JP2022511348A - Ａａｖトリプルプラスミドシステム - Google Patents

Abstract

組換えアデノ随伴ウイルスを産生するためのトリプルプラスミドシステムが開示される。一態様では、本発明は、（ｉ）５’および３’ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接する少なくとも１つの異種核酸配列と、それらＩＴＲの外側のスタッファー配列とを含む導入遺伝子含有プラスミド；（ｉｉ）ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）遺伝子配列とキャプシド（Ｃａｐ）遺伝子配列とを含むプラスミド；および（ｉｉｉ）アデノウイルス（Ａｄ）ヘルパープラスミド；を含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）産生のためのプラスミドシステムに関する。

Description

関連出願の相互参照

この出願は、２０１８年１０月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／７５０，６０３号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年１０月２２日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、２５０４７８＿００ｌ８５８＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは２７４，１６５バイトである。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト、ならびに霊長類、ウシ、ネコ、およびイヌなどの他の様々な動物種に感染するＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶによる増殖感染はヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）の存在下でのみ生じるため、ＡＡＶはパルボウイルス科に属し、ディペンドウイルス属に分類される。この小型のノンエンベロープウイルスは、複製（Ｒｅｐ）およびキャプシド（Ｃａｐ）タンパク質のセットをコードする４．６キロベース（ｋｂ）の一本鎖ＤＮＡゲノムを含む。例えば、Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）は、ＡＡＶゲノムの複製、レスキュー、および組み込みに関与し、Ｃａｐタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）は構造機能を提供し、ビリオンキャプシドを形成する。５’および３’末端のＲｅｐおよびＣａｐオープンリーディングフレームに隣接するのは、１４５ｂｐの末端逆位反復配列（Inverted Terminal Repeat ）（ＩＴＲ）である。ＩＴＲは、核酸複製の起点としておよびウイルスのパッケージングシグナルとしてシスで機能する。

感染が生じると、ＡＡＶのライフサイクルには２つの段階がある：１）溶菌段階（lytic stage）および２）溶原段階(lysogenic stage)である。ヘルパーウイルスの助けを借りて、溶菌段階が始まる。この段階中に、ＡＡＶは増殖感染を開始し、ゲノム複製、ウイルス遺伝子発現、およびビリオン産生をもたらす。アデノウイルスヘルパーの場合、ＡＡＶ発現に関してヘルパー機能を提供するアデノウイルスタンパク質には、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡが含まれる。アデノウイルスは、ＡＡＶの増殖感染に適切な環境を提供することにより、細胞の遺伝子発現を調節するのを助ける。非特許文献１を参照されたい。

ＡＡＶは、遺伝子治療用に改変することができる多用途のウイルスである。遺伝子治療に使用される、ＤＮＡゲノム中にウイルス遺伝子を欠く組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、主に、細胞の核にそのＤＮＡカーゴを輸送および送達するために細胞膜を通過するように改変されたタンパク質ベースのナノ粒子である。ｒＡＡＶ ＤＮＡゲノムは、形質導入された細胞の核内でエピソームとして存続する環状コンカテマーを形成することができる。ｒＡＡＶ ＤＮＡは宿主ゲノムに組み込まれないため、長期的な遺伝子発現および耐久性に寄与し、これが、ｒＡＡＶが遺伝子治療に理想的である理由の１つである。

組換え型のＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ベクターのパッケージングおよびＤＮＡ複製に必要な唯一のシスエレメントであるＩＴＲを保持しながら、全てのウイルス遺伝子を治療用導入遺伝子発現カセットに置き換えることにより、ベクターとして開発された。例えば、特許文献１～８を参照されたい。ｒＡＡＶ産生の初期の方法は、１）ＡＡＶヘルパープラスミド（一般に、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコード領域を含むが、ＡＡＶ ＩＴＲを欠いているため、それ自体を複製またはパッケージングできない）、および２）ＩＴＲ含有プラスミド（一般に、ウイルス複製およびパッケージング機能を提供するＡＡＶ ＩＴＲに囲まれた目的の選択された導入遺伝子を包含する）を含む２プラスミドシステムに依存していた。ヘルパープラスミドと選択された遺伝子を搭載するＩＴＲ含有プラスミドとの両方を、一過性トランスフェクションにより産生に適した細胞に導入することができる。次に、トランスフェクトした細胞に、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスを感染させてよく、それらはＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ領域の転写および翻訳を指示するヘルパープラスミド上に存在するＡＡＶプロモーターをトランス活性化する。Ａｄヘルパーウイルスに関して、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、ｒＡＡＶ産生に必要なヘルパー機能を提供できる。ｒＡＡＶを作製するためのプロデューサー細胞へのヘルパーウイルスの感染は、ｒＡＡＶの産生に効果的であった；しかしながら、結果として、宿主から免疫応答を誘導し得るヘルパーウイルス粒子も産生する可能性がある。特定のプラットフォームでは、ＡＡＶの製造に必要なウイルスヘルパー遺伝子を製造細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）に安定的にトランスフェクトさせることができ、それによって微量レベルの残留ヘルパーウイルスから生じる宿主免疫系による抗ヘルパーウイルス免疫応答の可能性を低減することができる。

最近、トリプルプラスミドトランスフェクション法が開発された。この方法は、ＡＡＶ血清型特異的なＲｅｐおよびＣａｐプラスミド、ならびに導入遺伝子含有プラスミドを使用するが、第３のプラスミド上に必須ヘルパーウイルス遺伝子を供給することによりヘルパーウイルス感染の使用を排除し（すなわち、ウイルスコード配列が除去または低減され）、したがって、宿主免疫系による潜在的な抗ヘルパーウイルス免疫応答を低下させる。第３のプラスミド上にウイルスヘルパー遺伝子を供給すると、トランスフェクトされた細胞でのヘルパーウイルスの産生が大幅に減少し、ｒＡＡＶのみが提供される。接着性ＨＥＫ２９３細胞のマルチプラスミド一過性トランスフェクションは、ｒＡＡＶ産生に一般的に使用される方法である。

マルチプラスミドシステムでは、適切なプラスミドサイズを維持することが重要である。したがって、プラスミドが最適なサイズであることを確実にするために、核酸配列（別名「スタッファー配列」）を追加することが重要な場合がある。例えば、ＩＴＲ含有プラスミドのプラスミドバックボーンがベクターキャプシドにパッケージングされることを防ぐために、バックボーンが大きすぎてキャプシドに効果的にパッケージングされないようにスタッファー配列を追加することが必要となり得る。ただし、そのプラスミドがパッケージングされるようになる稀な場合に、スタッファー配列が「サイレント」であり、免疫系を活性化しないことが重要である。

したがって、必要とされているのは、ｒＡＡＶを製造するための改良されたトリプルプラスミドベースのシステムである。そのプラスミドシステムは、導入遺伝子の最適な発現を維持しながら、トランスフェクションの改善および免疫原性の低下をもたらすはずである。本開示の実施形態は、そのようなプラスミドシステムに関する。

米国特許第４，７９７，３６８号明細書 米国特許第５，１５３，４１４号明細書 米国特許第５，１３９，９４１号明細書 米国特許第５，２５２，４７９号明細書 米国特許第５，３５４，６７８号明細書 国際公開第１９９１／０１８０８８号 国際公開第１９９３／０２４６４１号 国際公開第１９９４／１３７８８号

Daya and Berns Clinical Microbiology Reviews Oct 2008, p. 583-593

背景技術の欄で明記したように、当技術分野では、ｒＡＡＶベースの遺伝子治療のためのｒＡＡＶプラスミドシステムを改善することに対する大きなニーズがある。本開示は、このニーズおよび他のニーズを満たす。本開示の実施形態は、一般に、ｒＡＡＶの産生のためのプラスミドシステム、より具体的には、トリプルプラスミドベースのシステムに関する。

一態様では、本発明は、（ｉ）５’および３’ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接する少なくとも１つの異種核酸配列と、それらＩＴＲの外側のスタッファー配列とを含む導入遺伝子含有プラスミド；（ｉｉ）ＡＡＶの複製（Ｒｅｐ）およびキャプシド（Ｃａｐ）遺伝子配列を含むプラスミド；および（ｉｉｉ）アデノウイルス（Ａｄ）ヘルパープラスミド；を含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）の産生のためのプラスミドシステムに関する。

ある実施形態において、スタッファー配列は、導入遺伝子含有プラスミドのバックボーンのサイズを増加させる。ある実施形態において、スタッファー配列は、導入遺伝子含有プラスミドのバックボーンがｒＡＡＶキャプシドにパッケージングされることを阻止するように、導入遺伝子含有プラスミドのバックボーンのサイズを増加させる。ある実施形態において、ｒＡＡＶへのプラスミドバックボーンの取り込みは検出限界未満である。ある実施形態において、導入遺伝子含有プラスミドのバックボーンは、スタッファー配列の付加後に野生型ＡＡＶゲノムよりも大きい。

ある実施形態において、スタッファー配列は、エンハンサー、プロモーター、スプライシング制御因子、ノンコーディングＲＮＡ、アンチセンス配列、コード配列、またはそれらの任意の組み合わせを欠いている。ある実施形態において、スタッファー配列は、エンハンサー、プロモーター、スプライシング制御因子、ノンコーディングＲＮＡ、アンチセンス配列、およびコード配列を欠いている。ある実施形態において、スタッファー配列は、ヒトゲノムに見られる不活性なイントロンＤＮＡ配列を含む。

ある実施形態において、スタッファー配列は、１０００～５０００ヌクレオチド長の間の核酸配列、または１０００～２０００ヌクレオチド長の間の核酸配列を含む。

ある実施形態において、スタッファー配列は、ＧＡＰＤＨイントロン２、そのフラグメント、またはその変異体を含む。ある実施形態において、スタッファー配列は、不活化されたゲンタマイシン遺伝子を含む。

ある実施形態において、スタッファー配列は、配列番号９と少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含む。ある実施形態において、スタッファー配列は、配列番号９またはそのフラグメントを含む。ある実施形態において、フラグメントは、８００～１０００ヌクレオチド長である。

ある実施形態において、スタッファー配列は、配列番号９と少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸からなる。ある実施形態では、スタッファー配列は、配列番号９またはそのフラグメントからなる。ある実施形態において、フラグメントは、８００～１０００ヌクレオチド長である。

ある実施形態において、導入遺伝子含有プラスミドは、図３Ａと同じ順序の構造を有するプラスミドを含み、ｅＧＦＰおよびＳＥＡＰ導入遺伝子は、少なくとも１つの異種核酸配列で置き換えることができる。

ある実施形態において、導入遺伝子含有プラスミドは、図３Ｂと同じ順序の構造を有するプラスミドを含み、ｅＧＦＰ導入遺伝子は、少なくとも１つの異種核酸配列で置き換えることができる。

ある実施形態において、導入遺伝子含有プラスミドは、５’から３’の方向で、５’ＩＴＲ（例えば、配列番号２または４３）、プロモーター（例えば、配列番号４）、少なくとも１つの異種核酸配列、ポリＡ（ｐｏｌｙＡ）配列（例えば、配列番号８）、３’ＩＴＲ（例えば、配列番号３）、およびスタッファー配列（例えば、配列番号９）の核酸配列を含み、各核酸配列は、その対応する機能的フラグメントもしくは誘導体、またはその配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列で置換することができまたはそれをコードする。

ある実施形態において、導入遺伝子含有プラスミドは、発現カセットの外側であるが５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとの間にＤＮＡ力価タグ（titer tag）をさらに含む。

ある実施形態において、導入遺伝子含有プラスミドは、ｉ）３’ＩＴＲの上流でかつポリＡ配列の下流；またはｉｉ）３’ＩＴＲの上流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の下流；またはｉｉｉ）５’ＩＴＲの下流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の上流；またはｉｖ）５’ＩＴＲの下流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列のプロモーターの上流；またはｖ）５’ＩＴＲの下流でかつ３’ＩＴＲの上流；にＤＮＡ力価タグをさらに含む。

ある実施形態において、導入遺伝子含有プラスミドは、ｉ）３’ＩＴＲ（例えば、配列番号３）の上流でかつポリＡ配列（例えば、配列番号８）の下流；またはｉｉ）３’ＩＴＲ（例えば、配列番号３）の上流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の下流；またはｉｉｉ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号２または４３）の下流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の上流；またはｉｖ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号２または４３）の下流でかつプロモーター（例えば、配列番号４）の上流；またはｖ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号２または４３）の下流でかつ３’ＩＴＲ（例えば、配列番号３）の上流；にＤＮＡ力価タグをさらに含む。

ある実施形態において、導入遺伝子含有プラスミドは、５’から３’の方向で、５’ＩＴＲ（例えば、配列番号２または４３）、プロモーター（例えば、配列番号４）、少なくとも１つの異種核酸配列、ポリＡ配列（例えば、配列番号８）、３’ＩＴＲ（例えば、配列番号３）、およびスタッファー配列（例えば、配列番号９）の核酸配列を含み、各核酸配列は、その対応する機能的フラグメントもしくは誘導体、またはその配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列で置換することができまたはそれをコードする。

ある実施形態において、導入遺伝子含有プラスミドは、発現カセットの外側であるが５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとの間にＤＮＡ力価タグをさらに含む。

ある実施形態において、導入遺伝子含有プラスミドは、ｉ）３’ＩＴＲの上流でかつポリＡ配列の下流；またはｉｉ）３’ＩＴＲの上流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の下流；またはｉｉｉ）５’ＩＴＲの下流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の上流；またはｉｖ）５’ＩＴＲの下流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列のプロモーターの上流；またはｖ）５’ＩＴＲの下流でかつ３’ＩＴＲの上流；にＤＮＡ力価タグをさらに含む。

ある実施形態において、導入遺伝子含有プラスミドは、ｉ）３’ＩＴＲ（例えば、配列番号３）の上流でかつポリＡ配列（例えば、配列番号８）の下流；またはｉｉ）３’ＩＴＲ（例えば、配列番号３）の上流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の下流；またはｉｉｉ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号２または４３）の下流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の上流；またはｉｖ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号２または４３）の下流でかつプロモーター（例えば、配列番号４）の上流；またはｖ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号２または４３）の下流でかつ３’ＩＴＲ（例えば、配列番号３）の上流；にＤＮＡ力価タグをさらに含む。

