TW202003052A

TW202003052A - 用於治療黃斑部失養症之組成物及方法

Info

Publication number: TW202003052A
Application number: TW108112207A
Authority: TW
Inventors: 羅伯特馬克拉倫; 克里斯蒂那馬汀費南; 傑格瑞羅賓森
Original assignee: 英商牛津大學科技創新公司; 英商夜星Ｒｘ公司
Priority date: 2018-04-05
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2020-01-16
Also published as: JOP20200253A1; EA202092069A1; BR112020020204A2; PE20210918A1; MX2020010477A; AU2019247864A1; WO2019195727A1; KR20210005040A; PH12020551641A1; SG11202009759SA; EP3775233A1; JP2021520232A; CL2020002561A1; MA52199A; CO2020013690A2; CA3096088A1; IL277779A; US20230149566A1; CN113056561A; RU2020132890A

Abstract

本發明提供包含核酸序列之組成物，該序列包含(a)編碼卵黃狀(vitelliform)黃斑部失養症-2 (VMD2)啟動子之序列，及(b)編碼斑萎蛋白(Bestrophin)-1 (BEST1)蛋白質之序列，以及該等組成物用於治療個體的黃斑部失養症之用途，其包含經由次視網膜或脈絡膜上途徑對個體眼部投予組成物。

Description

用於治療黃斑部失養症之組成物及方法

本發明關於變性眼部疾病之分子生物學、神經生物學及基因療法治療的領域。 [相關申請案]

本申請案主張在2018年4月5日申請之臨時申請案USSN 62/653,131之權益，將其內容以其全文併入本文以供參考。 [序列表的併入]

將2019年4月4日創建且大小為72 KB的以“NIGH-011/002WO_SeqList.txt,”為名稱之正文檔案的內容特此以其全文併入以供參考。

黃斑部變性為醫學症狀，其可導致視野中央的視力模糊或無視覺。在黃斑部變性中，視網膜部分的感光受體被稱為黃斑，其負責中央視覺、變性或死亡。在一些病例中，黃斑部變性係由斑萎蛋白(Bestrophin)-1基因(BEST1，亦稱為VMD2)突變而引起。目前還沒有用於此破壞性疾病之治療。因此，本技術對治療黃斑部變性之其他治療方法有長期的需求。本發明提供用於黃斑部變性治療之組成物及方法。

本發明提供包含核酸序列之組成物，該核酸序列包含：(a)編碼卵黃狀(vitelliform)黃斑部失養症-2 (VMD2)啟動子之序列，及(b)編碼斑萎蛋白-1 (BEST1)蛋白之序列。在一些實施態樣中，編碼VMD2啟動子之序列編碼人類VMD2啟動子。在一些實施態樣中，編碼BEST1蛋白質之序列編碼人類BEST1蛋白質。在一些實施態樣中，編碼BEST1蛋白質之序列包含編碼序列。在一些實施態樣中，編碼BEST1蛋白質之序列包含cDNA序列。

本發明提供包含核酸序列之組成物，該核酸序列包含：(a)編碼遍存啟動子(ubiquitous promoter)之序列，及(b)編碼斑萎蛋白-1 (BEST1)蛋白之序列。在一些實施態樣中，編碼BEST1蛋白質之序列編碼人類BEST1蛋白質。在一些實施態樣中，編碼BEST1蛋白質之序列包含編碼序列。在一些實施態樣中，編碼BEST1蛋白質之序列包含cDNA序列。在一些實施態樣中，編碼遍存啟動子之序列包含編碼CAG啟動子之序列。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，核酸序列另外包含：(c)編碼轉錄後調節元件(PRE)之序列。在一些實施態樣中，編碼PRE之序列包含自天然生成序列單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼PRE之序列包含自非天然生成序列單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼PRE之序列包含自病毒序列單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼PRE之序列包含自土撥鼠肝炎病毒(WPRE)單離或衍生之序列。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，核酸序列另外包含：(d)編碼多腺苷酸化(polyA)訊號之序列。在一些實施態樣中，編碼polyA訊號之序列包含自天然生成序列單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼polyA訊號之序列包含自非天然生成序列單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼polyA訊號之序列包含自哺乳動物序列單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼polyA訊號之序列包含自人類序列單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼polyA訊號之序列包含自哺乳動物牛生長激素(BGH)基因單離或衍生之序列。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，核酸序列另外包含：(e)編碼5’非轉譯區(UTR)之序列。在一些實施態樣中，編碼5’UTR之序列包含自天然生成序列單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼5’UTR之序列包含自非天然生成序列單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼5’UTR之序列包含自哺乳動物序列單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼5’UTR之序列包含自人類序列單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼5’UTR之序列包含自病毒序列單離或衍生之序列。在本發明之組成物的一些實施態樣中，核酸序列另外包含：(f)編碼內含子之序列，及(g)編碼外顯子之序列，其中編碼內含子之序列及編碼外顯子之序列可操作地連結。在一些實施態樣中，內含子係位於編碼VMD2啟動子之序列與編碼外顯子之序列之間，其中編碼外顯子之序列係位於編碼內含子之序列及編碼5’UTR之序列之間，且其中編碼內含子之序列係以哺乳動物細胞剪接。在一些實施態樣中，編碼外顯子之序列包含自哺乳動物基因單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼外顯子之序列包含自兔子(穴兔(Oryctolagus cuniculus))β球蛋白基因單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼內含子之序列包含非天然生成序列。在一些實施態樣中，編碼內含子之序列包含融合序列。在一些實施態樣中，編碼內含子之序列包含編碼剪接供體位點之序列，及編碼剪接分支點和接受體位點之序列。在一些實施態樣中，編碼剪接供體位點之序列包含自脊椎動物基因單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼剪接供體位點之序列包含自雞(原雞(Gallus gallus))β肌動蛋白基因(CBA)單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼剪接分支點和接受體位點之序列包含自脊椎動物基因單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，編碼剪接分支點和接受體位點之序列包含自兔子(穴兔)β球蛋白基因單離或衍生之序列。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，編碼5’UTR之序列包含編碼Kozak序列或其部分之序列。在一些實施態樣中，編碼Kozak序列之序列與GCCRCCATGG之核酸序列具有至少50%之同一性。在一些實施態樣中，編碼Kozak序列之序列包含GGCACCATGA之核酸序列或由其所組成。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，編碼人類VMD2啟動子之序列包含下列者或由下列者所組成：

(SEQ ID NO：1)。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，編碼CAG啟動子之序列包含下列者或由下列者所組成：

(SEQ ID NO：2)。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，編碼人類BEST1蛋白質之序列包含下列者或由下列者所組成：

(SEQ ID NO：3)。

本發明提供包含本發明之組成物的載體。在一些實施態樣中，載體為質體。

本發明提供包含本發明之載體的遞送載體。在一些實施態樣中，遞送載體為病毒遞送載體。在一些實施態樣中，遞送載體包含單股病毒基因組。在一些實施態樣中，遞送載體包含雙股病毒基因組。在一些實施態樣中，遞送載體包含RNA分子。

本發明提供包含本發明之載體的遞送載體。在一些實施態樣中，遞送載體包含自腺相關病毒(AAV)載體單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，遞送載體包含自血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其任何組合的AAV載體單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，遞送載體包含自血清型AAV2之AAV載體單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，遞送載體包含自血清型AAV8之AAV載體單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，遞送載體包含編碼自血清型AAV2之AAV載體單離或衍生之第一反向終端重複(ITR)和第二ITR之序列及編碼自血清型AAV2之AAV載體單離或衍生之病毒基因之序列。在一些實施態樣中，遞送載體包含編碼自血清型AAV8之AAV載體單離或衍生之第一反向終端重複(ITR)和第二ITR之序列及編碼自血清型AAV8之AAV載體單離或衍生之病毒基因之序列。在一些實施態樣中，遞送載體包含編碼自血清型AAV2之AAV載體單離或衍生之第一反向終端重複(ITR)和第二ITR之序列及編碼自血清型AAV8之AAV載體單離或衍生之病毒基因之序列。

本發明提供包含本發明之組成物及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。在一些實施態樣中，醫藥上可接受之載劑包含TMN200。

本發明提供包含本發明之載體及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。在一些實施態樣中，醫藥上可接受之載劑包含TMN200。

本發明提供包含本發明之遞送載體及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。在一些實施態樣中，醫藥上可接受之載劑包含TMN200。

本發明提供包含本發明之組成物的細胞。本發明提供包含本發明之載體的細胞。本發明提供包含本發明之遞送載體的細胞。本發明提供包含本發明之醫藥組成物的細胞。在一些實施態樣中，細胞為哺乳動物細胞。在一些實施態樣中，哺乳動物細胞為非人靈長類動物細胞、囓齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞或兔子細胞。在一些實施態樣中，細胞為人類細胞。在一些實施態樣中，人類細胞為視網膜色素上皮(RPE)之神經元細胞、神經膠細胞、視網膜細胞、感光受體細胞、視桿細胞、視錐細胞或立方形細胞。在一些實施態樣中，人類細胞為感光受體細胞。在一些實施態樣中，人類細胞為HEK293細胞或ARPE19細胞。在一些實施態樣中，人類細胞係自人類視網膜之RPE單離或衍生。在一些實施態樣中，細胞係於活體內、試管內、活體外或原位。

本發明提供治療有其需要之個體的黃斑部失養症之方法，其包含對個體投予治療有效量的本發明之組成物。

本發明提供治療有其需要之個體的黃斑部失養症之方法，其包含對個體投予治療有效量的包含本發明之載體的組成物。

本發明提供治療有其需要之個體的黃斑部失養症之方法，其包含對個體投予治療有效量的包含本發明之遞送載體的組成物。

在本發明之方法的一些實施態樣中，個體為人類。在一些實施態樣中，個體為非人靈長類動物、狗、貓、囓齒動物、小鼠、大鼠或兔子。在一些實施態樣中，個體患有黃斑部失養症。

在本發明之方法的一些實施態樣中，個體在BEST1基因的一或兩複本(copy)中具有突變。在一些實施態樣中，突變係以顯性突變遺傳。在一些實施態樣中，顯性突變引起個體的貝斯特(Best)卵黃狀黃斑部失養症(BVMD)。在一些實施態樣中，突變係以隱性突變遺傳。在一些實施態樣中，隱性突變引起個體的體染色體隱性斑萎蛋白病(Bestrophinopathy)(ARB)。在一些實施態樣中，突變係發生在BEST1基因的一或兩複本之編碼序列中。在一些實施態樣中，突變係發生在BEST1基因的一或兩複本之非編碼序列中。在一些實施態樣中，突變包含在一或兩個BEST1基因複本中的取代、插入、缺失、倒置、移位、讀框轉移(frameshift)或彼之組合。

在本發明之方法的一些實施態樣中，投予包含經由次視網膜、脈絡膜上或玻璃體內途徑注射或輸注。在一些實施態樣中，投予包含經由次視網膜途徑注射或輸注。在一些實施態樣中，投予包含經由次視網膜途徑的兩步驟注射或兩步驟輸注。

在本發明之方法的一些實施態樣中，治療有效量經配製成介於10與200 µL之間的體積，納入端點。在一些實施態樣中，治療有效量經配製成介於10與50 µL之間、介於50與100 µL之間、介於100與150 µL之間或介於150與200 µL之間的體積，納入各範圍的端點。在一些實施態樣中，治療有效量經配製成介於70與120 µL之間的體積，納入端點，且其中投予包含經由次視網膜途徑注射或輸注。在一些實施態樣中，治療有效量經配製成100 µL之體積，且其中投予包含經由次視網膜途徑注射或輸注。

