CN105980569A

CN105980569A - 重组aav-crumbs同源物组合物及治疗lca-8和进行性rp的方法

Info

Publication number: CN105980569A
Application number: CN201480054880.9A
Authority: CN
Inventors: J·韦南霍尔兹; L·P·F·佩利希尔
Original assignee: Leiden Teaching Hospital Leiden University Medical Center
Current assignee: Leiden Teaching Hospital Leiden University Medical Center; Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Priority date: 2013-08-05
Filing date: 2014-08-05
Publication date: 2016-09-28
Also published as: AU2014305218B2; IL243954A0; EP3030665B1; US11246947B2; US20160194374A1; JP2016530253A; EP3030665B9; JP6827320B2; CA2919995A1; EP3030665A1; WO2015020522A1; US20220193258A1; AU2014305218A1; IL243954B; JP2021038244A

Abstract

本发明涉及toa Crumbs同源物(CRB)治疗剂，其用作药物或用于治疗或预防的方法，例如用于治疗或预防归因于Crumbs同源物‑1(CRB1)基因突变的视网膜病症，例如先天性利伯氏黑蒙8(LCA8)或色素性视网膜炎12(RP12)。特别的，本发明涉及包含CRB2或修饰的无毒形式的类似于CRB2的CRB1或CRB3的重组病毒载体。

Description

重组AAV-CRUMBS同源物组合物及治疗LCA-8和进行性RP的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学、病毒学和基因治疗领域。具体而言，本发明涉及使用基因治疗载体治疗归因于Crumbs同源物-1(CRB1)突变的视网膜病症。

背景技术

先天性利伯氏黑蒙(LCA)是最早且最严重的一组遗传性视网膜病变，发病率为每100000人2到3人，且是儿童先天性盲的最常见病因。它是在处于生命前几个月的婴儿中鉴别的常染色体隐性或显性病状(condition)。8型LCA(LCA8)是隐性遗传的。LCA8患者的症状包括眼球震颤、瞳孔反应迟缓、视网膜功能障碍、视觉损伤以及最终的失明。这些失明的或视觉严重受损的幼儿的眼睛显示出表面上正常的眼底，但却缺少如通过视网膜电描记术(ERG)测量出的视网膜活性。至少一些LCA8患者显示出厚于正常人或其它LCA患者的视网膜。LCA8患者在CRB1基因座位中具有突变或DNA改变(alteration)，或具有影响CRB1基因座位的突变或DNA改变。LCA8患者占全部LCA患者的10-15％。

色素性视网膜炎(RP)是遗传性的且严重的一组退行性眼病，其发病率为每3000人1人，导致严重的视觉损伤，并经常导致彻底失明。严重的隐性遗传的进行性色素性视网膜炎发生于幼儿中，所述幼儿在Crumbs同源物-1(CRB1)基因座位中具有突变或DNA改变，或具有影响CRB1基因座位的突变或DNA改变。这些幼儿在其第二十个生日前逐步变得失明。在基因型(突变类型)和表型(LCA或RP)间不存在明确的关系。归因于CRB1基因突变的RP(RP12)占全部RP患者的3-5％。

CRB1突变导致具有RPE的动脉旁保护(PPRPE)的隐性遗传的色素性视网膜炎；隐性遗传的色素性视网膜炎；隐性遗传的先天性利伯氏黑蒙；或显性遗传的色素性静脉旁脉络膜视网膜萎缩。症状可包括科茨样渗出性血管病变(Coats-like exudativevasculopathy)；突变导致具有异常分层的增厚的视网膜。遗传分析显示，LCA主要是单基因的，但却由超过20种基因导致，包括CRB1(占全部病例的～10-15％)、CEP290(占全部病例的～20％)、GUCY2D(占全部病例的～15％)、IMPDH1(占全部病例的～10％)、RPE65(占全部病例的～5％)，以及较低频率发生的AIPL1、RPGRIP1、RDH12、NMNAT1、SPATA7、LCA5、CRX、TULP1、MERTK、LRAT、RD3、OTX、CABP4、KCNJ13、IQCB1以及其它基因(den Hollander et al.,2009)。CRB1基因突变是LCA的最主要原因(占全部病例的10-15％)。遗传分析显示，RP由超过50种基因导致。CRB1基因突变占RP全部病例的3-5％(RP12)。患有归因于CRB1突变的LCA8或RP12的患者数目与患有归因于鸟苷酸环化酶2D(GUCY2D)基因突变的LCA1的患者数目大致相同，且甚至是患有归因于编码视网膜色素上皮65kD蛋白(RPE65)的基因突变的LCA2的患者数目的两倍。

据估计，超过100000个世界居民患有8型先天性利伯氏黑蒙或RP12。CRB1基因编码Crumbs同源物-1(CRB1)，其在人视网膜中的感光细胞和Müller神经胶质细胞以及视网膜祖细胞中表达，并临近外界膜处的粘合连接复合体(adherens junction complex)。CRB1直接或间接调节视网膜细胞类型间的生理(physical)相互作用。在成人视网膜中，CRB1的丧失导致Müller神经胶质细胞和感光细胞间粘合的丧失，导致结构改变如正常分层的丧失。最后，这导致由于细胞死亡而引起的视杆细胞的丧失，及随后视锥细胞的丧失。在发育中的视网膜中，CRB1的丧失导致视网膜祖细胞和新分化的感光细胞以及Müller神经胶质细胞间粘合的丧失。最后，异位的细胞不形成有功能的神经元网络并遭遇细胞死亡。发育中的视网膜中的CRB1的丧失还导致了迟生的(late born)视网膜细胞(视杆细胞、Müller神经胶质细胞、双极细胞、无长突细胞的迟生亚型)数量增加，并增加了导致视网膜不成熟外观的错误定位的(mislocalized)视网膜细胞。

目前，还没有可用于预防、延迟或治疗人类LCA8或RP12的疗法或有效治疗。因此，本领域需要治疗归因于CRB1突变的视网膜病症的方法和手段。优选地，该方法和手段无毒或几乎无毒。具体地，本发明试图提供用于治疗归因于CRB1突变的视网膜病症的基因治疗载体。

发明内容

在第一方面，本发明涉及用作药物的基因治疗载体，其中该基因治疗载体包含：a)编码Crumbs同源物-2(CRB2)蛋白的核苷酸序列；和/或b)编码修饰的Crumbs同源物-1(CRB1)蛋白或修饰的Crumbs同源物-3(CRB3)蛋白的核苷酸序列，其中修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白包含蛋白C末端部分的修饰。优选地，修饰的CRB1或CRB3蛋白的蛋白C末端部分中的修饰降低了蛋白的毒性，如可在体内测定中所测定的。更优选地，修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白在体内测定中毒性较低或无毒。优选地，该体内测定包含：用含有编码修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列的AAV颗粒在一只眼睛(例如左眼)内玻璃体内转导与野生型小鼠视网膜相比缺少CRB2或CRB2蛋白水平降低的小鼠视网膜，优选地，该小鼠为Crb2条件敲除(cKO)或Crb1Crb2^F/+cKO小鼠，更优选为Crb2^F/FChx10Cre/+cKO或Crb1^-/-Crb2^F ^/+Chx10Cre/+cKO小鼠；并用编码野生型CRB2蛋白、野生型CRB1或野生型CRB3的核苷酸序列在另一只眼睛(如右眼)中进行转导作为对照；并在转导后一个月和三个月测定视网膜电流图，其中，与野生型CRB1或野生型CRB3转导的视网膜中的视网膜电流图相比，修饰的CRB1或修饰的CRB3转导的视网膜中视网膜电流图的最大a-波和/或b-波波幅(微伏)百分比增加表明，具有氨基酸取代与CRB2蛋白C末端部分具有实质(substantial)同一性的修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白毒性低，或者，其中视网膜电流图中的最大a-波和/或b-波波幅(微伏)是用修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的最大a-波和/或b-波波幅减去野生型CRB2的最大a-波和/或b-波波幅的差的至少60％，则修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白是无毒的。

在优选的实施方案中，药物用于治疗或预防归因于CRB1基因突变的视网膜病症。更优选地，视网膜病症是先天性利伯氏黑蒙或色素性视网膜炎，优选地，LCA8或RP12。

在优选的实施方案中，至少下述之一：a)CRB2蛋白是真后生生物(eumetazoan)CRB2蛋白，优选人类、非人类灵长类动物、鼠、猫、犬、猪、绵羊(ovine)、牛、马、epine、山羊(caprine)或狼源的CRB2蛋白，更优选地，CRB2蛋白是人类CRB2蛋白；b)修饰的CRB1蛋白是修饰的真后生动物CRB1蛋白，优选人类、非人类灵长类动物、鼠、猫、犬、猪、绵羊、牛、马、epine、山羊或狼源的修饰的CRB1蛋白，更优选地，修饰的CRB1蛋白是修饰的人CRB1蛋白；和c)修饰的CRB3蛋白是修饰的真后生动物CRB3蛋白，优选人类、非人类灵长类动物、鼠、猫、犬、猪、绵羊、牛、马、epine、山羊或狼源的修饰的CRB1蛋白，更优选地，修饰的CRB3蛋白是修饰的人CRB3蛋白。

在优选的实施方案中，基因治疗载体是重组的细小病毒载体或慢病毒载体，更优选地，其中载体是重组的腺相关病毒(rAAV)载体。更优选地，基因治疗载体是重组的腺相关病毒载体，其选自下述组成的组：重组的腺相关病毒血清型1(rAAV1)、重组的腺相关病毒血清型2(rAAV2)、重组的腺相关病毒血清型3(rAAV3)、重组的腺相关病毒血清型4(rAAV4)、重组的腺相关病毒血清型5(rAAV5)、重组的腺相关病毒血清型6(rAAV6)、重组的腺相关病毒血清型7(rAAV7)、重组的腺相关病毒血清型8(rAAV8)、重组的腺相关病毒血清型9(rAAV9)、血清型变体，例如用于Müller神经胶质细胞的增强转导的，例如RAAV6ShH10和ShH10Y，及其组合。

在优选的实施方案中，CRB2蛋白包含与SEQ ID NO：40-63和65-83任意之一，更优选地，SEQ ID NO：40-42任意之一的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成，其中，优选地，如通过视网膜电流图所测量的，CRB2蛋白具有功能活性。

在优选的实施方案中，编码CRB2、修饰的CRB1或修饰的CRB3的核苷酸序列与表达控制元件有效连接，所述表达控制元件包括分别产生CRB2、修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的充分表达以获得治疗效果的启动子，其中优选地，启动子选自下述组成的组：截短的CMV启动子、CMV启动子、截短的人RLBP1启动子、人感光细胞特异性视紫红质激酶启动子和人视杆细胞特异性视紫红质启动子，其中，优选地，启动子选自由下述组成的组：根据SEQ IDNO：121的CMV启动子，根据SEQ ID NO:122的截短的人RLBP1启动子，根据SEQ ID NO：123的人感光细胞特异性视紫红质激酶启动子，根据SEQ ID NO：124的人视杆细胞特异性视紫红质启动子和根据SEQ ID NO：133的截短的CMV启动子。

在优选的实施方案中，修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的氨基酸序列C末端部分中的修饰选自下述组成的组：i)CRB1或CRB3的PDZ结合域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1282-1285所取代；ii)CRB1或CRB3的FERM结合域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1251-1264所取代；iii)CRB1或CRB3的跨膜域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1225-1247所取代；iv)CRB1或CRB3的16个C末端氨基酸残基被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1270-1285所取代或被SEQ IDNO：40的氨基酸残基1270-1285的保守氨基酸取代所取代；v)由CRB1或CRB3的FERM结合域、2个N末端氨基酸残基和5个C末端氨基酸残基组成的CRB1或CRB3的氨基酸序列被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1249-1269所取代或被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1249-1269的保守氨基酸取代所取代；vi)由CRB1或CRB3的跨膜域、2个N末端氨基酸残基和1个C末端氨基酸残基组成的CRB1或CRB3的氨基酸序列被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1223-1248所取代或被SEQ IDNO：40的氨基酸残基1223-1248的保守氨基酸取代所取代；vii)在对应于SEQ ID NO：40的位置1243、1254、1257、1258、1259、1261和/或1274的位置处包含丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸中任一种的CRB1或CRB3氨基酸序列，其中，优选地，在位置1243、1254、1259、1261和1274处的氨基酸残基是丝氨酸，并且在位置1257和1258处的氨基酸残基分别是苏氨酸和酪氨酸；和viii)i)-vii)的一个或多个的组合。

在第二方面，本发明涉及核酸构建体，其包含至少下述之一：a)编码Crmbs同源物-2(CRB2)蛋白的核苷酸序列和至少一个细小病毒反向末端重复(ITR)序列，其中，优选地，编码Crmbs同源物-2(CRB2)蛋白的核苷酸序列有效连接到包含能使CRB2蛋白充分表达以获得治疗效果的启动子的表达控制元件；和b)编码Crumbs同源物-1(修饰的CRB1)蛋白或Crumbs同源物-3(修饰的CRB3)蛋白的核苷酸序列，和至少一个ITR序列，其中，优选地，编码修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列有效连接到包含能使修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白充分表达以获得治疗效果的启动子的表达控制元件，并且其中，修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白包含蛋白C末端部分的修饰且在体内测定中毒性较低或无毒，所述测定包含：

–在缺少CRB2的小鼠或CRB2降低的小鼠，优选Crb2条件敲除(cKO)或Crb1Crb2^F/+cKO小鼠，更优选Crb2^F/FChx10Cre/+cKO或Crb^1-/-Crb2^F/+Chx10Cre^/+cKO小鼠的一只眼睛中用重组腺相关病毒(rAAV)进行玻璃体内转导，所述rAAV包含编码修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列；

–在该小鼠的另一只眼睛中用rAAV进行玻璃体内转导，其中所述rAAV包含编码野生型CRB2蛋白、野生型CRB1或野生型CRB3的核苷酸序列作为对照；

–在转导后一个月和三个月制备视网膜电流图；

–其中，与野生型CRB1或野生型CRB3转导的视网膜的视网膜电流图相比，修饰的CRB1或修饰的CRB3转导的视网膜的视网膜电流图的最大a-波和/或b-波波幅百分比增加表明，修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白毒性较低，或者，

-其中视网膜电流图中的最大a-波和/或b-波波幅是用修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的最大a-波和/或b-波波幅减去野生型CRB2的最大a-波和/或b-波波幅的差的至少60％，则表明修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白是无毒的。

在优选的实施方案中，修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的氨基酸序列C末端部分中的修饰选自由下述组成的组：i)CRB1或CRB3的PDZ结合域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1282-1285所取代；ii)CRB1或CRB3的FERM结合域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1251-1264所取代；iii)CRB1或CRB3的跨膜域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1225-1247所取代；iv)CRB1或CRB3的16个C末端氨基酸残基被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1270-1285所取代或被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1270-1285的保守氨基酸取代所取代；v)由CRB1或CRB3的FERM结合域、2个N末端氨基酸残基和5个C末端氨基酸残基组成的CRB1或CRB3的氨基酸序列被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1249-1269所取代或被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1249-1269的保守氨基酸取代所取代；vi)由CRB1或CRB3的跨膜域、2个N末端氨基酸残基和1个C末端氨基酸残基组成的CRB1或CRB3的氨基酸序列被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1223-1248所取代或被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1223-1248的保守氨基酸取代所取代；vii)在对应于SEQID NO：40的位置1243、1254、1257、1258、1259、1261和/或1274的位置处包含丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸中任一种的CRB1或CRB3氨基酸序列，其中，优选地，在位置1243、1254、1259、1261和1274处的氨基酸残基是丝氨酸，在位置1257和1258处的氨基酸残基分别是苏氨酸和酪氨酸；和viii)i)-vii)的一个或多个的组合。

在第三个方面中，本发明涉及根据本发明的核酸构建体，其中，优选地，病毒体是AAV病毒体。

在第四个方面中，本发明涉及包含根据本发明的核酸构建体的宿主细胞。

在第五个方面中，本发明涉及包含根据本发明的基因治疗载体、根据本发明的核酸构建体或根据本发明的病毒体以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

在第六个方面中，本发明涉及试剂盒，其包含：(a)根据本发明的基因治疗载体，根据本发明的核酸构建体，根据本发明的病毒体，或根据本发明保护的药物组合物；以及，(b)任选地，使用根据本发明的(a)的基因治疗载体或药物组合物预防、治疗或缓解归因于CRB1基因突变的视网膜病症的一个或多个症状的说明书。

具体实施方式

定义

如本文所用，“昆虫细胞”指允许重组细小病毒(rAAV)载体的复制并可以维持在培养物中的昆虫细胞。例如，使用的细胞系可以来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、果蝇属细胞系，或蚊细胞系，例如，源自白纹伊蚊(Aedes albopictus)的细胞系。优选的昆虫或细胞系是来自对杆状病毒感染敏感的昆虫物种的细胞，包括例如Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、Ha2302、Hz2E5、High Five(Invitrogen,CA,USA)和(US 6,103,526；Protein Sciences Corp.,CT,USA)。昆虫细胞在培养物中的生长条件以及昆虫细胞在培养物中生产异源产物都是本领域公知的，并在例如下述关于昆虫细胞的分子工程学的参考文献中进行了描述。昆虫细胞的分子工程学和多肽表达的方法学公开在例如Summers和Smith.1986.A Manual of Methodsfor Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures,Texas AgriculturalExperimental Station Bull.No.7555,College Station,Tex.；Luckow.1991.在Prokopet al.,Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells withBaculovirus Vectors'Recombinant DNA Technology and Applications,97-152；King,L.A.和R.D.Possee,1992,The baculovirus expression system,Chapman and Hall,United Kingdom；O'Reilly,D.R.,L.K.Miller,V.A.Luckow,1992,BaculovirusExpression Vectors:A Laboratory Manual,New York；W.H.Freeman和Richardson,C.D.,1995,Baculovirus Expression Protocols,Methods in Molecular Biology,卷39；US 4,745,051；US2003148506和WO 03/074714。

如本文所用，术语“有效连接”是指多核苷酸(或多肽)元件以有功能的关系连接。当核酸与其它核酸序列处于有功能的关系时，其就是“有效连接的”。例如，如果转录调控序列影响了编码序列的转录，其就被有效连接到编码序列。有效连接的是指被连接的DNA序列通常是连续的，且如果必须连接两个蛋白编码区，则是连续的并且在阅读框中。短语“处于…的控制下”在本文中被互换的使用。