ある実施形態において、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子配列は、ＡＡＶ血清型２、５、８、９、またはそれらのハイブリッドに由来する。ある実施形態において、ＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子配列は、ＡＡＶ血清型２、５、８、９、またはそれらのハイブリッドに由来する。ある実施形態において、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子配列を含むプラスミドは、プロモーターをさらに含む。ある実施形態では、プロモーターはＡＡＶプロモーターである。ある実施形態では、プロモーターはＡＡＶ Ｐ５プロモーターである。

ある実施形態において、Ａｄヘルパープラスミドは、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、またはＶＡ ＲＮＡから選択される１つまたは複数のアデノウイルス遺伝子を含む。

ある実施形態において、Ａｄヘルパープラスミドは、５’から３’の方向で、配列番号１８、１７、１６、および２０の核酸配列を含み、各核酸配列は、その対応する機能的フラグメントもしくは誘導体、またはその配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列で置換することができる。

ある実施形態において、Ａｄヘルパープラスミドは、５’から３’の方向で、配列番号２１、１６、３９、４０、２２、２３、および２０の核酸配列を含み、各核酸配列は、その対応する機能的フラグメントもしくは誘導体、またはその配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列で置換することができまたはそれをコードする。

ある実施形態において、Ａｄヘルパープラスミドは、図５のいずれかの構築物と同じ順序の構造を含む。

ある実施形態において、Ａｄヘルパープラスミドは、配列番号１４と少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含む。

ある実施形態において、Ａｄヘルパープラスミドは、配列番号１５と少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含む。

ある実施形態において、異種核酸配列は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする目的の異種遺伝子である。ある実施形態において、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、酵素、抗体、ＭＨＣ分子、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、アプタマー、アビマー、受容体結合リガンド、ターゲティングペプチド、治療薬、または遺伝子編集分子（gene editing molecule）である。ある実施形態において、異種核酸配列は、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、リボザイム、またはアプタマーなどの核酸配列である。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載のプラスミドシステムのいずれか１つを含む宿主細胞に関する。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載のプラスミドシステムのいずれか１つによって産生されたｒＡＡＶに関する。

別の態様では、本発明は、普遍的なベクター力価測定（universal vector titering）を可能にするＤＮＡ力価タグに関し、それは、導入遺伝子含有プラスミド内の異種核酸配列の核酸配列の上流または下流のいずれかにある約６０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド長の核酸タグ配列を含み、その核酸タグ配列を少なくとも２つの異なる導入遺伝子含有プラスミドで使用して、少なくとも２つの異なるタイプのＡＡＶベクター間での普遍的なベクターゲノム力価測定を可能にすることができる。ある実施形態において、核酸タグ配列は、約１００ヌクレオチド長である。

ある実施形態において、核酸タグ配列は、導入遺伝子含有プラスミドの３’ＩＴＲ配列の上流にあるが、導入遺伝子含有プラスミドの発現カセット内にはない。

ある実施形態において、核酸タグ配列は、導入遺伝子含有プラスミドの５’ＩＴＲ配列の下流にあるが、導入遺伝子含有プラスミドの発現カセット内にはない。

ある実施形態において、ＤＮＡ力価タグは、配列番号６１～７０の核酸配列のいずれか１つを含む。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のプラスミドシステムのいずれか１つを用いて細胞に形質導入し、さらにｒＡＡＶを単離することを含む、ｒＡＡＶを製造する方法に関する。別の態様では、本発明は、前記方法によって製造されたｒＡＡＶに関する。

別の態様では、本発明は、本発明のプラスミドシステムを含む組成物に関する。

別の態様では、本発明は、本発明のプラスミドシステムによって産生されたｒＡＡＶを含む医薬組成物に関する。

別の態様では、本発明は、本発明のプラスミドシステムによって産生されたｒＡＡＶを対象に投与し、それにより、核酸配列を細胞に送達するすることを含む、核酸配列を対象の細胞に送達または移送する方法に関する。ある実施形態において、対象の細胞は、培養中であるか、または対象に存在する。

別の態様において、本発明は、それを必要とする対象に、本発明のプラスミドシステムによって産生されたｒＡＡＶを投与することを含む、対象における疾患または障害を処置または予防するための方法に関する。

別の態様では、本発明は、宿主細胞を本発明のプラスミドシステムによって産生されたｒＡＡＶと接触させることを含む、宿主細胞に関する。

本開示のこれらおよび他の目的、特徴、および利点は、添付の説明、特許請求の範囲、および図面と併せて、以下の明細書を読むことでより明らかになるであろう。

本開示のいくつかの実施形態による、ｒＡＡＶの産生のための例示的なトリプルプラスミドシステムを示す。 本開示のいくつかの実施形態による、導入遺伝子としてｅＧＦＰおよびＳＥＡＰを組み込んだｒＡＡＶ産生のための例示的な導入遺伝子含有プラスミドを示す。 一本鎖（ｓｓ）ｒＡＡＶの産生のための導入遺伝子含有プラスミドの例示的な遺伝子構築物を示す。 自己相補的（ｓｃ）ｒＡＡＶの産生のための導入遺伝子含有プラスミドの例示的な遺伝子構築物を示す。 本開示のいくつかの実施形態による、異なるＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を組み込んだ例示的なＡＡＶ Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドを示す。 ＡＡＶ血清型２由来のプロモーターを組み込んだ例示的なＡＡＶ Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドを示す。 短い（上のパネル）および長い（下のパネル）実施形態における例示的なＡｄヘルパープラスミドを示す。 本開示によるプラスミドからの異なるＡＡＶ血清型由来のＣａｐタンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロットである。 本開示によるプラスミドからの異なるＡＡＶ血清型由来のＣａｐタンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロットである。モノクローナルＢ１クローンをブロット解析に使用した。 本開示によるプラスミドからの異なるＡＡＶ血清型由来のＣａｐタンパク質のＡＡＶ Ｐ５駆動発現レベルを示すウエスタンブロットである。－：Ｐ５プロモーターを含まないプラスミド構築物；＋：Ｐ５プロモーターを含むプラスミド構築物。モノクローナルＢ１クローンをブロット解析に使用した。 本開示による短いＡｄヘルパープラスミドを使用したウイルスゲノムコピー数のｑＰＣＲアッセイの結果を示す。１：陰性対照１（ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＡＡＶ－ＲＣ２（Ａｇｉｌｅｎｔ））；２：陰性対照２（ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＴＲＵＦ１１）；３：陽性対照（ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＡＡＶ－ＲＣ２＋ｐＴＲＵＦ１１）；４：短いＡｄヘルパー試験（Ｓｈｏｒｔ－Ｈｅｌｐｅｒ（配列番号１４）＋ｐＡＡＶ－ＲＣ２＋ｐＴＲＵＦ１１）。 本開示による、長いＡｄヘルパープラスミドを使用したウイルスゲノムコピー数のｑＰＣＲアッセイの結果を示す。１：陰性対照１（ｐＴＲＵＦ１１＋ｐＡＡＶ－ＲＣ２（Ｒｅｐ２Ｃａｐ２（Ａｇｉｌｅｎｔ））；２：陽性対照２（ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＡＡＶ－ＲＣ２＋ｐＴＲＵＦ１１）；３：短いＡｄヘルパー試験（Ｓｈｏｒｔ－Ｈｅｌｐｅｒ（配列番号１４）＋ｐＵＣ１９－Ｒｅｐ２Ｃａｐ８＋ｐＩＴＲｓｓ（配列番号１））；４：長いＡｄヘルパー試験（Ｌｏｎｇ－Ｈｅｌｐｅｒ（配列番号１５）＋ｐＵＣ１９－Ｒｅｐ２Ｃａｐ８＋ｐＩＴＲｓｓ（配列番号１））。 ｒＡＡＶ産生用の対応する導入遺伝子含有プラスミドを使用して産生された一本鎖（上のパネル）または自己相補的（下のパネル）ＤＮＡゲノムを含むｒＡＡＶの細胞溶解物１ｍｌあたりのウイルスゲノムコピー数を示す。上のパネルについて、１：陰性対照（ｐＨｅｌｐｅｒ＋ＡＡＶ－ＲＣ２）；２：陽性対照（ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＡＡＶ－ＲＣ２＋ｐＴＲＵＦ１１）；３：ｓｓＩＴＲ（ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＡＡＶ－ＲＣ２＋ｓｓＩＴＲ）（配列番号１）。下のパネルについて、１：陰性対照（ｐＨｅｌｐｅｒ＋ＡＡＶ－ＲＣ２）；２：陽性対照（ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＡＡＶ－ＲＣ２＋ｐＴＲＵＦ１１）；３：ｓｃＩＴＲ（ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＡＡＶ－ＲＣ２＋ｓｃＩＴＲ）（配列番号４２）。 陽性および陰性対照とともに、本開示によるトリプルプラスミドシステムの多様なキャプシド血清型の細胞溶解物１ｍｌあたりのウイルスゲノムコピー数を示す。１：陰性対照（ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＴＲＵＦ１１）；２：陽性対照（ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＴＲＵＦ１１＋ｐＡＡＶ－ＲＣ２）；３：ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＴＲＵＦ１１＋ｐＵＣ１９－Ｐ５－Ｒｅｐ２Ｃａｐ２（配列番号３１）；４：ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＴＲＵＦ１１＋ｐＵＣ１９－Ｒｅｐ２／５Ｃａｐ５（配列番号２４）；５：ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＴＲＵＦ１１＋ｐＵＣ１９－Ｐ５－Ｒｅｐ２Ｃａｐ８（配列番号３５）；６：ｐＨｅｌｐｅｒ＋ｐＴＲＵＦ１１＋ｐＵＣ１９－Ｐ５－Ｒｅｐ２Ｃａｐ９（配列番号３７）；７：Ｓｈｏｒｔ－Ｈｅｌｐｅｒ（配列番号１４）＋ｓｓＩＴＲ（配列番号１）＋ｐＵＣ１９－Ｐ５－Ｒｅｐ２Ｃａｐ２（配列番号３１）；８：Ｓｈｏｒｔ－Ｈｅｌｐｅｒ（配列番号１４）＋ｓｓＩＴＲ（配列番号１）＋ｐＵＣ１９－Ｒｅｐ２／５Ｃａｐ５（配列番号２４）；９：Ｓｈｏｒｔ－Ｈｅｌｐｅｒ（配列番号１４）＋ｓｓＩＴＲ（配列番号１）＋ｐＵＣ１９－Ｐ５－Ｒｅｐ２Ｃａｐ８（配列番号３５）；１０：Ｓｈｏｒｔ－Ｈｅｌｐｅｒ（配列番号１４）＋ｓｓＩＴＲ（配列番号１）＋ｐＵＣ１９－Ｐ５－Ｒｅｐ２Ｃａｐ９（配列番号３７）；１１：Ｓｈｏｒｔ－Ｈｅｌｐｅｒ（配列番号１４）＋ｓｓＩＴＲ（配列番号１）＋ｐＡＡＶ－ＲＣ２。 ｑＰＣＲ分析のためにＳＶ４０ ｐｏｌｙＡと１００ヌクレオチド長のＤＮＡ力価タグの両方を使用した、一本鎖ＩＴＲ（ｓｓＩＴＲ）導入遺伝子プラスミドの溶解物１ｍｌあたりのウイルスゲノムコピー数を示す。 ｑＰＣＲ分析のためにＳＶ４０ ｐｏｌｙ Ａと１００ヌクレオチド長のＤＮＡ力価タグの両方を使用した、自己相補的ＩＴＲ（ｓｃＩＴＲ）プラスミドの溶解物１ｍｌあたりのウイルスゲノムコピー数を示す。 本開示のいくつかの実施形態による、異なるＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を組み込んだ例示的なＡＡＶ Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドを示す。 本開示のいくつかの実施形態による、異なるＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を組み込み、さらにＰ５プロモーターを組み込んだ例示的なＡＡＶ Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドを示す。 一本鎖（ｓｓ）ｒＡＡＶの産生のための導入遺伝子含有プラスミドの例示的なｅｎｅ構築物を示す。修飾プラスミドは、より高い開発性を備えた改良されたプラスミドバックボーンを含んでいた。 自己相補的（ｓｃ）ｒＡＡＶの産生のための導入遺伝子含有プラスミドの例示的なｅｎｅ構築物を示す。修飾プラスミドは、より高い開発性を備えた改良されたプラスミドバックボーンを含んでいた。 ｑＰＣＲ分析のために１００ヌクレオチド長のＤＮＡ力価タグを使用した、修飾一本鎖ＩＴＲ（ｓｓＩＴＲ）導入遺伝子プラスミドの溶解物１ｍｌあたりのウイルスゲノムコピー数を示す。 ｑＰＣＲ分析のために１００ヌクレオチド長のＤＮＡ力価タグを使用した、修飾自己相補的ＩＴＲ（ｓｃＩＴＲ）プラスミドの溶解物１ｍｌあたりのウイルスゲノムコピー数を示す

背景技術の欄で明記したように、当技術分野では、ｒＡＡＶベースの遺伝子治療薬を作製するためにｒＡＡＶ産生のための技術を特定することに対する大きなニーズがある。本開示は、このニーズおよび他のニーズを満たす。本開示の実施形態は、一般に、ｒＡＡＶ産生に関し、より具体的には、ｒＡＡＶを産生するためのトリプルプラスミドベースのシステムに関する。

本開示の様々な実施形態の原理および特徴の理解を容易にするために、様々な例示的な実施形態を以下に説明する。本開示の例示的な実施形態が詳細に説明されているが、他の実施形態も企図されていることを理解されたい。したがって、本開示の範囲を以下の説明または実施例に記載される構成要素の構造および配置の詳細に限定することは意図されていない。本開示は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実現または実施することができる。また、例示的な実施形態を説明する際に、明確にするために特定の用語を使用する。

各用語は、当業者によって理解されるその最も広い意味を意図し、同様の目的を達成するために同様の方法で動作する全ての技術的同等物を含むことが意図されている。開示された技術の実施形態は、これら具体的な詳述なしで実施できることを理解されたい。他の例では、この説明の理解を曖昧にしないために、周知の方法、構造、および技法を詳細には示していない。「一実施形態」、「実施形態」、「例示的な実施形態」、「いくつかの実施形態」、「ある実施形態」、「様々な実施形態」などへの言及は、そのように記載された開示技術の実施形態が、特定の特徴、構造、または特性を含み得るが、全ての実施形態が必ずしもその特定の特徴、構造、または特性を含むわけではないことを示す。さらに、「一実施形態において」という句の繰り返しの使用は、そうである場合もあるが、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。