在本發明之方法的一些實施態樣中，治療有效量包含至少1×10¹⁰ DRP/mL、至少1×10¹¹ DRP/mL、至少1×10¹² DRP/mL、至少2×10¹² DRP/mL、至少5×10¹² DRP/mL或至少1.5×10¹³ DRP/mL之AAV遞送載體濃度。在一些實施態樣中，治療有效量包含至少2×10¹² DRP/mL、至少5×10¹² DRP/mL或至少1.5×10¹³ DRP/mL之AAV遞送載體濃度。在一些實施態樣中，治療有效量包含至少5×10¹² DRP/mL之AAV遞送載體濃度。在一些實施態樣中，治療有效量包含至少1.5×10¹³ DRP/mL之AAV遞送載體濃度。

在本發明之方法的一些實施態樣中，治療有效量包含2×10⁸ 個基因組粒子(gp)、5×10⁸ gp、1.5×10⁹ gp、2×10⁹ gp、5×10⁹ gp、2×10¹⁰ gp、5×10¹⁰ gp、6×10¹⁰ gp、1.2×10¹¹ gp、1.5×10¹¹ gp、2×10¹¹ gp、4.5×10¹¹ gp、5×10¹¹ gp、1.2×10¹² gp、1.5×10¹² gp、2×10¹² gp或5×10¹² gp之劑量。在一些實施態樣中，個體為小鼠，且其中治療有效量包含5×10⁸ gp、1.5×10⁹ gp或5×10⁹ gp之劑量。在一些實施態樣中，個體為非人靈長類動物，且其中治療有效量包含1.2×10¹¹ gp、4.5×10¹¹ gp或1.2×10¹² gp之AAV病毒粒子的劑量。在一些實施態樣中，個體為人類，且其中治療有效量包含5×10¹⁰ gp、1.5×10¹¹ gp、5×10¹¹ gp或1.5×10¹² gp之AAV病毒粒子的劑量。

在本發明之方法的一些實施態樣中，組成物另外包含TMN200緩衝劑。

本發明提供用於治療有其需要之個體的黃斑部失養症的本發明之組成物。

本發明提供用於治療有其需要之個體的黃斑部失養症的本發明之載體。

本發明提供用於治療有其需要之個體的黃斑部失養症的本發明之遞送載體。

本發明關於在許多病例中的黃斑部變性可由蛋白質斑萎蛋白-1 (BEST1，亦稱為VMD2)的突變及異常功能引起的發現。黃斑為視網膜中央附近的區域且負責中央高解析度色覺。位於黃斑中央附近的中央窩(fovea)含有在眼中最大濃度的視錐細胞感光受體。稱為斑萎蛋白-1 (BEST1或人類BEST1 (hBEST1)，亦稱為VMD2)的基因突變係與稱為貝斯特視網膜病(bestrinopathies)的至少五種不同的視網膜變性疾病相關聯。貝斯特視網膜病包含貝斯特卵黃狀黃斑部失養症(BVMD)、體染色體隱性斑萎蛋白病、成年發病型卵黃狀黃斑部失養症、體染色體顯性玻璃體視網膜病變和色素沉著性視網膜炎。該等突變可為顯性(例如BVMD)或隱性。貝斯特卵黃狀黃斑部失養症(BVMD)及體染色體隱性斑萎蛋白病可在兒童晚期或青春期引起發病的黃斑部變性。然而，在一些病例中，黃斑部變性始於成年期。然而，與發病年齡無關，貝斯特視網膜病可對視覺具有破壞性效應，且目前尚無已知的有效治療。鑒於BEST1功能在斑萎蛋白病中扮演關鍵角色，一種治療斑萎蛋白病之方法為遞送功能性BEST1蛋白質至受影響的患者細胞。斑萎蛋白-1 (BEST1)

斑萎蛋白-1 (BEST1)為主要在眼部的視網膜色素上皮(RPE)中發現的膜主體蛋白且主要定位於基底外側質膜。BEST1蛋白質被視為細胞內鈣傳訊之離子通道及調節劑起作用。人類BEST1可於NCBI數據庫中以登錄號NP_004174.1及NM_004183.3找到，將其內容以其全文併入本文以供參考。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，編碼本發明之BEST1蛋白質之序列包含與下列的序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之同一性的胺基酸序列或由彼等所組成：

(SEQ ID NO：4)。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，編碼本發明之BEST1蛋白質之序列包含下列的胺基酸序列或由彼等所組成：

(SEQ ID NO：4)。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，編碼本發明之BEST1蛋白質之核酸序列包含與下列的核酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之同一性的核酸或由彼等所組成：

(SEQ ID NO：3)。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，編碼本發明之BEST1蛋白質之核酸序列包含下列的核酸序列或由彼等所組成：

(SEQ ID NO：3)。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，編碼本發明之BEST1蛋白質之核酸序列包含經密碼子最適化之序列。在一些實施態樣中，序列已經密碼子最適化以表現於哺乳動物細胞中。在一些實施態樣中，序列已經密碼子最適化以表現於人類細胞中。 BEST1表現

在本發明之組成物的一些實施態樣中，編碼本發明之BEST1蛋白質之核酸序列另外包含編碼增強或增加BEST1轉錄子或BEST1蛋白質表現的調節元件之序列。增強或增加BEST1轉錄子或BEST1蛋白質表現的調節元件之實例包括但不限於啟動子、增強子、超級增強子、內含子、外顯子、內含子與外顯子之組合、編碼非轉譯區(例如5’非轉譯區(UTR)或3’ UTR)之序列、包含多腺苷酸化(polyA)訊號之序列及轉錄後調節元件(PRE)。

本發明之啟動子的實例包括但不限於那些能夠表現編碼BEST1蛋白質或哺乳動物細胞中的BEST1蛋白質之序列的啟動子。本發明之啟動子的實例包括但不限於那些能夠表現編碼BEST1蛋白質或人類細胞中的BEST1蛋白質之序列的啟動子。在一些實施態樣中，哺乳動物或人類細胞可於活體內、試管內、活體外或原位。在一些實施態樣中，啟動子可具有組成型活性。在一些實施態樣中，啟動子可具有細胞型特異性。在一些實施態樣中，啟動子可為可誘導的。

本發明之組成型活性啟動子的實例包括但不限於病毒啟動子。本發明之病毒啟動子可包括但不限於猿猴病毒40 (SV40)啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、泛素(ubiquitin) C (UBC)啟動子、延伸因子(elongation factor)-1α (EF1A)啟動子、磷酸甘油酯激酶1 (PGK)啟動子和CAG啟動子((C)巨細胞病毒(CMV)早期增強子元件、(A)包含雞β-肌動蛋白基因的第一外顯子和第一內含子之啟動子與(G)兔子β-球蛋白基因之剪接接受體的組合)。在一些實施態樣中，使用CMV啟動子控制編碼本發明之BEST1蛋白質之核酸序列的表現。在一些實施態樣中，使用CAG啟動子控制編碼本發明之BEST1蛋白質之核酸序列的表現。本發明之非病毒啟動子可包括但不限於雞β肌動蛋白(CBA)啟動子。在一些實施態樣中，CBA啟動子包含CBA基因之雞β肌動蛋白第一外顯子和內含子。在一些實施態樣中，啟動子包含雞β肌動蛋白啟動子及巨細胞病毒早期增強子元件。在一些實施態樣中，啟動子另外包含兔子β球蛋白剪接接受體序列(CAG啟動子)。在一些實施態樣中，CAG啟動子包含與下列的核酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之同一性的核酸序列或由彼等所組成：

(SEQ ID NO：2)。

本發明之細胞型特異性啟動子的實例包括但不限於能夠表現神經元中的核酸或蛋白質之啟動子、能夠表現視網膜細胞中的核酸或蛋白質之啟動子、能夠表現感光受體中的核酸或蛋白質之啟動子、能夠表現視桿細胞中的核酸或蛋白質之啟動子和能夠表現錐形細胞中的核酸或蛋白質之啟動子。在一些實施態樣中，編碼組織特異性啟動子之序列包含編碼人類VMD2基因(亦稱為斑萎蛋白-1)之序列。在一些實施態樣中，組織特異性啟動子包含人類VMD2啟動子(亦稱為斑萎蛋白-1)。在一些實施態樣中，人類VMD2啟動子包含與下列的核酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之同一性的核酸序列或由彼等所組成：

(SEQ ID NO：1)。

在一些實施態樣中，人類VMD2啟動子包含與下列的核酸序列具有100%之同一性的核酸序列或由彼等所組成：

(SEQ ID NO：1)。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，包含編碼BEST1蛋白質之序列及編碼啟動子之序列的核酸序列另外包含內含子和外顯子。內含子和外顯子的存在增加蛋白質表現水平。在一些實施態樣中，內含子係位於VMD2啟動子與外顯子之間。在一些實施態樣中，包括其中內含子係位於VMD2啟動子與外顯子之間那些實施態樣，外顯子係位於BEST編碼序列之5’。

外顯子可包含編碼序列、非編碼序列或二者之組合。在一些實施態樣中，外顯子包含非編碼序列。在一些實施態樣中，外顯子係自哺乳動物基因單離或衍生。在實施態樣中，哺乳動物為兔子(穴兔)。在一些實施態樣中，哺乳動物基因包含兔子β球蛋白基因。在一些實施態樣中，外顯子包含與下列的核酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之同一性的核酸序列：

(SEQ ID NO：6)。

在一些實施態樣中，外顯子包含與下列的核酸序列具有100%之同一性的核酸序列：

(SEQ ID NO：6)。

內含子可包含剪接供體位點、剪接受體位點或分支點。內含子可包含剪接供體位點、剪接接受體位點和分支點。剪接接受體位點的實例包含在內含子的5’端之核苷酸「GT」(在前mRNA中的「GT」)。剪接接受體位點的實例包含在內含子的3’端之「AG」。在一些實施態樣中，分支點包含在內含子的3’端上游之介於20與40個核苷酸之間(納入端點)的腺苷酸(A)。內含子可為人工或非天然生成序列。另一選擇地，內含子可自脊椎動物基因單離或衍生。內含子可包含編碼融合的兩個序列之序列，各序列可自複數種脊椎動物基因單離或衍生。在一些實施態樣中，促成內含子核酸序列之脊椎動物基因包含雞(原雞)基因。在一些實施態樣中，雞基因包含雞β肌動蛋白基因。在一些實施態樣中，促成內含子核酸序列之脊椎動物基因包含兔子(穴兔)基因。在一些實施態樣中，兔子基因包含兔子β球蛋白基因。在一些實施態樣中，內含子包含與下列的核酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之同一性的核酸序列：

(SEQ ID NO：7)。

在一些實施態樣中，內含子包含與下列的核酸序列具有100%之同一性的核酸序列：

(SEQ ID NO：7)。

Kozak序列為經核糖體辨識為轉譯起始位點之短序列基序。Kozak序列可位於轉譯起始位點的正上游或周圍。在脊椎動物中，Kozak共有序列包含與gccRccATGG之共有序列具有至少50%之同一性的序列，其中R表示A或G，且編碼起始甲硫胺酸之ATG係以粗體表示。本發明之Kozak序列的實例包含GGCACCATGA之序列。在一些實施態樣中，包含編碼BEST1之核酸序列的核酸另外包含編碼5’非轉譯序列(5’UTR)之序列。在一些實施態樣中，5’UTR包含Kozak序列。在一些實施態樣中，5’UTR包含一部分的Kozak序列。在一些實施態樣中，5’UTR包含至少50%、至少60%、至少70%或至少80%之Kozak序列。

在一些實施態樣中，包含編碼BEST1之核酸序列的核酸另外包含編碼轉錄反應元件(PRE)之核酸序列。PRE的實例包含土撥鼠PRE (WPRE)，其係自土撥鼠肝炎病毒衍生。在一些實施態樣中，編碼WPRE之序列係位於編碼BEST1之核酸序列的3’。在一些實施態樣中，編碼WPRE之序列係位於編碼BEST1之核酸序列與編碼polyA訊號之序列之間。在一些實施態樣中，編碼WPRE之序列包含與下列的核酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之同一性的核酸序列：