“表达控制序列”是指调控与其有效连接的核苷酸序列表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调控核苷酸序列的转录和/或翻译时，表达控制序列就被“有效连接”到核苷酸序列。因此，表达控制序列可以包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、转录终止子、蛋白编码基因前的起始密码子(start codon)、内含子剪切信号和终止密码子。术语“表达控制序列”至少旨在包括其存在被设计成影响表达并且也可包括其它有利组成的序列。例如，前导序列和融合配偶体序列(fusion partner sequence)是表达控制序列。该术语也包括设计核酸序列以使得不需要的、潜在的框内或框外的起动密码子(initiationcodon)从序列中去除。该术语也包括设计核酸序列以使得不需要的潜在剪切位点被移除。该术语包括指导添加多聚A尾(即在mRNA的3’端的一串腺嘌呤残基)序列的序列或多聚腺苷酸化序列(pA)，该多聚A尾序列称为多聚A序列。其也可被设计来增强mRNA稳定性。昆虫细胞中的影响转录和翻译稳定性的表达控制序列，如启动子，以及影响翻译的序列，如Kozak序列，是公知的。表达控制序列可具有下述性质：调控其有效连接的核苷酸序列，以获得较低的表达水平或较高的表达水平。

如本文所用，术语“启动子”或“转录调控序列”是指其如下核酸片段：其功能为控制一个或多个编码序列的转录，位于编码序列的转录起始位点的转录方向上游，并且通过DNA依赖的RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其它DNA序列的存在而在结构上得以识别，包括但不限于转录因子结合位点、抑制子和激活子蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的直接或间接用于调控从启动子启动的转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是指在大多数生理和发育条件下在大多数组织中都有活性的启动子。“诱导型”启动子是指如通过应用化学诱导剂生理地或发育地调控的启动子。“组织特异型”启动子是指仅在特定类型的组织或细胞中有活性的启动子。

术语“实质上相同”、“实质上的同一性”、“％同一性”或“基本相似”或“基本的相似性”指例如通过使用默认参数的程序GAP或BESTFIT最优比对时，两条肽或两条核苷酸序列共享本文其它地方所定义的至少一定百分比的序列同一性。GAP使用Needleman和Wunsch全面比对算法来在它们的全长上比对两条序列，最大化匹配的数目且最小化空位的数目。通常，使用GAP的默认参数：空位创立罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)且空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认打分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质，默认的打分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,915-919)。清楚的是，当说RNA序列与DNA序列是基本上相似的或具有一定程度的序列同一性时，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为与RNA序列中的尿嘧啶等同。百分比序列同一性的序列比对和打分可以通过使用计算机程序(如GCG Wisconsin Package,版本10.3，可从Accelrys Inc.,9685Scranton Road,SanDiego,CA 92121-3752 USA获得或用于Windows的开源软件Emboss(当前版本为2.7.1-07))进行测定。备选地，百分比相似性或同一性可以通过检索数据库如FASTA、BLAST等进行测定。

如本文所用，术语“核酸构建体”旨在指有效连接到表达控制元件上的核酸分子(典型地，包括DNA)，所述表达控制元件如能表达核酸分子的启动子。

如本文所用，术语“基因治疗载体”通常旨在指能够在宿主细胞中复制和/或另一个核酸片段可与其有效连接以使所连接的片段复制的核酸分子(典型地，包含DNA)。病毒是示例性的基因治疗载体。如本文所用，术语“载体”指包含遗传材料(即核酸)的遗传构建体。载体可包括如本文所描述并被排列以使得被插入的编码序列可在合适的表达细胞中转录和翻译的一种或多种遗传元件。此外，载体可包括一种或多种核酸片段、基因、启动子、增强子、激活子、多克隆位点或其任意组合，包括由一种或多种天然和/或人工来源获得或起源的片段。

本文所公开的基因治疗载体可任选地包含在感染性表达颗粒内。术语“病毒颗粒”和“病毒体”在本文中互换使用。因此，本发明还包括病毒体以及包含本发明的核酸构建体或基因治疗载体的宿主细胞。

如本文所用，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”互换使用，并包括包含将两个或更多个氨基酸残基连接在一起的至少一个酰胺键的分子。尽管可互换使用，通常，肽是相对短的(例如长度从2到大约100个氨基酸残基)分子，而蛋白或多肽是相对较长的聚合物(例如长度为100或更多个残基)。然而，除非特意定义链长度，否则术语肽、多肽和蛋白互换使用。

如本文所用，术语“受试者”(也互换地指“患者”)指能充作本发明的基因治疗载体、药物组合物或病毒体的接受者的任意客体。在某些方面中，受试者是脊椎动物，其旨在指任意的动物物种(并且优选地，哺乳动物物种如人类)。在某些实施方案中，“患者”指任意动物宿主，包括但不限于人类和非人类灵长类动物、牛、犬、山羊(caprine)、cavines、乌鸦(corvines)、epines、马、猫、山羊(hircines)、雌兔(lapines)、兔(leporines)、狼、鼠、绵羊(ovine)、猪、racines、狐狸等，包括但不限于驯养的牲畜(domesticated livestock)、放牧动物(herding animals)或迁徙动物(migratory animals)、外来动物(exotics)或动物园样品，以及伴侣动物、宠物和任何处于兽医关照之下的动物。

如本文所用，“有效量”被本领域普通技术人员理解为向接受者提供治疗的、预防的或其他有益效果。

术语“分离的”是指材料实质上或基本上不含在所述材料天然状态下发现的通常与上述材料相伴的成分。因此，根据本发明的分离的多核苷酸优选不含有通常与这些多核苷酸在天然或原位环境下相关的物质。

如本文所用，短语“相同功能类别中的氨基酸取代”是指本领域技术人员清楚知晓的所谓的“保守的”氨基酸取代。保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有小侧链的一组氨基酸是丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有酸性侧链的一组氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文所公开的氨基酸序列的取代变体是所公开的序列中的至少一个残基已经被去除且在该位置插入不同的残基的那些变体。优选地，氨基酸改变是保守的。每种天然产生的氨基酸的优选的保守取代如下：Ala到ser；Arg到lys；Asn到gln或his；Asp到glu；Cys到ser或ala；Gln到asn；Glu到asp；Gly到pro；His到asn或gln；Ile到leu或val；Leu到ile或val；Lys到arg,gln或glu；Met到leu或ile；Phe到met,leu或tyr；Ser到thr或gly；Thr到ser或val；Trp到tyr；Tyr到trp或phe；以及Val到ile或leu。

发明详述

本发明涉及治疗视网膜病症或与视网膜中的细胞改变相关的病症，特别是归因于CRB1中的一个或多个突变的改变。更具体地，本发明涉及治疗先天性利伯氏黑蒙(LCA)，特别是先天性利伯氏黑蒙-8(LCA8)，以及治疗进行性色素性视网膜炎(RP)，特别是进行性色素性视网膜炎12(RP12)，或者备选地，早期发作RP12。本发明提供了至少部分减少动物中的视网膜活性和结构完整性损失的方法，其中视网膜活性和结构完整性的损失包含所述动物中Crumbs同源物(CRB)功能的至少部分损失。优选地，所述视网膜活性和结构完整性损失的减少通过重组的腺相关病毒(rAAV)表达载体而实现，所述载体表达编码第一治疗性基因产物的第一核酸片段，所述第一治疗性基因产物表达用于一个或多个研究性、诊断性和/或治疗性方案的具有生物功能的Crumbs同源物(CRB)肽、多肽或蛋白，所述方案包括例如，治疗哺乳动物眼睛的一种或多种病症(disorders)或疾病(diseases)，特别是用于治疗人类的包括视网膜营养不良在内的先天性视网膜性失明，例如归因于缺少充足的Crumbs同源物(CRB)生物功能的先天性利伯氏黑蒙-8(LCA8)和色素性视网膜炎12(RP12)。优选地，治疗是无毒的或几乎无毒的。

在第一方面中，本发明涉及用作药物的基因治疗载体，其中该基因治疗载体包含：a)编码Crumbs同源物-2(CRB2)蛋白的核苷酸序列；和/或b)编码修饰的Crumbs同源物-1(CRB1)蛋白或修饰的Crumbs同源物-3(CRB3)蛋白的核苷酸序列，其中修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白包含蛋白C末端部分的修饰。优选地，修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白C末端部分与CRB2蛋白的C末端部分具有实质上的同一性，优选与CRB2蛋白C末端部分具有至少85、90、93、95、97、98或99％的同一性，其在下文进一步进行了定义。优选地，修饰的CRB1CRB3蛋白的蛋白C末端部分中的修饰降低了蛋白的毒性，如可在体内测定中所测定的。优选地，包含编码修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的序列的基因治疗载体比野生型CRB1或野生型CRB3蛋白毒性低，更优选地，包含编码修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的序列的基因治疗载体在体内测定中几乎无毒或无毒。优选地，该测定包含：用含有编码修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列的AAV颗粒在一只眼睛内玻璃体内转导具有降低的CRB2水平或缺少CRB2的小鼠视网膜，优选地缺少CRB1并具有降低水平的CRB2的小鼠视网膜，并用编码野生型CRB2蛋白、野生型CRB1或野生型CRB3的核苷酸序列在另一只眼睛内进行玻璃体内转导作为对照；并在转导后一个月和三个月测定视网膜电流图，其中，与野生型CRB1或野生型CRB3转导的视网膜中的视网膜电流图相比，修饰的CRB1或修饰的CRB3转导的视网膜中视网膜电流图的最大a-波和/或b-波波幅(微伏)百分比增加表明，修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白毒性较低，或者，其中视网膜电流图中的最大a-波和/或b-波波幅(微伏)是用修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的最大a-波和/或b-波波幅减去野生型CRB2的最大a-波和/或b-波波幅的差的至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％，则是无毒的。因此，体内测定优选包含下述步骤或更优选由下述步骤组成：

i)用含有编码修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列的1μL5.10⁹个基因组拷贝基因组拷贝的重组腺相关病毒(rAAV)在具有降低的CRB2水平或缺少CRB2的小鼠(优选地，缺少CRB1并具有降低水平的CRB2的小鼠，更优选地，Crb2条件敲除(cKO)或Crb1Crb2^F/+cKO小鼠，更优选地，Crb2^F/FChx10Cre/+cKO或Crb1^-/-Crb2^F/+Chx10Cre/+cKO小鼠)的一只眼睛(例如左眼)内进行玻璃体内转导，其中，优选地，rAAV是ShH10Y并且其中，编码修饰的CRB1或修饰的CRB3的核苷酸序列分别有效连接到最小CMV(minimalCMV)或CMV启动子；

ii)用含有编码野生型CRB2蛋白、野生型CRB1蛋白或野生型CRB3蛋白的核苷酸序列的1μL 5.10⁹个基因组拷贝基因组拷贝的rAAV在小鼠的另一只眼睛(如右眼)中进行玻璃体转导作为对照，其中，优选地，rAAV是ShH10Y并且其中，编码野生型CRB2、CRB1或CRB3蛋白的核苷酸序列分别有效连接到CMV、最小CMV或CMV启动子；和

iii)在转导后一个月和三个月制得视网膜电流图，

其中，与野生型CRB1或野生型CRB3转导的视网膜中的视网膜电流图相比，修饰的CRB1或修饰的CRB3转导的视网膜中视网膜电流图的最大a-波和/或b-波波幅百分比增加表明，修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白毒性较低；或者，

其中视网膜电流图中的最大a-波和/或b-波波幅是用修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的最大a-波和/或b-波波幅减去野生型CRB2的最大a-波和/或b-波波幅的差的至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％，则表明修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白是无毒的。

在另外可选的优选实施方案中，包含编码修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的序列的基因治疗载体在体外测定中是几乎无毒或无毒的。优选地，该体外测定包括：用编码修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列或用作为对照的编码CRB 1蛋白、CRB2蛋白和CRB3蛋白的核苷酸序列转染人类起源的视网膜色素上皮细胞，并在转染后72小时测定细胞的存活率。优选地，CRB1、CRB2和CRB3对照蛋白是野生型CRB1、CRB2和CRB3蛋白。修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白具有比野生型CRB1蛋白或野生型CRB3蛋白更高百分比的活细胞则表明修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白比野生型CRB1蛋白或野生型CRB3蛋白毒性低。另外可选地，活细胞的百分比是对照CRB2蛋白的活细胞百分比的至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％，则表明修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白是无毒的。

更详细而言，体外测定优选包括：用编码修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列以及作为转染对照编码绿色荧光蛋白的核苷酸序列转染人类起源的视网膜色素上皮细胞。用CRB2转染的人类起源的视网膜色素上皮细胞用作对照。转染后72小时测定细胞的存活率。优选地，活细胞的百分比(即，％活细胞＝[1.00–(死细胞数÷总细胞)]×100)是对照CRB2蛋白的活细胞百分比的至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％，更优选地，活细胞的百分比等于或高于对照CRB2的活细胞的百分比，则表明修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白是无毒的。在优选的实施方案中，如果用编码这些蛋白的任一种的核苷酸序列处理细胞后的活细胞的量是CRB2处理的对照细胞中活细胞的量的至少80、90或95％，则认为修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白是无毒的。

由于无活力的细胞不表达转基因蛋白，在优选的实施方案中，除了测定活细胞的百分比之外，还测定了细胞表达的修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白的量，例如利用ELISA或Western Blot。在实施例中，提供了Western Blot的方法。如果用编码修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列处理的细胞相对于野生型CRB1或野生型CRB3对照显示更高的蛋白表达，那么，也可以认为修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白毒性较低。如果用编码修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列处理的细胞显示CRB2对照细胞中CRB2蛋白表达的至少60、65、70、75、80、85、90、95或100％蛋白表达(优选地，归一化到持家蛋白如肌动蛋白水平)，则认为修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白是无毒的。

如果用编码修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列转染后活细胞的百分比在统计学上与用编码CRB2蛋白的核苷酸序列转染后的活细胞的百分比无显著性差别，或高于用编码CRB2蛋白的核苷酸序列转染后的活细胞的百分比，则CRB构建体是无毒的。优选地，如果用编码修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列转染后活细胞的百分比少于用编码CRB2蛋白的核苷酸序列转染后的活细胞的百分比的5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60％，则表明构建体是有毒的。

优选地，人类起源的视网膜色素上皮细胞是ARPE19细胞，优选获自ATCC CRL-2302。

在优选的实施方案中，基因治疗载体包含编码CRB2蛋白的核苷酸序列。

全长CRB1(例如SEQ ID NO：1-2)由于其大小，通常不能用于腺相关病毒中，尽管近期已经显示在使用小启动子时，可能通过使用AAV9表达全长CRB1，所述小启动子如截短的CMV(最小CMV；优选SEQ ID NO：133)或hGRK1启动子(Pellissier等人，(2014)Mol TherMethods&Clinical Dev1:14009)。正常全长CRB1 cDNA的大小为大约4.22kb。包含该序列并且还包含其它表达元件如CMV启动子、反向末端重复和5'非翻译区的载体为大约5.2bk。由于本发明优选载体AAV的正常基因组为4.7kb，大于4.9kb的重组基因组没有在壳体中正确包装，经常因此导致有缺陷的病毒。结果导致认为，截短版本的CRB1在基因治疗中也可能是有用的，因为短变体出现在数个物种中且其蛋白结构类似CRB2。然而，本发明人令人预想不到地发现，天然产生的CRB1短变体(与全长CRB1相比缺少EGF结构域；短CRB1或sCRB1示于SEQ ID NO：3)和CRB3A(SEQ ID NO：84)都是有毒的(在AAV5和AAV9壳体中测试；参见本发明的实施例1，其中显示了，人短CRB1在首次免疫(immune )CRB1敲除视网膜中的表达是有毒的。)因此，优选地，本发明的基因治疗载体不包含编码天然产生的CRB1和/或CRB3蛋白的核苷酸序列，并且也不包含编码天然产生的CRB1短变体(与全长CRB1相比缺少EGF结构域)的核苷酸序列。在序列表中提供了这些序列的范例(例如CRB1的SEQ ID NO：1-39和64，以及CRB3的SEQ ID NO：84-120)。甚至更令人惊奇的是，本发明人发现CRB2未导致在天然产生的CRB1短变体和CRB3中所看到的显著毒性作用。

本发明人对缺少CRB1的小鼠、缺少CRB2的小鼠、缺少CRB1并具有降低水平的CRB2的小鼠、缺少CRB2并具有降低水平的CRB1的小鼠以及缺少CRB1和CRB2二者的小鼠的分析表明了CRB1和CRB2具有非常相似的功能。相似地，Crumbs同源物(CRB)蛋白的功能是可交换的(exchangeable)，例如，人CRB1蛋白可以部分恢复缺少Crumbs(Crb)蛋白的果蝇的表型(denHollander et al.,2001)，且斑马鱼CRB2蛋白可以恢复缺少CRB2A蛋白的斑马鱼的表型(Omori&Malicki,2006)。内源或外源增加水平的人CRB2蛋白的其它优点如下：

A)人CRB2 cDNA小，约3.9kb，导致包含CRB2 cDNA和表达元件的表达盒通常仅约4.9kb。发现在视网膜中使用细小病毒载体可以获得人CRB2的表达。

B)天然CRB2存在于小鼠视网膜的感光细胞和Müller神经胶质细胞中，并且很可能存在于视网膜色素上皮细胞中。并且在其它物种中，天然CRB2在感光细胞中存在且有功能。然而，在人类中，天然CRB2仅存在于Müller神经胶质细胞中，更具体地，在临近Müller神经胶质细胞中外界膜处粘附连接的近顶区(subapical region)，当不在感光细胞中。已认识到小鼠和人间的位置不同(图1和2)。已经开发了多个小鼠模型并已经在多个小鼠模型中进行了实验。在实施例中已经例证了，已开发出具有与患有RP12的人类中所呈现的类似的表型的条件敲除小鼠。

C)CRB1缺陷的人类的免疫系统可识别重组CRB1为非自身蛋白，并可能引起针对重组CRB1的免疫反应。CRB2被识别为自身蛋白，这是因为CRB2已经在这些患者的视网膜和其它器官的上皮中被表达且在其中是免疫耐受的，并且不会导致免疫反应。

