视网膜下注射通过增加RGS9和GTPase复合物的水平可显著提高视杆光转导的失活速度。

实施例7——通过R9AP过表达的视杆功能的“明视偏移”

为了研究在视杆中通过RGS9和GTPase复合物的过表达而实现的失活速度增加是否能够改变光感受器功能的运转范围，使用增加的闪光强度来记录暗适应的6Hz闪光ERG。与未经处理的眼相比，用rAAV2/8.CMV.mR9ap或rAAV2/8.Rho.mR9ap处理的眼显示出增加的对更亮闪光的响应。这导致响应上限的升高最多达约2log单位(图5A)，对最大光响应的影响很小(在经处理的眼中为151±17μV以及在未经处理的眼中为162±29μV；平均值±平均值的标准误差)。如所预期的，这种视杆运转范围的“明视偏移”伴随着响应下限的相互升高最多达约1.5log单位。同时，与未经处理的Cnga3-/-眼相比，均具有功能性视锥的野生型眼和Gnat1-/-眼的ERG响应的上限升高约4.0log单位。将rAAV2/8.Rho.mR9ap注射到Pde6c-/-小鼠中时得到类似的结果(图9)。因此，治疗使视杆响应于更长持续时间的闪光(图5B)，以及响应于视锥分离背景照明下的闪光(图5C)。这些包括未经处理的视杆实际上未显示出响应的情况。

总之，这些结果确定，视杆中R9AP过表达导致它们的脱敏，并且使细胞获得明视功能以交换暗视功能。这种对视杆功能的“明视偏移”的治疗性诱导至少持续5个月，而没有明显的视网膜变性证据(图10)。同时，使用相同病毒载体对野生型小鼠的治疗未显示出可测量的视网膜功能变化(图11)。

实施例8——视杆双极途径适应改变的视杆功能的传输。

本工作确定了视杆中R9AP的过表达导致更快的光感受器失活动力学，并且使神经元响应于更大量的光子。同时，加速失活还应导致光感受器突触末端的神经递质释放的持续时间更短。因此，评估了下游视杆双极信号传导是否受到治疗的影响。首先，通过使用ERG来测量a波(源自光感受器)和b波(源自双极细胞)的隐含期和振幅，研究了对于短的单闪光，信号从光感受器传输到双极细胞的速度和范围(图6a)。总体上，对于a波和b波，观察到经治疗和未经治疗的眼的稍微更小但是几乎相同的强度-响应曲线。观察到的小差异可反映出加速的光感受器失活的真实结果或仅反映出由视网膜下注射诱导的神经损伤。a波隐含期标志着双极细胞驱动的b波不可检测时的时间点。本发明人还观察到a波和b波隐含期的小延迟，表明从光感受器到双极细胞的神经信号传输中存在中等程度的延迟。然而，个体之间ERG响应的相对大的变化表明，视杆响应的小延迟或降低未必转变为视觉功能障碍(Birch and Anderson 1992)。

因此，这些结果表明，原则上，双极细胞几乎完全适应光感受器功能的改变，并且重要的是，表现出适当的剂量-响应关系。

实施例9——R9ap过表达导致改善的对比敏感度函数

接下来，通过使用标准计算机显示器，在可能的最亮记录条件(62cd/m²)下测量对旋转正弦光栅的光动力响应，询问通过R9AP过表达的视杆功能的“明视偏移”是否因此转化为光照下改善的视觉表现(Carvalho et al.,2011)。该行为测试的独特优势在于，可单独地研究每只眼的视觉功能；右眼的功能可通过对逆时针(CCW)光栅的响应来检测，左眼的功能通过顺时针(CW)刺激来检测(Douglas et al.,2005)。使用6.0Hz固定时间频率来研究空间对比敏感度函数(CSF)，发现与野生型小鼠相比，Cnga3-/-小鼠具有降低的CSF(图7)。CSF——对比敏感度和视敏度的函数——表现出视觉感知的估计范围(假定动物可在曲线下而非曲线上感知光栅；图7A)。有趣的是，当比较经处理的和未经处理的眼的对比敏感度时，观察到使用0.128和0.256周/度(c/d)光栅的敏感度分别增加8.0倍(P＝0.005)和5.4倍(P＝0.011)(图7A，左图)。对于0.383(P＝0.056)和0.511(P＝0.111)c/d的光栅，未观察到明显的对比敏感度改变。有趣的是，Cnga3-/-小鼠中处理的眼的平均敏感度超过了具有正常视锥功能的野生型对照的平均敏感度。然而，当用相同的病毒构建体处理野生型小鼠时，经处理的眼和未经处理的眼的CSF并无差异(图12)。