(SEQ ID NO：8)。

在一些實施態樣中，編碼WPRE之序列包含與下列的核酸序列具有100%之同一性的核酸序列：

(SEQ ID NO：8)。

在一些實施態樣中，包含編碼BEST1之核酸序列的核酸另外包含編碼多腺苷酸化(polyA)訊號之序列。polyA訊號加速核輸出、增強轉譯及增加mRNA穩定性。在一些實施態樣中，編碼polyA訊號之序列包含合成或人工序列。在一些實施態樣中，編碼polyA訊號之序列包含自哺乳動物基因單離或衍生之序列。在一些實施態樣中，哺乳動物基因為人類基因。在一些實施態樣中，哺乳動物基因為牛生長激素基因(BGH)。在一些實施態樣中，編碼polyA訊號之序列包含與下列的核酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%之同一性的核酸序列：

(SEQ ID NO：9)。

在一些實施態樣中，編碼polyA訊號之序列包含與下列的核酸序列具有100%之同一性的核酸序列：

(SEQ ID NO：9)。 AAV載體

載體可包含核酸，其包含編碼BEST1之核酸序列。在本發明之組成物的一些實施態樣中，載體可為病毒遞送載體。本發明之病毒遞送載體可含有包裝本發明之核酸序列至病毒遞送系統中以遞送靶細胞或組織所必要的序列。本發明之典型的病毒遞送載體包括但不限於慢病毒、反轉錄病毒或腺相關病毒(AAV)載體。

本發明之AAV病毒遞送系統可呈成熟的AAV粒子或病毒粒子的形式，亦即以AAV蛋白殼體圍繞之核酸。在一些實施態樣中，AAV病毒遞送載體可包含AAV基因組或其衍生物。

AAV基因組為核酸序列，其編碼用於產生AAV粒子所必需之功能。該等功能包括那些在宿主細胞中操作AAV複製及包裝循環的功能，包括包封AAV基因組至AAV粒子中。天然生成之AAV具有複製缺陷且依賴於分子間(in trans)提供的輔助功能以完成複製及包裝循環。在較佳的實施態樣中，本發明之載體的AAV基因組具有複製缺陷。

AAV基因組可呈正義或反義單股形式，或另一選擇地呈雙股形式。使用雙股形式容許繞過在靶細胞中的DNA複製步驟且如此可加速轉基因表現。本發明之載體的AAV基因組可為單股形式。

AAV基因組可來自AAV的任何天然生成之血清型、單離物或進化體(clade)。因此，AAV基因組可為天然生成之AAV的全基因組。如熟習本技術領域者已知，天然生成之AAV可根據各種生物學系統分類。

AAV係依據其血清型提及。血清型係相應於AAV之變體亞種，AAV係由於其殼體表面抗原之表現輪廓而具有獨特的反應性，可用於區分其與其他的變體亞種。具有特定的AAV血清型之病毒不與對任何其他的AAV血清型具有特異性的中和抗體有效地交叉反應。AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11，以及重組血清型，諸如最近自靈長類動物腦部鑑定之Rec2和Rec3。該等AAV血清型中之任一者可用於本發明。因此，在一些實施態樣中，本發明之AAV載體可自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rec2或Rec3 AAV衍生。

AAV血清型之綜述可見於Choi等人之(2005) Cur. Gene There. 5：299-310及Wu等人(2006)之Molecular Therapy 14：316-27中。AAV基因組之序列或AAV基因組元件之序列(包括ITR序列、rep或cap基因)可自AAV全基因組序列之下列登錄號衍生：腺相關病毒1 NC_002077、AF063497；腺相關病毒2 NC_001401；腺相關病毒3 NC_001729；腺相關病毒3B NC_001863；腺相關病毒4 NC_001829；腺相關病毒5 Y18065、AF085716；腺相關病毒6 NC_001862；鳥類AAV ATCC VR-865 AY186198、AY629583、NC_004828；鳥類AAV菌株DA-1 NC_006263、AY629583；牛AAV NC_005889、AY388617。

AAV亦可依據進化體或克隆(clone)提及。這係指天然衍生之AAV的親緣關係，以及可追溯至共同祖先的AAV之親緣關係，且包括其所有的後代。另外，AAV可依據特定的單離物提及，亦即在自然界中發現之特定的AAV之遺傳單離物。術語遺傳單離物說明與其他天然生成之AAV經歷有限的遺傳混合之AAV群體，從而以遺傳水平定義可識別的不同群體。

AAV血清型確定AAV病毒感染(或趨性)之組織特異性。據此，在依照本發明投予患者之AAV中使用之較佳的AAV血清型為那些對眼內靶細胞之感染具有天然趨性或高效力的AAV血清型。在一個實施態樣中，在本發明使用之AAV血清型為那些感染神經感覺視網膜細胞、視網膜色素上皮細胞及/或黃斑細胞的AAV血清型。

AAV的天然衍生之血清型、單離物或進化體的AAV基因組包含至少一個反向終端重複序列(ITR)。ITR序列係於分子內(in cis)見效以提供複製之功能性起點且容許整合及切除來自細胞基因組之載體。

AAV病毒遞送載體可包括至少一個反向終端重複序列(ITR)，較佳為超過一個ITR，諸如二或更多個ITR。ITR中之一或多者可自具有不同的血清型之AAV基因組衍生，或可為嵌合或突變ITR。較佳的突變ITR為具有trs (終端解析位點)缺失的ITR。此缺失容許基因組連續複製以產生含有編碼及互補序列二者之單股基因組，亦即自身互補的AAV基因組。這容許繞過在靶細胞中的DNA複製，且如此能夠加速轉基因表現。

以包括一或多個ITR較佳，其有助於宿主細胞的細胞核中形成本發明之病毒遞送載體的多聯體(concatamer)，例如在藉由宿主細胞DNA聚合酶之作用而使單股載體DNA轉換為雙股DNA後。此等游離型(episomal)多聯體的形成在宿主細胞壽命期間保護載體構築體，從而容許延長活體內之轉基因表現。

在一些實施態樣中，ITR元件為病毒遞送載體中自原始AAV基因組保留的唯一序列。因此，在一些實施態樣中，病毒遞送載體不包括原始基因組之rep或cap基因，而且缺少原始基因組之任何其他序列。出於上述理由及亦為了降低載體整合至宿主細胞基因組的可能性，這為較佳的。另外，減小AAV基因組的大小容許增加除了轉基因以外的其他序列元件(諸如調節元件)併入載體內的靈活性。在一些實施態樣中，本發明之病毒遞送載體包含編碼AAV2 ITR之序列。在一些實施態樣中，編碼兩個AAV2 ITR之序列可包含下列的核酸序列或由彼等所組成：

(SEQ ID NO：10)。及/或

(SEQ ID NO：11)。

AAV基因組可包含約4.7 kb長度之核酸序列。因此，在那些其中欲以AAV病毒載體遞送之核酸序列少於4.7 kb長度的實施態樣中，可使用填充(stuffer)或填充(filler)序列。在一些實施態樣中，填充序列的存在有助於AAV病毒載體包裝至病毒粒子中。在一些實施態樣中，填充序列包含隨機序列。本發明之填充序列的實例可包含下列的核酸序列或由彼等所組成：

(SEQ ID NO：12)。

在一些實施態樣中，AAV病毒遞送載體包含核酸序列，其包含編碼VMD2啟動子之序列、編碼BEST1蛋白質之序列及編碼WPRE之序列。包含此核酸序列(VMD2.BEST1.WPRE.pA)的本發明之AAV病毒遞送載體的實例包含下列的核酸序列或由彼等所組成：

(SEQ ID NO：13)。

表1. VMD2.BEST1.WPRE.pA質體序列的特徵

在一些實施態樣中，AAV病毒遞送載體包含核酸序列，其包含編碼VMD2啟動子之序列、編碼BEST1蛋白質之序列、編碼內含子之序列、編碼外顯子之序列及編碼WPRE之序列。本發明之AAV病毒遞送載體的實例包含編碼VMD2.IntEx.BEST1.WPRE.pA序列之核酸序列，其包含下列的核酸序列或由彼等所組成：

(SEQ ID：14)。

表2. VMD2.IntEx.BEST1.WPRE.pA質體序列的特徵

在一些實施態樣中，AAV病毒遞送載體包含核酸序列，其包含編碼CAG啟動子之序列、編碼BEST1蛋白質之序列及編碼WPRE之序列。本發明之AAV病毒遞送載體的實例包含編碼CAG.BEST1.WPRE.pA序列之核酸序列，其包含下列的核酸序列或由彼等所組成：

(SEQ ID NO：15)。

表3. CAG.BEST1.WPRE.PA質體序列的特徵

在本發明之組成物的一些實施態樣中，載體可包含編碼標記之序列，當細胞係於試管內或活體內時，其可表現在細胞中。例如，在本發明之載體或核酸序列中，編碼標記之序列可用於代替或可取代編碼本發明之BEST1蛋白質之序列(例如包含BEST1基因之編碼序列的序列)。本發明之標記的實例包括但不限於螢光團蛋白質(諸如GFP、YFP或dsRED)以及各種表位標籤(諸如FLAG、HA、His或Myc)。螢光團或表位標籤可融合至BEST1編碼序列，例如成為N或C端融合，或可用於代替BEST1，使本發明之載體特徵化。含有本發明之標記的載體之用途的實例包括但不限於使基因表現(例如表現水平)特徵化或使本發明之載體的細胞類型特異性特徵化。

包含標記的本發明之載體的實例包括VMD2.GFP.WPRE.pA。編碼VMD2.GFP.WPRE.pA構築體之核酸序列包含下列者或由下列者所組成：

(SEQ ID NO：16)。

表4. VMD2.GFP.WPRE.pA質體序列的特徵

包含標記的本發明之載體的實例包括VMD.IntEx.GFP.WPRE.pA。編碼VMD.IntEx.GFP.WPRE. pA構築體之核酸序列包含下列者或由下列者所組成：

(SEQ ID NO：17)。

表5. VMD2.IntEx.GFP.WPRE.pA質體序列的特徵

AAV 粒子

本發明之AAV載體含有以投予患者為目的而衍生之AAV基因組。此種衍生係以本技術的標準進行，且本發明包含使用任何已知的AAV基因組衍生物及藉由應用本技術中已知的技術可產生之衍生物。AAV基因組及AAV殼體之衍生綜述於Coura和Nardi (2007)之Virology Journal 4：99及上文參考之Choi等人和Wu等人之文獻中。

AAV基因組之衍生物包括AAV基因組之任何截斷或修飾形式，其容許於活體內表現來自本發明之載體的轉基因。有可能相當程度地截斷AAV基因組以包括最小的病毒序列但仍保留上述功能。出於安全的理由，較佳的是降低載體與野生型病毒重組的風險且亦避免以靶細胞中存在的病毒基因蛋白質觸發細胞免疫反應。

因此，可自本發明之衍生物移除下列部分：一個反向終端重複(ITR)序列、複製(rep)和殼體(cap)基因。然而，在一些實施態樣中，衍生物可另外包括一或多個rep及/或cap基因或AAV基因組的其他病毒序列。天然生成之AAV係以高頻率整合在人類19號染色體的特定位點上，且顯示可忽略的隨機整合頻率，使得在治療環境中可忍受保留在載體中的整合能力。

AAV基因組包含包裝基因，諸如rep及/或cap基因，其編碼AAV粒子之包裝功能。rep基因編碼蛋白質Rep78、Rep68、Rep52和Rep40或其變體中之一或多者。cap基因編碼一或多種殼體蛋白質，諸如VP1、VP2和VP3或其變體。該等蛋白質構成AAV粒子之殼體。