还不知晓如上所述的全长和短CRB1的毒性的原因，其可能是在DNA、RNA或蛋白质水平上的。不希望被任何理论所束缚，例如可能是短CRB1蛋白的过表达清除了必须蛋白(essential proteins)，或者，短CRB1 cDNA的RNA转录体导致了microRNA的失衡。

在优选的实施方案中，使用如实施例3所述的人源视网膜色素上皮细胞测试了CRB蛋白的毒性。简言之，该测定进行如下。体外测定包括用编码(修饰的)CRB1或(修饰的)CRB3蛋白的核苷酸序列以及作为转染对照的编码绿色荧光蛋白的核苷酸序列转染人源视网膜色素上皮细胞。用不同CRB构建体(例如，CRB1、sCRB1、CRB2同种型1、CRB2同种型2、CRB2同种型3、CRB3或其修饰版本等)之一和对照GFP构建体(Aartsen等人，(2010)PLoS One 5:e12387；GFAP-driven transgene expression in activated Müller glial cellsfollowing intravitreal injection of AAV2/6vectors；UniProtKB/Swiss-Prot序列P42212)使用磷酸钙法(例如在Sambrook和Russell(2001)"Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第三版),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York中进行了描述)转染ARPE19细胞(ATCC CRL-2302)。用CRB2构建体(优选具有SEQ ID NO:40所示的CRB2序列)、野生型CRB1构建体(优选具有SEQ ID NO：1或2所示的CRB1序列，或者SEQ ID NO：3所示的野生型短CRB1序列)或野生型CRB3构建体(优选具有SEQ ID NO:84所示的CRB3序列)转染的细胞用作用于比较活细胞百分比的对照。在单独的培养皿中一式两份测试每种CRB构建体或对照。以等摩尔量使用CRB构建体，且在每个培养皿中加入总量20μg的DNA。如实施例2.1所述制备CRB构建体。简言之，通过化学合成制备CRB构建体并亚克隆到pUC57中。这些构建体包括AAV2 ITR(SEQ ID NO：131和132)、CMV启动子(SEQ ID NO：121)、待测CRB cDNA(例如SEQ ID NO：40或其它CRB序列)、内含子5(SEQID NO：128)和合成的pA(SEQ ID NO：130)。

GFP构建体用作内部转染对照，并向细胞提供20μg固定量的DNA。例如，使用18μgCRB构建体加2μg GFP构建体。以这种方式，当加入相同量的DNA时，例如2、4、8或16μg CRB构建体，分别地加18、16、12或4μg GFP构建体，可以测试一系列等摩尔质粒浓度。

转染前一日，将ARPE19细胞一式两份、以30％汇合度铺于含有补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM的10cm培养皿中。在转染前2小时更换培养基后，以每皿500μl0.25M CaCl₂和TE(10mM Tris、1mM EDTA pH 8)中的20μg DNA制备转染混合物。在持续涡旋的同时，将500μl的2x HBS(281mM NaCl，100mM Hepes，1.5mM Na₂HPO₄，pH 7.12)滴加到转染混合物中，将完成的混合物直接加到细胞中，过夜孵育。次晨更换培养基(使用补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM)。两天后(即转染后72小时)，单独(一式两份中的一份)和同时(一式两份中的另一份)收集贴壁和悬浮细胞，并且在离心后重悬于1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS；137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄和1.76mM KH₂PO₄，pH 7.4)中。随后，用Luna Automated Cell Counter(Logos Biosystems,Inc.；Annandale,USA)测试细胞的存活率。计数器测定细胞的数量并利用台盼蓝染色区分活细胞和无活力的细胞。使用如实施例3进一步展示的Life Technologies的标准程序进行台盼蓝染色。上面已经描述了可以如何通过使用存活率百分比确定该测定中使用的构建体具有毒性或是无毒的。

由于无活力的细胞不表达转基因蛋白，可以测定CRB蛋白表达代替活细胞的百分比，或者除了活细胞的百分比之外，还可测定CRB蛋白表达。可以使用任何蛋白测定方法来测定CRB蛋白表达，例如实施例3中所述的Western Blotting，或者ELISA。简言之，使用SDS-PAGE电泳分离来自细胞裂解物的蛋白。在转移到硝酸纤维素膜后，硝酸纤维素膜对CRB、GFP和肌动蛋白进行免疫染色，并使用Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR；WestburgBV,Leusden，荷兰)进行分析。使用肌动蛋白对所获取的数据归一化。上面已经描述了如何能确定该测定中使用的构建体具有毒性或是无毒的。

在更优选的实施方案中，使用实施例6中所述且以上对体内测试所更详细描述的小鼠视网膜上的视网膜电描记术测试CRB蛋白的毒性。

在优选的实施方案中，根据本发明的基因治疗载体用于治疗或预防归因于CRB1基因突变的视网膜病症。换言之，在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的基因治疗载体在制备用于治疗归因于CRB1基因突变的视网膜病症的药物中的用途。优选地，CRB1基因中的该类突变导致CRB1功能蛋白的丧失，其可通过使用视网膜电描记术(ERG)、多焦点ERG、光学相干断层扫描(OCT)、微视野检测(microperimetry)、视觉诱发电位(VEP)测试、功能性磁共振成像测试或行为迷宫测试(behaviour maze-test)(参见例如：Bainbridge等人，(2008)N Engl J Med.五月22日；358(21):2231-9；Annear等人，(2011)Gene Ther.Jan；18(1):53-61；Maguire等人，(2008)N Engl J Med.五月22日；358(21):2240-8；Testa等人，(2013)Ophthalmology.Jun；120(6):1283-91；Cideciyan等人，(2008)Proc Natl Acad SciU S A.九月30日；105(39):15112-7；Watkins等人，(2012)Brain.May；135(Pt 5):1566-77.)来测定。这些方法提供了可定量的方式来测量所检测的眼睛的视网膜视觉功能的退步或进步。优选地，视网膜病症是先天性利伯氏黑蒙或色素性视网膜炎，更优选LCA8或RP12。

色素性视网膜炎(RP)是常染色体隐性或显性的一组疾病，其代表了开始时影响视杆细胞且随后影响视锥细胞的遗传性视网膜营养不良的进行性或后期严重形式。位于染色体1长(q)臂位置31和32.1间、涉及该病发作的遗传上和临床上异源的、且因此被指定为RP12基因座位(van Soest等人，1994)的第十二个基因是Crumbs同源物-1(CRB1)(denHollander等人，1999)。RP12基因导致具有动脉旁视网膜色素保护上皮(preserved para-arteriolar retinal pigment epithelium，PPRPE)的RP(Heckenlively等人，1982)。导致色素性视网膜炎的某些基因也导致先天性利伯氏黑蒙。CRB1基因也涉及先天性利伯氏黑蒙(LCA)类型8(LCA8)和没有PPRPE的RP的进行类型(den Hollander等人，2004)。LCA是常染色体隐性或显性的一组疾病，其代表了所有遗传性视网膜营养不良的最早和最严重形式。RP12或LCA8基因编码Crumbs同源物-1(CRB1)，其主要在临近视网膜中外界膜处的粘附连接的近顶区处的感光细胞和Müller神经胶质细胞中表达。CRB1在感光细胞和Müller神经胶质细胞间粘附的形成和维持中发挥作用。没有CRB1蛋白，这些细胞间的粘附被弱化，导致正常视网膜分层的丧失。没有CRB1蛋白，维持细胞极化和维持感光细胞和Müller神经胶质细胞间粘附所需的近顶的CRB1/PALS1/MUPP1和CRB1/PALS1/PATJ蛋白复合体会失稳。CRB1基因突变降低了或去除了CRB1蛋白维持近顶的CRB1/PALS1/MUPP1和CRB1/PALS1/PATJ蛋白复合体以及维持感光细胞和Müller神经胶质细胞间粘附的能力，就如在具有CRB1基因或LCA8突变的RP中。不清楚为何某些具有CRB1基因突变的人具有与先天性利伯氏黑蒙相关的严重的早期视觉损害，而其他人经历更逐步的视觉丧失和其它与色素性视网膜炎相关的眼部问题。其它遗传因子(例如CRB2；Alves等人，2013)可能缓和了CRB1基因突变的影响，影响了这些病症的严重程度。

LCA的首次报道于1869年由Theodor Leber公开。当前，已经报道了导致LCA的至少二十种基因。CRB1突变占LCA所有病例的～15％，使其成为LCA的主要诱因之一。LCA8的诊断通常在患有严重视力损伤或彻底失明、平视网膜电流图(ERG)和无意识眼动(眼球震颤)的婴儿的生命的前几个月内进行(Hufnagel等人，2013)。LCA8中正常视网膜结构的丧失与该病的其它形式不同，这些其它形式显示显著的通常随年龄而恶化的视网膜变薄(Pasadhikaet al.,2009)或显示具有视网膜活性丧失的保护的视网膜结构(preserved retinalstructure)，如归因于Gucy2d基因突变的LCA1的情况。通过使用光谱域光学相干层析成像术(SDOCT)扫描中央黄斑区和中心凹区(perifoveal area)，一项研究揭示了LCA8患者典型地显示了与没有眼病的人或患有其它类型LCA如LCA2的患者相比，具有6个视网膜层的丧失和发育不全形状的较厚视网膜(Jacobson等人，2003)。

在缺少功能性CRB1基因、归因于色素性视网膜炎的视觉受损的患者中观察到了严重程度较低的视网膜退化。色素性视网膜炎是遗传性视网膜退化相关的失明的主要诱因。色素性视网膜炎(RP)是1857年由Donders博士首次鉴定和命名的疾病状况。色素性视网膜炎是一组相关的状况，其是遗传性的、进行性的和临床上有区别的，且共享视网膜的感光细胞的营养不良或损害以及感光细胞下的色素上皮的相似特征。当前，已经报道了至少50种基因导致了显性的或隐性的RP。大约30-40％是常染色体显性的，50到60％是常染色体隐性的，5到15％是X-染色体连锁的。患病率是所有年龄组为1/4000，低于65岁人群为1/3000。CRB1突变占RP全部病例的～3-5％，这使得它成为RP的主要诱因之一。受CRB1基因中的隐性突变影响的患者(RP和LCA)数目是受RPE65基因突变(2型LCA或LCA2)影响的患者数目的大约两倍，已经公开了后者的成功的AAV介导的基因治疗临床试验。典型地，在患有最初的视觉问题，尤其是在暗光下的视觉问题的患者生命的前几十年内诊断RP患者。这表现为围绕眼周的视觉丧失，称为管状视。到该病的后期，中央视觉也变得微弱。RP12患者典型的显示具有动脉旁视网膜色素保护上皮(PPRPE)(Heckenlively,1982)。与归因于CRB1基因突变的LCA8患者相比，RP患者中视网膜结构的保护确实表明它们更适合今后的治疗策略，但在LCA8患者中及时表达CRB1基因也将恢复LCA8视网膜的结构和功能。

人类CRB1功能的丧失导致进行性RP12或LCA8，尽管小鼠CRB1功能的丧失导致相对轻微的视网膜组织破坏和退化。不清楚为何某些具有CRB1基因突变的人具有与先天性利伯氏黑蒙相关的严重的早期视觉损害，且其他人经历更逐步但进行性的早期发作的视觉丧失和其它与色素性视网膜炎相关的眼部问题。也不清楚为何缺少CRB1的小鼠与缺少CRB1的人相比仅显示相对轻微的表型。其它遗传因子(例如CRB2；Alves等人，2013)可能缓和了CRB1基因突变的影响，影响了这些病症的严重程度。确实，在视网膜中缺少CRB2的小鼠显示了模拟缺少CRB1的人类患者中检测到的进行性RP的表型(Alves等人，2013)，且缺少CRB2和CRB1的小鼠模拟了在缺少CRB1的人类患者中检测到的LCA8(Pellissier等人，PLoS Genet.2013年12月；9(12):e1003976)。涉及的其它因子是光照；中等水平的白光照射显著增加了缺少CRB1的小鼠中的视网膜组织破坏和退化的水平(van de Pavert等人，2004；van de Pavert等人，2007a；van de Pavert等人，2007b)。

在某种程度上，小鼠和人的表型可能不同，这是因为CRB1和CRB2蛋白的不同位置。在小鼠视网膜中，免疫电镜显示，CRB1定位于位于临近外界膜(OLM)处的粘附连接(AJ)的近顶区(SAR)处的Müller神经胶质细胞的顶部绒毛(apical villi)中。在小鼠视网膜中，CRB2位于两个区域：临近外界膜(OLM)处的粘附连接(AJ)的近顶区(SAR)处的感光细胞的内节，以及临近外界膜(OLM)处的粘附连接(AJ)的近顶区(SAR)处的Müller神经胶质细胞的顶部绒毛处(van Rossum等人，2006)。因此，小鼠视网膜中CRB1的丧失在感光细胞和Müller神经胶质细胞中留下(leaves)了功能性CRB2蛋白，导致了轻微的表型。

在人类视网膜中，免疫电镜显示CRB2位于临近外界膜(OLM)处的粘附连接(AJ)的近顶区(SAR)处的Müller神经胶质细胞的顶部绒毛处。在人类视网膜中，CRB1位于两个区域：临近外界膜(OLM)处的粘附连接(AJ)的近顶区(SAR)处的感光细胞的内节，以及临近外界膜(OLM)处的粘附连接(AJ)的近顶区(SAR)处的Müller神经胶质细胞的顶部绒毛处(Pellissier等人，Hum Mol Genet.2014年7月15日；23(14):3759-71)。因此，人类视网膜中CRB1的丧失在Müller神经胶质细胞中的SAR处留下了功能性CRB2蛋白，但在感光细胞中没有留下，导致了严重的表型。

已经描述了三个携带Crb1基因突变的小鼠模型。具有天然发生的Crb1基因中的rd8突变的纯合子小鼠(Crb1^rd8/rd8)显示了轻微的视网膜退化，优先地，在视网膜的一个象限中，(腹侧)鼻下象限(inferior(ventral)nasal quadrant)(Aleman et al.,2011；Mehalow et al.,2003)。缺少任何CRB1蛋白的纯合子敲除小鼠(Crb1^-/-)显示轻微的视网膜退化，优先地，在视网膜的一个象限中，(腹侧)颞下象限(inferior(ventral)temporalquadrant)(van de Pavert et al.,2004；van de Pavert et al.,2007a)。不表达野生型小鼠CRB1但表达具有位置249处的半胱氨酸(C)到氨基酸色氨酸(W)的取代的CRB1的杂合子敲入/杂合子敲除小鼠(Crb1^C249W/-)显示了在非常后期的轻微的视网膜退化(van dePavert et al.,2007b)。开发Crb1^C249W/-小鼠作为在两个等位基因中具有C250W取代的RP12患者的小鼠模型。

重要的是，在三个小鼠模型(Crb1^rd8/rd8,Crb1^-/-,or Crb1^C249W/-)中，均不存在如通过视网膜电描记术所测量的视网膜功能的显著降低(Aleman et al.,2011；Mehalow etal.,2003；van de Pavert et al.,2004；van de Pavert et al.,2007a；van de Pavertet al.,2007b)。因此，这些小鼠似乎不适用于检测如通过视网膜电描记术所检测的CRB基因治疗载体的功效。

数个其它新开发的小鼠模型用于评估基因替换疗法。第一个是在除视网膜色素上皮之外的所有视网膜细胞中缺少CRB2的Crb2条件敲除小鼠(Crb2cKO)(例如Crb2^flox/ ^floxChx10Cre)(Alves et al.,2013)。第二个是在感光细胞中缺少CRB2的Crb2条件敲除小鼠(例如Crb2^flox/floxCrxCre)(Alves et al.,Hum Mol Genet.2014Jul 1；23(13):3384-401)。第三个是在Müller神经胶质细胞中缺少CRB2的Crb2条件敲除小鼠(例如Crb2^flox/ ^floxPdgfraCre)(Alves et al.,Hum Mol Genet.2014Jul 1；23(13):3384-401)。第四个是在所有视网膜细胞中缺少CRB1并在除视网膜色素上皮之外的所有视网膜细胞中具有CRB2的降低表达的纯合子Crb1杂合子Crb2条件敲除小鼠(例如Crb1^-/-Crb2^flox/+Chx10Cre)(Pellissier et al.,Hum Mol Genet.2014Jul 15；23(14):3759-71)。第五个是在所有视网膜细胞中缺少CRB1且在感光细胞中具有CRB2的降低表达的纯合子Crb1杂合子Crb2条件敲除小鼠(例如Crb1^-/-Crb2^flox/+CrxCre)。第六个是在所有视网膜细胞中缺少CRB1且在Müller神经胶质细胞中具有CRB2的降低表达的纯合子Crb1杂合子Crb2条件敲除小鼠(例如Crb1^-/-Crb2^flox/+PdgfraCre)。第七个是在所有视网膜细胞中缺少CRB1且在除视网膜色素上皮之外的所有视网膜细胞中缺少CRB2的纯合子Crb1纯合子Crb2条件敲除小鼠(例如Crb1^-/-Crb2^flox/floxChx10Cre)(Pellissier et al.,PLoS Genet.2013 Dec；9(12):e1003976)。第八个是在所有视网膜细胞中缺少CRB1且感光细胞中缺少CRB2的纯合子Crb1纯合子Crb2条件敲除小鼠(例如Crb1^-/-Crb2^flox/floxCrx10Cre)。第九个是在所有视网膜细胞缺少CRB1且在Müller神经胶质细胞中缺少CRB2的纯合子Crb1纯合子Crb2条件敲除小鼠(例如Crb1^-/-Crb2^flox/floxPdgfraCre)。

在除视网膜色素上皮之外的所有视网膜细胞中缺少CRB2的Crb2条件敲除小鼠(例如Crb2^flox/floxChx10Cre)(Alves et al.,2013)用于评估基因替换疗法。Crb2^flox/ ^floxChx10Cre显示如通过1到6个月龄的ERG所测量的进行性视网膜退化和视网膜功能的暗视(视杆细胞介导的)和明视(视锥细胞介导的)丧失(Alves et al.,2013)。小鼠在12-18月龄时失明。如通过ERG所证实的，AAV介导的CRB2到Crb2cKO视网膜的转移恢复了这些动物的视力。AAV介导的CRB2到出生后Crb2cKO视网膜的转移在感光细胞和Müller神经胶质细胞中表达了CRB2，并导致了CRB2表达时视网膜结构的保护。这些实验显示了给予单剂量的AAV-CRB2之后保护视网膜结构的可行性，即使是在严重退化的Crb2 cKO视网膜中。