明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形の参照も含むことに留意されたい。例えば、構成要素への言及は、複数の構成要素の構成も含むことが意図されている。成分を含む組成物への言及は、指定されたものに加えて他の成分を含むことが意図されている。言い換えれば、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、数量の制限を示すのではなく、参照されるアイテムの「少なくとも１つ」の存在を示す。

本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、「および」を意味する場合があり、「または」を意味する場合があり、「排他的論理和」を意味する場合があり、「１つ」を意味する場合があり、「一部であるが全てではない」を意味する場合があり、「どちらでもない」を意味する場合があり、および／または「両方」を意味する場合がある。「または」という用語は、包括的な「または」を意味することが意図される。

範囲は、本明細書では、「約」または「ほぼ」または「実質的に」１つの特定の値から、および／または「約」または「ほぼ」または「実質的に」別の特定の値までとして表現され得る。そのような範囲が表される場合、他の例示的な実施形態は、その１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。さらに、「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、許容可能な標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、より好ましくはさらに最大±１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は暗黙的であり、この文脈において、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する。

「含む（comprising）」または「含有する（containing）」または「含まれる（including）」とは、少なくとも指定された化合物、要素、粒子、または方法ステップが組成物または物品または方法に存在することを意味するが、他の化合物、材料、粒子、方法ステップが指定されたものと同じ機能を有している場合でも、他のそのような化合物、材料、粒子、方法ステップを排除しない。

この説明全体を通して、様々な構成要素が特定の値またはパラメータを有するとして特定され得るが、これらの項目は、例示的な実施形態として提供されている。実際、多くの比較可能なパラメータ、サイズ、範囲、および／または値が実装され得るため、例示的な実施形態は本開示の様々な態様および概念を限定しない。「第１」、「第２」などの用語、「一次」、「二次」などは、順序、量、または重要性を示すのではなく、ある要素を別の要素と区別するために使用される。

「特に」、「好ましくは」、「典型的に」、「一般的に」、および「しばしば」のような用語は、請求された開示の範囲を制限するため、あるいは特定の特徴がクレームされた開示の構造または機能に重大、必須、または重要であることを暗示すために本明細書で使用されているわけではない。むしろ、これらの用語は、本開示のある実施形態において利用することができるまたは利用することができない代替または追加の特徴を強調することを意図するにすぎない。「実質的に」および「約」のような用語は、任意の定量的比較、値、測定、または他の表示に起因し得る固有の不確実性の程度を表すために本明細書で使用されることにも留意されたい。

本明細書に開示される寸法および値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものとして理解されるべきではない。そうではなく、別に明記されていない限り、そのような各寸法は、記載された値とその値を取り囲む機能的に同等の範囲の両方を意味することが意図される。例えば、「５０ｍｍ」として開示される寸法は、「約５０ｍｍ」を意味することが意図される。

１つまたは複数の方法ステップへの言及は、明示的に特定されたそれらのステップの間に追加の方法ステップまたは介在する方法ステップの存在を排除するものではないことも理解されたい。同様に、組成物中の１つまたは複数の成分への言及は、明示的に特定されたもの以外の追加の成分の存在を排除しないことも理解されたい。

本明細書で使用される場合、「対象」、「患者」、「個体」、および「動物」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、ヒトおよび獣医動物（例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど）および実験動物モデルを含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。好ましい実施形態では、対象はヒトである。

本明細書で使用される場合、「遺伝子治療」という用語は、疾患または状態に関連する１つまたは複数の症状（例えば、臨床的要因）の緩和、軽減、またはその再発を防止するために、治療遺伝子（例えば、第ＶＩＩＩ／ＩＸ／Ｘ因子）をコードする核酸を患者に提供する任意の治療アプローチを含む。この用語は、治療遺伝子（その遺伝子の任意の改変形態（例えば、第ＶＩＩＩ／ＩＸ／Ｘ因子のバリアント）を含む）をコードする核酸を含む任意の化合物、薬物、手順、またはレジメンを、疾患または状態を有する個体の健康を維持または改善するために投与することを包含する。当業者は、例えば、本開示に従って得られた結果に基づいて、遺伝子治療のコースまたは遺伝子治療薬の用量を変更できることを理解するであろう。

本明細書で使用される場合、用量または量に適用される「治療（上）有効」という用語は、状況、障害または状態を処置（例えば、予防または改善）するために対象に投与したときにそのような処置を有効にするのに十分な化合物または医薬組成物の量を指す。例えば、血友病の処置に有用な薬物の治療有効量は、血友病に関連する１つまたは複数の症状を予防または緩和することができる量であり得る。「治療有効量」は、投与される化合物または細菌または類似体、ならびに疾患およびその重症度、処置される哺乳動物の年齢、体重、体調および反応性に応じて変化するであろう。正確な用量は、処置の目的に依存し、既知の技術を使用して当業者によって確認可能である（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999);およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkinsを参照されたい）。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、核酸（例えば、遺伝子治療構築物をコードする）を宿主細胞に移送するために使用される任意のビヒクルを指す。いくつかの実施形態において、ベクターは、標的核酸と共に、ビヒクルを複製するように機能するレプリコンを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、標的核酸（例えば、治療遺伝子または治療遺伝子バリアントをコードするコドン改変ポリヌクレオチド）を導入するためのウイルス粒子である。遺伝子治療に有用な多くの改変真核生物ウイルスが当技術分野で知られている。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトがウイルスの自然宿主であり、ネイティブウイルスがいずれの病気にも寄与することは知られておらず、ウイルスが誘導する免疫応答が軽度であるため、ヒトの遺伝子治療での使用に特に適している。「組換えＡＡＶ」（ｒＡＡＶ）および「ＡＡＶ」は、本願全体で同じ意味で使用される。

「プラスミド」という用語は、所与の細菌細胞において自律的に複製することができる染色体外環状ＤＮＡを指す。例示的なプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ５７、ｐＪ２４１、またはｐＪ２４７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＣＩ、およびｐ Ｐｏｌｙに由来するものが含まれるが、これらに限定されない (Lathe et al., Gene 57 (1987), 193-201)。プラスミドは、標準的な分子生物学技術によって改変することもできる（Sambrook et al., Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), N.Y.）。それは、（例えば、細胞栄養要求性の相補性または抗生物質耐性によって）トランスフェクトされた細胞を選択または識別するための選択遺伝子、安定化エレメント（例えば、ｃｅｒ配列）または組込みエレメント（integrative element）（例えば、ＬＴＲウイルス配列およびトランスポゾン）も含み得る。

本明細書で使用される場合、「プラスミドバックボーン」という用語は、典型的には、適切なプラスミドで形質転換された宿主のみの特異的成長に必要である、複製起点（例えば、配列番号２０および２６）および抗生物質選択遺伝子を含むＤＮＡの配列を指す。ある実施形態において、これらのエレメントは、ｒＡＡＶキャプシドにパッケージングされることは意図されていない。

本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子のセグメント（例えば、コード領域）を指す。いくつかの実施形態において、遺伝子には、ポリペプチド鎖の産生に関与する、コード領域の直前の、後の、および／またはその間に介在する領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列、５’非翻訳領域、３’－非翻訳領域、またはイントロンなどの調節エレメント）が配置される。

本明細書で使用される場合、「調節エレメント」という用語は、細胞におけるコード配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化配列、イントロンなどの核酸配列を指す。

本明細書で使用される場合、「プロモーターエレメント」という用語は、コード配列の発現を制御するのを助ける核酸配列を指す。一般的に、プロモーターエレメントは遺伝子の翻訳開始部位の５’に位置する。しかしながら、ある実施形態では、プロモーターエレメントは、イントロン配列内、またはコード配列の３’に位置する場合もある。いくつかの実施形態において、遺伝子治療に有用なプロモーターは、標的タンパク質の天然遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子治療に有用なプロモーターは、標的生物の特定の細胞または組織での発現に特異的である（例えば、肝臓特異的プロモーター）（Wu Z et al. Molecular Therapy 16(2):280-9. Choi VW et al. Molecular Therapy Methods & Clinical Development 2015. 2:15022；これらは両方とも、意図された全ての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに他の実施形態では、複数の十分に特徴付けられたプロモーターエレメントのうちの１つが本明細書に記載の遺伝子治療で使用される。十分に特徴付けられたプロモーターエレメントの非限定的な例には、ＣＭＶ初期プロモーター（例えば、ｈＣＭＶｉｅ（配列番号４））、３－アクチンプロモーター、およびメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーターが含まれる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、標的タンパク質の実質的に定常的な発現を駆動する構成的プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、特定の刺激（例えば、特定の処置または薬剤への曝露）に応答して標的タンパク質の発現を駆動する誘導性プロモーターである。ＡＡＶ媒介遺伝子治療のためのプロモーターの設計のレビューについては、その内容が全ての目的のためにその全体が参照により明示的に組み込まれるGray et al., Human Gene Therapy 22:1143-53 (2011)を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、動物のゲノムに導入される任意の核酸を広く指し、おそらく通常はゲノムに存在しない配列を有する遺伝子または核酸、所与のゲノム中に存在するが通常は転写および翻訳（「発現」）されない遺伝子、あるいはゲノム中に導入することが望まれる任意の他の遺伝子または核酸を含むがこれらに限定されない。これには、通常非トランスジェニックゲノムに存在し得るが発現を変更することが望まれる遺伝子、または非変異形態または改変もしくはバリアント形態で導入することが望まれる遺伝子が含まれ得る。導入遺伝子は、規定された遺伝子座に特異的に標的化される場合があり、または染色体内にランダムに組み込まれる場合があり、または染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。導入遺伝子は、選択された核酸の最適な発現に必要であり得る、１つまたは複数の転写調節配列、およびイントロンなどの他の任意の核酸を含み得る。導入遺伝子は、わずか数ヌクレオチド長であってよいが、好ましくは、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または５００ヌクレオチド長またはそれ以上であり、例えば、ウイルスゲノム全体であってもよい。導入遺伝子は、コード配列またはノンコーディング配列、あるいはそれらの組み合わせであり得る。導入遺伝子は通常、適切な条件下で１つまたは複数の導入遺伝子の発現を駆動することができる調節エレメントを含む。

本明細書で使用される場合、コード配列および／または制御配列などの核酸配列に関連する「異種」という用語は、通常は一緒に結合されない、および／または通常は特定の細胞に関連しない配列を示す。したがって、「異種」核酸配列は、核酸配列がＡＡＶ以外の生物に由来するか、または合成的に誘導されたものであることを意味する。ある実施形態では、異種核酸配列（例えば、目的の異種遺伝子）は、凝固因子、酵素、抗体、または他の目的のポリペプチドなどであるがこれらに限定されないポリペプチドをコードすることができる。ある実施形態において、異種核酸配列は、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、リボザイム、またはアプタマーなどであるがこれらに限定されない構造的または治療的機能を有するＲＮＡをコードすることができる。同様に、通常は細胞内に存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的のために異種であると見なされるであろう。

「作動可能に連結された」とは、配列の１つの機能が別の配列によって影響を受けるように物理的に連結された２つ以上の核酸配列エレメントの関連性を指す。例えば、調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を与える（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）ように２つの配列が位置する場合、調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に「作動可能に連結された」または「関連する」と言われる。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結され得る。

本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖形態のそれらのポリマー、ならびにそれらの相補体を指す。この用語は、既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または結合を含む核酸を包含し、これらは、合成のもの、天然に存在するもの、および非天然のものであってよく、参照核酸と同様の結合特性を有しかつ参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される。そのような類似体の例には、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、およびペプチド－核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。

「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を含む、天然に存在するおよび非天然のアミノ酸を指す。天然に存在するアミノ酸には、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに翻訳後修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、およびＯ－ホスホセリンが含まれる。天然に存在するアミノ酸には、例えば、Ｄ－およびＬ－アミノ酸が含まれ得る。本明細書で使用されるアミノ酸は非天然アミノ酸も含み得る。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合する任意の炭素を有する化合物を指し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、またはメチオニンメチルスルホニウムなどである。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている３文字の記号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する１文字の記号のいずれかで表記される。同様に、ヌクレオチドは、一般的に受け入れられている１文字のコードで表記され得る。

本明細書で使用される「誘導体」という用語は、対応する完全長の野生型の核酸、ペプチドまたはタンパク質と比較して、１つまたは複数の変異および／または化学修飾を含む核酸、ペプチド、またはタンパク質あるいはそれらのバリアントまたは類似体を指す。核酸が関与する化学修飾の非限定的な例には、例えば、塩基部分、糖部分、リン酸部分、リン酸－糖骨格、またはそれらの組み合わせへの修飾が含まれる。

本明細書に記載のプラスミドシステムで有用であり得る変異遺伝子構築物をコードする核酸配列は、野生型（すなわち、変異していない）配列と同一であってよく、または遺伝暗号の冗長性または縮重の結果として野生型コード配列と同じポリペプチドをコードする異なるコード配列であってもよい。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を生成できることを認識するであろう。したがって、同じポリペプチドをコードする核酸の各バリエーションは、実際の遺伝子治療構築物に関してではなく、発現産物に関して記載の各配列に暗に含まれる。

アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列中の単一アミノ酸またはアミノ酸のごく一部を変更、追加または削除する核酸またはペプチド配列への個々の置換、欠失または付加が、その変更によりアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換される「保存的に改変されたバリアント」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野でよく知られている。そのような保存的に改変されたバリアントは、本開示の多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に追加され、またそれらを除外しない。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換は、当技術分野でよく知られている。例えば、触媒的アミノ酸、構造的アミノ酸、または立体的に重要なアミノ酸など、特定のアミノ酸の機能性に応じて、アミノ酸の様々な集団が互いの保存的置換と見なされ得る。

２つ以上の核酸またはペプチド配列の文脈における「同一」または「同一性」パーセント（％）という用語は、以下に説明するデフォルトのパラメータを用いてＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを使用してあるいは手動アラインメントおよび目視検査により測定した場合に、同一であるか、または特定のパーセンテージの同一アミノ酸残基またはヌクレオチド（すなわち、比較ウインドウまたは指定された領域にわたり最大の一致となるように比較および整列させた場合に、特定領域にわたり、約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性）を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。

当技術分野で知られているように、タンパク質（または以下で論じる核酸）が既知の配列と配列同一性または類似性を有するかどうかを特定するために、いくつかの異なるプログラムを使用することができる。配列同一性および／または類似性は、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)の局所配列同一性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)の配列同一性アラインメントアルゴリズムによる、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988)の類似性探索法による、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WisのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）による、Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 (1984) に記載されるベストフィットシーケンスプログラム、好ましくはデフォルト設定を使用して、または検査によるものを含むが、これに限定されない当技術分野で知られている標準的技術を使用して決定される。好ましくは、同一性パーセントは、次のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢによって計算される：１のギャップペナルティ；０．３３のギャップサイズペナルティ；および、３０の結合ペナルティ（"Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc、参照によってその全てが組み込まれる）。