在衍生物包含殼體蛋白質(亦即VP1、VP2及/或VP3)的情況下，衍生物可為一或多種天然生成之AAV的嵌合、經改組或經殼體修飾之衍生物。本發明特別地包含提供來自不同的AAV血清型、進化體、克隆或單離物之殼體蛋白質序列於相同的載體內(亦即假型化(pseudotyped)載體)。

選擇嵌合、經改組或經殼體修飾之衍生物以提供病毒載體一或多種所欲功能。因此，與包含天然生成之AAV基因組(諸如AAV2)之AAV載體相比，該等衍生物可展示增加的基因遞送效力、降低的免疫原性(體液或細胞)、改變的趨性範圍及/或改進的特定細胞類型之靶向。增加的基因遞送效力可藉由細胞表面上改進的受體或共受體結合、改進的內化、改進的細胞內和細胞核中的運送、改進的病毒粒子去殼化及改進的單股基因組轉換成雙股形式而實現。增加的效力亦可與改變的趨性範圍或靶向特定的細胞群體有關，使得載體劑量不因投予不需要其之組織而稀釋。

嵌合殼體蛋白質包括那些藉由天然生成之AAV血清型的二或更多種殼體編碼序列之間的重組而產生的該等蛋白質。這可例如藉由標記救援方法執行，其中使一種血清型的非感染性殼體序列與不同的血清型之殼體序列共轉染，且使用定向選擇來選擇具有所欲性質的殼體序列。不同的血清型之殼體序列可藉由細胞內的同源重組以產生新穎的嵌合殼體蛋白質而改變。

嵌合殼體蛋白質亦包括那些藉由使殼體蛋白質序列工程化而在二或更多種殼體蛋白質之間(例如在不同的血清型之二或更多種殼體蛋白質之間)轉移特定的殼體蛋白質結構域、表面環路或特定的胺基酸殘基所產生的該等蛋白質。

經改組或嵌合殼體蛋白質亦可藉由DNA改組或藉由易錯PCR而產生。雜合體AAV殼體基因可藉由隨機地片段化相關的AAV基因之序列(例如那些編碼多種不同的血清型之殼體蛋白質之序列)及接著隨後在自引發聚合酶反應中重組片段(其亦可引起序列同源性區域的交換)而創造。可篩選藉由改組許多血清型之殼體基因的此方式創造之雜合體AAV基因庫以鑑定具有所欲功能之病毒克隆。同樣地，易錯PCR可用於隨機地突變AAV殼體基因以創造多樣化的變體庫，接著可針對所欲性質而進行選擇。

殼體基因之序列亦可進行遺傳修飾以引入相對於原始野生型序列的特定缺失、取代或插入。殼體基因特別地可藉由將無關的蛋白質或肽之序列插入殼體編碼序列之開放閱讀框內或殼體編碼序列之N端及/或C端上而修飾。無關的蛋白質或肽最好可為一種作為特定的細胞類型之配體見效的蛋白質或肽，從而賦予改進的靶細胞結合或改進載體靶向特定的細胞群體之特異性。無關的蛋白質亦可為一種協助病毒粒子純化(作為生產方法的一部分)之蛋白質，亦即表位或親和性標籤。選擇插入位點以便於不干擾病毒粒子的其他功能，例如內化、運送病毒粒子。熟習的技術人員可基於彼等的一般常識來鑑定適合於插入的位點。特別的位點係揭示於上文參考的Choi等人之文獻。

本發明另外包含提供與原始AAV基因組不同的順序及構型之AAV基因組序列。本發明亦包含以來自另一病毒之序列或以來自一種以上的病毒之序列所組成之嵌合基因取代一或多種AAV序列或基因。此等嵌合基因可由來自不同的病毒種類之二或更多種相關病毒蛋白質之序列所組成。

本發明之AAV載體包括轉殼化(transcapsidated)形式，其中將具有一種血清型之ITR的AAV基因組或衍生物包裝在不同的血清型之殼體中。本發明之AAV載體亦包括鑲嵌形式，其中來自二或更多種不同的血清型之未經修飾之殼體蛋白質的混合物構成病毒殼體。AAV載體亦可包括攜有經吸附至殼體表面之配體的化學修飾形式。例如，此等配體可包括用於靶向特定的細胞表面受體之抗體。

因此，例如本發明之AAV載體包括那些具有AAV2基因組與AAV2殼體蛋白質之載體(AAV2/2)、那些具有AAV2基因組與AAV5殼體蛋白質之載體(AAV2/5)及那些具有AAV2基因組與AAV8殼體蛋白質之載體(AAV2/8)。本發明之AAV載體可包含突變AAV殼體蛋白質。在一個實施態樣中，本發明之AAV載體包含突變AAV8殼體蛋白質。突變AAV8殼體蛋白質較佳為AAV8 Y733F殼體蛋白質。

製造本發明之AAV病毒粒子之方法為熟習本技術領域者已知。製造本發明之AAV病毒粒子的實例但非限制性方法說明於下。需要三種質體來產生給出之AAV載體：一種包含編碼欲遞送之關注的核酸序列之病毒遞送載體(亦即編碼BEST1之核酸序列)的質體、編碼rep和cap基因之質體及含有成功產生AAV必要的所需之腺病毒基因的第三種輔助質體。啟動子可操作地連結每一包裝基因。此等啟動子的特定實例包括p5、p19和p40啟動子(Laughlin等人(1979)之Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76：5567-5571)。例如，p5及p19啟動子通常用於表現rep基因，而p40啟動子通常用於表現cap基因。質體係用轉染能夠複製AAV病毒載體、轉錄且轉譯AAV蛋白質及包裝AAV病毒載體至AAV病毒粒子中之適合的細胞。適合的細胞之實例包含HEK293細胞。在轉染後收集細胞且溶解。接著AAV粒子可通過各種方法而自溶解物純化。另一選擇地，AAV粒子可自上清液純化。例如，在施予由15%、25%、40%和60%之相所組成的碘克沙醇(iodixanol)梯度前，可將溶解物以班佐酶(Benzonase)處理且淨化。梯度可在59,000 rpm下旋轉1小時30分鐘且接著取出40%之餾分。接著可將此AAV相使用Amicon Ultra-15 100K過濾單元純化且濃縮。醫藥組成物

本發明之AAV載體可配製成醫藥組成物。除了藥劑以外，該等組成物可包含醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、緩衝劑、穩定劑或本技術中熟知的其他材料。此等材料應為無毒性且不應該干擾活性成分之效力。載劑或其他材料之確切性質可根據投予途徑(例如經次視網膜、直接視網膜或玻璃體內注射)而由熟習的技術人員決定。

醫藥組成物可經配製成液體。液體醫藥組成物可包括液體載劑，諸如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。可包括生理食鹽水溶液、氯化鎂、右旋糖或其他的醣溶液或甘油，諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。在一些例子中，可使用界面活性劑，諸如0.001%之普洛尼克酸(pluronic acid)(PF68)。

用於注射痛苦部位之活性成分可呈水性溶液的形式，其為無熱原且具有適合的pH、等滲壓性及穩定性。熟習的技術人員完全能夠使用例如等滲壓媒劑製備適合的溶液，諸如氯化鈉注射液、林格氏(Ringer's)注射液或乳酸化林格氏注射液。可依需要包括保存劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他的添加劑。

緩衝劑可對本發明之病毒載體及載體粒子在儲存及通過用於AAV基因療法之注射裝置後的穩定性及生物相容性具有影響。在一些實施態樣中，本發明之病毒載體及載體粒子可在TMN 200緩衝劑中稀釋以維持生物相容性及穩定性。TMN 200緩衝劑包含20 mM Tris (調整至8.0之pH)、1 mM MgCl₂ 及200 mM NaCl。

物理病毒基因組效價(titer)之測定包含病毒載體或病毒粒子特徵化的一部分。在一些實施態樣中，物理病毒基因組效價之測定包含確保病毒載體及病毒粒子在基因療法期間之效力及安全性的步驟。在一些實施態樣中，測定AAV效價之方法包含定量性PCR (qPCR)。有可影響結果的不同變量，諸如用作為標準物的DNA構型或在樣本製備期間的酵素消化。可測得其效價之病毒載體或粒子製劑可與使用質體所產生之標準稀釋曲線進行比較。在一些實施態樣中，在標準曲線中所使用之質體DNA係呈超螺旋化構型。在一些實施態樣中，在標準曲線中所使用之質體DNA係呈線性構型。線性化質體可例如藉由以HindIII限制酵素消化來製備，藉由瓊脂糖凝膠電泳顯現，且使用QIAquick凝膠提取套組(Gel Extraction Kit)(Qiagen)依照製造商的指示來純化。在用於產生標準曲線之質體內切割的其他限制酵素亦可為適合的。在一些實施態樣中，與使用線性化質體相比，使用超螺旋化質體作為標準物使AAV載體之效價增加。

為了自純化之AAV載體提取DNA以定量AAV基因組效價，可使用兩種酵素方法。在一些實施態樣中，AAV載體可以DNase I進行單獨消化。在一些實施態樣中，AAV載體可以DNase I及額外的蛋白酶K處理而進行雙重消化。接著可以CFX Connect即時PCR檢測系統(BioRad)使用對轉基因序列具有特異性的引物及Taqman探針執行QPCR。

用於延遲釋放之藥劑可包括在藥物組成物中，其係根據本技術中已知的方法配製而用於緩慢釋放，諸如在自生物相容性聚合物形成之微膠囊中或在脂質體載劑系統中。劑量

如本文所使用之術語「Dnase抗性粒子(DRP)」係指抵抗Dnase消化之AAV 粒子且因此被視為完全包封及保護本發明之AAV載體免於Dnase消化。AAV粒子亦可依據所投予之基因組粒子(gp)總數量而以劑量或gp/mL (每毫升(mL)溶液計的基因組粒子數量)來定量。如本文所使用之基因組粒子(gp)係指含有本發明之AAV遞送載體(或AAV基因組)的複本之AAV 粒子。如本文所使用之術語以每mL計的基因組含量(GC)係指以每mL溶液計的病毒基因組數量，且可以例如上文所述之qPCR測定。術語GC及VG (病毒基因組)可以同義詞性質使用，使本發明之AAV劑量及濃度特徵化。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體係以單一劑量投予個體。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體可經配製成液體懸浮液，其中將AAV載體懸浮在醫藥上可接受之載劑中。在一些實施態樣中，本發明之組成物可包含以每mL計1-2×10⁹ 、1-2×10¹⁰ 、1-2×10¹¹ 、1-2×10¹² 或1-2×10¹³ 個基因組粒子(gp)之濃度的複數種AAV載體。在一些實施態樣中，本發明之組成物可包含5×10¹¹ DRP/mL、1.5×10¹² DRP/ mL、5×10¹² DRP/ mL、1.2×10¹² DRP/mL、4.5×10¹² DRP/mL、1.2×10¹³ DRP/mL、1.5×10¹³ DRP/mL或5×10¹³ DRP/1.2×10¹² DRP/mL之濃度的複數種AAV載體。在一些實施態樣中，本發明之組成物可包含以每mL計5×10¹² DRP之濃度的複數種AAV載體。在一些實施態樣中，本發明之組成物可包含以每mL計1.5×10¹³ DRP之濃度的複數種AAV載體。因此，為了投予約2×10¹⁰ gp之AAV載體劑量，例如具有以每mL計2×10¹² gp之濃度的約10毫升醫藥組成物之單一注射液於活體內達成所欲劑量。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體可包含介於1與500 µl之間的體積，納入端點。在本發明之組成物的一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體可包含介於10與500、50與500、100與500、200與500、300與500、400與500、50與250、100與250、200與 250、50與150、1與100或1與10 μl之間的體積，納入各範圍的端點。在本發明之組成物的一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體可包含1、2、5、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 μl或兩者之間任何的毫升數量之體積。在一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體可包含100 μl。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，可將包含AAV載體之組成物或AAV載體的總體積以單一注射液注射。在一些實施態樣中，可將包含AAV載體之組成物或AAV載體的一部分體積以單一注射液注射。在一些實施態樣中，可將包含AAV載體之組成物或AAV載體的第一部分體積以第一次單一注射液注射及可將包含AAV載體之組成物或AAV載體的第二部分體積以第二次單一注射液注射。