为了测试本发明的基因治疗载体在人类患者中的功效，数个标准以及本领域的现有技术是可用的，例如视网膜电描记术、瞳孔测量法、扫描激光眼底镜、光学相干断层扫描术和行为测试。特别地，作为用AAV-CRB基因治疗载体治疗视网膜之后皮层视觉功能中早期改善的生物标记物，使用功能性磁共振成像(fMRI)对于分析和解释不同的剂量方案是最有用的。

在优选的实施方案中，本发明的基因治疗载体用于组合治疗中，例如与下述组合：a)添加保护因子、营养因子或生长因子，如GDNF或CTNF，b)添加使眼中的眼内压正常化的药物，如含有前列腺素类似物、β阻断剂、α激动剂和/或碳酸酐酶抑制剂的滴眼液，c)添加降低眼的光敏性的药物或工具，例如人工隐形眼镜(prosthetic contact lenses)，d)添加使视网膜中的视网膜类视黄醇循环(retinoid cyclus)正常化的药物，例如类视黄醇，e)添加增加视网膜外界膜处的粘附连接的强度的药物，如镁盐和钙盐。

在优选的实施方案中，本发明的基因治疗载体仅对患有归因于CRB1基因突变的视网膜病症的受试者应用一次。预期再应用相同或相似的载体(例如具有相同的壳体或另一种壳体)是有利的，迹象是黑暗中降低的视觉。相同或相似的载体可被再次应用，因为视网膜下注射AAV载体仅激发低免疫反应。相反地，已经证实玻璃体内注射导致免疫反应，但在这样的情况下，可以使用另一种合适的载体(Li et al.[2008]Intraocular route ofAAV2vector administration defines humoral immune response and therapeuticpotential.Mol Vis.14:1780-1789)。认为迷宫实验但优选具有暗光中的视觉任务的通过检测视觉皮层的fMRI实验在确定再次应用变得有利的时间点中是最有帮助的。

在优选的实施方案中，患有归因于CRB1基因突变的视网膜病症且待使用根据本发明的基因治疗载体、核酸构建体、病毒体、宿主细胞或药物组合物治疗的受试者是哺乳动物，例如人类、非人灵长类动物、小鼠、犬、猫、猪、鸡、猴、奶牛、绵羊、兔。更优选地，受试者是人类。

在根据本发明的优选的基因治疗载体中：a)CRB2蛋白是真后生动物CRB2蛋白，优选人类、非人灵长类动物、鼠、猫、犬、猪、绵羊、牛、马、epine、山羊或狼源的CRB2蛋白，更优选地，CRB2蛋白是人类CRB2蛋白；b)修饰的CRB1蛋白是修饰的真后生动物CRB1蛋白，优选人类、非人类灵长类动物、鼠、猫、犬、猪、绵羊、牛、马、epine、山羊或狼源的修饰的CRB1蛋白，更优选地，修饰的CRB1蛋白是修饰的人CRB1蛋白；和/或c)修饰的CRB3蛋白是修饰的真后生动物CRB3蛋白，优选人类、非人类灵长类动物、鼠、猫、犬、猪、绵羊、牛、马、epine、山羊或狼源的修饰的CRB3蛋白，更优选地，修饰的CRB3蛋白是修饰的人CRB3蛋白。

在本发明优选的实施方案中，基因治疗载体是重组的细小病毒载体或慢病毒载体。

细小病毒科的病毒是小DNA动物病毒。细小病毒科可分为两个亚科：细小病毒亚科，其感染脊椎动物，和浓核病毒亚科，其感染昆虫。细小病毒亚科的成员在本文称为细小病毒且包括依赖病毒属。如可从其属名推论的，依赖病毒的成员是独特的，因为它们通常需要与辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒共感染，以在细胞培养物中产生生产性感染。

依赖病毒属包括腺相关病毒(AAV)，其通常感染人类(例如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类动物(例如血清型1和4)，以及感染其他温血动物的相关病毒(例如牛、犬、马和绵羊腺相关病毒)。当前，可在至少AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8和AAV-9的血清学上可区分的类型间进行区分。AAV载体构成了单链DNA，具有直径为18到26nm、通常约25nm的结构蛋白的外层二十面体壳体。细小病毒亚科和细小病毒科的其它成员的其它信息公开于Kenneth I.Berns,"Parvoviridae:The Viruses and TheirReplication,"Chapter 69in Fields Virology(第三版，1996)。方便起见，在此处通过参考AAV进一步举例说明和描述了本发明。然而，应理解，本发明并不限于AAV，且可同样地应用于其它细小病毒。也应理解，本发明延及包含嵌合壳体蛋白的AAV嵌合病毒和/或也具有与所发现的野生型细小病毒的类似大小(18-26nm直径)的AAV杂种病毒(或假型病毒(pseudotyped viruse))。在WO0028004中给出了说明和一些实例。AAV嵌合和/或杂种病毒的实例是例如AAV2/1、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/5.2、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8和AAV2/9。

AAV基因组由以下组成：编码病毒复制所需蛋白的rep基因，和编码病毒结构蛋白的cap基因。当制备腺相关载体时，一个或多个复制所需的rep基因(例如rep 40、rep 52、rep 68和/或rep 78)或壳体结构所需的cap基因(例如VP-1、VP-2和/或VP-3)可例如在病毒中用转基因替换。在5'和3'末端依然存在的ITR区域作为顺式活性元件是包装转基因到感染性的重组AAV颗粒以及重组AAV基因组的DNA复制所需的(Kotin,R.M.(1994)Hum GeneTher.5(7):793-801)。“重组细小病毒或AAV载体”(或“rAAV载体”)在本文是指包含位于细小病毒或AAV反向末端重复序列(ITR)侧翼的一条或多条目标的核苷酸序列、目标基因或“转基因”的载体。此类rAAV载体在存在于表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的昆虫或哺乳动物宿主细胞时，可以被复制并包装到有感染性的病毒颗粒中。当rAAV载体整合入更大的核酸构建体(例如用于克隆或转染的染色体或其它载体，如质粒或杆状病毒)中时，rAAV载体通常称为“前载体”(pro-vector)，其可在存在AAV包装功能和必须的辅助者功能时通过复制和壳体化而被“恢复”。因此，在优选的实施方案中，本发明的基因治疗载体是rAAV载体。甚至更优选地，rAAV选自由重组腺相关病毒血清型1(rAAV1)、重组腺相关病毒血清型2(rAAV2)、重组腺相关病毒血清型3(rAAV3)、重组腺相关病毒血清型4(rAAV4)、重组腺相关病毒血清型5(rAAV5)、重组腺相关病毒血清型6(rAAV6)、重组腺相关病毒血清型7(rAAV7)、重组腺相关病毒血清型8(rAAV8)、重组腺相关病毒血清型9(rAAV)、血清型变体，如用于Müller神经胶质细胞的增强转导，例如rAAV6ShH10(Klimczak et al[2009]PLoSOne 4,e7467)和ShH10Y(Dalkara et al[2011]Mol Ther 19,1602-1608)组成的组，及其组合。

在优选的实施方案中，核苷酸序列编码CRB2蛋白，其包含与SEQ ID NO:40–63、65–83任一条，更优选SEQ ID NO:40–42任一条，最优选SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，优选至少100％序列同一性的氨基酸序列。该CRB2蛋白优选具有37个氨基酸残基的胞内域，或者备选地，63个氨基酸残基的胞内域加跨膜域。不希望被任何理论所束缚，这些域被特别地认为与连接到细胞的肌动蛋白细胞骨架的Crumbs同源物(CRB)蛋白复合体的膜定位和形成最相关，其被认为对恢复表型和无毒是重要的。更优选地，核苷酸序列编码CRB2蛋白，其由与SEQ ID NO:40–63、65–83任一条，更优选SEQ ID NO:40–42任一条，最优选SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，优选至少100％序列同一性的氨基酸序列组成。甚至更优选地，核苷酸序列编码CRB2蛋白，其包含SEQID NO:40–63、65–83任一条，更优选SEQ ID NO:40–42任一条，最优选SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列，或由其组成。在优选的实施方案中，CRB2蛋白包含与SEQ ID NO:40–63、65–83，更优选SEQ ID NO:40–42任一条，甚至更优选SEQ ID NO:40中所示的序列的37个连续氨基酸的羧(C)末端区具有至少95％同一性的连续氨基酸序列。优选地，包含本文所定义的氨基酸序列或由其组成的CRB2蛋白是有功能的，或者，也可以说，有活性的CRB2蛋白。为了测试包含本文所定义的氨基酸序列或由其组成的蛋白是否是有功能的CRB2蛋白，优选地，进行视网膜电描记术。

简言之，产生AAV载体，优选地，AAV2/9或AAV2/5，其中壳体是AAV9或AAV5而ITR是AAV2，以允许有效连接到CMV启动子的包含本文所定义的氨基酸序列或由其组成的CRB2蛋白的表达。可以根据本文所提供的实施例来制备构建体。出生后第14天，将AAV载体视网膜下施用于Crb2 cKO小鼠(Crb2^F/F-Chx10Cre)的视网膜。对侧的眼睛接受包含GFP而不是待测CRB2蛋白的对照AAV载体。阳性对照动物接受表达根据SEQ ID NO：40、41或42的CRB2蛋白的重组AAV。在3月龄时或之后，即应用病毒后至少2.5个月，按Tanimoto等人所述的方法(Tanimoto N,Sothilingam V,Seeliger MW；Functional phenotyping of mouse modelswith ERG.Methods Mol Biol.2013；935:69-78)制备a-波和b-波视网膜电流图。简言之，麻醉小鼠的视网膜暴露于不同强度的闪光(在X-轴上，光强度表示为log(cd*s/m²))。如果与AAV-GFP处理的对侧视网膜相比，视网膜电流图中的最大b-波和/或a-波波幅(微伏)增加至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0倍，则认为包含本文所定义的氨基酸序列或由其组成的CRB2蛋白具有CRB2活性(或是功能性的CRB2蛋白)。更优选地，不是在出生后第14天，而是在出生后第3天或第4天施用AAV载体，因为这显著增加了治疗的功效。

在优选的实施方案中，在根据本发明的基因治疗载体中，编码CRB2、修饰的CRB1或修饰的CRB3的核苷酸序列有效连接到包含分别产生CRB2、修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的充足表达的启动子的表达控制元件，以获得治疗效果，其中启动子优选选自由下述组成的组：优选根据SEQ ID NO：121的CMV启动子、CMV启动子、截短的CMV或最小CMV启动子，截短的人RLBP1启动子、人感光细胞特异性视紫质激酶启动子和人视杆细胞特异性视紫质启动子。优选用于本发明的示例性的人Müller神经胶质细胞特异性视黄醛结合蛋白-1(RLBP1)启动子的核酸序列(Pellissier LP,Hoek RM,Vos RM,Aartsen WM,Klimczak RR,Hoyng SA,Flannery JG,Wijnholds J(2014)Specific tools for targeting and expression ofMuller glia cells.Mol Ther Methods&Clinical Dev1:14009；部分类似于Vazquez-Chona et al.,2009；Vogel et al.,2007中描述的已公开的小鼠RLBP1启动子)示于SEQ IDNO：122中。

优选用于本发明的示例性的人GRK1特异性启动子的核酸序列(Khani et al.,2007；Boye et al.,2012)示于SEQ ID NO：123中。

优选用于本发明的示例性的人RHO特异性启动子的核酸序列(Pellissier LP,Hoek RM,Vos RM,Aartsen WM,Klimczak RR,Hoyng SA,Flannery JG,Wijnholds J(2014)Specific tools for targeting and expression of Muller glia cells.Mol TherMethods&Clinical Dev1:14009)示于SEQ ID NO：124中。

示例性的截短的CMV启动子的核酸序列(Pellissier LP,Hoek RM,Vos RM,Aartsen WM,Klimczak RR,Hoyng SA,Flannery JG,Wijnholds J(2014)Specific toolsfor targeting and expression of Muller glia cells.Mol Ther Methods&ClinicalDev1:14009)示于SEQ ID NO：133中。

特别优选的本发明的基因治疗构建体如下：AAV-hGRK1-CRB2(特异于视杆细胞和视锥细胞)；AAV-hRHO-CRB2(特异于视杆细胞但不特异于视锥细胞)；AAV-CMV-CRB2(允许视杆细胞+视锥细胞、Müller神经胶质细胞和视网膜色素上皮中的表达)；AAV-CMV-CRB2-miRT(其降低了视网膜色素上皮中的转录)；AAV-截短的RLBP1-CRB2；AAV-截短的CMV-CRB2。AAV-hGRK1-CRB2(特异于视杆细胞和视锥细胞)和AAV-hRHO-CRB2(特异于视杆细胞但不特异于视锥细胞)以及AAV-CMV-CRB2是最优选的。

可以组合用于本发明的降低含有miRT序列的AAV转录物在视网膜色素上皮细胞中表达的示例性microRNA靶位点(miRT's)的核酸序列(Karali et al.,2011)示于SEQ IDNO：125-127。这些序列是例如AAV-CMV-CRB2-miRT载体中而不是miRNA序列本身中的预测的和功能性的靶位点。在RPE中表达miRNA，其识别并干扰靶CRB2-miRT mRNA转录体的翻译，或降解靶CRB2-miRT mRNA转录体。本领域技术人员能在本发明中使用此类miRT(参见例如Karali et al.(2011)PLoS One 6(7):e22166.doi:10.1371/journal.pone.0022166.Epub2011年7月26日)。

在本发明的优选实施方案中，在视杆细胞和视锥细胞而不在视网膜色素上皮或Müller神经胶质细胞中表达重组CRB蛋白，优选CRB2。这可例如通过应用根据SEQ ID NO：123的人感光细胞特异性视紫质激酶启动子而完成。结果视网膜得以对抗退化。本发明的优选的基因治疗载体是使用AAV2 ITR和AAV5壳体蛋白的hGRK1-hCRB2(In5)-spA。

在本发明的优选实施方案中，基因治疗载体包含编码修饰的CRB1蛋白的核苷酸序列。由于例如人CRB1的大小，该核苷酸序列不能置于CMV启动子的控制下，因为这将产生太大以至于不能产生有活力的AAV病毒体的构建体。因此，为了产生AAV病毒体，必须使用产生最大约4.9kb的载体的启动子和增强子元件。在此情况下，例如，可以使用截短的CMV启动子或人感光细胞特异性视紫质激酶启动子。

在优选的实施方案中，根据本发明的基因治疗载体进一步包含有效连接到编码CRB蛋白的核苷酸序列的下述之一或多个：反向末端重复，例如任何野生型或突变体AAV的反向末端重复；启动子/增强子，例如CMV启动子/增强子；野生型的或合成的转录剪切供体/受体位点，如In5；野生型或合成的转录多聚腺苷酸化位点，例如spA；降低视网膜细胞类型如视网膜色素上皮中的转录活性的一个或多个microRNA靶位点。在优选的实施方案中，根据本发明的基因治疗载体包含编码任何物种的野生型或突变体Crumbs同源物(CRB)蛋白的野生型、突变体或密码子优化的DNA序列。

在优选的实施方案中，野生型或合成的转录剪切供体/受体位点如合成内含子(In5)已被插入基因治疗载体中，以稳定的转录加工CRB2、修饰的CRB1或修饰的CRB3。在Crumbs同源物(CRB)基因的编码序列中的示例性合成内含子(In5)的优选核酸序列示于SEQID NO：128。内含子优选在具有外显子NNNAG/内含子/GNNN外显子的序列的两个相邻外显子间插入到CRB2、修饰的CRB1或修饰的CRB3cDNA中，其中G、A、T、C分别代表四个核苷酸中的一个，且N代表四个核苷酸中的任一个。

在优选的实施方案中，根据本发明的基因治疗载体包含编码CRB2蛋白的核苷酸序列，所述CRB2蛋白包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，优选至少100％序列同一性的氨基酸序列，并且其中启动子是根据SEQ ID NO：121的CMV启动子。

在特别优选的实施方案中，根据本发明的基因治疗载体包含编码CRB2蛋白的核苷酸序列，所述CRB2蛋白包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，优选至少100％序列同一性的氨基酸序列，并且其中启动子是根据SEQ ID NO：123的人感光细胞特异性视紫质激酶启动子。在优选的实施方案中，修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的氨基酸序列C末端部分中的突变选自下述组成的组：i)CRB1或CRB3的PDZ结合域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1282-1285所取代；ii)CRB1或CRB3的FERM结合域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1251-1264所取代；iii)CRB1或CRB3的跨膜域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1225-1247所取代；iv)CRB1或CRB3的16个C末端氨基酸残基被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1270-1285所取代或被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1270-1285的保守氨基酸取代所取代；v)由CRB1或CRB3的FERM结合域、2个N末端氨基酸残基和5个C末端氨基酸残基组成的CRB1或CRB3的氨基酸序列被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1249-1269所取代或被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1249-1269的保守氨基酸取代所取代；vi)由CRB1或CRB3的跨膜域、2个N末端氨基酸残基和1个C末端氨基酸残基组成的CRB1或CRB3的氨基酸序列被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1223-1248所取代或被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1223-1248的保守氨基酸取代所取代；vii)在对应于SEQ ID NO：40的位置1243、1254、1257、1258、1259、1261和/或1274的位置处包含丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的任一种的CRB1或CRB3的氨基酸序列，其中，优选地，在位置1243、1254、1259、1261和1274处的氨基酸残基是丝氨酸，并且在位置1257和1258处的氨基酸残基分别是苏氨酸和酪氨酸；和viii)i)-vii)中的一个或多个的组合。

在优选的实施方案中，修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的C末端部分是蛋白的最后70、60、40、35、30、25、20、15、10、5个残基。优选地，蛋白的最后70、60、40、35、30、25、20、15、10、5个残基对应于SEQ ID NO:1–39、64(修饰的CRB1)或SEQ ID NO:84-120(修饰的CRB3)。