本開示によれば、当技術分野の技術の範囲内で、従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を使用することができる。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、とりわけ、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Springa Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (herein "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994);を参照されたい。

開示のプラスミドシステム
一態様では、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を操作（engineering）および産生するためのトリプルプラスミドシステムを提供する。ある実施形態では、３つのプラスミドバックボーンは全て同じである。ある実施形態において、３つのプラスミドバックボーンのうち少なくとも１つは異なる。ある実施形態では、３つのプラスミドバックボーンは全て異なる。ある実施形態では、３つのプラスミドバックボーンは全て、完全なＡＡＶゲノムの再構築につながり得る組換えの発生を防ぐために異なる。ある実施形態において、３つのプラスミドは、例えば、これらに限定されないが、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ５７、ｐＪ２４１、またはｐＪ２４７に基づくプラスミドバックボーンを含む。ある実施形態において、３つのプラスミドは、ｐＵＣ１９、ｐＪ２４１、およびｐＪ２４７に基づくプラスミドバックボーンを含む。

ある実施形態において、１つのプラスミドは、ｒＡＡＶ産生構築物のための導入遺伝子含有プラスミドとして機能し、第２のプラスミドは、ＡＡＶ Ｒｅｐ－Ｃａｐ構築物として機能し、第３のプラスミドは、アデノウイルス（Ａｄ）ヘルパー構築物として機能する。各タイプの例示的プラスミドを図１に示す。

ｒＡＡＶ産生のための導入遺伝子含有プラスミド
ｒＡＡＶ産生のための導入遺伝子含有プラスミドは、少なくとも１つの目的の異種核酸配列（例えば、アンチセンスＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、または目的ポリペプチドをコードする遺伝子）を運ぶように操作され、ＡＡＶゲノムの内部が、発現カセット内の目的の異種核酸配列に置き換えられる。本明細書で使用される「発現カセット」は、適切な宿主細胞（例えば、哺乳動物）において特定の異種核酸配列の発現を導くことができる核酸配列を意味し、これは、終結シグナルに作動可能に連結され得る目的の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。目的の異種核酸配列を含む発現カセットはキメラであってよい。発現カセットはまた、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものであってもよい。

ある実施形態において、導入遺伝子含有プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含まない。ある実施形態では、導入遺伝子含有プラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子（例えば、配列番号７１および７３）を含まない。抗生物質耐性遺伝子はプラスミド産生の選択マーカーとして一般的に使用されているが、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）を含めると安全性の懸念が生じる可能性がある。例えば、患者の細菌への遺伝子の水平伝播が生じる可能性があるが、遺伝子がプラスミドに存在しなければそれが防止される。環境微生物への抗生物質耐性形質の拡散の不必要なリスクを回避するために、重要な臨床使用の抗生物質に関連する抗生物質選択マーカーの使用を避けることが特に重要である（例えば、アンピシリン）。医薬組成物中に残留抗生物質（例えば、ペニシリンおよび他のβ－ラクタム抗生物質）が含まれる可能性があるため、患者に重篤な過敏反応を引き起こす抗生物質の抗生物質耐性遺伝子を使用することも避けるべきである。

本発明による例示的な導入遺伝子含有プラスミドは、図２、３Ａ、３Ｂ、１５Ａ、および１５Ｂ、ならびに配列番号１、４２、７１、および７３に示され、または配列番号１、４２、７１、および７３と少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有するプラスミドである。図２、３Ａ、３Ｂ、１５Ａ、および１５Ｂは、本発明の導入遺伝子含有プラスミドのエレメントの順序の例を提供する。

配列番号７１および７３による導入遺伝子含有プラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子の全ての痕跡を除去し、また追加のスタッファー配列として機能する不活性化ゲンタマイシン耐性遺伝子（例えば、オープンリーディングフレームから開始コドンが除去された）を含むため有利である。

導入遺伝子含有プラスミドは、転写の方向に作動可能に連結された成分、すなわち転写開始領域含む制御エレメント、目的のＤＮＡおよび転写終結領域を少なくとも提供するように、既知の技術を使用して構築される。制御エレメントは、哺乳動物細胞で機能するように選択される。作動可能に連結された成分を含む得られた構築物は、機能的なＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）配列に隣接している（５’および３’）。ポリアデニル化部位などの終結シグナルもプラスミドに含めることができる。

ＩＴＲは、パッケージングに必要な唯一のシスエレメントであることが示されており、ｒＡＡＶを作製するためにウイルス遺伝子を完全に欠失させることを可能にする。ローリングサークルＤＮＡ複製メカニズムは、ＩＴＲ内のＤ配列の存在により、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子発現カセットのＤＮＡ配列を主に増幅（すなわち複製）するが、プラスミドＤＮＡバックボーン（例えば、複製起点、抗生物質耐性遺伝子発現カセットなど）も、隣接するＤ配列ドメインがないため低頻度ではあるが、ベクターキャプシドにパッケージされ得る。ＡＡＶは、野生型ウイルスゲノム（約４．７ｋｂａｓｅ）と同様であるかそれよりも小さいゲノムサイズのパッケージングに効率的である。バックボーンがキャプシドにパッケージングされるのに不都合となる程度にバックボーンのサイズを増加させることにより、プラスミドバックボーンのパッケージングを阻止することができる。バックボーンの拡大は、追加の「スタッファー」配列（すなわち、フィラー成分）によって達成することができ、野生型ＡＡＶゲノムよりも大きいプラスミドバックボーンサイズをもたらす。理論に拘束されることを望まないが、拡大されたプラスミドバックボーンの存在は、ｒＡＡＶがプラスミドバックボーンをベクターキャプシド内にパッケージングする可能性を低減できることが示唆されている。いくつかの実施形態において、拡大されたプラスミドバックボーンは、スタッファー配列を使用することによって作製される。

ある実施形態において、スタッファー配列は、エンハンサー、プロモーター、スプライシング制御因子、ノンコーディングＲＮＡ、アンチセンス配列、および／またはコード配列のうちの少なくとも１つを欠いているという点で、生物学的活性に関してサイレントである。ある実施形態において、エンハンサー、プロモーター、スプライシング制御因子、ノンコーディングＲＮＡ、アンチセンス配列、およびコード配列のそれぞれが存在しない。

ある実施形態において、スタッファー配列は、ヒトゲノムに見られる不活性なイントロンＤＮＡ配列を含む。ヒトゲノムからのＤＮＡ配列を利用することにより、プラスミドがキャプシドにパッケージングされた場合に、スタッファー配列が免疫応答を誘導する可能性が低くなる。スタッファー配列がオープンリーディングフレームを含まないことも重要である。

スタッファー配列は、プラスミドバックボーンがベクターキャプシドにパッケージングされないように、プラスミドバックボーンのサイズがｒＡＡＶの最適なパッケージングサイズよりも大きくなるくらい十分に大きい必要がある。スタッファー配列は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、または少なくとも１００００ヌクレオチドからなり得る。ある実施形態において、スタッファー配列は、１０００～５０００ヌクレオチド長の間の核酸を含む。ある実施形態において、スタッファー配列は、１０００～２０００ヌクレオチド長の間の核酸を含む。ある実施形態において、スタッファー配列は、８００～１５００ヌクレオチド長の間の核酸を含む。ある実施形態において、スタッファー配列は、８００～１０００ヌクレオチド長の間の核酸を含む。

好ましい実施形態では、スタッファー配列は、ヒトＧＡＰＤＨイントロン２（ＮＧ００７０７３．２）を含む。理論に拘束されることを望まないが、ヒトＧＡＰＤＨイントロン２の使用は、ヒトゲノムにすでに存在するため免疫原性が低く、したがって、偶然にパッケージングされた場合に免疫応答を誘導しないはずである。ＧＡＰＤＨイントロン２は、単一の天然に存在する配列であるため、スタッファー配列として理想的である。ＤＮＡ配列の不自然な強化をもたらす、追加のヌクレオチドを含めたり、複数の配列を連結したりする必要はない。

ある実施形態において、スタッファー配列は、配列番号９またはそのフラグメントと、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。ある実施形態において、スタッファー配列は、配列番号９またはそのフラグメントを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。

ある実施形態において、スタッファー配列は、不活化されたゲンタマイシン遺伝子を含む。ある実施形態において、ゲンタマイシン遺伝子は、それが発現されないように改変されている。例えば、開始コドンが除去され得る。

ある実施形態において、スタッファー配列は、配列番号７２またはそのフラグメントと、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。ある実施形態において、スタッファー配列は、配列番号７２またはその非機能的フラグメントを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。

導入遺伝子含有プラスミドは、様々なＡＡＶ血清型のいずれかからのＩＴＲを使用して構築できる。これらのＩＴＲの塩基対は、相補的ＤＮＡ鎖の合成を可能にする。ＩＴＲは、目的の異種核酸配列を含むｒＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にするためにそのようなプラスミドで機能的であり続ける。ＡＡＶプラスミドの末端反復配列内の変異は、機能的なＡＡＶベクターの作製において十分に許容される。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ，１９８３；Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ，１９８４；および米国特許第９，１６３，２５９号（これらは全ての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。２つのＩＴＲの１つが欠失されたプラスミドでさえ、構築物内の既存のＩＴＲが完全なＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む限り、ＡＡＶ配列がレスキューされ、複製され、また感染性ビリオンが産生され得る。

ＡＡＶ ＩＴＲ領域の核酸配列は既知である。ＩＴＲは、野生型核酸配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって改変され得る。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそれらのキメラを含むがこれらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶベクター内の選択された核酸配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、それらが意図したように機能する限り、すなわち宿主細胞ゲノムからの目的配列の切除およびレスキューを可能にする限り、必ずしも同一である必要はなく、また同じＡＡＶ血清型または分離株に由来する必要はない。この明細書に記載されているｒＡＡＶの５’ＩＴＲ配列の例として配列番号２および４３が使用されているが、その末端解離部位（terminal resolution site）を保有する任意の５’ＩＴＲ配列が、同じ機能を有するベクターを産生すると予想される。同様に、本明細書に記載されているｒＡＡＶの３’ＩＴＲ配列の例として配列番号３が使用されているが、末端解離部位を保有する任意の３’ＩＴＲ配列が、同じ機能を持つベクターを産生すると予想される。

ある実施形態において、５’ＩＴＲ配列は、配列番号２または配列番号４３、またはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体と、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含むか、それからなるか、または本質的それからなる。ある実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号２または配列番号４３、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。

ある実施形態において、３’ＩＴＲ配列は、配列番号３またはその機能的フラグメントもしくは誘導体と、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。ある実施形態において、３’ＩＴＲは、配列番号３またはその機能的フラグメントもしくは誘導体を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。

ある実施形態において、上記のようなスタッファー配列を含む導入遺伝子含有プラスミドは、発現カセットに作動可能に連結されている。

ある実施形態において、発現カセットはプロモーターを含む。ある実施形態において、少なくとも１つの異種核酸配列（例えば、目的の異種遺伝子）は、異種核酸配列が適切なまたは望ましい条件下で患者の標的細胞で発現され得るように、ｐｏｌ ＩＩプロモーター（構成的、細胞特異的、または誘導性）に作動可能に連結される。構成的、細胞特異的、および誘導性プロモーターの多数の例が当技術分野で知られており、当業者は、特定の使用目的のためのプロモーターを容易に選択することができ、例えば、筋細胞特異的発現のための筋肉特異的骨格筋α－アクチンプロモーターまたは筋肉特異的クレアチンキナーゼプロモーター／エンハンサーの選択、強力なレベルの連続的またはほぼ連続的発現のための構成的ＣＭＶプロモーター（例えば、ｈＣＭＶｉｅ（配列番号４））の選択、または誘導性発現のための誘導性エクジソンプロモーターの選択である。誘導性発現は、当業者が合成されるタンパク質の量を制御することを可能にする。このようにして、治療薬の濃度を変えることが可能である。よく知られている誘導性プロモーターの他の例は、ステロイドプロモーター（例えば、エストロゲンおよびアンドロゲンプロモーター）およびメタロチオネインプロモーターである。ある実施形態において、プロモーターは、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。ある実施形態において、プロモーターは、Ｕ６プロモーターである。ある実施形態において、プロモーターは、Ｈ１プロモーターである。ある実施形態において、遺伝子発現カセットはプロモーターを含まない。

ある実施形態では、導入遺伝子含有プラスミドはマルチシストロン性であり、すなわち、複数の遺伝子を運ぶ。発現される遺伝子ごとに固有のｍＲＮＡ転写産物を生成するプロモーターとは異なり、マルチシストロン性プラスミドは、同じｍＲＮＡから２つ以上の別個のタンパク質を同時に発現する。このような場合、複数の遺伝子は、各遺伝子の個別の翻訳を可能にするエレメント（例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチド）によって分離される。

本明細書に記載されているｒＡＡＶのＩＲＥＳ配列の例として配列番号６が使用されているが、末端解離部位を保有する任意の５’ＩＴＲ配列が、同じ機能を持つベクターを産生すると予想される。

ＩＲＥＳは、別のリボソーム動員部位として機能することにより、ｍＲＮＡの内部領域からの翻訳の開始を可能にする。ある実施形態において、ＩＲＥＳ配列は、配列番号６またはその機能的フラグメントもしくは誘導体と、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。ある実施形態において、ＩＲＥＳは、配列番号６またはその機能的フラグメントもしくは誘導体を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。

ある実施形態において、導入遺伝子含有プラスミドは、２Ａペプチドをコードする。２Ａペプチド（以下の表１の非限定的な例を参照）は、ＩＲＥＳエレメントの欠点のいくつかを克服するために作製された。特に、２Ａペプチドは「自己切断（self-cleaving）」であり、これらペプチドは、リボソームに２ＡエレメントのＣ末端でのペプチド結合の合成をスキップさせ、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドとの間の分離をもたらす。「切断」は、Ｃ末端にあるグリシン残基とプロリン残基の間で生じ、上流のシストロンはその末端に付加されたいくつかの追加の残基を有するが、下流のシストロンはプロリンで始まることを意味する。２Ａ切断は真核細胞で普遍的であり、何人かの科学者はほぼ１００％の切断を報告している。具体的な２Ａペプチドの選択は、最終的には細胞タイプや実験条件などの多くの要因に依存し、当業者はどれを選択すべきか理解するであろう。