在本發明之組成物的一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體係以每一眼計至少2×10⁷ 、2×10⁸ 、5×10⁸ 、1.5×10⁹ 、2×10⁹ 、5×10⁹ 、2×10¹⁰ 、5×10¹⁰ 、6×10¹⁰ 、1.2×10¹¹ 、2×10¹¹ 、4.5×10¹¹ 、5×10¹¹ 、1.2×10¹² 、1.5×10¹² 、2×10¹² 或5×10¹² gp之劑量投予。在一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體係以每一眼計約5×10¹⁰ 、1.5×10¹¹ 、5×10¹¹ 或1.5×10¹¹ gp之劑量投予。在一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體係以每一眼計約5×10¹¹ DRP之劑量經次視網膜注射而投予。在一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體係以每一眼計約2×10¹⁰ gp之劑量經次視網膜注射而投予。在一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體係以每一眼計約5×10¹⁰ gp之劑量經次視網膜注射而投予。在一些實施態樣中，AAV載體係以每一眼計約6×10¹⁰ gp之劑量經次視網膜注射而投予。在一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體係以每一眼計約1.5×10¹¹ gp之劑量經次視網膜注射而投予。在一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體係以每一眼計約2×10¹¹ gp之劑量經次視網膜注射而投予。在一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體係以每一眼計約5×10¹¹ gp之劑量經次視網膜注射而投予。在一些實施態樣中，包含AAV載體之組成物或AAV載體係以每一眼計約1.5×10¹² gp之劑量經次視網膜注射而投予。

劑量或體積可基於玻璃體體積的物種之間的異速生長比例為基礎來計算。如本文所使用之「異速生長」係指生物體相對於體型的變化。當比較物種時考慮的一些因素包括體積、表面積、代謝率和獨特的解剖學、生理學或生物化學過程。人類等效劑量可相對於體表面積、體重或表面積與體重之組合標準化。亦可能考慮其他的因素。遞送

本發明之病毒載體可藉由次視網膜、直接視網膜、脈絡膜上或玻璃體內注射而投予個體眼部。熟習的技術人員熟悉且完全能夠進行單獨的次視網膜、直接視網膜或玻璃體內注射。

次視網膜注射係注射至次視網膜腔，亦即在神經感覺視網膜下面。在次視網膜注射期間，經注射之材料被引導至感光受體細胞與視網膜色素上皮(RPE)層之間且在其間創造腔。當注射係通過小視網膜切開術進行時，可能產生視網膜剝離。由經注射之材料產生的視網膜經剝離之隆起層被稱為「小泡(bleb)」。由次視網膜注射所創造的孔必須足夠小，使得經注射之溶液在投予後不顯著地回流至玻璃體腔中。當注射藥劑時，此種回流會有特別的問題，因為藥劑的作用會被引導而遠離靶區域。注射較佳地在神經感覺視網膜中創造自密封進入點，亦即一旦移除注射針，則由針創造的孔重新密封，使得非常少或實質上沒有經注射之材料通過孔釋放。

為了促成該過程，專業的次視網膜注射針係於市場上取得(例如DORC 41G Teflon次視網膜注射針，Dutch Ophthalmic Research Center International BV, Zuidland, The Netherlands)。該等針經設計以進行次視網膜注射。

另一選擇地，次視網膜注射可藉由使用手術用顯微鏡(Leica Microsystems，Germany)在直接視覺導引下遞送包含AAV粒子之組合物來進行。一種實例方法為使用鞏膜隧道方法，其係以Hamilton注射器及34號針(ESS labs，UK)通過後極至視網膜上方。另一選擇地，在使用WPI注射器及斜角式35G針系統(World Precision Instruments，UK)進行次視網膜注射前，可使用前房穿刺術以33G針進行次視網膜注射。另外的替代法為WPI Nanofil注射器(WPI，零件號NANOFIL)及34規(gauge)WBI Nanofil針(WPI，零件號NF34BL-2)。

本發明之載體或組成物可經由脈絡膜上注射投予。設想以任何脈絡膜上注射之設施作為本發明之載體或組成物的潛在遞送系統。脈絡膜上注射係注射至脈絡膜上腔，其為介於脈絡膜與鞏膜之間的腔。注射至脈絡膜上腔中因此為遞送組成物至鄰近的眼部結構(諸如視網膜、視網膜色素上皮(RPE)或黃斑)之潛在投予途徑。在一些實施態樣中，注射至脈絡膜上腔中係使用微針、微鈍針或微導管在眼球前部位進行。眼球前部位可包含眼球前區至眼球中緯線或由其組成。載體組成物或AAV病毒粒子可經由脈絡膜上途徑自注射位點向後擴散。在一些實施態樣中，使用導管直接注射至後眼球之脈絡膜上腔中。在此實施態樣中，脈絡膜上腔可經由睫狀體扁平部中的切口插入導管。在一些實施態樣中，經由脈絡膜上途徑注射或輸注橫貫脈絡膜、布魯赫氏膜(Bruch’s membrane)及/或RPE層以遞送本發明之載體或組成物至次視網膜腔。在包括那些其中本發明之載體或組成物係經由脈絡膜上途徑遞送至次視網膜腔的一些實施態樣中，使一或多次注射進入鞏膜、睫狀體扁平部、脈絡膜、布魯赫氏膜及RPE層中之至少一者中。在包括那些其中本發明之載體或組成物係經由脈絡膜上途徑遞送至次視網膜腔的一些實施態樣中，使用兩步驟程序，在遞送本發明之載體或組成物前在脈絡膜上腔或次視網膜腔中創造小泡。

在那些其中注射小鼠的實施態樣中，可將動物以含有克他命(ketamine)(40至80 mg/kg)及甲苯噻嗪(xylazine)(1至10 mg/kg)之腹膜內注射液麻醉且將瞳孔以托吡卡胺(tropicamide)眼滴劑(美多替滿(Mydriaticum) 1%，Bausch & Lomb，UK)及脫羥腎上腺素(phenylephrine)眼滴劑(脫羥腎上腺素鹽酸鹽2.5%，Bausch & Lomb，UK)充分擴張。亦可在次視網膜注射前施予丙美卡因(Proxymetacaine)眼滴劑(丙美卡因鹽酸鹽0.5%，Bausch & Lomb，UK)。在注射後，可施予氯黴素(chloramphenicol)眼滴劑(氯黴素0.5%，Bausch＆Lomb，UK)且以所施予之阿替美唑(atipamezole)(2 mg/kg)和卡波姆(carbomer)凝膠(Viscotears，Novartis，UK)逆轉麻醉，以防止白內障形成。

除非在注射期間發生視網膜損傷，且只要使用足夠小的針，實質上所有經注射之材料經定位保持在剝離之神經感覺視網膜與定位化視網膜剝離位點上的RPE之間(亦即不回流至玻璃體腔中)。實際上，在短時段內典型的小泡持久性表示經注射之材料通常很少逃逸至玻璃體中。當經注射之材料被吸收時，小泡可以更長的時段消散。

可在手術前進行眼部(特別為視網膜)的可視化，例如使用光學同調斷層掃描術。

本發明之AAV載體可使用其中以第一溶液之次視網膜注射創造定位化視網膜剝離的兩步驟方法遞送，具有增加的精確性及安全性。第一溶液不包含載體。接著使用第二次視網膜注射以遞送包含載體之藥劑至以第一次視網膜注射所創造之小泡的次視網膜流體中。因為遞送藥劑之注射不用於剝離視網膜，所以可以此第二步驟注射特定體積的溶液。本發明之AAV載體可藉由下列方式遞送：(a)經次視網膜注射對個體投予溶液，其量有效使視網膜至少部分剝離以形成次視網膜小泡，其中溶液不包含載體；及(b)經次視網膜注射投予藥劑組成物至以步驟(a)所形成之小泡中，其中藥劑包含載體。實施例實施例1：在HEK293細胞中使用CAG啟動子的斑萎蛋白-1蛋白質

將HEK293細胞以含有以WPRE (AAV2/2 CAG.BEST1.WPRE.pA，圖3)及不以WPRE (AAV2/2 CAG.BEST1.pA)驅動BEST1表現之CAG啟動子的AAV2/2載體轉導，且檢查斑萎蛋白-1蛋白質的表現及定位。在圖6中，將轉導之HEK293細胞以Hoechst及抗人類斑萎蛋白-1 (hBEST1或huBEST1)抗體染色。當與未轉導之對照細胞相比時，在整個細胞溶質中發現斑萎蛋白-1蛋白質。

在HEK293細胞中的斑萎蛋白-1表現係自西方墨點法定量(圖7)。在圖7A中，樣本1為AAV2/2 CAG.hBEST1.pA載體；樣本2為AAV2/2 CAG.hBEST1.WPRE.pA載體；及樣本3為陰性對照物。經質體轉染之HEK293細胞被用作為陰性對照物。在圖7B中，定量顯示AAV2/2 CAG.BEST1.WPRE.pA (n=9)顯示比AAV2/2 CAG.BEST1.pA (n=9)增加約4倍的斑萎蛋白-1表現(p＜0.01，以塔基氏(Tukey’s)多重比較試驗的單因子ANOVA)且觀察到相對於未轉導之對照細胞(n=8)(p＜0.001)的統計學顯著性增加。儘管在AAV2/2 CAG.BEST1.pA細胞中觀察到斑萎蛋白-1表現，但是這沒有相較於未轉導之細胞的統計學顯著性。當與未轉導之對照物相比時，誤差槓= ±SEM，且***表示p＜0.001。

表現斑萎蛋白-1之HEK293細胞另外以全細胞膜片鉗紀錄檢定。圖8A顯示以AAV2/2 CAG.BEST1.pA、AAV2/2 CAG.BEST1.WPRE.pA及AAV2/2 CAG.GFP.WPRE.pA載體轉導之HEK293細胞，以及未轉導之對照物的電流(I) /電壓(V)標繪圖。圖8B顯示電流波形及圖9顯示弦電導率。實施例2：在經培養之ARPE19細胞中使用VMD2啟動子的斑萎蛋白-1蛋白質

已知經適當地分化之ARPE19具有類似於原始視網膜色素上皮(RPE)細胞的基因表現概況，且可用作為原始RPE細胞的替代物以測試基因表現。使用經分化之ARPE19細胞測試VMD2及CAG啟動子驅動RPE細胞中之BEST1表現的能力及測試內含子-外顯子(IntEx)序列對來自VMD2啟動子之表現的效果。

將ARPE19細胞使用圖10B概述之方案轉染及進行對BEST1表現之檢定。將ARPE19細胞在96孔盤中於37°C及5%之CO₂ 下在分化培養基中(以1%之胎牛血清(FBS)補充之具有4.5 g/l之葡萄糖、L-麩醯胺酸及1 mM丙酮酸鈉的DMEM)生長1至4個月。接著將經分化之ARPE19細胞以每一孔計各質體3.8×10¹⁰ 個複本數量之pCAG.BEST1.WPRE (CAG啟動子)、pVMD.BEST1.WPRE (VMD2啟動子)或pVMD2.IntEx.BEST1.WPRE (VMD2啟動子和內含子-外顯子構築體)轉染。將細胞單獨以TransIT-LT1試劑處理且沒有轉染試劑或質體之細胞充當為陰性對照物。接著將細胞在37°C培養2天，然後固定且以抗-hBest1及抗-ZO1 (亦稱為ZO-1或閉鎖小帶(zona occluden)-1或緊密接合蛋白1，位於細胞間緊密接合之細胞質膜表面上的蛋白質)染色。圖11至13顯示在以三種編碼BEST1之載體轉染的經分化之ARPE19細胞及未轉染之對照物中的BEST1表現。