CRB蛋白的C末端包含两个蛋白相互作用结构域：位于紧邻于跨膜域的FERM域和在C末端的PDZ域。此外，存在潜在的磷酸化位点。CRB1/CRB2/CRB3的FERM域可结合多种蛋白，例如EPB41L5(＝YMO1)和膜突蛋白。CRB1/CRB2/CRB3的PDZ域可结合至少两种蛋白：MPP5(＝PALS1)和PAR6家族成员(例如PAR6A、PAR6B、PAR6C、PAR6D)。可能的情况是，C末端(最后63个氨基酸残基)的氨基酸序列中的小修饰可导致CRB蛋白复合体动力学的差异。此外，某些结合蛋白抑制CRB的功能，而另一些结合蛋白增强CRB的功能。因此，预期CRB1或CRB3的C末端部分中的氨基酸到CRB2氨基酸残基(或来自相同功能类别的氨基酸残基)的每一个单独的突变/取代都有可能减少天然CRB1和CRB3所见到的毒性。

来自不同物种的所述Crubms同源物(CRB)家族成员序列间的相似性可容易地由本领域技术人员识别。

参考共有序列SEQ ID NO：77的氨基酸位置而阐释了Crumbs同源物(CRB)共有区：氨基酸位置：265-1515、1555-2068和2083-2146。CRB可变区域：氨基酸位置：1-264、1516-1554和2069-2082。Crumbs同源物(CRB)共有区比对的其它值得注意的区域可包括或不包括：

(1)位于共有序列的氨基酸位置265到301、304到341、346到384、386到423、425到461、462到498、499到530、543到579、580到609、607到644、646到683、685到721、723到759、761到798、800到836、838到900、902到938、940到976、978到1019、1205到1241、1479到1515、1756到1792、1794到1830、1832到1868、1871到1912、1912到1948、1950到1987、1989到2027、2028到2068的表皮生长因子样结构域(已知对极化细胞如感光细胞和Müller神经胶质细胞中的活性是必要的-参见例如Richard et al.,2006；van de Pavert et al.,2007b)。

(2)位于共有序列的氨基酸位置1021到1203、1248到1478和1555到1755的层粘连蛋白G样结构域(已知对细胞粘附、信号传导、迁移、组装和分化活性是必要的)。

(3)位于氨基酸位置2083到2109的跨膜域。

(4)在氨基酸位置2110到2146的包含FERM-蛋白和C末端PDZ-蛋白结合基序的高保守的37个氨基酸的C末端区(Richard et al.,2006)。

在第二个方面，本发明涉及核酸构建体，优选分离的核酸构建体，其包含：a)编码Crumbs同源物-2(CRB2)蛋白核苷酸序列和至少一个细小病毒反向末端重复(ITR)序列，其中优选地，编码Crumbs同源物-2(CRB2)蛋白的核苷酸序列有效连接到包含能使CRB2蛋白充分表达以获得治疗效果的启动子的表达控制元件；和/或b)编码Crumbs同源物-1(修饰的CRB1)蛋白或Crumbs同源物-3(修饰的CRB3)蛋白的核苷酸序列，和至少一个ITR序列，其中优选地，编码修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列有效连接到包含能使修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白充分表达以获得治疗效果的启动子的表达控制元件，并且其中修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白包含蛋白C末端部分突变。更优选地，该突变提供了修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白与CRB2蛋白的C末端部分的实质上同一性。优选地，包含编码修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的序列的核酸构建体在体外和/或体内测定在是无毒的。优选地，体外测定包含用编码如上所述的修饰的CRB1或CRB3蛋白的核苷酸序列转染人源视网膜色素上皮细胞。优选地，体内测试包含用编码如上所述的修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列转导小鼠视网膜。

在优选的实施方案中，核酸构建体包含编码CRB2蛋白的核苷酸序列。

在优选的实施方案中，修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的氨基酸序列的C末端部分突变提供了修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白与CRB2蛋白C末端部分的实质上的同一性，优选与CRB2蛋白C末端部分的至少85、90、93、95、97、98、99或100％同一性，更优选与SEQ ID NO：40的氨基酸残基的下述范围。在优选的实施方案中，修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的氨基酸序列的C末端部分中的突变选自下述组成的组：i)CRB1或CRB3的PDZ结合域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1282-1285所取代；ii)CRB1或CRB3的FERM结合域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1251-1264所取代；iii)CRB1或CRB3的跨膜域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1225-1247所取代；iv)CRB1或CRB3的16个C末端氨基酸残基被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1270-1285所取代或被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1270-1285的保守氨基酸取代所取代；v)由CRB1或CRB3的FERM结合域、2个N末端氨基酸残基和5个C末端氨基酸残基组成的CRB1或CRB3的氨基酸序列被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1249-1269所取代或被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1249-1269的保守氨基酸取代所取代；vi)由CRB1或CRB3的跨膜域、2个N末端氨基酸残基和1个C末端氨基酸残基组成的CRB1或CRB3的氨基酸序列被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1223-1248所取代或被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1223-1248的保守氨基酸取代所取代；vii)在对应于SEQ ID NO：40的位置1243、1254、1257、1258、1259、1261和/或1274位置处包含丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸中任一种的CRB1或CRB3的氨基酸序列，其中，优选地，在位置1243、1254、1259、1261和1274处的氨基酸残基是丝氨酸，在位置1257和1258处的氨基酸残基分别是苏氨酸和酪氨酸；和viii)i)-vii)中的一个或多个的组合。

在第三个方面中，本发明涉及病毒体，其包含根据本发明的核酸构建体，其中优选地，病毒体是AAV病毒体。

在第四个方面中，本发明涉及包含根据本发明的核酸构建体的宿主细胞。优选地，宿主细胞是如上所述的哺乳动物或昆虫宿主细胞。如果宿主细胞是哺乳动物细胞，则优选人宿主细胞。

在第五个方面中，本发明涉及包含根据本发明的基因治疗载体、根据本发明的核酸构建体或根据本发明的病毒体以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员熟知的。药学上可接受的赋形剂的实例是缓冲剂、载体(carrier)、溶媒(vehicle)或稀释剂。优选地，药物组合物进一步包含下述的一种或多种：脂质、脂质体、脂质复合物、短链醇类的磷脂脂质体(ethosome)、泡囊(niosome)、纳米颗粒、微粒、脂球(liposphere)、纳米胶囊或其任意组合。在优选的实施方案中，药物组合物被配制以施用于人眼。通常，通过直接注射到视网膜或周围组织而施用组合物。更优选地，组合物需要适用于视网膜下或玻璃体内注射，并因此需要使用NaCl或蔗糖时是无菌且等渗的液体。关于这一点，请参考国际申请WO 2012/114090 A1和WO 2011/133933 A2。

在第六个方面，本发明涉及试剂盒，其包括：(a)根据本发明的基因治疗载体，根据本发明的核酸构建体，根据本发明的病毒体，或根据本发明的药物组合物；以及(b)使用根据(a)的基因治疗载体或药物组合物预防、治疗或缓解归因于CRB1基因突变的视网膜病症的一个或多个症状的说明书。

在本说明书及其权利要求书中，动词“包含”及其变化形式以其非限制性意思使用，指该词后的条目内包括在内，但未特别提及的条目未被排除。此外，不定冠词“一”或“一个”指代的成分不排除多于一个的成分存在的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅存在成分中的一个。因此，不定冠词“一”或“一个”通常是指“至少一个”。

本说明书中引用的所有专利和参考文献都通过引用以其整体并入本文。

提供的下述实施例仅用于说明的目的，而不意味着以任何方式限制本发明的范围。

表1：SEQ ID NO的物种、基因和登录号的列表

表2：SEQ ID NO列表及其说明

附图说明

图1：CRB1在人视网膜中定位的代表性示意图。

图2：CRB1在小鼠视网膜中定位的代表性示意图。

图3：哺乳动物Crumbs同源物蛋白家族的示意图。

图4：在Crb1^-/-Crb2^F/+Chx10Cre/+小鼠的腹侧而不在背侧视网膜中的退化。A-E，Technovit切片。左侧图，背侧(上部)视网膜。右侧图，腹侧(下部)视网膜。

图5：Crb1^-/-Crb2^F/+Chx10Cre/+小鼠(50％C57BL/6J和50％129/Ola遗传背景)的视网膜电流图b-波，显示了3月龄时视网膜活性的丧失。请注意，野生型、Crb1^-/-和Crb1^-/-Crb2^F/F小鼠(不含有Chx10Cre)不显示视网膜活性的差异(数据未显示)。图a，暗视ERG，显示了Crb1^-/-Crb2^F/+Chx10Cre视网膜(浅灰；下侧的线)对.Crb1^-/-Crb2^F/F视网膜(深灰；上侧的线)中视杆细胞活性的丧失。图b，明视ERG，显示了Crb1^-/-Crb2^F/+Chx10Cre视网膜(浅灰；下侧的线))对.Crb1^-/-Crb2^F/F视网膜(深灰；上侧的线)中视锥细胞活性的丧失。

图6：Crb1^-/-Crb2^F/FChx10Cre/+视网膜中单独感光细胞层的丧失。A-E，Technovit切片。左图：对照视网膜。中图：Crb1^+/-Crb2^F/FChx10Cre/+视网膜。右图：Crb1^-/-Crb2^F/ ^FChx10Cre/+视网膜，显示了单独的感光细胞层的缺失和定位错误的(mislocalized)视网膜细胞。

图7：与Crb1和Crb2 cKO视网膜相比，Crb1Crb2 cKO中视网膜活性的丧失。图a和c，3月龄时测量的ERG。图b和d，1月龄时测量的ERG。图a和b：暗视。图c和d：明视。(注意，3月龄时，Crb1 KO和Crb2 cKO视网膜间b-波波幅中的置信区间的非常好的分离)。图中的线代表如下：最上部的线涉及Crb1 KO，从上往下的第二条线是Crb2 KO，从上往下的第三条线是Crb1^+/-Crb2^F/FChx10Cre(杂合子Crb1^+/-纯合子floxed Crb2^F/F杂合子Chx10Cre)，底部的线是Crb1^-/-Crb2^F/FChx10Cre(纯合子Crb1^-/-纯合子floxed Crb2^F/F杂合子Chx10Cre)。

图8：当视网膜下注射时，AAV9-CMV-GFP和ShH10Y-CMV-GFP感染Müller神经胶质细胞和感光细胞。缩写：GCL，神经节细胞；PRC，感光细胞；RPE，视网膜色素上皮细胞。

图9：使用视网膜下注射AAV2/9-CMV-sCRB1载体在Crb1 KO视网膜中表达短CRB1(SEQ ID NO：3)。图a，对照Crb1KO视网膜。图b，当用AAV2/9-CMV-sCRB1病毒颗粒转导时，表达sCRB1的Crb KO视网膜。缩写：OLM，外界膜；OPL，外网层。注释：SCRB1的表达在大约一半的转导的视网膜中导致视网膜退化(退化数据未显示)。

图10：显示视网膜活性丧失的恢复的代表性实验。出生后第23天，用10¹⁰AAV2/ShH10Y-CMV-CRB2或AAV2/ShH10Y-CMV-GFP病毒颗粒视网膜下注射Crb2 cKO视网膜，并在3月龄时分析ERG和免疫组化。图a，视网膜电流图暗视b-波，显示了与用AAV2/ShH10Y-CMV-GFP转导的同一Crb2 cKO的左眼(虚线)相比，用AAV2/ShH10Y-CMV-CRB2转导的Crb2 cKO右眼中视网膜活性的恢复(黑线)。暗视a-波也得以恢复(数据未显示)。图b，免疫组化，显示了图a中使用的动物的右眼中sCRB1的表达。在同一动物的左眼中未检测到CRB2的表达。缩写：OLM，外界膜；RPE：视网膜色素上皮。

图11：使用含有人RLBP1启动子(SEQ ID NO：122)的10¹⁰AAV2/6-RLBP1-GFP病毒颗粒利用玻璃体内注射特异性转导Müller神经胶质细胞(Müller神经胶质细胞的特异性感染)。注射后3周收集视网膜。图a，激光共焦扫描检眼镜(scanning-laser-ophtalmoscopy，SLO)。图b，显示荧光细胞的SLO。图c，显示GFP在Müller神经胶质细胞中的特异性表达的免疫组化。

图12：AAV6和ShH10Y壳体转导成人Müller神经胶质细胞。将1μl的每ml10¹³个基因组拷贝的AAV2/6-CMV-GFP-WPRE-pA(图a)或AAV6变体AAV2/ShH10-CMV-GFP-WPRE-pA(图b)应用到多片培养的成人视网膜。检测Müller神经胶质细胞中的GFP表达。

图13：细胞系中GFP和CRB1蛋白的表达。用磷酸钙法和10μg的pAAV-CMV-GFP-WPRE-pA或pAAV-CMV-hCRB1-pA载体转染的HEK293T细胞裂解物的Western Blotting显示了随后的CRB1和GFP蛋白水平。然而，尽管RPE起源的ARPE-9细胞表达正常量的GFP，在三倍过载的蛋白裂解物中，CRB1蛋白刚刚高于检测水平。

图14：在Crb突变体小鼠眼睛中视网膜下注射AAV2/9-CRB2病毒颗粒恢复了丧失的视网膜功能；用AAV2/9-CRB1病毒颗粒未能恢复视网膜功能。Crb1^-/-Crb2^F/+Chx10Cre^Tg/+(Crb1Crb2^F/+cKO；a-f)和Crb2^F/F Chx10Cre^Tg/+(Crb2 cKO；g-h)小鼠视网膜在2周龄时视网膜下注射1μL的2.10¹⁰基因组拷贝的4.9kb AAV2/9-CMV-CRB2-In5-spA(简称AAV2/9-CRB2)，即，CRB2侧翼为AAV2 ITR并包装入AAV9壳体蛋白中，并在对侧的对照眼中用AAV2/9-CMV-GFP(a-c,g-h)注射，或用1μl的1x10¹⁰基因组拷贝的含有AAV9病毒颗粒的4.8kb AAV2-最小CMV-CRB1-spA(最小CMV显示为序列表的SEQ ID NO:133)，并在对侧对照眼中用AAV2/9-minCMV-GFP(d-f)，3月龄或4月龄时利用视网膜电描记术在暗视(暗适应；a-b,d-e,g-h)或明视(光适应；c,f)条件下进行分析。示出了暗视b-波波幅(a，d，g)和a-波波幅(b，e，h)和明视b-波波幅(c，f)。CRB2载体在两个不同的Crb突变体小鼠模型中恢复了丧失的视网膜功能(a-c，g-h)，而CRB1载体未能恢复丧失的视网膜功能(d-f)。

图15：通过在Crb突变体小鼠眼睛中玻璃体内注射AAV2/ShH10Y-最小CMV-CRB1-In5-spA或AAV2/ShH10Y-CMV-CRB2-In5-spA病毒颗粒测试的CRb蛋白的毒性，即，CRB2或CRB1DNA，其有效连接到所示的启动子，侧翼为AAV2 ITR，并包装在ShH10Y壳体蛋白中。Crb1^-/-Crb2^F/+Chx10Cre^Tg/+(Crb1Crb2^F/+cKO；a-e)小鼠视网膜于2周龄时玻璃体内注射1μl的10¹⁰个基因组拷贝的4.9kb AAV2/ShH10Y-CMV-CRB2-In5-spA，并在对侧对照眼用AAV2/ShH10Y-CMV-GFP(a-b)注射，或者用1μL的5.10⁹个基因组拷贝的含有ShH10Y病毒颗粒的4.8kb AAV2/ShH10Y-最小CMV-CRB1-In5-spA注射，并在对侧对照眼用AAV2/ShH10Y-最小CMV-GFP(c-e)注射。3月龄时，上述眼睛利用视网膜电描记术在暗视(暗适应；a-b，c-d)或明视(光适应；e)条件下进行分析。示出了暗视b-波波幅(a，c)和a-波波幅(b，d)，以及明视b-波波幅(e)。与GFP对照载体相比，玻璃体内应用的CRB2载体在视网膜功能方面未检测到统计学上显著的差异(a-b)。玻璃体内应用的CRB1载体在CRB1载体表达时，显示了强烈降低的视网膜反应，暗示了CRB1载体的毒性效果。

实施例

小鼠模型的描述：

Crb1 ^-/+ Crb2 ^F/F Chx10Cre/+和Crb1 ^-/- Crb2 ^F/F Chx10Cre/+小鼠

Crb1^-/+Crb2^F/FChx10Cre/+小鼠视网膜(对于Crb1是杂合子，对于floxed Crb2是纯合子)显示了与Crb2^F/FChx10Cre/+视网膜中观察到的表型相比，在某种程度上相似但更严重的表型。视网膜电描记术显示了在1月龄时快速进行的视网膜活性的显著丧失。表型已经在E15.5(在该时间点类似于Crb2^F/FChx10Cre/+视网膜中的E17.5)开始，具有外界膜的破坏，且能检测到视网膜细胞的花纹样体(rosetter)。与Crb2^F/FChx10Cre/+视网膜相比，这些小鼠视网膜的主要区别在于数个视网膜细胞类型的异常定位。例如，某些无长突细胞异位定位于感光细胞层，且某些视锥细胞和视杆细胞异位定位于神经节细胞层。无论如何，在这些视网膜中，依然存在三个核(nuclear)层(外核层和内核层，以及神经节层)和两个网状层(外网层和内网层)，这表明视网膜的分层还是十分正常的。

Crb1^-/-Crb2^F/FChx10Cre/+小鼠(对于Crb1是纯合子，对于floxed Crb2是纯合子；也称为Crb1Crb2 cKO)视网膜显示了最严重的表型(图6)。视网膜电描记术显示了1月龄时视力的严重丧失(尽管依然存在某些视网膜活性；图7)。这些视网膜未显示出单独的感光细胞层(无外节和内节，核或外网层)且没有外网层，但有单独的广泛的核层，内网层和神经节细胞层。核层含有视杆细胞和视锥细胞、两级细胞、水平细胞、无长突细胞和Müller神经胶质细胞的细胞核，但令人惊奇地，还有神经节细胞的细胞核。内网层仅偶尔含有细胞核。正常含有神经节和移位的无长突细胞的细胞核的神经节细胞层还含有视杆细胞、两级细胞、水平细胞和Müller神经胶质细胞的细胞核。因此，尽管存在分层的视网膜，多种早生以及晚生的细胞异位定位。此外，在E15.5、E17.5、P1和P5存在分裂(dividing)的视网膜祖细胞的显著增加。伴随而来地，存在后生的细胞类型如视杆细胞、两级细胞、Müller神经胶质细胞和后生的无长突细胞的增加，但早生细胞类型如神经节、视锥细胞、水平细胞和早生无长突细胞没有增加。在E13.5、E17.5、P1、P5、P14和3月龄检测到增加的凋亡。这些数据表明，CRB蛋白(CRB2和CRB1)在抑制后生视网膜祖细胞增殖或及时退出细胞循环以及维持视网膜祖细胞、视杆细胞和视锥细胞，两级细胞和Müller神经胶质细胞间的粘附连接中发挥作用。