当查看最大亮度显示器设置时，已确定R9AP过表达导致视觉表现的增加，需要确定这种视觉增加是否是可持续的。这是合理的担忧，因为已知视杆中视色素的再生比视锥中视色素的再生慢得多(Wangand Kefalov 2011)。首先，评估是否治疗导致视色素漂白速度改变。发现经处理的和未经处理的眼暴露于亮光5分钟并未产生残留的可漂白视色素水平的任何差异(图7B，左下图)。其次，在将Cnga3-/-小鼠暴露于进行CSF测量的相同实验条件下不同时间之后，研究眼中可漂白的视紫红质的量。结果表明，对于经处理的和未经处理的眼，在相似地暴露于视觉刺激的2小时中，视色素水平保持稳定而没有减少迹象(图7B，右下图)。这些结果表明，在经处理的Cnga3-/-小鼠中视觉感知的增加由充分供应的视紫红质分子支持，并且是可持续的。

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Claims

1.一种包含编码感光细胞中光敏性基因产物和/或调节内源性光敏性信号传导的基因产物的核酸的载体，其用于在具有视锥细胞功能障碍和/或变性的患者中改善视觉的方法，所述方法通过将所述核酸引入到所述患者的视网膜中的健康视杆细胞中并在其中表达所述基因产物，从而扩大视杆细胞响应的光强度的范围和/或提高视杆细胞响应光的速度。

2.根据权利要求1使用的载体，其中所述核酸编码以光刺激之后导致视杆超极化(外向电流)的方式改变膜电导的蛋白。

3.根据权利要求2使用的载体，其中所述核酸编码(a)光敏性或光门控G偶联膜蛋白、离子通道、离子泵或离子转运蛋白；(b)RGS9复合物成员；或(c)另一种增加内源性视杆信号传导机制的速度的蛋白。

4.根据权利要求3使用的载体，其中所述光门控分子是ArchT、Jaws(cruxhalorhodopsin)、iC1C2，或所述RGS9复合物成员是R9AP。

5.根据前述权利要求中任一项使用的载体，所述载体为病毒载体。

6.根据权利要求5使用的载体，所述载体为腺相关病毒(AAV)载体。

7.根据权利要求6使用的载体，所述载体的衣壳源自AAV8。

8.根据权利要求6或7使用的AAV载体，所述载体的基因组源自AAV2。

9.根据前述权利要求中任一项使用的载体，其中所述患者患有黄斑变性、全色盲或利伯先天性黑矇。

10.根据权利要求9使用的载体，其中所述黄斑变性为年龄相关性黄斑变性(AMD)、遗传性黄斑变性病症或遗传性视锥营养不良。

11.根据权利要求10使用的载体，其中所述AMD是湿性AMD或新生血管性AMD或地图状萎缩。

12.根据前述权利要求中任一项使用的载体，其中视杆细胞信号传导被扩大到中间视觉或明视觉照明范围。

13.根据前述权利要求中任一项使用的载体，其中所述视杆表现出改善的调节强度和/或更快的激活/失活动力学。

14.根据前述权利要求中任一项使用的载体，其中在体外将所述载体引入到视杆细胞，然后移植到视网膜中。

15.根据前述权利要求中任一项使用的载体，其中所述患者的中间视觉和/或明视觉得到改善。

16.根据前述权利要求中任一项使用的载体，其中所述核酸在光感受器特异性启动子或光感受器优选的启动子的控制下表达。

17.根据权利要求16使用的载体，其中所述光感受器特异性启动子或光感受器优选的启动子是视杆特异性启动子或视杆优选的启动子。

18.根据权利要求17使用的载体，其中所述核酸在视紫红质(Rho)、神经视网膜特异性的亮氨酸拉链蛋白(NRL)或磷酸二酯酶6B(PDE6B)启动子的控制下表达。

19.包含权利要求1至4中任一项中所定义的核酸的表达盒，所述核酸与权利要求17或18中所定义的视杆特异性启动子或视杆优选的启动子可操作地连接。

20.包含权利要求19的表达盒的载体。

21.权利要求20的载体，其为权利要求5至8中任一项所定义的病毒载体。

22.包含权利要求20或21的载体的宿主细胞。

23.权利要求1至8、16、17、19或20中任一项所定义的载体用于制备用于如权利要求1或9至15中任一项中所定义的改善视觉的药物的用途。

24.一种在具有视锥细胞功能障碍的患者中改善视觉的方法，所述方法通过将编码光敏性基因产物的核酸引入到所述患者的视网膜中的健康视杆细胞中并在其中表达所述基因产物，从而扩大视杆细胞响应的光强度的范围和/或提高视杆细胞响应光的速度。

25.权利要求24的方法，其中所述载体如权利要求1至8、16、17、19或20中任一项所定义。

26.权利要求23或24的方法，其中如权利要求1或9至15中任一项所定义来改善视觉。