在轉染前經1個月分化之ARPE19細胞中，未轉染之細胞未顯示出表現。相反地，pCAG.BEST1.WPRE及pVMD2.IntEx.BEST1.WPRE二者能夠在經分化之ARPE19細胞中驅動BEST1蛋白質表現(參見圖11A，比對第一、第二和第四排)。pVMD2.BEST1.WPRE (沒有外顯子-內含子)亦能夠在經1個月分化之ARPE19細胞中驅動BEST1表現(圖11B)，儘管此構築體似乎以比具有內含子-外顯子序列之構築體(pVMD2.IntEx.BEST1.WPRE)更低水平表現BEST1。在經三個月分化之ARPE19細胞中獲得類似的結果：pCAG.BEST1.WPRE、pVMD2.IntEx.BEST1. WPRE及pVMD2.BEST1.WPRE全部皆能夠驅動BEST1蛋白質表現，儘管以CAG啟動子之表現比以VMD2啟動子及以VMD2啟動子之表現更高，且內含子-外顯子序列改進表現(比對圖12A的第一排(未轉染之對照物)與圖12B)。

將ARPE19細胞使用圖10概述之方案轉染及進行對BEST1表現之檢定。將經分化之ARPE19細胞在轉導前以400 nM阿黴素預處理。已證明此藥物在數個試管內模式中改進AAV2轉導效力。在處理後4小時，將細胞經不同的病毒構築體以不同的感染倍率(MOI)轉導。

與在轉導後10天未以阿黴素預處理的經轉導之細胞相比，經4個月分化、以400 nM阿黴素預處理且以2、4和8×10⁴ gp/細胞之AAV2/2.CAG.GFP.WPRE及AAV2/2.VMD2.InEx.GFP.WPRE轉導之ARPE19細胞顯示更高的GFP螢光(比對圖13A) AAV2/2.CAG.GFP.WPRE及B) AAV2/2.VMD2.InEx.GFP.WPRE的各圖板之上和下排)。在用作為陰性對照物的未轉導之細胞中未檢測出GFP螢光(圖13A和B的第一行)。

與未轉導之對照物相比(第一排，圖14)，在經4個月分化、以400 nM阿黴素預處理且以1和4×10⁴ gp/細胞之AAV2/2.CAG.BEST1.WPRE及AAV2/2.VMD2.InEx. BEST1.WPRE轉導之ARPE19細胞中，在轉導後10天的BEST1表現可藉由以抗hBEST1免疫染色來檢測(紅色，圖14的第三行、第二至第五排)。實施例3：在小鼠中以4/8週活體內先導研究

於活體內檢定VMD2.BEST1.WPRE及VMD2. IntEx.BEST1.WPRE構築體驅動BEST1表現的能力。4/8週活體內先導研究之方案顯示於圖15中。將C57BL/6小鼠(每組6隻)以仿體注射液、AAV2/2 VMD2.BEST1.WPRE或AAV2/2 VMD2.IntEx.BEST1.WPRE AAV病毒粒子經雙側注射。將1 µL AAV溶液以34規(gauge)Nanofil針(WPI #NF34BL-2)經次視網膜注射，1×10⁹ GC/µL/眼。在第4週和第8週使用光學同調斷層掃描術進行眼部成像以評定視網膜薄化(毒性)，且在各時間點犧牲3隻動物，以免疫組織化學法及西方墨點法評定BEST1蛋白質表現。

當與仿體處理相比時，在第4週和第8週的OCT成像顯示沒有一個VMD2構築體顯示出感光受體毒性(圖16至18)。

在第4週和第8週的兩個時間點犧牲三隻動物，且將BEST1蛋白質表現以西方墨點法(圖21)及免疫組織化學法(圖19)進一步特徵化。圖19顯示注射後四週的眼部之免疫組織化學法結果，而圖20顯示注射後八週的眼部之免疫組織化學法結果。將眼部以標記感光受體細胞之抗BEST1 (綠色)及抗視紫質(紅色) 與DAPI染色(圖19和20)。自VMD2.BEST1.WPRE.pA及VMD2.IntEx.BEST1.WPRE.pA觀察到BEST1蛋白質表現。經VMD2啟動子驅動之BEST1表現定位於RPE層及感光受體外層之會合點。在來自四週經注射之眼部的經解剖之RPE/脈絡膜複合體組織上以西方墨點法顯示出蛋白質表現(圖21)。實施例4：在小鼠中以4/13週活體內概念驗證研究

額外的4和13週活體內概念驗證(PoC)研究係在小鼠中進行以確認先導研究的結果、檢定AAV病毒粒子劑量的效果及檢查在AAV注射後之隨後的時間點的效果。圖22列出4/13週概念驗證研究之方案的概要。將C57BL/6小鼠(每一組隊12隻)以1×10⁸ GC/µL/眼或1×10⁹ GC/µL/眼之VMD2.IntEx.BEST1.WPRE或VMD2.BEST1.WPRE.pA AAV粒子或以仿體注射液經雙側注射。將1 µL AAV溶液以34規(gauge)Nanofil針(WPI #NF34BL-2)經次視網膜注射。在注射後4和13週以OCT進行眼部成像。在注射後四週犧牲4隻小鼠及在注射後13週犧牲剩餘的8隻小鼠，且將BEST1表現以免疫組織化學法及西方墨點法特徵化。

當與仿體對照物相比時，在第4週和第13週的OCT成像顯示沒有一個VMD2構築體(具有或不具有內含子-外顯子序列)在高劑量(1×10⁹ GC/眼)或低劑量(1×10⁸ GC/眼)下顯示出毒性，如以視網膜薄化證實(圖23)。以抗BEST1 (在圖24中的huBEST1)及抗視紫質染色顯示經VMD2驅動之BEST1定位於RPE層，在經VMD2.IntEx.BEST1.WPRE注射之眼部具有更多BEST1表現的趨勢。在來自4週經注射之眼部(4)的聚集之經解剖之RPE/脈絡膜複合體組織上以西方墨點法顯示出蛋白質表現(圖25B)。實施例5：在小鼠中以優良實驗室規範(GLP)毒性評定研究

BEST1 AAV經較長時期的安全性及表現係以小鼠中的優良實驗室規範(GLP)毒性研究於小鼠中驗證。圖27列出研究的概要。將8隻雄性及8隻雌性小鼠的組隊以低劑量(5.0×10⁸ GC/眼)、中劑量(1.5×10⁹ GC/眼)或高劑量(5.0×10⁹ GC/眼)之VMD2.IntEx.BEST1.WPRE AAV 粒子經次視網膜及雙側注射。使用異速生長體積比例，高的小鼠劑量相當於人類中以100 µL之5×10¹² GC/mL/眼的劑量。在第4週和第26週評估及犧牲小鼠。以眼科檢查評定眼部：測量眼壓(IOP)之眼壓計、用於視網膜厚度之OCT (給藥前及在4週和13週結束時)。在犧牲後，以驗屍評定器官重量且收集用於qPCR之組織，諸如左眼、腦、心臟、骨骼肌、肺、肝、腎、睪丸和卵巢。進行組織病理學評估且保留組織(例如儲存在福馬林中)用於額外的免疫組織化學法。另一選擇地或另外，將4隻小鼠的分組以2×10⁹ GC/眼及5×10⁹ GC/眼之劑量的VMD2.IntEx.BEST1.WPRE AAV 粒子注射且在第4週評估，使更大的毒性研究之方案最適化(參見圖28之概要)。以參考方式併入

本文所引用的每篇文件(包括任何交叉參考或相關的專利或申請案)特此以其全文併入本文以供參考，除非明確地排除或以其他方式限制。任何文件的引用並不承認其為關於本文所揭示或主張之任何發明的先前技術，或其單獨或與任何其他的參考文獻或參考文獻類之任何組合教導、建議或揭示任何此等發明。再者，在本文件中的術語之任何含義或定義與併入以供參考之文件中的相同術語之任何含義或定義達到衝突的程度時，則應以本文件中賦予該術語之含義或定義為準。其他的實施態樣

雖然已例證及說明本發明之特定的實施態樣，但是可進行各種其他改變及修飾而不脫離本發明之精神和範圍。所附之申請專利範圍包括在本發明之範圍內的所有此等改變及修飾。

專利或申請檔案含有至少一個以彩色製成之圖形。以彩色製圖之本專利或專利申請公開案的副本將在請求及支付必要費用後由主管局提供。

圖1A至B為編碼具有AAV2 ITR的VMD2.IntEx.BEST1.WPRE.pA構築體之質體的一對圖譜。

圖2A至B為編碼具有AAV2 ITR的VMD2.BEST1.WPRE.pA構築體之質體的一對圖譜。

圖3A至C為兩個編碼具有AAV2 ITR的CAG.BEST1.WPRE.pA之質體的一系列三個圖譜。圖3A和圖3B為具有AmpR可篩選標記之CAG.BEST.WPRE.pA質體的兩個圖譜。圖3C為具有KanR可篩選標記及填充序列(stuffer sequence)之CAG.BEST.WPRE.pA質體的圖譜。

圖4為編碼具有AAV2 ITR的VMD2.GFP. WPRE.pA之質體的圖譜。

圖5為編碼具有AAV2 ITR的VMD2.Int.Ex. GFP.WPRE.pA之質體的圖譜。

圖6A至B各自為分別6個影像和3個影像的一系列影像，其顯示在以AAV.CAG.BEST1.pA、AAV.CAG.BEST1.WPRE.pA轉導之HEK293細胞及未轉導之對照物中的BEST1表現。細胞係以Hoechst藍染料及抗h斑萎蛋白-1染色。斑萎蛋白-1蛋白質係定位於整個細胞溶質中。

圖7A至B分別為西方墨點法(7A)和長條圖(7B)之圖，其顯示在經AAV.CAG.BEST1.pA (樣本1)或AAV.CAG.BEST1.WPRE.pA (樣本2)轉導之HEK293細胞或陰性對照物(樣本3)中的斑萎蛋白-1蛋白質及β-肌動蛋白對照物表現。經質體轉染之HEK293細胞被用作為陽性對照物。圖7B顯示在經AAV.CAG.BEST1.pA (n=9)或AAV.CAG.BEST1.WPRE.pA (n=9) 轉導之HEK293細胞或未轉導之陰性對照物(n=8)中的斑萎蛋白-1蛋白質表現之定量。Y軸顯示標準化之LiCor值。誤差槓為±SEM。***表示與未轉導之對照物相比時p＜0.001。

圖8A至B分別為單一標繪圖(8A)及一系列四個標繪圖(8B)，其顯示來自經AAV2/2 CAG.BEST1.pA、AAV2/2 CAG.BEST1.WPRE.pA或AAV2/2 CAG.GFP.WPRE. pA載體轉導之HEK293細胞，以及未轉導之對照物的全細胞膜片鉗紀錄數據。在圖8A中，電流(pA)係以X軸繪製，以20增量自-140至500，而電壓(以mV計)係以Y軸繪製，以100為單元自-200至500。電流波形顯示在圖8B中。自左上角以順時針方向顯示以不同的載體轉導之HEK293及未轉導之對照物的電流(I)/電壓(V)標繪圖：AAV2/2 CAG.BEST1.pA、AAV2/2 CAG.BEST1.WPRE.pA、未轉導之對照物及AAV2/2 CAG.GFP.WPRE.pA。插圖比例尺(中間)以Y軸顯示250 pA及以X軸顯示100毫秒。

圖9A至B為一對標繪圖，其顯示以AAV2/2 CAG.BEST1.pA (n = 10)、AAV2/2 CAG.BEST1.WPRE.pA (n = 10)、AAV2/2 CAG.GFP.WPRE.pA (n = 11)轉導之HEK293細胞及未轉導之對照物(n =10)的弦電導率(chord conductance)。弦電導率係以Y軸繪製，以2為單元自0至10。****表示p＜0.0001，*表示p＜0.05, ns代表無顯著性。