Crb1 ^-/- Crb2 ^F/+ Chx10Cre/+小鼠

在Crb1^-/-Crb2^F/+Chx10Cre/+小鼠中，形态学表型在P10开始(图4)，在3月龄时检测到显著降低的ERG(数据未显示)且在6月龄时非常清晰(而在Crb1^-/-视网膜中未检测到降低)。在这些视网膜中，视网膜的背侧(上部)部分未显示视网膜退化，而腹侧(下部颞和鼻侧)部分显示退化。这部分暗示了Crb1^-/-视网膜(其中仅有一象限(下颞))和Crb1^rd8/rd8视网膜(其中仅有视网膜的一象限(下部鼻侧)部分)显示了(有限的)视网膜退化。这些小鼠用于通过视网膜电描记术(ERG)功能测试本发明的AAV CRB基因治疗载体，因为对照的双杂合子Crb1^+/-Crb2^F/+Chx10Cre/+视网膜不显示形态学表型或ERG表型。不幸的是，3月龄和6月龄的对照和突变体小鼠(50％C57BL/6J和50％129/Ola混合遗传背景)的置信区间彼此非常接近，使得该模型难以解释(部分)恢复研究。产生了99.9％C57BL/6J背景的Crb1^-/-Crb2^F/+Chx10Cre/+小鼠，并将提供更少的鼠间差异。如下所述，本发明人认为模拟色素性视网膜炎患者中CRB1丧失的Crb2^F/FChx10Cre/+视网膜对于恢复研究是最佳的，因为它们的视网膜电流图更易于解释。

实施例1在初次免疫的CRB1敲除视网膜中短人CRB1的表达是有毒的

重要的是请注意，存在人CRB1基因的可替代的转录物。缺少外显子3和4但维持开放阅读框的一种转录物编码比全长CRB1短的形式，但存在于人类(SEQ ID NO：3)和例如类人猿、猴、犬、马、猫和许多其它物种中，而不存在于小鼠中。值得注意的是，CRB2(SEQ IDNO：40)的序列与该天然产生的CRB1的短变体(sCRB1或sCRB1ΔE3/4)非常相似。在本发明的初始试验中，本发明人制备了具有CMV启动子、短CRB1、短CRB1 cDNA序列中的合成内含子(In5)、合成spA的AAV载体。在视网膜下注射该包装在AAV血清型9(AAV9)中的载体时，发明人在Müller神经胶质细胞和感光细胞中的“外界膜”处检测到了短CRB1的显著表达。相似地，用包装于AAV血清型5(AAV5)中的载体获得了该结果。发明人将1μl的AAV2/9-CMV-hCRB1ΔE3/4In5-spA(1.00x10¹⁰递送的载体基因组)加低10倍剂量的AAV2/9-CMV-GFP-WPRE-pA(1.00x10⁹递送的载体基因组)在视网膜下注射到缺少CRB1并具有降低水平的CRB2的视网膜(Crb1^-/-Crb2^flox/+Chx10Cre视网膜)的左眼。对侧对照眼接受1μl的AAV2/9-CMV-GFP-WPRE-pA(1.00x10¹⁰递送的载体基因组)。Crb1^-/-Crb2^flox/+Chx10Cre视网膜从1到3到6月龄显示出视网膜功能的进行性丧失(数据未显示)。治疗的眼镜显示了短CRB1在Müller神经胶质细胞和感光细胞的“外界膜”处和视网膜色素上皮中的视网膜的巨大区域中的表达。然而，使用两个独立产生的病毒颗粒批次，发明人利用组织化学和免疫组化都检测到了归因于CRB1的短变体在Müller神经胶质细胞或感光细胞或视网膜色素上皮中的表达的感光细胞层和视网膜色素上皮层的丧失。这些毒性作用的原因被进一步分析，并可能是例如CRB1初次免疫Crb1敲除视网膜中的免疫反应、异位表达影响、小鼠和人CRB1蛋白的不相容性、短CRB1和全长CRB1间的差异、具有其它CRB1转录物或蛋白的表达的短CRB1的干扰、剂量依赖的毒性、短CRB1的不合时宜的表达)，并且它可能与不能在培养的细胞系中产生短(或全长)CRB1的持续高水平表达有关。在野生型C57BL/6J视网膜中表达短CRB1的初步研究也显示了毒性，这表明毒性不仅是归因于短人CRB1在初次免疫的Crb1敲除视网膜中的表达。这激励本发明人测试CRB2在治疗性载体中的表达，因为CRB2表达在细胞系中是耐受良好的。CRB2在Müller神经胶质细胞或感光细胞或视网膜色素上皮中的表达没有导致毒性作用。更具体地，CRB2在Müller神经胶质细胞或感光细胞或视网膜色素上皮中的表达没有导致感光细胞层和/或视网膜色素上皮层的可检测到的损失。该在Müller神经胶质细胞和感光细胞和视网膜色素上皮中CRB2表达的毒性作用的缺少与未来临床应用的开发相关。请注意，本发明人使用了非常高水平的AAV-CRB2载体(10¹⁰递送的载体基因组)，但没有检测到毒性作用。

实施例2AAV介导的基因治疗恢复了归因于Crumbs同源物(CRB)功能丧失的色素性视网膜炎(RP)小鼠模型中的视觉功能和行为

在该实施例中，本发明人评估了将Crumbs同源物(CRB)的物种特异版本(即人类)递送到出生后的Crb2 cKO小鼠的Müller神经胶质细胞和感光细胞是否能恢复这些细胞的功能。使用血清型6(变体ShH10Y)AAV载体视网膜下递送人CRB2到出生后23天(P23)的Crb2cKO小鼠的Müller神经胶质细胞和感光细胞。使用视网膜电流图(ERG)和行为测试来评估视觉功能，并且使用免疫组化来检查治疗和未治疗眼睛中的治疗性转基因表达、Crumbs同源物(CRB)复合体蛋白定位和视网膜结构的保护。

该实施例证实了视网膜下递送到P23 Crb2 cKO小鼠的左眼的AAV载体促进了野生型CRB2的表达，视觉功能和行为的恢复和视杆细胞以及视锥细胞的保护。注射后10周，在治疗和未治疗的眼睛中分析视网膜功能(ERG)。在一些实验中，在注射后四周，每两周进行ERG，直到10周(评估的最后时间点)。在注射后10周时，处死所有动物，且评估其治疗和未治疗的视网膜的CRB2表达和Crumbs同源物(CRB)复合体蛋白的定位。

结果确认了Crb2 cKO小鼠的治疗的眼睛恢复了视杆细胞介导的和视锥细胞介导的功能(ERG a-波和b-波波幅比未治疗眼睛的高大约两倍)。更重要的是，施用后，治疗效果稳定至少10周。组织学揭示了治疗小鼠中Müller神经胶质细胞和感光细胞中AAV介导的CRB2表达，以及Crumbs同源物(CRB)复合体蛋白定位的恢复。此外，治疗的眼睛中的视锥细胞密度高于未治疗的对侧对照。该结果表明，治疗后，治疗能够保护视锥细胞和视杆细胞至少10周。这首次证实，出生后的基因治疗能够在归因于Crumbs同源物基因突变的RP哺乳动物模型中恢复视觉功能和行为，并保护视网膜结构。重要的是，使用良好表征的、临床相关的AAV载体获得了该结果；因此，获得的体内动物模型数据提供了基于AAV的基因治疗载体用于治疗受到归因于CRB1基因突变的LCA8和/或RP影响的儿童的基础。

2.1材料和方法

实验动物

在发明人的实验室(facility)中产生了Crb2(flox/flox)小鼠。Chx10Cre杂合子胚胎获自The Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME,美国)的活体库存(living stock)。在发明人的实验室中交配杂合子，以产生Crb2(flox/flox)Chx10Cre纯合小鼠和同基因Crb2(flox/+)Chx10Cre对照后代(两者对于Chx10Cre都是杂合的)。所有小鼠均在12hr/12hr明/暗循环下养育并维持在发明人的研究所的中心实验室。食物和水可随意获取。所有的动物研究都得到了当地的动物保护和利用委员会的批准，且根据眼睛及视觉研究委员会(Ophthalmic and Vision Research)和KNAW(荷兰皇家科学研究院，KoninklijkeNederlandse Akademie van Wetenschappen)法令的动物利用的ARVO声明进行。

AAV载体的构建

使用带有血清型6变体ShH10Y壳体蛋白和AAV ITR和Rep蛋白的AAV载体(AAV2/ShH10Y)递送人CRB2(hCRB2)，因为已经显示它们具有高的转导效率，以及相比其它AAV血清型在视网膜Müller神经胶质细胞和感光细胞中的更快的表达起始。血清型6变体ShH10YAAV壳体由John Flannery博士(University of California,Berkeley,CA,美国)提供。AAV血清型5获自Plasmid Factory。AAV血清型9获自Joost Verhaagen博士(NetherlandsInstitute for Neuroscience)。选择普遍存在的巨细胞病毒(CMV)启动子来驱动hCRB2的表达。用于该研究的示例性的普遍存在的CMV启动子的核酸序列示于SEQ ID NO：121。CMV启动子位于具有BglII限制性位点(AGATCT)的5'序列的侧翼。插入CRB2cDNA的合成内含子(In5)用于CRB2的稳定转录加工。Crumbs同源物(CRB)基因编码区中的示例性合成内含子(In5)的核酸序列示于SEQ ID NO：128。内含子在具有序列外显子NNNAG/内含子/GNNN外显子的两个相邻外显子间插入到CRB2cDNA，其中G、A、T、C代表四个核苷酸中的一个，且N代表四个核苷酸中的任一个。合成的多聚腺苷酸(spA)序列用于有效终止转录。所使用的位于Crumbs同源物(CRB)基因翻译区后的终止密码子和3'侧翼反向末端重复间的示例性合成多聚腺苷酸区的核酸序列(Levitt et al.,1989)示于SEQ ID NO：129。合成的多聚腺苷酸位点位于具有BglII限制性位点(AGATCT)的3'序列的侧翼。所使用的位于CMV启动子和Crumbs同源物(CRB)基因翻译区间的示例性5'非翻译区的核酸序列示于SEQ ID NO：130。

由GenScript(Piscataway,NJ,美国)合成CMV-hCRB2In5-spA片段，其包含5'和3'末端的BglII限制性位点，具有SEQ ID NO：40中所述的序列。将BglII CMV-hCRB2In5-spA片段克隆到pUC57中(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,美国)，所述pUC57含有AAV2的两个反向末端重复(ITR)，侧翼为BglII限制性位点(SEQ ID NO:131和132)。产生的4.9kb的AAV-hCRB2质粒含有SEQ ID NO：40中所述的序列并且序列得到确认。

包装AAV载体，并根据先前公开的方法(Zolotukhin et al.,1999；Hermens etal.,1999；Ehlert et al.,2010)，利用碘克沙醇梯度超离心进行纯化。稀释、洗涤病毒颗粒，并使用Amicon 100kDa MWCO Ultra-15装置(Millipore,Billerica,MA,美国)在Dulbecco’s平衡盐溶液(Life Technologies,Bleiswijk,荷兰)中进行浓缩，并通过定量实时PCR滴定(Aartsen et al,2010)。对于AAV2/ShH10Y-CMV-hCRB2或AAV2/9-CMV-hCRB2(AAV2ITR和Rep蛋白；AAV9壳体蛋白)或AAV2/5-CMV-hCRB2(AAV2ITR和Rep蛋白；AAV5壳体蛋白)，获得的滴度是每ml 1.00x10¹³个病毒基因组(vg/ml)。

视网膜下注射：

在典型的实验中，在出生后23天(P23)，将1μl的AAV2/ShH10Y-CMV-hCRB2(1.00x10¹⁰递送的载体基因组)加少十倍剂量的AAV2/ShH10Y-CMV-GFP-WPRE-pA(1.00x10⁹递送的载体基因组)视网膜下递送到每只Crb2(flox/flox)Chx10Cre小鼠的左眼。用1μl的AAV2/ShH10Y-CMV-GFP-WPRE-pA(1.00x10¹⁰递送的载体基因组)注射对侧对照右眼。如先前所述进行视网膜下注射(Aartsen et al.,2010)。在所有动物中进行进一步的分析，而不仅是接受可比较的、成功注射的动物(>60％视网膜脱离和最小的并发症)。良好确定了视网膜脱离的区域对应于病毒转导的区域(Cideciyan et al.,2008；Timmers et al.,2001)。

视网膜电流图分析：

在代表性的实验中，使用基于PC的控制和记录单元(Toennies MultilinerVision；Jaeger/Toennies,Hochberg,德国)、根据先前描述并具有轻微改动的方法(Haireet al.,2006)记录治疗的Crb2 cKO(n＝3)和同基因的对照(n＝2)的视网膜电流图(ERG)。在注射后4周记录初始的ERG测量，并在此后每两周进行一次，直到注射后10周(该研究中评估的最后的时间点)。年龄匹配的同基因对照与治疗的动物在每一个时间点一并记录。小鼠暗适应过夜(超过12个小时)并用1:1:5比例的100mg/kg氯胺酮，20mg/kg赛拉嗪和盐水的混合物分别进行麻醉。瞳孔用1％托吡卡胺和2.5％盐酸去氧肾上腺素进行扩张。使用加热的循环水浴维持体温在38℃。向每只眼应用2.5％羟丙基甲基纤维素，以防止角膜脱水。使用定制的、金线圈角膜电极记录全场(Full-field)ERG。参比电极和接地电极分别皮下置于眼睛之间和尾巴中。用一系列七个增加的强度(seven increasing intensities)(0.1mcds/m²到1.5cds/m²)的白色闪光得出暗视视杆细胞记录。低强度刺激的刺激间隔是1.1秒。在三个最高的强度(100mcds/m²、1cds/m²和5cds/m²)，刺激间隔分别是2.5、5.0和20.0秒。在每一个强度记录10个反应并进行平均。然后，使小鼠光适应100cds/m²白光背景，持续2分钟。用一系列五个增加的光强度(100mcds/m²到12cds/m²)得出明视视锥细胞反应。在每一个强度记录五十个反应并进行平均。所有的刺激都在存在100cds/m²背景的情况下提供。b-波波幅定义为a-波波谷到每一个波形的正峰间的差。

另外可选地，用一系列增加的强度(2.7cds/m²到25cds/m²，对数地遍布10个水平)的光脉冲得出ERG记录。脉冲长度范围为0.5到5msec。在脉冲之间存在大约2秒的延迟(.5Hz)。在每一个强度记录30个反应并进行平均。从一个强度水平到下一个的过渡时不引入额外的延迟。在脉冲之间不存在背景照明。a-波波谷定义为刺激开始后0和30毫秒之间的最小反应。b-波波峰定义为刺激开始后15和100毫秒间的最大反应。a-波波幅定义为基线和a-波波谷之间的差，而b-波波幅定义为b-波波峰和a-波波谷之间的差。

将所有CMV-hCRB2治疗的(n＝3)Crb2cKO(治疗和未治疗的眼睛二者)和同基因对照小鼠的明视b-波最大波幅(在12cds/m2产生的那些)进行平均并用于测试标准误差。在每个时间点(注射后4周到10周)进行这些计算。该数据输入Sigma Plot以进行最后的图示。使用配对t-检验计算每一组内治疗和未治疗的眼睛相对于时间(注射后4周对注射后10周)的P-值。显著性差异定义为P-值＜0.05。

组织制备

注射后10周，P23治疗的Crb2 cKO小鼠和年龄匹配的同基因对照暗适应2小时。暗适应之后，立即在暗红光(>650nm)下处死小鼠。注射和未注射眼睛的角膜缘在12:00位置用热针做记号，以便于定位。在暗红光下摘除眼球并将眼睛立即置于4％多聚甲醛中。用于冰冻切片的眼睛根据先前描述的方法进行制备(Haire et al.,2006)。简言之，从每只眼睛移出角膜，同时让晶状体保留在剩余的眼杯(eye cup)中。在临近烧痕的角膜缘的虹膜中制备小的"V"形切口，以保持定位。过夜固定之后，移出晶状体和玻璃体。剩余的含有视网膜RPE的眼杯于4℃置于含30％蔗糖的PBS中至少1小时。然后，将眼杯置于低温恒温器化合物(Tissue Tek OCT 4583；Sakura Finetek,Inc.,Torrance,CA,美国)中，并在干冰/乙醇浴槽中速冻。用低温恒温器(Microtome HM550；Walldorf,德国)以10μm对眼睛进行连续切片。用于全标本包埋分析的眼睛根据先前描述的方法进行制备(van de Pavert et al.,2007)。如上所述获得定位。过夜固定后，从每只眼睛移除角膜、晶状体、玻璃体和视网膜色素上皮而不破坏视网膜。在临近初始角膜缘烧痕(bum)的视网膜上部(背侧)部分制作切口，以维持定位。

免疫组化和显微镜检查

视网膜冷冻切片和全标本包埋用1x PBS洗涤三次。洗涤之后，在暗处于室温将样品在0.5％Triton中孵育1小时。然后，于室温将样品在1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中封闭1小时。用稀释于0.3％Triton/1％BSA中的兔多克隆CRB2抗体EP13或SK11(分别为1:1000和1:200；由Penny Rashbass博士,University of Sheffield,英国提供)于37℃过夜孵育视网膜切片。一抗(primary)孵育之后，用1x PBS洗涤视网膜切片和全标本包埋3次。

用1:500稀释于1x PBS中的标记有花青染料Cy5(Molecular Probes,Eugene,OR,美国)的IgG二抗于室温孵育视网膜切片1小时。用二抗孵育之后，用1x PBS洗涤切片和全标本包埋。于室温用4',6'-二氨基-2-苯基吲哚(4',6'-diamino-2-phenylindole，DAPI)复染视网膜切片5分钟。用1X PBS和水最终冲洗后，将切片包埋于水基媒介(DAKO)中并用盖玻片封盖(cover-slipped)。用置于12：00位置的视网膜的上部(背侧)部分将视网膜全标本包埋定位于载玻片上。将样品包埋于DAKO中并用盖玻片封盖。