一実施形態では、プラスミドは、ＡＡＶからの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含み、これらＩＴＲは少なくとも１つの遺伝子を取り囲む。ある実施形態において、スタッファー配列は、３’ＩＴＲの下流に位置する。ある実施形態では、スタッファー配列は５’ＩＴＲの上流にある。ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、および／またはＡＡＶ１１、あるいはそれらのキメラに由来し得る。ある実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ２および／またはＡＡＶ５に由来する。ある実施形態において、ＩＴＲは、配列番号２、３または４３、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体であり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子は、例えば、限定されないが、ｅＧＦＰ（例えば、配列番号５）および／またはＳＥＡＰ（例えば、配列番号７）などのレポーター遺伝子である。いくつかの実施形態において、スタッファー配列は、ＧＡＰＤＨイントロン２、またはそのフラグメントもしくは変異体である。いくつかの実施形態において、スタッファー配列は、配列番号９またはそのフラグメントである。ｓｓＡＡＶ（図３Ａ）およびｓｃＡＡＶ（図３Ｂ）のｒＡＡＶを生成するためのプラスミドで使用するための例示的な遺伝子構築物を図３に示す。

Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミド
第２のプラスミドは、ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）およびキャプシド（Ｃａｐ）遺伝子配列を含む。ＡＡＶ Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドは、主要なＡＡＶ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、すなわちＲｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子の両方を含む。Ｒｅｐタンパク質は、とりわけ、ＡＡＶのＤＮＡ複製の起点（Ｏｒｉ）の認識、結合、およびニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節；を含む、多くの機能を有することが示されている。Ｃａｐタンパク質は、必要なパッケージング機能を提供し、ウイルスキャプシドシェルを組み立てる。本明細書では、ＡＡＶヘルパー機能を使用して、ＡＡＶベクターから失われているＡＡＶ機能をトランスで補完する。ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子は翻訳されて、複数の異なるタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０－ＡＡＶのライフサイクルに必要；ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３－キャプシドタンパク質）を産生する。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ遺伝子は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、および／またはＡＡＶ１１、またはそれらのキメラに由来し得る。ある実施形態において、ＡＡＶ Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ遺伝子は、遺伝子操作されたＡＡＶおよび／または化学的に修飾されたＡＡＶをコードする。例えば、全ての意図された目的のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２５９，１５１号に記載されているものなど、免疫原性が低くなるように変異させたＡＡＶビリオンを参照されたい。ＡＡＶ血清型の選択は、ＡＡＶ血清型の向性（tropism）に基づいて選択できる。以下の表２は、最も広く使用されているＡＡＶ血清型の向性の例を示すが、これらに限定されない。ＡＡＶの向性は、シュードタイピング（すなわち、異なるウイルス血清型由来のＩＴＲからのキャプシドとゲノムの混合）を介して変更することもできる。これらの血清型はスラッシュを使用して示されるため、ＡＡＶ２／５は、血清型５のキャプシドにパッケージングされた血清型２のＩＴＲを運ぶゲノムを含むウイルスを表す。これらのシュードタイプウイルスを使用すると、形質導入効率を改善できるだけでなく、向性を変化させることができる。例えば、ＡＡＶ２によって効率的に形質導入されないニューロンでは、脳内により広く分布され、形質導入効率が向上されることが示されているＡＡＶ２／５を使用できる。複数の異なる血清型に由来するハイブリッドキャプシドを使用することもでき、これもウイルスの向性を変化させる。例えば、８つの血清型に由来するハイブリッドキャプシドを含むＡＡＶ－ＤＪは、どの野生型の血清型よりもｉｎ ｖｉｔｒｏで高い形質導入効率を示す；ｉｎ ｖｉｖｏでは、広範囲の細胞タイプにわたり非常に高い感染力を示す。変異体ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を示すが、脳への取り込みが強化されている。ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子発現産物の両方をコードする一般的に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５など、多くのＡＡＶヘルパープラスミドが記載されている。例えば、Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; and McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945、および米国特許第５，１３９，９４１号；同第６，００１，６５０号；同第６，３７６，２３７号；同第７，２５９，１５１号（これらのそれぞれは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

本発明による例示的なＲｅｐ－Ｃａｐプラスミドは、図４Ａ、４Ｂ、１４Ａ、および１４Ｂ、ならびに配列番号２４、３１、３３、３５、３７、４１、５９および６０に示され、あるいは、配列番号２４、３１、３３、３５、３７、４１、５９または６０と、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有するプラスミドである。図４Ａ、４Ｂ、１４Ａ、および１４Ｂは、本発明のＡＡＶ Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドのプラスミド中のエレメントの順序の例を提供する。

ある実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、および／またはＡＡＶ１１、またはそれらのキメラに由来し得る。ある実施形態において、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子は、遺伝子操作されたＡＡＶおよび／または化学的に修飾されたＡＡＶである。ある実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ血清型２（Ｒｅｐ２）および／またはＲｅｐ５からの遺伝子を含み、それにはキメラ（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐ２／５）も含まれる。

ある実施形態において、Ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、および／またはＡＡＶ１１、またはそれらのキメラに由来し得る。ある実施形態において、ＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子は、遺伝子操作されたＡＡＶおよび／または化学的に修飾されたＡＡＶである。前述の実施形態のいずれにおいても、Ｃａｐ遺伝子は、Ｒｅｐ遺伝子と同じＡＡＶ血清型に由来しても、Ｒｅｐ遺伝子とは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。前述の実施形態のいずれかにおいて、プラスミドは、ＡＡＶ血清型２、５、８、および／または９（それぞれ、Ｃａｐ２、Ｃａｐ５、Ｃａｐ８、およびＣａｐ９）のいずれかに由来するＣａｐ遺伝子をさらに含み、それら血清型由来のＣａｐタンパク質のハイブリッドを含むキメラタンパク質も含まれる。

ある実施形態において、Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドは、ＡＡＶ血清型２からのＲｅｐ遺伝子配列、および２つ以上の血清型から組み合わせたキメラＲｅｐタンパク質として、例えばＲｅｐ２／５、およびＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、および／またはＡＡＶ９を含む任意のＡＡＶキャプシド血清型からのキャプシド遺伝子配列を含むが、これらに限定されない。

ある実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子配列は、配列番号１１、１２、２８または３０、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体と、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。ある実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子配列は、配列番号１１、１２、２８または３０、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。

ある実施形態において、Ｃａｐ遺伝子配列は、配列番号１３、２９、３２または３６、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体と、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。ある実施形態において、Ｃａｐ遺伝子配列は、配列番号１３、２９、３２または３６、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。

ある実施形態において、プロモーター配列は、配列番号３４またはその機能的フラグメントもしくは誘導体と、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。ある実施形態において、プロモーター配列は、配列番号３４またはその機能的フラグメントもしくは誘導体を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。

一実施形態では、Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドは、本明細書に記載のＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現を制御するためのＡＡＶプロモーターをさらに含む。プロモーターは、任意の所望のプロモーターであってよく、プロモーターに機能的に連結された核酸の発現レベルおよびベクターが使用される細胞タイプなどの既知の考慮事項によって選択され得る。すなわち、プロモーターは、組織／細胞特異的であってよい。プロモーターは、原核生物、真核生物、真菌、核、ミトコンドリア、ウイルス、または植物のプロモーターであってよい。プロモーターは、ベクターによって形質導入される細胞タイプに対して外因性であっても内因性であってもよい。プロモーターには、例えば、細菌プロモーター、ＳＶ４０または誘導性メタロチオネインプロモーターなどの既知の強力なプロモーター、またはＡＡＶ Ｐ５プロモーターなどのＡＡＶプロモーターが含まれ得る。さらに、標的化された遺伝子発現のためにキメラ調節プロモーターを利用してもよい。当技術分野で知られているこれらの調節システムの例には、大腸菌のｔｅｔリプレッサーに融合したＶＰ１６活性化ドメインを含むキメラタンパク質であるｔｅｔトランスアクチベータータンパク質（ｔＴＡ）を利用するテトラサイクリンベースの調節システム、ＥＰＴＧベースの調節システム、ＣＩＤベースの調節システム、およびエクジソン（Ｅｃｄｙｓｏｎｅ）ベースの調節システムが含まれる。他のプロモーターには、アクチン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ｈＣＭＶｉｅ（配列番号４））、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター、誘導性熱ショックプロモーター、呼吸器多核体（ＲＳ）ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などに由来するプロモーターが含まれる。プロモーターは、任意のＡＡＶ血清型のプロモーターであってよく、ｐ１９プロモーターまたはｐ４０プロモーターであってよい。ある実施形態において、プロモーターは、ＡＡＶ２ Ｐ５プロモーターまたはＡＡＶ５ Ｐ５プロモーターまたはＡＡＶ Ｐ５プロモーターであり得る。さらに、プロモーター活性を保持するＰ５プロモーターのより小さなフラグメントは、例えば、Ｐ５プロモーターに一連の欠失を構築すること、欠失をレポーター遺伝子に連結すること、およびレポーター遺伝子が発現されるか否か、すなわち転写および／または翻訳されるか否かを決定することを含む、標準的な手順によって容易に決定することができる。可能なプロモーターの例は、国際公開第２００５／０１７１０１号に見ることができ、それは全ての意図された目的のために参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、ＡＡＶプロモーターは、ＡＡＶ血清型２に由来する。ＡＡＶ２プロモーターＰ５を含む例示的なＰ５－Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドは、図４Ｂおよび１４Ｂ、ならびに配列番号３４に示される。

Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドに適したプラスミドバックボーンには、ｐＨＬＰ１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、およびｐＡＡＶ－ＲＣ２が含まれるが、これに限定されず、また米国特許第６，００１，６５０号および同第６，１５６，３０３号（それら両方は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているプラスミドバックボーンも参照されたい。ある実施形態において、Ｒｅｐ－ＣａｐプラスミドバックボーンはｐＵＣ１９である。

Ａｄヘルパープラスミド
一実施形態において、Ａｄヘルパープラスミドは、Ａｄ２および／またはＡｄ５を含むがこれらに限定されないアデノウイルス遺伝子を含む。一実施形態では、Ａｄヘルパープラスミドは、Ａｄ５遺伝子を含む。Ａｄ５はｒＡＡＶに対する効率的なヘルパーウイルスであるため、Ａｄ５遺伝子配列が使用される。アデノウイルス遺伝子の全搭載(full-complement)はヘルパー機能に必要ないことが知られている。実際に、全搭載しないことがより望ましい。例えば、ＤＮＡ複製および後期遺伝子合成が不可能なアデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製のために許容されることが示されている。Ito et al., (1970) J. Gen. Virol. 9: 243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45: 317。したがって、Ａｄヘルパープラスミドは、ｒＡＡＶ産生に必要な必要Ａｄ遺伝子のみを運ぶ最小サイズであり、かつ縮小プラスミドサイズの構築物として機能するように設計される。Ｅ１領域に欠陥がある、またはＥ４領域が欠失されているアデノウイルスは、ＡＡＶ複製を支持できないことが示されている。したがって、Ｅ１Ａおよび／またはＥ４領域は、直接的または間接的にＡＡＶ複製に必要である可能性が高い。Laughlin et al., (1982) J. Virol. 41: 868; Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1925; Carter et al., (1983) Virology 126: 505。他の特徴づけられたＡｄ変異体には以下のものが含まれる：Ｅ１Ｂ（Laughlin et al. (1982), supra; Janik et al. (1981), supra; Ostrove et al., (1980) Virology 104: 502）；Ｅ２Ａ（Handa et al., (1975) J. Gen. Virol. 29: 239; Strauss et al., (1976) J. Virol. 17: 140; Myers et al., (1980) J. Virol. 35: 665; Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2927; Myers et al., (1981) J. Biol. Chem. 256: 567）；Ｅ２Ｂ（Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)）；Ｅ３（Carter et al. (1983), supra）；およびＥ４ （Carter et al. (1983), supra; Carter (1995)）。Ｅ１Ｂコード領域に変異を有するアデノウイルスによって提供されるアクセサリー機能の研究は相反する結果を生み出したが、Samulski et al., (1988) J. Virol. 62: 206-210は、最近、Ｅ１Ｂ５５ｋがＡＡＶビリオン産生に必要であるが、Ｅ１Ｂ１９ｋは必要ないことを報告した。さらに、国際公開第９７／１７４５８号およびMatshushita et al., (1998) Gene Therapy 5: 938-945は、様々なＡｄ遺伝子をコードするアクセサリータンパク質を記載する。特に好ましいアクセサリー機能プラスミドは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、および無傷のＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠くアデノウイルスＥ１Ｂ領域を含む。これらのプラスミドの例は、国際公開第０１／８３７９７号に記載されている。この段落に記載されている各参考文献は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明による例示的なＡｄヘルパープラスミドは、図５および配列番号１４および１５に示されており、あるいは配列番号１４および１５と、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有するプラスミドである。図５は、本発明のＡｄヘルパープラスミドのプラスミド中のエレメントの順序の例を提供する。

ある実施形態において、Ａｄヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ、Ｅ４（ｏｒｆ６）、ＶＡ１ ＲＮＡ遺伝子、およびパルボウイルスＶＰキャプシド遺伝子ユニットのためのアデノウイルス遺伝子配列を含み得るが、これらに限定されない。ある実施形態において、Ａｄヘルパープラスミドは、ＶＡ、Ｅ４、およびＥ２Ａ遺伝子を含み得る。ｒＡＡＶ産生のために細胞に効率的にトランスフェクトすることができるプラスミドの量には制限があるため、これらのＡｄ遺伝子を運ぶプラスミドのサイズを小さくすることは、トランスフェクションに使用される３つのプラスミド全てのモル含有量を増加し、より高い収量のｒＡＡＶを産生する可能性を高めるのに役立つ。