圖10A至B為一對流程圖，其顯示用於檢定在經分化之ARPE19細胞中的BEST1表現之實驗程序的兩個實施態樣。圖10A顯示用於檢定在經轉染的分化之ARPE19細胞中的BEST1表現之實驗程序。圖10B顯示用於檢定在經轉染及/或經轉導的分化之ARPE19細胞中的BEST1表現之實驗程序。

圖11A至B為一系列16個影像(A)及6影像(B)，其顯示經1個月分化的經轉染之ARPE19細胞的BEST1及ZO-1免疫染色。(A)由上至下的排顯示具有下列構築體之ARPE19細胞：未轉染之對照物、CAG.BEST1.WPRE、VMD2.BEST1.WPRE和VMD2.IntEx.BEST1.WPRE。由左至右的行顯示：以Hoechst染成藍色的核、染成綠色的ZO-1 (ZO-1為細胞間緊密接合的細胞質膜表面之標記)、染成紅色的BEST1及合併影像(Hoechst、ZO-1、BEST1)。比例尺顯示100微米(µm)。(B)上排顯示經VMD2.BEST1.WPRE.pA轉染之ARPE19細胞。下排顯示經VMD2.IntEx.BEST1. WPRE.pA.轉染之ARPE19細胞。由左至右的影像顯示ZO-1 (綠色)和BEST1 (紅色)及合併影像(Hoechst、ZO-1及BEST1)。合併影像之比例尺表示25 µm。

圖12A至B為一系列16個影像(A)及9個影像(B)，其顯示經3個月分化的經轉染之ARPE19細胞的BEST1及ZO-免疫染色。(A)由上至下的排顯示具有下列構築體之ARPE19細胞：未轉染之對照物、CAG.BEST1.WPRE、VMD2.BEST1.WPRE及VMD2.IntEx.BEST1.WPRE。由左至右的行顯示：以Hoechst染成藍色的核、染成綠色的ZO-1、染成紅色的BEST1和合併影像(Hoechst、ZO-1、BEST1)。比例尺顯示100微米(µm)。(B)以更大的放大率之圖12A的代表性影像。由上至下的排顯示CAG.BEST1.WPRE、VMD2.BEST1.WPRE及VMD2.IntEx. BEST1.WPRE。由左至右的行顯示染成綠色的ZO-1、染成紅色的BEST1及包括以Hoechst染成藍色之合併影像。合併影像中的比例尺表示25 µm。

圖13A至B顯示兩系列8個影像，各自顯示經400 nM阿黴素(doxorubicin)預處理且經(圖13A) AAV2/2.CAG.GFP.WPRE或(圖13B) AAV2/2.VMD2.InEx. GFP.WPRE以3個不同的感染倍率(MOI)轉導之經4個月分化之ARPE19細胞的GFP螢光。所使用之MOI為2、4及8×10⁴ 個基因組粒子(gp)/細胞。在陰性對照物(未轉導且未處理之細胞)中的比例尺表示50 μm。各圖板的上排表示未處理之對照細胞，下排為以400 nM阿黴素預處理之細胞。

圖14為一系列20個影像，其顯示經400 nM阿黴素預處理且經AAV2/2.CAG.BEST1.WPRE及AAV2/2.VMD2.InEx.BEST1.WPRE以2個不同的MOI：1及4×10⁴ gp/細胞轉導之經4個月分化之ARPE19細胞的BEST1及ZO-1免疫染色。由上至下的排顯示具有下列病毒載體之ARPE19細胞：未轉導之對照物、以MOI 10,000 gp/細胞之AAV2/2.CAG.BEST1.WPRE、以MOI 40,000 gp/細胞之AAV2/2.CAG.BEST1.WPRE、以MOI 10,000 gp/細胞之AAV2/2.VMD2.InEx.BEST1.WPRE及以MOI 40,000 gp/細胞之AAV2/2.VMD2.InEx.BEST1.WPRE。由左至右的行顯示：以Hoechst染成藍色的核、染成綠色的ZO-1、染成紅色的BEST1及合併影像(Hoechst、ZO-1、BEST1)。比例尺顯示50 µm。

圖15為概述在小鼠中以4/8週活體內先導研究方案的表。

圖16為以仿體(sham)、VMD2.BEST1.WPRE或VMD2.IntEx.BEST1.WPRE AAV構築體注射後四週之小鼠眼部的一系列6個光學同調斷層掃描術(optical coherence tomography)(OCT)影像。由左至右的行顯示以仿體、以VMD2.BEST1.WPRE及以VMD2.IntEx.BEST1.WPRE AAV構築體注射之小鼠。

圖17為經下列者注射後四週之小鼠眼部的由左至右的一系列3個OCT影像：仿體、VMD2.BEST1.WPRE或VMD2.IntEx.BEST1.WPRE AAV構築體。所表示之形態結構為視網膜節細胞(RGC)、內叢狀層(IPL)、內核層(INL)、外叢狀層(OPL)、外核層(ONL)、視網膜色素上皮(RPE)。藍色及紅色箭頭表示視網膜厚度。

圖18為以仿體、VMD2.BEST1.WPRE或VMD2.IntEx.BEST1.WPRE AAV構築體注射後四週及八週之小鼠眼部的一系列12個OCT影像(由左至右的行)。以交替的排顯示中矢狀和偏心視圖。上兩個排為注射後4週成像的動物，而下兩個排為注射後8週成像的動物。

圖19為以仿體、VMD2.BEST1.WPRE或VMD2.IntEx.BEST1.WPRE AAV構築體注射後四週且以抗BEST1 (綠色)、抗視紫質(紅色)及DAPI (藍色)染色之小鼠眼部的一系列12個螢光顯微術影像。由上至下的排顯示經仿體注射之眼部，經VMD2.BEST1.WPRE或VMD2.IntEx.BEST1.WPRE AAV粒子注射之眼部。由左至右的行顯示抗BEST1 (綠色)、抗視紫質(紅色)、DAPI (藍色)及合併影像。視網膜色素上皮(RPE)、感光受體(PR)及視網膜節細胞(RGC)表示於底部。

圖20為經下列者注射後八週且對BEST1 (綠色)、視紫質(紅色)及DAPI (藍色)染色之小鼠眼部的由左至右的行一系列12個影像：仿體、VMD2.BEST1.WPRE或VMD2.IntEx.BEST1.WPRE AAV 粒子。由上至下的排為合併影像、抗BEST1 (亦稱為huBEST1)、抗視紫質及亮視野影像。

圖21為西方墨點法之影像，其顯示經仿體、CAG.BEST1.WPRE、VMD2.BEST1.WPRE或VMD2.IntEx. BEST1.WPRE AAV構築體注射後四週的經解剖之小鼠RPE及脈絡膜複合體中的BEST1蛋白質表現。藍色箭頭表示重組人類斑萎蛋白-1蛋白質，而紅色箭頭表示BEST1蛋白質之建議大小。CAG.BEST1.WPRE被用作為對照物。CAG為哺乳動物細胞中具有組成型表現之強力啟動子。其為介於巨細胞病毒(CMV)增強子元件、雞β-肌動蛋白啟動子(CBA)與兔子β-球蛋白基因之剪接接受體之間的雜合體。

圖22為概述在小鼠中以4/13週活體內概念驗證(PoC)研究方案的表。

圖23為經仿體、兩個不同的劑量(1×10⁸ GC/µL/眼和1×10⁹ GC/µL/眼)之VMD2.IntEx.BEST1.WPRE或VMD2.BEST1.WPRE AAV構築體注射後四週和13週之小鼠眼部的一系列20個OCT影像。以交替的排顯示中矢狀(上排)和偏心(下排)視圖。

圖24為經仿體、兩個不同的劑量(1×10⁸ GC/µL/眼和1×10⁹ GC/µL/眼)之VMD2.IntEx.BEST1.WPRE或VMD2.BEST1.WPRE AAV構築體注射後四週且經抗BEST1 (huBEST1，綠色)、抗視紫質(紅色)及DAPI (藍色)染色之小鼠眼部的一系列20個顯微術影像。亦顯示亮視野影像(下排)。由左至右的行顯示1×10⁸ GC/µL/眼之VMD2.IntEx.BEST1.WPRE、1×10⁹ GC/µL/眼之VMD2. IntEx.BEST1.WPRE、1×10⁸ GC/µL/眼之VMD2.BEST1. WPRE和1×10⁹ GC/µL/眼之VMD2.BEST1.WPRE。由上至下的排顯示：合併影像、抗BEST1、抗視紫質及亮視野。以左上影像表示之解剖學結構為內核層(INL)、外核層(ONL)、外節段(OS)、視網膜色素上皮(RPE)及脈絡膜。

圖25A至B為以西方墨點法觀察在細胞中或經注射之小鼠RPE及脈絡膜複合體中的BEST1蛋白質表現之一對影像。圖25A為顯示在經pCAG.BEST1.WPRE、pVMD2.BEST1.WPRE及pVMD2.InEx.BEST1.WPRE轉染之HEK293及ARPE-19細胞或作為陰性對照物的未轉染之樣本中的斑萎蛋白-1蛋白質表現及β-肌動蛋白對照物表現之西方墨點法。圖25B為顯示自高劑量(1×10⁹ GC/µL/眼)或低劑量(1×10⁸ GC/µL/眼)之VMD2.IntEx.BEST1.WPRE或VMD2.BEST1.WPRE AAV粒子注射之小鼠單離之RPE及脈絡膜樣本中的BEST1蛋白質之西方墨點法。

圖26為顯示在經AAV2/2.VMD2.InEx. BEST1.WPRE注射之小鼠中以免疫組織化學法及西方墨點法檢定人類BEST1表現之研究設計的表。

圖27為顯示用於評定小鼠中的潛在毒性所提出之優良實驗室規範(GLP)研究之方案的表。

圖28為顯示用於在4週時評估毒性評定研究材料之方案的表。

圖29為顯示用於評定非人靈長類動物中的潛在毒性所提出之優良實驗室規範(GLP)研究之方案的表。

圖30為顯示使用本發明之BEST1 AAV病毒載體的基因組粒子(gp)計之小鼠、非人靈長類動物及人類等效劑量之給藥療程的表。用於所提出之劑量的BEST1 AAV病毒載體濃度為2×10¹² DRP/mL且根據目前的優良製造規範(GMP)標準製造。

圖31為顯示本發明之BEST1 AAV病毒載體在小鼠、非人靈長類動物及人類中的給藥療程及每一劑量所需之DNAse抗性粒子(DRP)濃度和基因組粒子(gp)數量的表。