用共焦显微镜检查(装备有LCS版本2.61,Build 1537软件的Leica TCS SP5 AOBSSpectral Confocal Microscope,(Bannockburn,IL,美国))分析视网膜切片。用相同的曝光设定以20X或63X放大率获取所有图像。用于DAPI和CRB2染色的激发波长分别是405nm和650nm。发射光谱分别是440-470nm和670nm。用装备有QImaging Retiga 4000R Camera和QImaging QCapture Pro软件(QImaging,Inc.,Surrey,BC,加拿大)的宽视野荧光显微镜(Axioplan 2)(Zeiss,Thornwood,NY,美国)分析视网膜全标本包埋。每个全标本包埋的象限在相同的曝光设定下以5X放大率进行成像，然后用(版本7.0)(Adobe,SanJose,CA,美国)归并在一起。

2.2结果

在AAV治疗的Crb2 cKO小鼠中感光细胞功能(ERG)得以恢复：

先前报道了Crb2 cKO小鼠中的视杆细胞和视锥细胞反应在1月龄时显著降低并在3月龄时进行性降低(Alves et al.,2013)。在本文中，本发明人表明，用携带有在遍在的(CMV)启动子控制之下的人CRB2基因(SEQ ID NO：40)的AAV载体P23治疗该小鼠实质性恢复了视杆细胞的功能，如通过视网膜电描记术(ERG)所测量的。来自CMV-hCRB2处理的和对照CMV-GFP处理的眼睛的代表性视杆细胞示踪显示，在注射后10周，CMV-hCRB2处理的眼睛中的视杆细胞功能恢复到大约正常值的40％。类似于先前的报道，截止到该时间点，在对侧的未处理眼睛中的视杆细胞反应是大约20％正常值。重要的是，视杆细胞a-波和b-波功能的恢复在3个月(该研究评估的最后的时间点)时保持稳定(见图10)。在Crb2 cKO小鼠中视杆细胞视网膜功能(ERG)得到了部分保护。研究表明，甚至非常小的ERG波幅也转化成了强烈的视觉行为(Williams et al.,2006)。实际上，发现接受AAV-RPE65治疗的LCA2患者尽管完全缺少ERG反应，依然展现了行为的恢复(Maguire et al.,2008)。因此，AAV-hCRB2载体对Crb2 cKO视网膜中视网膜功能丧失的恢复非常有希望用于将来的基因治疗研究。这是使用候选的临床基因治疗载体恢复缺少Crumbs同源物(CRB)功能的哺乳动物中视网膜功能丧失的第一个实例。

对所有动物进行分析，而不仅是那些接受同等的、成功注射的动物(＞60％视网膜脱离和最小的并发症)。十分确定，视网膜脱离的区域对应于病毒转导的区域(Cideciyanet al.,2008；Timmers et al.,2001)。具有不成功的视网膜下注射的小鼠显示缺少hCRB2和GFP的表达或受限的hCRB2和GFP表达以及缺少暗视b-波或a-波ERG功能的恢复(见图10)。由于未处理的Crb2 cKO视杆细胞反应中的鼠间差异性(3月龄时WT的60-80％)，在统计学上比较处理的对未处理的眼睛的平均视杆细胞反应是有问题的。然而，在同一动物内，视杆细胞ERG波幅在一对眼睛间是接近同等的，因此，本发明人计算了处理的对未处理的眼睛的平均鼠内视杆细胞a-波和b-波波幅比率，然后将这些比率相对于时间进行作图。

遍在的CMV启动子驱动了hCRB2在Crb2 cKO小鼠的Müller神经胶质细胞和感光细胞中的转基因表达：

缺乏CRB1影响了归因于CRB1基因突变的LCA8和RP患者中Müller神经胶质细胞和感光细胞二者。因此，本研究选择遍在的CMV启动子作为靶向这两种细胞类型的手段。选择AAV6变体ShH10Y壳体的原因是它在视网膜下注射时在小鼠体内有效感染Müller神经胶质细胞和感光细胞(也例如在体外感染人视网膜Müller神经胶质细胞，见图12)。用AAV-CMV-hCRB2处理后10周，Crb2 cKO视网膜的免疫染色揭示了该启动子在感光细胞的内节和Müller神经胶质细胞的顶部绒毛中驱动了高效的hCRB2表达。通常，来自用该治疗性载体注射的眼睛的视网膜断层(cross section)在外界膜处显示强烈的hCRB2染色，而来自同一小鼠的对侧模拟GFP处理的眼睛缺少任何hCRB2表达。CMV介导的hCRB2表达水平接近在同基因对照眼睛中看到的表达水平。CMV-hCRB2处理的神经视网膜中的hCRB2表达局限于外界膜。在视网膜色素上皮中偶尔发现hCRB2表达。在正常哺乳动物视网膜中，视网膜色素上皮也表达Crumbs同源物(CRB)复合体成员如PALS1(Park et al.,2011)，尽管是以比外界膜中低的水平进行表达(Pellissier LP,Lundvig DM,Tanimoto N,Klooster J,Vos RM,Richard F,Sothilingam V,Garcia Garrido M,Le Bivic A,Seeliger MW,Wijnholds J.Hum MolGenet.2014Jul 15；23(14):3759-71)。Crb2 cKO的野生型RPE细胞中hCRB2的过表达未导致显著改变的视网膜色素上皮的形态或功能。然而，引人注目的是，CMV启动子构建体在感光细胞、Müller神经胶质细胞和视网膜色素上皮外部未驱动治疗性hCRB2表达。该脱靶表达的缺乏与开发将来的临床应用相关。如果需要，视网膜色素上皮中的过表达可通过使用对在视网膜色素上皮细胞中表达的miRNA具有特异性的microRNA靶位点(miRT's)而降低(Karali et al.,2011)。

重要的是请注意，尽管人类中CRB1缺乏导致了用ERG可非常良好检测的LCA8和进行性RP，但小鼠中CRB1缺乏导致了迟发的视网膜退化并且退化局限于视网膜的一个象限且利用ERG不可检测。本发明的免疫电镜术数据显示，在小鼠中，CRB1局限于Müller神经胶质细胞的“外界膜”，而在人类中，CRB1定位于Müller神经胶质细胞和感光细胞的“外界膜”。本发明的免疫电镜术数据显示，在小鼠中，CRB2定位于Müller神经胶质细胞和感光细胞的“外界膜”，而在人类中，CRB2局限于Müller神经胶质细胞的“外界膜”。本发明的缺少CRB1的小鼠、缺少CRB2的小鼠、缺少CRB1且具有降低水平的CRB2的小鼠、缺少CRB2且具有降低水平的CRB1的小鼠和缺少CRB1和CRB2二者的小鼠的分析显示了CRB1和CRB2非常相似的功能。相似地，Crumbs同源物(CRB)蛋白的功能是可互换的，例如，人CRB1蛋白能部分恢复缺少Crumbs(Crb)蛋白的果蝇的表型(den Hollander et al.,2001)，并且斑马鱼CRB2B蛋白能恢复缺少CRB2A蛋白的斑马鱼中的表型(Omori&Malicki,2006)。

2.3讨论

在实施例1和2之前，如3.1材料和方法部分中所述，作为裸质粒DNA的多个质粒被转染于细胞系中(例如HEK293、MDCKII和ARPE19细胞系)。明显的，用短或全长CRB1 cDNA转染的细胞系始终导致了低CRB1表达。稳定表达全长CRB1 cDNA(SEQ ID NO：1)或短CRB1cDNA(缺少整个胞外域的CRB1；SEQ ID NO：3)的细胞系(例如HEK293和MDCKII细胞系)也具有低表达。与之相反，表达CRB2 cDNA的细胞系导致了CRB2蛋白的高表达。这些观察表明，细胞处理增加的CRB2表达要好于增加的CRB1表达。

已经在多个小鼠模型中进行了实验。

在缺少CRB1蛋白表达且具有降低水平的CRB2蛋白的视网膜中过表达短人CRB1。因此，这些小鼠在Müller神经胶质细胞和感光细胞中依然具有功能性的天然CRB2蛋白，因为小鼠视网膜中的CRB2存在于两种细胞类型中。可以想象的是，该剩余的小鼠CRB2蛋白能够接任CRB1蛋白的功能。这些50％C57BL/6J和50％129/Ola遗传背景的小鼠较不适用于测试视网膜中表型的恢复。如通过使用视网膜电描记术所测量的，对照小鼠和突变体小鼠在视网膜活性上是显著不同的。然而，在实验动物中存在不少差异，作为结果，置信区间彼此接近。就受关切的表型的恢复，小鼠模型仍然是亚最佳的并能通过回交进一步优化到99.9％C57BL/6J。近期，按照上述实验设定，使用AAV9中的人CRB2在缺少CRB1并具有降低水平的CRB2的小鼠(75％C57BL/6J和25％129/Ola遗传背景)中启动了试验。与所述的AAV2/ShH10Y-CMV-CRB2实验一样，使用视网膜下注射到P14Crb1^-/-Crb2^F/+Chx10Cre视网膜(75％C57BL/6J和25％129/Ola遗传背景)的AAV2/9-CMV-CRB2(1.00x10¹⁰递送的载体基因组)病毒颗粒获得了ERG恢复结果，所述视网膜在4月龄时进行分析。

在缺少CRB2的小鼠的视网膜中过表达人CRB2。这些小鼠在Müller神经胶质细胞中依然有功能性的CRB1蛋白，但在感光细胞中缺少功能性的CRB蛋白。该情况最类似于患有RP12或LCA8的患者中所见的情况。在这些患者中(缺少功能性CRB1)，CRB2存在于Müller神经胶质细胞中，但不存在于感光细胞中(也请见图1和2)。Crb2条件敲除小鼠的视网膜在1月龄和3月龄时显示了视网膜活性中的巨大差异。Crb2突变体小鼠的视网膜在表型上得以恢复，且置信区间是分离的和可以良好解释的。

在缺少CRB1且具有降低水平的CRB2的小鼠(Crb1^-/-Crb2^F/+Chx10Cre)的视网膜中过表达人CRB2。这些小鼠在视网膜中缺少CRB1，但在Müller神经胶质细胞和感光细胞中依然具有降低水平的功能性CRB2蛋白。该情况类似于缺少CRB1的小鼠(具有降低水平的CRB2的遗传背景)。与野生型小鼠相比，75％C57BL/6J和25％129/Ola遗传背景的对照Crb2^F/+条件敲除小鼠的视网膜不显示视网膜活性的丧失。75％C57BL/6J和25％129/Ola遗传背景的Crb1Crb2^F/+条件敲除小鼠的视网膜在3月龄时显示了视网膜活性的巨大差异。Crb1Crb2^F/+突变体小鼠的视网膜在表型上得以恢复，且置信区间是分离的且可以良好解释。这些实验表明CRB2能恢复哺乳动物疾病模型中的CRB1表型。

本实施例表明，在显示重组人CRB2表达的眼睛中的表型(使用视网膜电描记术测量为视网膜活性)得以恢复。在缺少重组人CRB2表达时，表型得不到恢复。

已经使用多个启动子进行了实验。本发明人使用了下述启动子-基因构建体：

-全长CMV-CRB2(在Crb2cKO和Crb1Crb2(flox/+)cKO小鼠中的恢复实验)

-全长CMV-sCRB1(Crb1Crb2(flox/+)cKO小鼠中的恢复实验)

-全长CMV-GFP(表达实验)

-截短的CMV-GFP(表达实验)

-截短的CMV-CRB1(Crb1Crb2(flox/+)cKO小鼠中的恢复实验和毒性实验)

-hGRK1-CRB1(Crb1 KO小鼠中的表达实验；恢复实验和毒性实验将会接着进行)

-hRHO-CRB1(Crb2 KO小鼠中的表达实验；恢复实验和毒性实验将会接着进行)

-hGRK1-CRB2(Crb2 KO小鼠中的表达实验；恢复实验将会接着进行)

-hRHO-CRB2(Crb2 KO小鼠中的表达实验；恢复实验将会接着进行)

-RLBP1-GFP(表达实验)

2.4结论

通过使用本文公开的rAAV载体CRB2构建体，在Crumbs同源物(CRB)缺乏、Crb2 cKO小鼠、Crb1Crb2^F/+cKO小鼠的哺乳动物模型中，长期治疗是可获得的。重要地，由于毒性，这些结果不能使用短CRB1或全长CRB1构建体获得，而用无毒的CRB2构建体可以获得所述结果。重要地，提供工具以在模拟归因于CRB1表型丧失的不同程度LCA8和RP的缺少CRB1和/或CRB2的小鼠中测试CRB2基因治疗载体。这些结果提供了成功使用基于rAAV的CRB2基因治疗载体治疗视网膜营养不良尤其是归因于CRB1丧失的LCA8和RP的证据。还在恢复实验中使用AAV2/9-CMV-hCRB2-spA、在表达实验中使用AAV2/5-CMV-hRHO-CRB2-spA和AAV2/5-hGRK1-CRB2-spA，并且还使用AAV2/9载体或hRHO或hGRK1启动子进行了实验，当过表达人CRB2时未检测到毒性，而在AAV5或AAV9载体中过表达人短CRB1则是有毒的。

实施例3通过细胞计数和Western Blotting测试CRB蛋白在ARPE-19细胞系中的毒性

3.1材料和方法

可以根据下述实施例使用人源视网膜色素上皮细胞测试CRB蛋白的毒性。用不同的(修饰的)CRB构建体(例如CRB1、sCRB1、CRB2同种型1、CRB2同种型2、CRB2同种型3、CRB3等)之一和对照GFP构建体(Aartsen et al.(2010)PLoS One 5:e12387；GFAP-driventransgene expression in activated Müller glial cells following intravitrealinjection of AAV2/6vectors；UniProtKB/Swiss-Prot序列P42212)使用磷酸钙法(例如在Sambrook和Russell(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3^rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York中进行了描述)转染ARPE19细胞(ATCC CRL-2302)。使用CRB2构建体作为对照(CRB2序列：SEQID NO:40)。以等摩尔量使用CRB构建体且每培养皿加入总量20μg的DNA。如实施例2.1所述制备CRB构建体。简言之，利用化学合成制备CRB构建体并亚克隆到pUC57中。这些构建体包含AAV2 ITR(SEQ ID NO:131和132)、CMV启动子(SEQ ID NO:121)、待测的CRB cDNA(例如SEQ ID NO:40或其它CRB序列)、内含子5(SEQ ID NO:128)和合成的pA(SEQ ID NO:130)。

固定量的GFP构建体用作内部转染对照。例如，使用18μg的CRB构建体加2μg的GFP构建体。以这种方式，可以测试一系列等摩尔的质粒浓度同时加入相同量的DNA，例如，2、4、8或16μg的CRB构建体分别加18、16、12或4μg的GFP构建体。

转染前一天，将30％汇合的ARPE19细胞一式两份铺于含补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM的10cm培养皿中。在转染前两小时更换培养基后，以每皿含20μg DNA的500μl的0.25M CaCl₂和TE(10mM Tris，1mM EDTA pH 8)缓冲液制备转染混合物。在持续涡漩的同时，将500μl的2x HBS(281mM NaCl,100mM Hepes,1.5mM Na₂HPO₄,pH 7.12)滴加到转染混合物，且完整的混合物直接加到细胞中过夜孵育。次晨更换培养基。两天后(即转染后72h)，单独(一式两份中的一份)和同时(一式两份中的第二份)收集贴壁和悬浮细胞，离心后重悬于1mL磷酸盐缓冲盐水(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na₂HPO₄和1.76mM KH₂PO₄)中。随后测试细胞的：

-用Luna Automated Cell Counter(Logos Biosystems,Inc.；Annandale,USA)测试细胞的数目和存活率。计数器测定细胞的数量并利用台盼蓝染色区分有活力的细胞和无活力的细胞。使用如下所示的Life Technologies的标准程序进行台盼蓝染色。

-利用Western Blotting检测蛋白表达。使用SDS-PAGE电泳分离来自细胞裂解物的蛋白。在转移到硝酸纤维素膜后，硝酸纤维素膜针对CRB、GFP和肌动蛋白进行免疫染色，并使用Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR；Westburg BV,Leusden，荷兰)进行分析。该方法在为Aerius开发的Western Blot Analysis和Li-Cor开发的Odyssey Family ofImagers的手册中进行了描述，其2003年出版并于2012年1月修订(http:// biosupport.licor.com/docs/Wester_Blot_Analysis_11488.pdf)。使用抗-CRB1(AK2,AK5和AK7；van de Pavert et al.,2004)和抗-CRB2(来自Pen Rashbash的SK II，在van dePavert et al.,2004中公开)以及抗-GFP(Becton Dickinson and Company)作为一抗。二抗(IRDye 800-CW山羊抗鸡、小鼠或兔，或驴抗山羊)来自Li-Cor。

使用Life Technologies的标准规程的台盼蓝染色：

规程

下述程序能够使本领域技术人员准确测定细胞存活率。细胞存活率计算为血细胞计数器网格内的活细胞数除以细胞总数。如果细胞吸收台盼蓝则认为它们是无活力的。

1.使用血细胞计数器测定细胞系悬浮液的细胞密度。

2.制备在缓冲的等渗盐溶液pH 7.2到7.3(即磷酸盐缓冲盐水)中的0.4％台盼蓝溶液。

3.加0.1mL的台盼蓝储液到1mL的细胞中。

4.装载血细胞计数器并立即在低放大率的显微镜下进行检查。

5.计数染成蓝色的细胞数和总细胞数。

％活细胞＝[1.00-(蓝色细胞数÷总细胞数)]×100

为了计算每mL培养物的活细胞的数目，使用下式：

活细胞数×10⁴×1.1＝细胞数/mL培养物(记住要对稀释因子进行校正)。

3.2结果

全长CRB1在ARPE-19细胞中转染产生大量的离壁/死亡细胞并产生少于20％的活CRB1转染细胞。CRB2在ARPE-19细胞中转染产生超过95％的活转染细胞。这表明全长CRB1是有毒的和/或抑制细胞生长。贴壁细胞表达的CRB1的量利用Western Blot几乎是不可测量的，这与ARPE-19中的GFP或HEK293T细胞中的CRB1相反(图13)。此外，即使是过载3倍时，CRB1转染的ARPE-19中的参考蛋白水平(肌动蛋白)仍然低于GFP转染的ARPE-19。这证明全长CRB1是有毒的和/或抑制细胞生长。