一実施形態では、Ａｄヘルパープラスミドは、Ｅ２Ａ、Ｅ４ ＯＲＦ１、２、３、４、および６／７、ならびにＶＡ（「短いＡｄヘルパープラスミド」）を含む。例示的な短いＡｄヘルパープラスミドを図５の上のパネルに示す。ここで説明する短いプラスミドは、トランスフェクションのステップ中の「プラスミド負荷」を減らし、３つのプラスミド全てのプラスミドの全体的なコピー数を増やして、ｒＡＡＶ産生のための遺伝子発現および複製のためのプラスミドテンプレートの数を増加させることができる。プラスミド負荷の低減は、驚くべきことにより大きなバッチに有益である。これは、小さな研究規模の産生では重要なパラメータではないかもしれないが、スケールアップするとはるかに重要になる可能性がある。この例示的な短いＡｄヘルパープラスミドは約１２ｋｂである。別の実施形態において、Ａｄヘルパープラスミドは、Ｅ２Ａ、Ｅ４ ＯＲＦ１、２、３、４、および６／７、およびＶＡ、ならびにプロテアーゼおよびファイバーをコードする遺伝子およびプロモーターｐＶＩＩＩを含む（「長いＡｄヘルパープラスミド」）。例示的な長いＡｄヘルパープラスミドを図５の下のパネルに示す。この例示的な長いＡｄヘルパープラスミドは約１８ｋｂである。

短い構築物と長い構築物の違いを図５に示す。３つの必須遺伝子エレメントの向き（orientation）が異なる。長いバージョンは、ｒＡＡＶの産生に影響を与える機能を有し得るアデノウイルスゲノムからの追加のエレメントを運ぶ。短いバージョンは、ｒＡＡＶの産生を支持できることが知られている最小限の遺伝子配列を含む。

ある実施形態では、ＶＡ配列は、配列番号１６または４８～５０、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体と、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。ある実施形態において、ＶＡ配列は、配列番号１６または４８～５０、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。

ある実施形態では、Ｅ４配列は、配列番号１７、４０、４７または５５～５８、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体と、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。ある実施形態において、Ｅ４配列は、配列番号１７、４０、４７または５５～５８、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。

ある実施形態では、Ｅ２Ａ配列は、配列番号１８、３９、４６または５１、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体と、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。ある実施形態において、Ｅ２Ａ配列は、配列番号１８、３９、４６または５１、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。

Ａｄヘルパープラスミドに適したプラスミドには、ｐＪ２４１が含まれるが、これに限定されず、また米国特許第６，００１，６５０号および第６，１５６，３０３号（それら両方、参照により本明細書にその全体が組み込まれる）に記載されているプラスミドも参照されたい。ある実施形態では、ＡｄヘルパープラスミドのバックボーンはｐＵＣ５７である。

追加の遺伝子
さらなる実施形態では、３つのプラスミド全てが選択マーカーを含む。選択マーカーの例には、Ｇ４１８（ｎｅｏｒを含む）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｒを含む）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇｒを含む）、ブラストサイジンＳ（ｂｓｒｒを含む）、ミコフェノール酸および６－チオ（グアニン）（ｇｐｔを含む）およびガンシクロビルまたは１（２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノフラノシル）－５－ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）（ＨＳＶ－ｔｋを含む）、ゲンタマイシン、および／またはカナマイシン（ｋａｎｒを含む）を含むがこれらに限定されない薬剤耐性遺伝子などのポジティブセレクションマーカーが含まれるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、３つ全てのプラスミド上の薬物選択マーカーはカナマイシンである。ある実施形態において、カナマイシン遺伝子は、配列番号１９または２５、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含むか、またはそれからなる。ある実施形態において、ゲンタマイシン遺伝子は、配列番号４４または７２、あるいはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含むか、またはそれからなる。

一実施形態では、３つのプラスミドのうちの１つまたは複数は、１つまたは複数のレポーター遺伝子を運ぶ。いくつかのレポーター遺伝子が当技術分野で知られており、いくつかは市販されている（上記のＡｌａｍおよびＣｏｏｋを参照）。レポーター遺伝子は、生物および分子生物学の操作に特に適したプラスミド内に挿入できる。レポーター遺伝子の発現がプロモーターの制御下にあるように、目的のプロモーターをクローニング部位に挿入することができる（Rosenthal, N., Methods Enzymol. 152: 704-720 (1987); and Shiau, A. and Smith, J. M., Gene 67: 295-299 (1988)を参照されたい）。既知の方法を使用して、これらのプラスミドを細胞タイプまたは生物全体に導入する（Sambrook et al., Molecular Biology, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); およびNolan, In: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)を参照されたい）。レポーター遺伝子の例には、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化型ＢＦＰ（ｅＢＦＰ）、ディスコソマサンゴ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｃｏｒａｌ）由来の赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、および／またはＭｍＧＦＰ（Zemicka-Goetz et al. (1997) Development 124: 1133-1137）、または当業者によく知られている他のものが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、３つのプラスミドのうちの１つまたは複数は、ｅＧＦＰとＳＥＡＰの両方を含むレポーター構築物を運び、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）がｅＧＦＰとＳＥＡＰとの間に位置する。そのような実施形態では、核に局在するｅＧＦＰは、ｒＡＡＶのベクター形質導入指向性を決定するために使用でき、一方、細胞外に分泌されるＳＥＡＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ設定で培地中またはｉｎ ｖｉｖｏ設定で対象の血流中のいずれかで、形質導入効率の定量的測定を可能にすることができる。ＬａｃＺは、クローン化された遺伝子によるｌａｃＺ遺伝子の破壊に基づき、所望のクローンの色に基づく選択を可能にする。

一実施形態では、各プラスミドは、固有のＤＮＡ力価タグを含む。ある実施形態では、ＤＮＡ力価タグは、導入遺伝子含有プラスミドにのみ現れる。ある実施形態では、ＤＮＡ力価タグは、全てのプラスミドシステムに現れる。この固有のＤＮＡ力価タグを含めて、例えばｑＰＣＲ（またはｄｄＰＣＲ）ベースのベクターゲノム力価測定アッセイにより、普遍的なベクターゲノム力価測定を可能にし、存在するベクターの量を定量化できる。ある実施形態では、ＤＮＡ力価タグは、それが確実にパッケージ化されるように、発現カセットの外側であるが、２つのＩＴＲの間にあってよい。例えば、ＤＮＡ力価タグは３’ＩＴＲ配列の上流にあってよい。別の例として、ＤＮＡ力価タグは５’ＩＴＲ配列の下流にあってよい。ある実施形態において、ＤＮＡ力価タグは、それが対象のゲノム内に内因的に現れないように構築される。例えば、配列を対象のＤＮＡと比較することができる（例えば、Ｂｌａｓｔ検索または他のアラインメント検索ツールを介して）。また、ｑＰＣＲ分析の実行に使用されるプライマーを分析して、それらがビリオンのパッケージングに使用される宿主細胞で見られるいずれの配列も識別しないことを確実にすることができる。

ＤＮＡ力価タグは、効率的なｑＰＣＲ分析を可能にするだけでなく、プラスミドの最小限のゲノムスペースしか取らない。ある実施形態において、ＤＮＡ力価タグ配列は、約６０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド長（例えば、配列番号１０）であり、ヒトまたは標準的な実験動物に存在しない配列に基づいて設計される。ある実施形態において、ＤＮＡ力価タグ配列は、約６０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約６５ヌクレオチド～約９５ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、または約７５ヌクレオチド～約８５ヌクレオチドである。ある実施形態において、ＤＮＡ力価タグ配列は、約６０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約６５ヌクレオチド～約７５ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド～約８５ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約８５ヌクレオチド～約９５ヌクレオチド、または約９０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドである。ある実施形態において、ＤＮＡ力価タグ配列は、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドである。ある実施形態において、ＤＮＡ力価配列のストレッチは、１００ヌクレオチド長である。ある実施形態において、１００ヌクレオチドの力価タグは、迅速なｑＰＣＲアッセイにおいて有利となることができ、また全体的なプラスミドサイズおよびパッケージング制限のために効率的なパッケージングを可能にすることができる。

ＤＮＡ力価タグをコードする核酸配列の非限定的な例には、配列番号６１～７０が含まれる。

異種核酸配列
本発明のプラスミドによって作製される組換えＡＡＶは、対象の１つまたは複数の細胞または組織に投与することができる。したがって、本発明は、対象の細胞または組織を調節するのに有用となり得る異種核酸配列の送達を包含する。例えば、ｒＡＡＶは、細胞または組織の活性または産物をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。

ある実施形態において、異種核酸配列は、１つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする目的の異種遺伝子であり得る。ある実施形態において、異種核酸配列は、対象における疾患の処置または予防に有用となり得る、目的の特定の標的に結合するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードすることができる。そのような異種核酸配列および関連するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の例には、抗体、ＭＨＣ分子、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、アプタマー、アビマー、受容体結合リガンド、またはターゲティングペプチドをコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。本発明において有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（heteroconjugate antibody）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、ならびに必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変された構成（抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合的に修飾された抗体を含む）を包含することができる。抗体は、マウス、ラット、ヒト、またはその他の起源のもの（キメラまたはヒト化抗体を含む）であってよい。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ（またはそれらのサブクラス）などの任意のクラスの抗体が含まれ、抗体は特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかはさらに、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２などのサブクラス（アイソタイプ）に分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）と呼ばれる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元形状はよく知られている。

ある実施形態において、異種核酸配列（例えば、目的の異種遺伝子）は、対象における疾患の処置または予防に有用であり得るペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードし得る。例えば、異種核酸配列は、疾患Ｙの処置のためのタンパク質Ｘをコードすることができる。タンパク質Ｘは、例えば、変異タンパク質の代わりになるか、または変異タンパク質をブロックするように作用することができる。そのような核酸配列および関連する疾患には、グリコーゲン蓄積症１Ａ型に関連する、グルコース－６－ホスファターゼをコードする核酸配列；Ｐｅｐｃｋ欠損症に関連するホスホエノールピルビン酸－カルボキシキナーゼをコードするＤＮＡ；ガラクトース血症に関連するガラクトース－１リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ；フェニルケトン尿症に関連するフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ；メープルシロップ尿症に関連する分岐鎖α－ケト酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ；チロシン血症１型に関連するフマリルアセト酢酸加水分解酵素をコードするＤＮＡ；メチルマロン酸血症に関連するメチルマロニルＣｏＡムターゼをコードするＤＮＡ；中鎖アセチルＣｏＡ欠損症に関連する中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素をコードするＤＮＡ；オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症に関連するオルニチントランスカルバミラーゼをコードするＤＮＡ；シトルリン血症に関連するアルギニノコハク酸シンテターゼをコードするＤＮＡ；家族性高コレステロール血症に関連する低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするＤＮＡ；クリグラー・ナジャー病に関連するＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ；重症複合免疫不全症に関連するアデノシンデアミナーゼをコードするＤＮＡ；痛風およびレッシュ・ナイハン（Ｌｅｓｃｈ－Ｎｙｈａｎ）症候群に関連するヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ；ビオチニダーゼ欠損症に関連するビオチニダーゼをコードするＤＮＡ；ファブリー病に関連するα－ガラクトシダーゼ－ＡをコードするＤＮＡ；ゴーシェ病に関連するβ－グルコセレブロシダーゼをコードするＤＮＡ；スライ（Ｓｌｙ）症候群に関連するβ－グルクロニダーゼをコードするＤＮＡ；ツェルベルガー（Ｚｅｌｌｗｅｇｅｒ）症候群に関連するペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａをコードするＤＮＡ；急性間欠性ポルフィリン症に関連するポルフォビリノーゲンデアミナーゼをコードするＤＮＡ；α－１アンチトリプシン欠乏症（肺気腫）の処置のためのα－１アンチトリプシンをコードするＤＮＡ；遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）の処置のためのＣ１－エステラーゼをコードするＤＮＡ；フェニルケトン尿症の処置のためのフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ；ポンペ（Ｐｏｍｐｅ）病の処置のための酸性α－グルコシダーゼをコードするＤＮＡ；ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）病の処置のためのＡＴＰ７ＢをコードするＤＮＡ；ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳＩ）の処置のためのα－Ｌ－イズロニダーゼをコードするＤＮＡ；ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）の処置のためのイズロン酸スルファターゼをコードするＤＮＡ；ムコ多糖症ＩＩＩＡ型（ＭＰＳＩＩＩＡ）の処置のためのヘパランスルファミダーゼをコードするＤＮＡ；ムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳＩＩＩＢ）の処置のためのＮ－アセチルグルコサミニダーゼをコードするＤＮＡ；ムコ多糖症ＩＩＩＣ型（ＭＰＳＩＩＩＣ）の処置のためのヘパラン－α－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ；ムコ多糖症ＩＩＩＤ型（ＭＰＳＩＩＩＤ）の処置のためのＮ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼをコードするＤＮＡ；ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳＩＶＡ）の処置のためのガラクトース－６－硫酸スルファターゼをコードするＤＮＡ；ムコ多糖症ＩＶＢ型（ＭＰＳＩＶＢ）の処置のためのβ－ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ；ムコ多糖症ＶＩ型（ＭＰＳＶＩ）の処置のためのＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼをコードするＤＮＡ；ムコ多糖症ＶＩＩ型（ＭＰＳＶＩＩ）の処置のためのβ－グルクロニダーゼをコードするＤＮＡ；ムコ多糖症ＩＸ型（ＭＰＳＩＸ）の処置のためのヒアルロニダーゼをコードするＤＮＡ；サラセミアまたは腎不全による貧血の処置のためのエリスロポエチンをコードするＤＮＡ；虚血性疾患の処置のための血管内皮増殖因子をコードするＤＮＡ、アンジオポエチン－１をコードするＤＮＡ、および線維芽細胞増殖因子をコードするＤＮＡ；例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、または塞栓症に見られるような、閉塞した血管の処置のためのトロンボモジュリンおよび組織因子経路インヒビターをコードするＤＮＡ；パーキンソン病の処置のための芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするＤＮＡ、およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするＤＮＡ；うっ血性心不全の処置のための、ベータアドレナリン受容体をコードするＤＮＡ、ホスホランバン（phospholamban）のアンチセンスをコードするＤＮＡ、またはホスホランバンの変異型をコードするＤＮＡ、サルコ（エンド）プラスミックレティキュラムアデノシントリホスファターゼ－２（sarco(endo)plasmic reticulum adenosine triphosphatase-2）（ＳＥＲＣＡ２）をコードするＤＮＡ、および心臓型アデニル酸シクラーゼをコードするＤＮＡ；様々ながんの処置のためのｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子をコードするＤＮＡ；炎症性および免疫性障害およびがんの処置のための様々なインターロイキンの１つなどのサイトカインをコードするＤＮＡ；筋ジストロフィーの処置のためのジストロフィンまたはミニジストロフィンをコードするＤＮＡ、およびユートロフィンまたはミニユートロフィンをコードするＤＮＡ；シュタルガルト病の処置のためのＡＢＣＡ４をコードするＤＮＡ；および、糖尿病の処置のためのインスリンをコードするＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。