Claims

一種組成物，其包含：核酸序列，其包含： (a)編碼卵黃狀(vitelliform)黃斑部失養症-2 (VMD2)啟動子之序列，及 (b)編碼斑萎蛋白(Bestrophin)-1 (BEST1)蛋白質之序列。
根據申請專利範圍第1項之組成物，其中編碼該VMD2啟動子之該序列編碼人類VMD2啟動子。
根據申請專利範圍第1或2項之組成物，其中編碼該BEST1蛋白質之該序列編碼人類BEST1蛋白質。
根據申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物，其中編碼該BEST1蛋白質之該序列包含編碼序列。
根據申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物，其中編碼該BEST1蛋白質之該序列包含cDNA序列。
根據申請專利範圍第1至5項中任一項之組成物，其中該核酸序列另外包含： (c)編碼轉錄後調節元件(PRE)之序列。
根據申請專利範圍第7項之組成物，其中編碼該PRE之該序列包含自土撥鼠肝炎病毒(WPRE)單離或衍生之序列。
根據申請專利範圍第1至7項中任一項之組成物，其中該核酸序列另外包含： (d)編碼多腺苷酸化(polyA)訊號之序列。
根據申請專利範圍第1至8項中任一項之組成物，其中該核酸序列另外包含： (e)編碼5’非轉譯區之序列。
根據申請專利範圍第1至8項中任一項之組成物，其中該核酸序列另外包含： (f)編碼內含子之序列，及 (g)編碼外顯子之序列，其中編碼該內含子之該序列及編碼該外顯子之該序列可操作地連結。
根據申請專利範圍第9或10項之組成物，其中編碼該內含子之該序列係位於編碼該VMD2啟動子之該序列與編碼該外顯子之該序列之間，其中編碼該外顯子之該序列係位於編碼該內含子之該序列與編碼該5’ UTR之該序列之間，且其中編碼該內含子之該序列係以哺乳動物細胞剪接。
根據申請專利範圍第9至11項中任一項之組成物，其中編碼該5’ UTR之該序列包含編碼Kozak序列或其部分之序列。
根據申請專利範圍第12項之組成物，其中編碼Kozak序列之該序列與GCCRCCATGG之核酸序列具有至少50%之同一性。
根據申請專利範圍第12項之組成物，其中編碼Kozak序列之該序列包含GGCACCATGA之核酸序列或由其所組成。
根據申請專利範圍第2至14項中任一項之組成物，其中編碼該人類VMD2啟動子之該序列包含下列者或由下列者所組成：

(SEQ ID NO：1)。
根據申請專利範圍第3至15項中任一項之組成物，其中編碼該人類BEST1蛋白質之該序列包含下列者或由下列者所組成：
(SEQ ID NO：3)。
根據申請專利範圍第8至16項中任一項之組成物，其中編碼該polyA訊號之該序列包含自哺乳動物基因單離或衍生之序列。
根據申請專利範圍第17項之組成物，其中編碼該polyA訊號之該序列包含自哺乳動物牛生長激素(BGH)基因單離或衍生之序列。
根據申請專利範圍第10至18項中任一項之組成物，其中編碼該外顯子之該序列包含自哺乳動物基因單離或衍生之序列。
根據申請專利範圍第19項之組成物，其中編碼該外顯子之該序列包含自兔子(穴兔(Oryctolagus cuniculus))β球蛋白基因單離或衍生之序列。
根據申請專利範圍第10至20項中任一項之組成物，其中編碼該內含子之該序列包含非天然生成序列。
根據申請專利範圍第21項之組成物，其中編碼該內含子之該序列包含融合序列。
根據申請專利範圍第22項之組成物，其中編碼該內含子之該序列包含編碼剪接供體位點之序列，及編碼剪接分支點和接受體位點之序列。
根據申請專利範圍第23項之組成物，其中編碼該剪接供體位點之該序列包含自脊椎動物基因單離或衍生之序列。
根據申請專利範圍第24項之組成物，其中編碼該剪接供體位點之該序列包含自雞(原雞(Gallus gallus))β肌動蛋白基因(CBA)單離或衍生之序列。
根據申請專利範圍第23至25項中任一項之組成物，其中編碼該剪接分支點和接受體位點之該序列包含自脊椎動物基因單離或衍生之序列。
根據申請專利範圍第26項之組成物，其中編碼該剪接分支點和接受體位點之該序列包含自兔子(穴兔)β球蛋白基因單離或衍生之序列。
一種載體，其包含根據申請專利範圍第1至27項中任一項之組成物。
根據申請專利範圍第28項之載體，其中該載體為質體。
一種遞送載體，其包含根據申請專利範圍第28或29項之載體。
根據申請專利範圍第30項之遞送載體，其中該遞送載體為病毒遞送載體。
根據申請專利範圍第31項之遞送載體，其中該遞送載體包含單股病毒基因組。
根據申請專利範圍第31項之遞送載體，其中該遞送載體包含雙股病毒基因組。
根據申請專利範圍第30至33項中任一項之遞送載體，其中該遞送載體包含RNA分子。
根據申請專利範圍第30至34項中任一項之遞送載體，其中該遞送載體包含自腺相關病毒(AAV)載體單離或衍生之序列。
根據申請專利範圍第35項之遞送載體，其中該遞送載體包含自血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其任何組合的AAV載體單離或衍生之序列。
根據申請專利範圍第35項之遞送載體，其中該遞送載體包含自血清型AAV2之AAV載體單離或衍生之序列。
根據申請專利範圍第35項之遞送載體，其中該遞送載體包含自血清型AAV8之AAV載體單離或衍生之序列。
根據申請專利範圍第37或38項之遞送載體，其中該遞送載體包含編碼自血清型AAV2之AAV載體單離或衍生之第一反向終端重複(ITR)和第二ITR之序列及編碼自血清型AAV2之AAV載體單離或衍生之病毒基因之序列。
根據申請專利範圍第37或38項之遞送載體，其中該遞送載體包含編碼自血清型AAV8之AAV載體單離或衍生之第一反向終端重複(ITR)和第二ITR之序列及編碼自血清型AAV8之AAV載體單離或衍生之病毒基因之序列。
根據申請專利範圍第37或38項之遞送載體，其中該遞送載體包含編碼自血清型AAV2之AAV載體單離或衍生之第一反向終端重複(ITR)和第二ITR之序列及編碼自血清型AAV8之AAV載體單離或衍生之病毒基因之序列。
一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1至27項中任一項之組成物及醫藥上可接受之載劑。
一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第28或29項之載體及醫藥上可接受之載劑。
一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第30至41項中任一項之遞送載體及醫藥上可接受之載劑。
一種細胞，其包含根據申請專利範圍第1至27項中任一項之組成物。
一種細胞，其包含根據申請專利範圍第28或29項之載體。
一種細胞，其包含根據申請專利範圍第30至41項中任一項之遞送載體。
一種細胞，其包含根據申請專利範圍第42至44項中任一項之醫藥組成物。
根據申請專利範圍第45至48項中任一項之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
根據申請專利範圍第49項之細胞，其中該哺乳動物細胞為非人靈長類動物細胞、囓齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞或兔子細胞。
根據申請專利範圍第45至49項中任一項之細胞，其中該細胞為人類細胞。
根據申請專利範圍第51項之細胞，其中該人類細胞為視網膜色素上皮(RPE)之神經元細胞、神經膠細胞、視網膜細胞、感光受體細胞、視桿細胞、視錐細胞或立方形細胞。
根據申請專利範圍第51項之細胞，其中該人類細胞為感光受體細胞。
根據申請專利範圍第51項之細胞，其中該人類細胞為HEK293細胞或ARPE19細胞。
根據申請專利範圍第51至53項中任一項之細胞，其中該人類細胞係自人類視網膜之RPE單離或衍生。
根據申請專利範圍第51至55項中任一項之細胞，其中該細胞係於活體內、試管內、活體外或原位。
一種治療有其需要之個體的黃斑部失養症之方法，其包含對該個體投予治療有效量的根據申請專利範圍第1至27項或第42至44項中任一項之組成物。
一種治療有其需要之個體的黃斑部失養症之方法，其包含對該個體投予治療有效量的包含根據申請專利範圍第28或29項之載體的組成物。
一種治療有其需要之個體的黃斑部失養症之方法，其包含對該個體投予治療有效量的包含根據申請專利範圍第30至41項中任一項之遞送載體的組成物。
根據申請專利範圍第57至59項中任一項之方法，其中該個體為人類。
根據申請專利範圍第57至59項中任一項之方法，其中該個體為非人靈長類動物、狗、貓、囓齒動物、小鼠、大鼠或兔子。
根據申請專利範圍第57至61項中任一項之方法，其中該個體患有黃斑部失養症。
根據申請專利範圍第57至62項中任一項之方法，其中該個體在BEST1基因的一或兩複本(copy)中具有突變。
根據申請專利範圍第63項之方法，其中該突變係以顯性突變遺傳。
根據申請專利範圍第64項之方法，其中該顯性突變引起個體的貝斯特(Best)卵黃狀黃斑部失養症(BVMD)。
根據申請專利範圍第63項之方法，其中該突變係以隱性突變遺傳。
根據申請專利範圍第66項之方法，其中該隱性突變引起個體的體染色體隱性斑萎蛋白病(Bestrophinopathy) (ARB)。
根據申請專利範圍第63至67項中任一項之方法，其中該突變係發生在BEST1基因的一或兩複本之編碼序列中。
根據申請專利範圍第63至67項中任一項之方法，其中該突變係發生在BEST1基因的一或兩複本之非編碼序列中。
根據申請專利範圍第57至69項中任一項之方法，其中投予包含經由次視網膜、脈絡膜上或玻璃體內途徑注射或輸注。
根據申請專利範圍第57至69項中任一項之方法，其中投予包含經由次視網膜途徑注射或輸注。
根據申請專利範圍第71項之方法，其中投予包含經由次視網膜途徑的兩步驟注射或兩步驟輸注。
根據申請專利範圍第57至72項中任一項之方法，其中該治療有效量經配製成介於10與200 µL之間的體積，納入端點。
根據申請專利範圍第73項之方法，其中該治療有效量經配製成介於10與50 µL之間、介於50與100 µL之間、介於100與150 µL之間或介於150與200 µL之間的體積，納入各範圍的端點。
根據申請專利範圍第57至72項中任一項之方法，其中該治療有效量經配製成介於70與120 µL之間的體積，納入端點，且其中該投予包含經由次視網膜途徑注射或輸注。
根據申請專利範圍第57至72項中任一項之方法，其中該治療有效量經配製成100 µL之體積，且其中該投予包含經由次視網膜途徑注射或輸注。
根據申請專利範圍第59至76項中任一項之方法，其中該治療有效量包含至少1×10¹⁰ DRP/mL、至少1×10¹¹ DRP/mL、至少1×10¹² DRP/mL、至少2×10¹² DRP/mL、至少5×10¹² DRP/mL或至少1.5×10¹³ DRP/mL之AAV遞送載體濃度。
根據申請專利範圍第59至76項中任一項之方法，其中該治療有效量包含至少2×10¹² DRP/mL、至少5×10¹² DRP/mL或至少1.5×10¹³ DRP/mL之AAV遞送載體濃度。
根據申請專利範圍第59至76項中任一項之方法，其中該治療有效量包含至少5×10¹² DRP/mL之AAV遞送載體濃度。
根據申請專利範圍第59至76項中任一項之方法，其中該治療有效量包含至少1.5×10¹³ DRP/mL之AAV遞送載體濃度。
根據申請專利範圍第59至80項中任一項之方法，其中該治療有效量包含2×10⁸ 個基因組粒子(gp)、5×10⁸ gp、1.5×10⁹ gp、2×10⁹ gp、5×10⁹ gp、2×10¹⁰ gp、5×10¹⁰ gp、6×10¹⁰ gp、1.2×10¹¹ gp、1.5×10¹¹ gp、2×10¹¹ gp、4.5×10¹¹ gp、5×10¹¹ gp、1.2×10¹² gp、1.5×10¹² gp、2×10¹² gp或5×10¹² gp之劑量。
根據申請專利範圍第59至80項中任一項之方法，其中該個體為小鼠，且其中該治療有效量包含5×10⁸ gp、1.5×10⁹ gp或5×10⁹ gp之劑量。
根據申請專利範圍第59至80項中任一項之方法，其中該個體為非人靈長類動物，且其中該治療有效量包含1.2×10¹¹ gp、4.5×10¹¹ gp或1.2×10¹² gp之AAV病毒粒子的劑量。
根據申請專利範圍第59至80項中任一項之方法，其中該個體為人類，且其中該治療有效量包含5×10¹⁰ gp、1.5×10¹¹ gp、5×10¹¹ gp或1.5×10¹² gp之AAV病毒粒子的劑量。
根據申請專利範圍第57至84項中任一項之方法，其中該組成物另外包含TMN200緩衝劑。