为了进一步分析全长CRB1相对于CRB2的毒性作用，使用了下述构建体：AAV-截短的CMV-CRB1；AAV-hGRK1-CRB1；AAV-hGRK1-sCRB1；AAV-hRHO-sCRB1。

实施例4在Crb1(-/-)Crb2(flox/+)Chx10Cre和Crb2(flox/flox)Chx10Cre小鼠中使用AAV2/9-CMV-CRB2-In5进行基因替代治疗

使用在所有视网膜细胞中缺少CRB1并在除视网膜色素上皮外的所有视网膜细胞中具有降低水平的CRB2的Crb1Crb2^flox/+条件敲除小鼠(例如75％C57BL/6J和25％129/Ola遗传背景的Crb1^-/-Crb2^flox/+Chx10Cre)和Crb2 cKO小鼠(99.9％C57BL/6J背景)评估使用AAV2/9-CMV-CRB2-In5的基因替代治疗。75％C57BL/6J和25％129/Ola遗传背景的Crb1^-/-Crb2^flox/+Chx10Cre小鼠显示了如通过3到6月龄的ERG所测量的进行性视网膜退化和视网膜功能的暗视(视杆细胞介导的)和明视(视锥细胞介导的)丧失(Pellissier L.P.(2014)CRB2acts as a modifying factor of CRB1-related retinal dystrophies inmice.Hum Mol Genet.Jul 15；23(14):3759-71)。在12-18月龄时，小鼠是失明的。

如利用ERG证实的，使用AAV2/9-CMV-hCRB2-In5的AAV介导的CRB2向Crb1Crb2^flox/+cKO视网膜的转移恢复了这些动物的视力。AAV介导的CRB2向出生后的Crb1Crb2^flox/+cKO视网膜的转移在感光细胞和Müller神经胶质细胞中表达了CRB2并在CRB2表达时保护了视网膜结构。

如利用ERG所证实的，AAV介导的使用1μL的包含4.9kbAAV2-CMV-hCRB2-In5的2.10¹⁰基因组拷贝的AAV9病毒颗粒视网膜下转移CRB2到Crb1Crb2^flox/+cKO视网膜或Crb2cKO视网膜恢复了这些动物的视力，图14(a-c、g-h)。AAV9介导的CRB2到出生后的Crb1Crb2^flox/+cKO视网膜或Crb2cKO视网膜的视网膜下转移在感光细胞和Müller神经胶质细胞中表达了CRB2，并在CRB2表达时保护了视网膜结构。

这些实验显示了在使用单剂量的AAV2/9-CMV-hCRB2-In5(简称AAV-CRB2)后，甚至在严重退化的Crb1Crb2^flox/+cKO或Crb2cKO视网膜中保护视网膜结构的可行性。这些数据证实了，Crb1^-/-Crb2^flox/+Chx10^Cre视网膜中CRB1的丧失可通过使用AAV-CRB2进行恢复而得以补偿。换言之，这些数据证实了，通过在Crb1^-/-Crb2^flox/+Chx10Cre视网膜中使用AAV-CRB2升高CRB2水平可恢复缺少CRB1且具有降低水平的CRB2的视网膜中的退化表型。

实施例5Crb1(-/-)Crb2(flox/+)Chx10Cre中使用AAV2/9-CMV-CRB1缺乏基因替代治疗

如利用ERG证实的，使用含有4.8kb AAV2-最小CMV-hCRB1表达载体(即hCRB1有效连接到最小CMV启动子且其侧翼为AAV2 ITR，包装于AAV9壳体蛋白中)的1μL的10¹⁰基因组拷贝的AAV9病毒颗粒视网膜下AAV介导CRB1转移到Crb1Crb2^flox/+cKO视网膜(99.9％C57BL/6J背景)没有恢复这些动物的视力，图14(d-f)。如利用免疫组化实验证实的，AAV介导的CRB1视网膜下转移到出生后的Crb1Crb2^flox/+cKO视网膜在感光细胞和Müller神经胶质细胞中表达了CRB1，但在CRB1表达时未能保护视网膜结构(数据未显示)。这些实验显示了，在严重退化的Crb1Crb2^flox/+cKO视网膜中使用单剂量的AAV-CRB1后野生型CRB1缺乏保护视网膜结构的能力。实施例4显示了野生型CRB2可以发挥基因替代治疗的作用，而实施例5证实了野生型CRB1在Crb1^-/-Crb2^flox/+Chx10Cre视网膜中不能发挥这样的作用。

实施例6CRB蛋白在Crb1(-/-)Crb2(flox/+)Chx10Cre小鼠中的毒性测试

可以使用Crb1(-/-)Crb2(flox/+)Chx10Cre小鼠根据下述实施例测试CRB蛋白的毒性。

6.1材料和方法

在一只眼睛内用在重组AAV表达载体内的(修饰的)CRB构建体(例如CRB1、短CRB1、CRB2同种型1、CRB2同种型2、CRB2同种型3、CRB3等)玻璃体内注射Crb1(-/-)Crb2(flox/+)Chx10Cre小鼠视网膜，而对侧眼睛接受对照的AAV-GFP构建体(Aartsen et al.(2010)PLoSOne 5:e12387；GFAP-driven transgene expression in activated Müller glial cellsfollowing intravitreal injection of AAV2/6 vectors；UniProtKB/Swiss-Prot序列P42212)。使用AAV转导方法(例如在Aartsen et al.(2010)PLoS One 5:e12387；GFAP-driven transgene expression in activated Müller glial cells followingintravitreal injection of AAV2/6 vectors中进行了描述)，用载体处理眼睛。对照动物在一只眼睛内接受AAV-CRB2构建体并在对侧眼睛中接受对照AAV-GFP构建体(CRB2序列：SEQ ID NO:40)。以等摩尔的量和1μL的5.10⁹到10¹⁰基因组拷贝的AAV2/ShH10Y-(CMV或最小CMV)-CRB的总量将AAV-CRB构建体玻璃体内注射到Crb1(-/-)Crb2(flox/+)Chx10Cre小鼠的眼睛中，并在对侧对照眼中用相同量的AAV2/ShH10Y-(CMV或最小CMV)-GFP进行注射。如实施例2.1所述制备AAV-CRB构建体。简言之，通过化学合成制备CRB构建体并亚克隆到pUC57中。这些构建体包含AAV2ITR(SEQ ID NO：131和132)、CMV启动子(SEQ ID NO：121)或最小CMV启动子、待测CRB cDNA(例如SEQ ID NO：40或其它CRB序列)、合成的pA(SEQ ID NO：130)和任选的内含子5(SEQ ID NO：128)。固定量的GFP构建体用作内部转染对照。质粒包装在AAV血清型ShH10Y壳体中。ShH10Y介导的基因到小鼠视网膜的玻璃体内转移在Müller神经胶质细胞和其它内部视网膜细胞类型(Pellissier et al.,(2014)Molecular TherapyMethods&Clinical Development 1:14009；Specific tools for targeting andexpression in Müller glial cells)以及视网膜睫状体中表达了蛋白。

用1μL的5.10⁹到10¹⁰基因组拷贝的CRB或对照GFP病毒颗粒于2周龄时玻璃体内注射3到7个Crb1^-/-Crb2^F/+Chx10Cre^Tg/+(Crb1Crb2^F/+cKO)。在暗视(暗适应过夜)或明视(用在记录前10分钟启动的30cd/m2的背景照明进行明适应)条件下利用视网膜电描记术在3到5月龄时体内分析视网膜功能。使用氯胺酮(66.7mg/kg体重)和赛拉嗪(11.7mg/kg体重)麻醉小鼠。扩张瞳孔，并且单独的品蓝闪光刺激的范围为从-3到1.5log cd s/m2。用2s的刺激间间隔平均二十个反应。a-波反应揭示了直接的感光细胞功能(暗视下的视杆细胞和视锥细胞，且在明视条件下仅来自视锥细胞)并且b-波揭示了视网膜活性。图15中显示了代表性的实验。

测量了与GFP对侧眼睛相比，CRB蛋白的潜在毒性(由ERG测量的降低的视网膜活性表示)。认为显著降低的ERG平均反应是有毒的。图15显示了一个范例，CRB1蛋白显示了毒性迹象，而CRB2没有显示。

利用标准的免疫组化、使用抗各个CRB蛋白的抗体(例如van de Pavert et al.,J.Cell Science,2004中的抗CRB2或抗CRB1或抗CRB3)检查Crb1Crb2^F/+cKO或Crb2 cKO中玻璃体内转导后CRB蛋白的视网膜表达。

6.2结果

全长CRB1玻璃体内转导到Crb1Crb2^F/+cKO眼睛导致了视网膜电流图中显著降低的b-波和a-波。使用全长CRB2的类似实验没有显示b-波或a-波的降低。这表明，当使用1μL的5.10⁹到10¹⁰基因组拷贝的壳体ShH10Y颗粒进行玻璃体内应用时，全长CRB1对Crb1Crb2^F/+cKO视网膜是有毒的(在视网膜电流图中降低了a-波和/或b-波)，而CRB2是无毒的。

参考文献

下述参考文献通过引用具体并入本文，到提供补充本文所述的程序或细节的范例性程序或其它细节的程度。

国际公开号WO 2011/133933及其中提及的参考文献和专利。

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Claims

1.用作药物的基因治疗载体，其中基因治疗载体包含至少下述之一：

a)编码Crumbs同源物-2(CRB2)蛋白的核苷酸序列；和

b)编码修饰的Crumbs同源物-1(CRB1)蛋白或修饰的Crumbs同源物-3(CRB3)蛋白的核苷酸序列，其中修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白包含蛋白C末端部分的修饰并且在体内测定中毒性较低或无毒，该测定包含步骤：

i)用含有编码修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列的重组腺相关病毒(rAAV)在Crb2条件敲除(cKO)或Crb1Crb2^F/+cKO小鼠的一只眼睛内进行玻璃体内转导；

ii)用包含编码野生型CRB2蛋白、野生型CRB1或野生型CRB3的核苷酸序列的rAAv在小鼠的另一只眼睛中进行玻璃体内转导作为对照；和

iii)在转导后一个月和三个月制作视网膜电流图，其中，与野生型CRB1或野生型CRB3转导的视网膜中的视网膜电流图相比，修饰的CRB1或修饰的CRB3转导的视网膜中视网膜电流图的最大a-波和/或b-波波幅百分比增加表明修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白毒性较低；或者，

其中视网膜电流图中的最大a-波和/或b-波波幅是修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的最大a-波和/或b-波波幅减去野生型CRB2的最大a-波和/或b-波波幅的差的至少60％，则表明修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白是无毒的。

2.根据权利要求1的基因治疗载体，其中药物用于治疗或预防归因于CRB1基因突变的视网膜病症。

3.根据权利要求2的基因治疗载体，其中视网膜病症是先天性利伯氏黑蒙或色素性视网膜炎，优选LCA8或RP12。

4.根据前述权利要求任一项的基因治疗载体，其中至少下述之一：

a)CRB2蛋白是真后生动物CRB2蛋白，优选人类、非人类灵长类动物、鼠、猫、犬、猪、绵羊、牛、马、epine、山羊或狼源的CRB2蛋白，更优选地，CRB2蛋白是人CRB2蛋白；

b)修饰的CRB1蛋白是修饰的真后生动物CRB1蛋白，优选人类、非人类灵长类动物、鼠、猫、犬、猪、绵羊、牛、马、epine、山羊或狼源的修饰的CRB1蛋白，更优选地，修饰的CRB1蛋白是修饰的人CRB1蛋白；和

c)修饰的CRB3蛋白是修饰的真后生动物CRB3蛋白，优选人类、非人类灵长类动物、鼠、猫、犬、猪、绵羊、牛、马、epine、山羊或狼源的修饰的CRB3蛋白，更优选地，修饰的CRB3蛋白是修饰的人CRB3蛋白。

5.根据前述权利要求任一项的基因治疗载体，其中基因治疗载体是重组的细小病毒载体或慢病毒载体，更优选地，其中载体是重组的腺相关病毒(rAAV)载体。

6.根据权利要求5的基因治疗载体，其中基因治疗载体是重组的腺相关病毒载体，其选自下述组成的组：重组的腺相关病毒血清型1(rAAV1)、重组的腺相关病毒血清型2(rAAV2)、重组的腺相关病毒血清型3(rAAV3)、重组的腺相关病毒血清型4(rAAV4)、重组的腺相关病毒血清型5(rAAV5)、重组的腺相关病毒血清型6(rAAV6)、重组的腺相关病毒血清型7(rAAV7)、重组的腺相关病毒血清型8(rAAV8)、重组的腺相关病毒血清型9(rAAV9)、血清型变体，例如其用于增强Müller神经胶质细胞的转导，例如rAAV6ShH10和ShH10Y，及其组合。

7.根据前述权利要求任一项的基因治疗载体，其中CRB2蛋白包含与SEQ ID NO：40-63和65-83任意之一，更优选地，SEQ ID NO：40-42任意之一的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成，并且其中，如通过视网膜电流图所测量的，CRB2蛋白具有功能活性。

8.根据前述权利要求任一项的基因治疗载体，其中编码CRB2、修饰的CRB1或修饰的CRB3的核苷酸序列与表达控制元件有效连接，所述表达控制元件包括分别产生CRB2、修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的充分表达以获得治疗效果的启动子，其中优选地，启动子选自下述组成的组：截短的CMV启动子、CMV启动子、截短的人RLBP1启动子、人感光细胞特异性视紫红质激酶启动子和人视杆细胞特异性视紫红质启动子，其中，优选地，启动子选自由下述组成的组：根据SEQ ID NO：121的CMV启动子，根据SEQ ID NO:122的截短的人RLBP1启动子，根据SEQ ID NO：123的人感光细胞特异性视紫红质激酶启动子，根据SEQ ID NO：124的人视杆细胞特异性视紫红质启动子和根据SEQ ID NO：133的截短的CMV启动子。

9.根据前述权利要求任一项的基因治疗载体，其中修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的氨基酸序列C末端部分中的修饰选自下述组成的组：

i)CRB1或CRB3的PDZ结合域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1282-1285所取代；

ii)CRB1或CRB3的FERM结合域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1251-1264所取代；

iii)CRB1或CRB3的跨膜域被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1225-1247所取代；

iv)CRB1或CRB3的16个C末端氨基酸残基被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1270-1285所取代或被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1270-1285的保守氨基酸取代所取代；

v)由CRB1或CRB3的FERM结合域、2个N末端氨基酸残基和5个C末端氨基酸残基组成的CRB1或CRB3的氨基酸序列被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1249-1269所取代或被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1249-1269的保守氨基酸取代所取代；

vi)由CRB1或CRB3的跨膜域、2个N末端氨基酸残基和1个C末端氨基酸残基组成的CRB1或CRB3的氨基酸序列被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1223-1248所取代或被SEQ ID NO：40的氨基酸残基1223-1248的保守氨基酸取代所取代；

vii)在对应于SEQ ID NO：40的位置1243、1254、1257、1258、1259、1261和/或1274的位置处包含丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸中任一种的CRB1或CRB3的氨基酸序列，其中，优选地，在位置1243、1254、1259、1261和1274处的氨基酸残基是丝氨酸，在位置1257和1258处的氨基酸残基分别是苏氨酸和酪氨酸；和

viii)一个或多个i)-vii)的组合。

10.一种核酸构建体，其包含至少下述之一：

a)编码Crmbs同源物-2(CRB2)蛋白的核苷酸序列和至少一个细小病毒反向末端重复(ITR)序列，其中，优选地，编码Crmbs同源物-2(CRB2)蛋白的核苷酸序列有效连接到包含能使CRB2蛋白充分表达以获得治疗效果的启动子的表达控制元件；和

b)编码Crumbs同源物-1(修饰的CRB1)蛋白或Crumbs同源物-3(修饰的CRB3)蛋白的核苷酸序列，和至少一个ITR序列，其中，优选地，编码修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列有效连接到包含能使修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白充分表达以获得治疗效果的启动子的表达控制元件，并且其中，修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白包含蛋白C末端部分的修饰且在体内测定中毒性较低或无毒，所述测定包含步骤：

i)在Crb2条件敲除(cKO)或Crb1Crb2^F/+cKO小鼠的一只眼睛中用重组腺相关病毒(rAAV)进行玻璃体内转导，所述rAAV包含编码修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的核苷酸序列；

ii)在该小鼠的另一只眼睛中用rAAV进行玻璃体内转导作为对照，其中所述rAAV包含编码野生型CRB2蛋白、野生型CRB1或野生型CRB3的核苷酸序列；和

iii)在转导后一个月和三个月制备视网膜电流图；

其中，与野生型CRB1或野生型CRB3转导的视网膜中的视网膜电流图相比，修饰的CRB1或修饰的CRB3转导的视网膜中视网膜电流图中最大a-波和/或b-波波幅的百分比增加表明，修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白毒性较低；或者，

其中视网膜电流图中的最大a-波和/或b-波波幅是用修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的最大a-波和/或b-波波幅减去野生型CRB2的最大a-波和/或b-波波幅的差的至少60％，则表明修饰的CRB1蛋白或修饰的CRB3蛋白是无毒的。

11.根据权利要求10的核酸构建体，其中修饰的CRB1或修饰的CRB3蛋白的氨基酸序列C末端部分中的修饰选自由下述组成的组：

viii)i)-vii)中的一个或多个的组合。

12.一种病毒体，其包含根据权利要求10或权利要求11的核酸构建体，其中，优选地，病毒体是AAV病毒体。

13.一种宿主细胞，其包含根据权利要求10或权利要求11的核酸构建体。

14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-9任一项的基因治疗载体、根据权利要求10或权利要求11的核酸构建体或根据权利要求12的病毒体以及药学上可接受的赋形剂。

15.一种试剂盒，其包含：

(a)根据权利要求1-9任一项的基因治疗载体，根据权利要求10或权利要求11的核酸构建体，根据权利要求12的病毒体，或根据权利要求14的药物组合物；以及，(b)任选地，使用根据(a)的基因治疗载体或药物组合物预防、治疗或缓解归因于CRB1基因突变的视网膜病症的一个或多个症状的说明书。