ある実施形態において、異種核酸配列（例えば、目的の異種遺伝子）は、血液凝固タンパク質をコードするペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードすることができ、これらのタンパク質は、血液障害（例えば、血友病）を有する対象の細胞に送達され得る。そのような核酸および関連するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の例には、血友病Ｂの処置の対象に対する第ＩＸ因子をコードするＤＮＡ、血友病Ａの処置の対象に対する第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子欠乏症の処置のための第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子欠乏症の処置のための第Ｘ因子、第ＸＩ因子欠乏症の処置のための第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子欠乏症の処置のための第ＸＩＩＩ因子、およびプロテインＣ欠乏症の処置のためのプロテインＣが含まれるが、これらに限定されない。

本発明はまた、遺伝性および／または後天性疾患のために宿主細胞ゲノムと相互作用して遺伝子発現レベルに上方または下方の影響を与えることができる、操作された人工ＤＮＡ結合ドメインペプチド、転写活性化因子または転写抑制因子およびヌクレアーゼの発現を含む。

本発明はまた、遺伝性および／または後天性疾患のためにタンパク質の遺伝子発現または活性を変化させることができる細胞のＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質と相互作用し得る、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、リボザイム、またはアプタマーを含むがこれらに限定されない異種核酸配列の発現を含む。

本発明はまた、細胞に感染させて遺伝子操作された細胞治療材料または医薬品を作製するために使用される、ｒＡＡＶを含むがこれらに限定されない、細胞治療のための中間のおよび／または重要な原材料の発現を含む。

本発明はまた、細胞内の目的のゲノム遺伝子座（すなわち、標的）を修飾するために使用される遺伝子編集分子である異種核酸配列を含む。そのような修飾には、遺伝子の標的遺伝子座における遺伝子配列の破壊、欠失、修復、突然変異、付加、改変、または修飾が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子編集分子の例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦｎｓ）などのエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、およびクラスター化等間隔短鎖回分リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。

ｒＡＡＶの送達
本明細書に記載の組換えＡＡＶは、それを必要とする対象に本発明のプラスミドによって作製されたｒＡＡＶの有効量を投与することにより、目的の疾患の処置および／または予防のために治療上有用な濃度で使用することができる。本発明のプラスミドによって作製されたｒＡＡＶで処置される対象には、疾患を処置または予防するのに既知の効力を有する他の治療薬またはデバイスも投与することができる。

対象へのｒＡＡＶの送達は、筋肉内注射または対象の血流への投与によるものであってよい。血流への投与は、静脈、動脈、または他の任意の血管導管への注射によるものであってよく、また分離式肢灌流（isolated limb perfusion）による血流への変異体ビリオンであり、これは、外科技術においてよく知られている技術であり、本質的に技術者がｒＡＡＶの投与の前に体循環から四肢（腕または脚）を隔離することを可能にする方法である。さらに、特定の条件では、変異体ビリオンを対象のＣＮＳに送達することが望ましい場合がある。「ＣＮＳ」とは、脊椎動物の脳および脊髄の全ての細胞および組織を意味する。したがって、この用語には、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質腔、骨、軟骨、脳室内、頭蓋内、大槽注射、髄腔内、頸動脈内、鼻腔内などが含まれるが、これらに限定されない。ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入されたｒＡＡＶまたは細胞を、例えば、脳室領域への注射によってＣＮＳまたは脳に直接送達させることができ、また定位注射（stereotactic injection）などの当技術分野で知られている脳神経外科技術を使用して、針、カテーテル、または関連するデバイスを用いて、線条体（例えば、線条体の尾状核または被殻）、脊髄および神経筋接合部、または小脳小葉に送達させることができる。例えば、Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; and Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000（これらのそれぞれは、全ての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。眼への投与の場合、方法には、網膜下、硝子体内、経強膜、または頭蓋内が含まれ得る。

本開示はまた、以下の実施例によって説明および実証される。しかしながら、本明細書のいずれかでのこれらおよび他の例の使用は、単なる例示にすぎず、開示または例示された用語の範囲および意味を決して制限するものではない。同様に、本開示は、本明細書に記載の好ましい実施形態に限定されない。実際に、本明細書を読むと、本開示の多くの修正および変形が当業者に明らかとなり、そのような変形は、精神または範囲において開示から逸脱することなく行うことができる。したがって、開示は、添付の特許請求の範囲の用語と、それら請求項が権利を与えられるものの同等物の全範囲によってのみ制限されるべきである。

実施例１：キャップタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現
この実施例では、ｐＵＣ１９ベースのプラスミドからのＡＡＶ２９３（Ａｇｉｌｅｎｔ）細胞におけるキャプシドタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を、Ｒｅｐ２およびＣａｐ２遺伝子（Ａｇｉｌｅｎｔ）を保持する対照のｐＡＡＶ－ＲＣ２ベースのプラスミドからの同じキャプシドタンパク質の発現レベルと比較して調べた（図４Ａ）。

様々なＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を持つ４つのプラスミドの第１のセットは、Ｒｅｐ２Ｃａｐ２－ｐＡＡＶ－ＲＣ（すなわち、図４Ａに示すｐＡＡＶ－ＲＣ２）を用いて開始して、ｐＡＡＶ－ＲＣバックグラウンドで作製した。ｐＡＡＶ－ＲＣ２を使用して、Ｒｅｐ２／５Ｃａｐ５－ｐＡＡＶ－ＲＣ、Ｒｅｐ２Ｃａｐ８－ｐＡＡＶ－ＲＣ、およびＲｅｐ２Ｃａｐ９－ｐＡＡＶ－ＲＣを作製した（図４Ａ）。

４つのプラスミドの第２のセットは、第１のセットと同じ複製およびキャプシドタンパク質を使用して、ｐＵＣ１９－Ｋａｎバックグラウンドで作製した。したがって、Ｒｅｐ２Ｃａｐ２－ｐＵＣ１９－Ｋａｎ、Ｒｅｐ２／５Ｃａｐ５－ｐＵＣ１９－Ｋａｎ、Ｒｅｐ２Ｃａｐ８－ｐＵＣ１９－Ｋａｎ、およびＲｅｐ２Ｃａｐ９－ｐＵＣ１９－Ｋａｎ（図４Ａおよび１４Ａ）。

実験のために、８つのプラスミドのそれぞれを、ＡｄヘルパープラスミドであるｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）（例えば、配列番号４５）とともに、１：１の比率で別々にトランスフェクトした。

モノクローナルＢ１抗体を使用したウエスタンブロッティングにより、ｐＵＣ１９－ＫａｎベースのプラスミドからのＣａｐタンパク質の発現レベルを、ｐＡＡＶ－ＲＣ２ベースのプラスミドからの同じＣａｐタンパク質の発現レベルと比較した（図６）。陽性対照であるＡＡＶ２参照標準物質（ＲＳＭ）およびＡＡＶ８ ＲＳＭは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８ Ｃａｐタンパク質を含む参照標準物質であるが、陰性対照は、Ｃａｐ搭載プラスミドを含まないＨＥＫ２９３からの細胞溶解物であった。キャプシドタンパク質の発現レベルは、ｐＵＣ１９ベースのプラスミドおよびｐＡＡＶ－ＲＣ２ベースのプラスミドの両方でＡＡＶ５＞ＡＡＶ８＞ＡＡＶ９＞ＡＡＶ２であった。

図７は、より明確にＣａｐタンパク質ＶＰ１－ＶＰ３の量を特異的に分析するために、サンプルを減らして行ったウエスタンブロット分析である。

次に、ＡＡＶ２ Ｐ５プロモーターをＲｅｐ２Ｃａｐ２－ｐＵＣ１９－Ｋａｎ、Ｒｅｐ２Ｃａｐ８－ｐＵＣ１９－Ｋａｎ、およびＲｅｐ２Ｃａｐ９－ｐＵＣ１９－Ｋａｎプラスミドに追加した（例えば、図４Ｂおよび１４Ｂ）。図８は、Ｐ５プロモーターを使用しない場合と比較して、上記と同じ条件下で試験したＰ５プロモーターを使用して発現させたＡＡＶ血清型２、８、および９由来のＣａｐタンパク質の発現レベルを示す。Ｐ５プロモーターはより高いレベルのキャプシドタンパク質の発現をもたらすことが分かった。導入遺伝子含有プラスミドとＡｄヘルパープラスミドは１：１の比率で投与された。

実施例２：短いＡｄヘルパープラスミドと長いＡｄヘルパープラスミドの機能試験
この実施例の目的は、短いＡｄヘルパープラスミドと長いＡｄヘルパープラスミドの機能を市販のｐＨｅｌｐｅｒと比較して試験することであった。組み合わせてそれらを使用する前に、各プラスミドを個別に試験して、それぞれが機能することを確認した。

図９は、ＨＥＫ２９３宿主細胞系で短いＡｄヘルパープラスミド（配列番号１４）を使用した陽性試験結果を示す。短いＡｄヘルパープラスミド（配列番号１４）は、２つのＩＴＲの間に導入遺伝子としてＧＦＰを運ぶｐＴＲＵＦ１１導入遺伝子含有プラスミド、およびＡＡＶ Ｒｅｐ２およびＣａｐ２遺伝子を運ぶＡｇｉｌｅｎｔ ＲＣ２プラスミドと一緒に、短いヘルパープラスミドをコトランスフェクトすることによって試験した。陰性対照は、１）市販のＡｄヘルパープラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒ）、およびＡｇｉｌｅｎｔプラスミドＲＣ２、ならびに２）ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＴＲＵＦ１１とで構成された；陽性対照は、ｐＨｅｌｐｅｒ、ｐＴＲＵＦ１１、およびＡｇｉｌｅｎｔ ＲＣ２プラスミドで構成された。４８時間後、ＨＥＫ２９３細胞をＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で溶解し、ベンゾナーゼヌクレアーゼで処理してＤＮＡおよびＲＮＡを分解した。ＡＡＶ粒子を含む細胞溶解物をＤＮａｓｅ Ｉで処理し、ｑＰＣＲを行う前に段階希釈して、細胞溶解物１ｍｌあたりのウイルスゲノムコピー数を決定した。図９はｑＰＣＲアッセイの結果を示し、列１および２は陰性対照を表し、列３は陽性対照を示し、列４は短いＡｄヘルパープラスミドを他の２つのプラスミドと一緒に使用してｒＡＡＶを産生した場合に得られたウイルスゲノムコピー数を示す。

同様の実験を行って、開示に従い長いＡｄヘルパープラスミド（配列番号１５）を試験した（図１０）。図１０は、ｑＰＣＲにより決定された、陰性対照（列１）、陽性対照（列２）、短いＡｄヘルパープラスミド（配列番号１４）＋Ｒｅｐ－Ｃａｐ搭載プラスミド＋ＩＴＲ－ＧＦＰ搭載プラスミド（列３）、および長いＡｄヘルパープラスミド＋Ｒｅｐ－Ｃａｐ搭載プラスミド＋ＩＴＲ－ＧＦＰ搭載プラスミド（列４）の細胞溶解物１ｍｌあたりのウイルスゲノムコピー数を示す。したがって、長いＡｄヘルパープラスミドもＡＡＶの産生をもたらした。

実施例３：トリプルプラスミドシステムを使用したｒＡＡＶビリオンの産生
本開示による一本鎖（ｓｓ）および自己相補的（ｓｃ）－ＩＴＲ搭載プラスミドがｒＡＡＶビリオンを形成する能力を試験した。この実験では、プラスミドをＨＥＫ２９３細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ）にコトランスフェクトした。各トランスフェクションについて、Ａｄ－ヘルパープラスミド、Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミド、および導入遺伝子含有プラスミドを１：１：１のモル比で使用し、１０ｃｍプレートあたり１０μｇの全ＤＮＡを使用した。陰性対照は市販のＡｄヘルパープラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ）と市販のＲｅｐ－Ｃａｐ搭載プラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ）であったが、陽性対照は異なるＩＴＲ搭載プラスミド（ＡＴＣＣ）を使用した。図１１の上のパネルは、ｓｓ－ＩＴＲ搭載プラスミドについて細胞溶解物１ｍｌあたりのウイルスゲノムコピー数（上記のようにｑＰＣＲで測定）を示し、下のパネルは、ｓｃ－ＩＴＲ搭載プラスミドについて細胞溶解物１ｍｌあたりのウイルスゲノムコピー数を示す。両方のパネルにおいて、列１は陰性対照のコピー数を示し、列２は陽性対照を表し、列３は本開示によるプラスミドを表す。

次に、本開示による３つのプラスミドを、ｑＰＣＲアッセイのためにＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトした（ここでも、１：１：１の比率）。陰性対照（図１２の列１）は、市販のＡｄヘルパープラスミドおよびＩＴＲ搭載プラスミドであった。陽性対照（図１２の列２）は、市販のＲｅｐ－Ｃａｐ搭載プラスミドを含んでいた。列３～６は、ＡＡＶ血清型２、５、８、または９（図の上部に記載されている）からのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードするｐＵＣ１９ベースのプラスミドとともに、同じ市販のＡｄヘルパープラスミドおよびＩＴＲ搭載プラスミドでトランスフェクトした細胞からのＡＡＶゲノムコピー数に対応する。図１２の列７～１０は、本開示による、Ａｄヘルパープラスミド、ｐＵＣ１９ベースのＲｅｐ－Ｃａｐ搭載プラスミド、およびＩＴＲ搭載プラスミドでトランスフェクトした細胞からのＡＡＶゲノムコピー数に対応する。図１２の列１１は、本開示によるＡｄヘルパープラスミドおよびｓｓ－ＩＴＲプラスミド、ならびに市販のＲｅｐ－Ｃａｐ搭載プラスミドでトランスフェクトした細胞からのＡＡＶゲノムコピー数に対応する別の陽性対照である。

実施例４：ｒＡＡＶの精製および産生
本開示に従う３つのプラスミドを含むプラスミドシステムでＨＥＫ２９３細胞をコトランスフェクトした。細胞を化学的に溶解し、細胞ペレットおよび培地を回収した。細胞溶解物を清澄化し、ベンゾナーゼで処理した。清澄化した溶解物を適切なアフィニティーカラムに流した（例えば、ＡＡＶ８キャプシドを含むプラスミドシステムの場合、アフィニティーカラムはＡＶＢであった；ＡＡＶ９を含むプラスミドシステムの場合、アフィニティーカラムはＡＡＶ９－ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔであった）。バッファー交換後、ｒＡＡＶをカラムから溶出した。次に、ｒＡＡＶを、限定ではなく例として、ｑＰＣＲによって特徴付けして、ウイルスゲノムのコピー数を決定した（図９～１３、１６を参照）。純度および同一性を決定するために銀染色により、エンドトキシン活性および微生物汚染を測定するためにリムルスアメーバ様細胞溶解物（Limulus amebocyte lysate）（ＬＡＬ）アッセイにより、また生物学的活性を決定するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイにより、ｒＡＡＶをさらに評価することができる。他の特性評価アッセイには、ウイルスゲノムのサイズおよび完全性を試験するためのアルカリ電気泳動、キャプシドを調べるためのＥＬＩＳＡ、ｒＡＡＶ粒子の感染性を決定するための細胞間伝播特異性評価（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｅｎｔｅｒ ａｓｓａｙ）、およびｒＡＡＶ粒子を観察するための電子顕微鏡が含まれる。適切な抗体を使用することにより特定タンパク質のウエスタンブロッティングを行うこともできる（図６～８を参照）。

実施例５：ベクターゲノムの力価を測定するためのタグの使用
ポリＡ配列などの配列をｑＰＣＲの定量化に使用できるが、このような配列を普遍的な力価測定に使用することは理想的ではない。例えば、各導入遺伝子は、異なるポリＡ配列（例えば、ＳＶ４０、ｂＧＨ ｐｏｌｙＡなど）を使用する場合があり、それにより、全ての導入遺伝子プラットフォームにわたりベクターを定量化するためにそれを使用することを不可能にする。したがって、導入遺伝子カセットの外側にある別個のＤＮＡ力価タグ（すなわち、導入遺伝子ｍＲＮＡ転写物の一部として転写されない）を、任意の導入遺伝子カセットを普遍的に定量化するその能力について試験した。

３’ＩＴＲ配列の上流に１００ヌクレオチドのＤＮＡ力価タグを含めた。この同じ力価タグを、ｒＡＡＶ産生用の任意の導入遺伝子含有プラスミドで使用して、ｑＰＣＲ技術による普遍的なベクターゲノム力価測定を可能にし、これはあらゆるプロジェクトのための単一の参照標準として使用できる。ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡまたは１００ヌクレオチドのＤＮＡ力価タグを標的配列として使用して、ｑＰＣＲ滴定の結果を同じバッチのＡＡＶについて比較した。

２つの異なるウイルスベクター：ｒＡＡＶ８－ｓｓＩＴＲ（配列番号１）およびｒＡＡＶ８－ｓｃＩＴＲ（配列番号４２）を、一本鎖（配列番号１）または自己相補的（配列番号４２）導入遺伝子含有プラスミドのいずれかである導入遺伝子含有プラスミドを用いて産生させた。２つの異なる標的配列を使用して同様のｑＰＣＲ力価が得られ、１００ヌクレオチドのＤＮＡ力価タグがｑＰＣＲベースのベクター滴定のためにこの分野で広く使用されているＳＶ４０ ｐｏｌｙＡと同等に機能することを示す（図１３Ａ（ｒＡＡＶ８－ｓｓＩＴＲ）および１３Ｂ（ｒＡＡＶ８－ｓｃＩＴＲ））。

実施例６：ベクターゲノムの力価を測定するためのタグの使用
ＤＮＡ力価タグの有用性をさらに確認するために、実施例５で使用したのと同じ１００ヌクレオチドのＤＮＡ力価タグを、２つの追加のウイルスベクター：ｒＡＡＶ９－ｓｓＩＴＲ（配列番号７１）およびｒＡＡＶ９－ｓｃＩＴＲ（配列番号７３）において３’ＩＴＲ配列の上流に含めた。

いくつかの可能な実施形態が上に開示されているが、本開示の実施形態はそのように限定されない。これらの例示的な実施形態は、網羅的であることまたは開示の範囲を不必要に制限することを意図するものではなく、当業者が開示を実施できるように、本開示の原理を説明するために選択および説明されている。実際に、本明細書に記載されているものに加えて、本開示の様々な変更が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。さらに、本開示の様々な実施形態の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその同等物によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、例示的な実施形態を説明する目的でのみ使用され、用語は限定することを意図していない。したがって、本開示の範囲は、前述の説明および上記の実施形態ではなく、以下の特許請求の範囲によって示され、その同等物の意味および範囲内に入る全ての変更は、それに含まれることが意図されている。

本明細書で引用される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の資料は、本明細書に物理的に存在するかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (51)

1. 組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）の産生のためのプラスミドシステムであって、
   （ｉ）５’および３’ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接する少なくとも１つの異種核酸と、それらＩＴＲの外側のスタッファー配列とを含む導入遺伝子含有プラスミド；
   （ｉｉ）ＡＡＶの複製（Ｒｅｐ）遺伝子配列とキャプシド（Ｃａｐ）遺伝子配列とを含むプラスミド；および
   （ｉｉｉ）アデノウイルス（Ａｄ）ヘルパープラスミド；
   を含む、プラスミドシステム。
2. 前記スタッファー配列が、導入遺伝子含有プラスミドがｒＡＡＶキャプシドにパッケージングされないように、導入遺伝子含有プラスミドのバックボーンのサイズを増加させる、請求項１に記載のプラスミドシステム。
3. 前記導入遺伝子含有プラスミドのバックボーンが野生型ＡＡＶゲノムよりも大きい、請求項１または２に記載のプラスミドシステム。
4. 前記スタッファー配列が、エンハンサー、プロモーター、スプライシング制御因子、ノンコーディングＲＮＡ、アンチセンス配列、コード配列、またはそれらの任意の組み合わせを欠いている、請求項１～３のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
5. 前記スタッファー配列が、エンハンサー、プロモーター、スプライシング制御因子、ノンコーディングＲＮＡ、アンチセンス配列、およびコード配列を欠いている、請求項４に記載のプラスミドシステム。
6. 前記スタッファー配列が、ヒトゲノムに見られる不活性なイントロンＤＮＡ配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
7. 前記スタッファー配列が、１０００～５０００ヌクレオチド長の間の核酸配列または１０００～２０００ヌクレオチド長の間の核酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
8. 前記スタッファー配列が、ＧＡＰＤＨイントロン２、そのフラグメント、またはその変異体を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
9. 前記スタッファー配列が、配列番号９と少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
10. 前記スタッファー配列が、配列番号９と少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸からなる、請求項１～９のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
11. 前記スタッファー配列が、配列番号９またはそのフラグメントを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
12. 前記スタッファー配列が、配列番号９またはそのフラグメントからなる、請求項１～８のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
13. 前記導入遺伝子含有プラスミドが、図３Ａと同じ順序の構造を有するプラスミドを含み、ｅＧＦＰおよびＳＥＡＰ導入遺伝子は少なくとも１つの異種核酸で置き換えることができる、請求項１～１２のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
14. 前記導入遺伝子含有プラスミドが、図３Ｂと同じ順序の構造を有するプラスミドを含み、ｅＧＦＰ導入遺伝子を少なくとも１つの異種核酸で置き換えることができる、請求項１～１２のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
15. 前記導入遺伝子含有プラスミドが、５’から３’の方向で、配列番号２、４、少なくとも１つの異種核酸、配列番号８、３、およびスタッファー配列の核酸配列を含み、各核酸配列は、その対応する機能的フラグメントもしくは誘導体、またはその配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列で置換することができまたはそれをコードする、請求項１～１２のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
16. 前記導入遺伝子含有プラスミドが、発現カセットの外側であるが５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとの間に、ＤＮＡ力価タグをさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
17. 前記導入遺伝子含有プラスミドが、ｉ）３’ＩＴＲの上流でかつポリＡ配列の下流、またはｉｉ）３’ＩＴＲの上流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の下流；またはｉｉｉ）５’ＩＴＲの下流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の上流；またはｉｖ）５’ＩＴＲの下流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列のプロモーターの上流；またはｖ）５’ＩＴＲの下流でかつ３’ＩＴＲの上流に、ＤＮＡ力価タグをさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
18. 前記導入遺伝子含有プラスミドが、ｉ）配列番号３の上流でかつ配列番号８の下流；またはｉｉ）配列番号３の上流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の下流；またはｉｉｉ）配列番号２の下流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の上流；またはｉｖ）配列番号２の下流でかつ配列番号４の上流；またはｖ）配列番号２の下流でかつ配列番号３の上流に、ＤＮＡ力価タグをさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
19. 前記導入遺伝子含有プラスミドが、５’から３’の方向で、配列番号４３、４、少なくとも１つの異種核酸配列、配列番号８、３、およびスタッファー配列の核酸配列を含み、各核酸配列は、その対応する機能的フラグメントもしくは誘導体、またはその配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列で置換することができまたはそれをコードする、請求項１～１２のいずれか一項に記載のプラスミドシステム
20. 前記導入遺伝子含有プラスミドが、発現カセットの外側であるが５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとの間に、ＤＮＡ力価タグをさらに含む、請求項１９に記載のプラスミドシステム。
21. 前記導入遺伝子含有プラスミドが、ｉ）３’ＩＴＲの上流でかつポリＡ配列の下流、またはｉｉ）３’ＩＴＲの上流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の下流；またはｉｉｉ）５’ＩＴＲの下流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の上流；またはｉｖ）５’ＩＴＲの下流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列のプロモーターの上流；またはｖ）５’ＩＴＲの下流でかつ３’ＩＴＲの上流に、ＤＮＡ力価タグをさらに含む、請求項１９または２０に記載のプラスミドシステム。
22. 前記導入遺伝子含有プラスミドが、ｉ）配列番号３の上流でかつ配列番号８の下流；またはｉｉ）配列番号３の上流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の下流；またはｉｉｉ）配列番号４３の下流でかつ少なくとも１つの異種核酸配列の上流；またはｉｖ）配列番号４３の下流でかつ配列番号４の上流；またはｖ）配列番号４３の下流でかつ配列番号３の上流に、ＤＮＡ力価タグをさらに含む、請求項１９または２０に記載のプラスミドシステム。
23. 前記ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子配列が、ＡＡＶ血清型２、５、８、９、またはそれらのハイブリッドに由来する、請求項１～２２のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
24. 前記ＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子配列が、ＡＡＶ血清型２、５、８、９、またはそれらのハイブリッドに由来する、請求項１～２３のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
25. Ｒｅｐ遺伝子配列およびＣａｐ遺伝子配列を含むプラスミドがプロモーターをさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
26. 前記プロモーターがＡＡＶプロモーターである、請求項２５に記載のプラスミドシステム。
27. 前記プロモーターがＡＡＶ Ｐ５プロモーターである、請求項２６に記載のプラスミドシステム。
28. 前記Ａｄヘルパープラスミドが、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、またはＶＡ ＲＮＡから選択される１つまたは複数のアデノウイルス遺伝子を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
29. 前記Ａｄヘルパープラスミドが、５’から３’の方向で、配列番号１８、１７、１６、および２０の核酸配列を含み、各核酸配列は、その対応する機能的フラグメントもしくは誘導体、またはその配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列で置換することができる、請求項２８に記載のプラスミドシステム。
30. 前記Ａｄヘルパープラスミドが、５’から３’の方向で、配列番号２１、１６、３９、４０、２２、２３、および２０の核酸配列を含み、各核酸配列は、その対応する機能的フラグメントもしくは誘導体、またはその配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列で置換することができまたはそれをコードする、請求項２８に記載のプラスミドシステム。
31. 前記Ａｄヘルパープラスミドが、図５のいずれかの構築物と同じ順序の構造を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
32. 前記Ａｄヘルパープラスミドが、配列番号１４と少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
33. 前記Ａｄヘルパープラスミドが、配列番号１５と少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する核酸を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
34. 前記異種核酸配列が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする目的の異種遺伝子である、請求項１～３３のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
35. 前記ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、酵素、抗体、ＭＨＣ分子、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、アプタマー、アビマー、受容体結合リガンド、ターゲティングペプチド、治療薬、または遺伝子編集分子である、請求項３４に記載のプラスミドシステム。
36. 前記異種核酸が、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、リボザイム、またはアプタマーなどの核酸配列である、請求項１～３５のいずれか一項に記載のプラスミドシステム。
37. 請求項１～３６のいずれか一項に記載のプラスミドシステムを含む宿主細胞。
38. 請求項３７に記載の宿主細胞によって産生された組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）。
39. 普遍的なベクター力価測定を可能にするＤＮＡ力価タグであって、導入遺伝子含有プラスミド内の異種核酸配列の核酸配列の上流または下流のいずれかにある約６０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド長の核酸タグ配列を含み、前記核酸タグ配列が、少なくとも２つの異なる導入遺伝子含有プラスミドで使用されて少なくとも２つの異なるタイプのＡＡＶベクター間での普遍的なベクターゲノム力価測定を可能にすることができる、ＤＮＡ力価タグ。
40. 前記核酸タグ配列が約１００ヌクレオチド長である、請求項３９に記載のＤＮＡ力価タグ。
41. 前記核酸タグ配列が、導入遺伝子含有プラスミドの３’ＩＴＲ配列の上流にあるが、導入遺伝子含有プラスミドの発現カセット内にはない、請求項３９または請求項４０に記載のＤＮＡ力価タグ。
42. 前記核酸タグ配列が、導入遺伝子含有プラスミドの５’ＩＴＲ配列の下流にあるが、導入遺伝子含有プラスミドの発現カセット内にはない、請求項３９または請求項４０に記載のＤＮＡ力価タグ。
43. 前記ＤＮＡ力価タグが、配列番号６１～７０の核酸配列のいずれか１つを含む、請求項３９～４２のいずれか一項に記載のＤＮＡ力価タグ。
44. 請求項１～３６のいずれか一項に記載のプラスミドシステムで細胞に形質導入し、さらにｒＡＡＶを単離することを含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を製造する方法。
45. 請求項４４に記載の方法によって製造された組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）。
46. 請求項１～３６のいずれか一項に記載のプラスミドシステムを含む組成物。
47. 請求項３８または請求項４５に記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物。
48. 核酸配列を対象の細胞に送達または移送する方法であって、請求項３８または請求項４５に記載のｒＡＡＶを対象に投与し、それによって核酸配列を細胞に送達することを含む、方法。
49. 前記対象の細胞が培養中であるか、または対象に存在する、請求項４８に記載の方法。
50. 対象における疾患または障害を処置または予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項３８または請求項４５に記載のｒＡＡＶを投与することを含む、方法。
51. 宿主細胞に請求項３８または請求項４５に記載のｒＡＡＶを接触させることを含む、宿主細胞に形質導入する方法。

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