JP6567974B2 - アデノ随伴ウイルスの定量方法 - Google Patents
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Description
[1] アデノ随伴ウイルスゲノムの定量方法であって、
(a)検体、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも1対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物を調製する工程、
(b)工程(a)により調製した組成物を用いて核酸増幅反応を行う工程、並びに
(c)工程(b)により得られた増幅産物を検出する工程、
を含む方法。
[2] プライマー対が、配列表の配列番号1で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号7で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、[1]に記載の方法。
[3] プライマー対が、配列表の配列番号1又は2で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号7又は8で表される塩基配列からなるプライマーとからなる、[1]又は[2]に記載の方法。
[4] インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、[1]〜[3]いずれかに記載の方法。
[5] [1]〜[4]いずれかに記載の方法によりアデノ随伴ウイルスゲノムを定量する工程を包含する、アデノ随伴ウイルスの力価測定方法。
[6] アデノ随伴ウイルスゲノムを定量するための組成物であって、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも1対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物。
[7] プライマー対が、配列表の配列番号1で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号7で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、[6]に記載の組成物。
[8] プライマー対が、配列表の配列番号1又は2で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号7又は8で表される塩基配列からなるプライマーとからなる、[6]又は[7]に記載の組成物。
[9] インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、[6]〜[8]いずれかに記載の組成物。
[10] アデノ随伴ウイルスゲノムの定量用のキットであって、DNAポリメラーゼ、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも1対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含むキット。
[11] プライマー対が、配列表の配列番号1で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号7で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、[10]に記載のキット。
[12] プライマー対が、配列表の配列番号1又は2で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号7又は8で表される塩基配列からなるプライマーとからなる、[10]又は[11]に記載のキット。
[13] インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、[10]〜[12]いずれかに記載のキット。
ここで、本発明で用いるシアニン系色素としては、CAS登録番号 163795−75−3の下記式(I)に示される[2−[N−(3−dimethylaminopropyl)−N−propylamino]−4−[2,3−dihydro−3−methyl−(benzo−1,3−thiazol−2−yl)−methylidene]−1−phenyl−quinolinium]あるいはその塩が使用できる。言い換えると、N’,N’−dimethyl−N−[4−[(E)−(3−methyl−1,3−benzothiazol−2−ylidene)methyl]−1−phenylquinolin−1−ium−2−yl]−N−propylpropane−1,3−diamine、あるいはその塩が使用できる。これらは、SYBR(登録商標)Green Iと称されている。さらにcis−trans異性体であってもよく、下記式(II)に示されるN’,N’−dimethyl−N−[4−[(Z)−(3−methyl−1,3−benzothiazol−2−ylidene)methyl]−1−phenylquinolin−1−ium−2−yl]−N−propylpropane−1,3−diamine、あるいはその塩が使用できる。
2型AAV(以下、AAV2)のゲノム塩基配列情報(RefSeq Acc. No.NC_001401)を元に、AAV2のITRに対して5’側プライマー及び3’側プライマーを設計した。5’側プライマーは、L1(配列番号1)、L2(配列番号2)、L3(配列番号3)、L4(配列番号4)、L5(配列番号5)、及びL6(配列番号6)の6種類、3’側プライマーは、R1(配列番号7)、R2(配列番号8)、R3(配列番号9)、R4(配列番号10)、R5(配列番号11)、R6(配列番号12)、及びR7(配列番号13)の7種類である。
(1)rAAV2ベクター製造用細胞の播種
細胞培養用10cmディッシュ(コーニング社製)に、10%FBS(ギブコ社製)を含むDMEM(シグマ社製)に懸濁した293細胞を播種した。その後、37℃のCO2インキュベーターで終夜培養し、細胞がおよそ70%コンフルエントになっていることを確認した。
前記実施例2−(1)で調製した細胞に、リン酸カルシウム法を用いて、AAV2のRepタンパク質及びCapタンパク質をコードするプラスミド、アデノウイルスのE2A、VA、V4配列を含むプラスミド、並びにAAV2の2つのITRの間に蛍光タンパク質ZsGreen1の発現カセットを含むプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクション7時間後、培地を完全に除去した後、10%FBSを含むDMEMをディッシュ1枚当たり15mL添加し、37℃のCO2インキュベーターで2日間培養した。
(2)の培養終了後、20mM EDTAを含むPBS溶液3mLを各ディッシュへ添加し、室温で数分間反応させることで細胞を剥離させた。その後、溶液ごと細胞を回収し、1,750×g、4℃で10分間遠心分離した後、上清を除去した。細胞ペレットにクエン酸を含有する酸性バッファーを添加し、遠心分離後、その上清をrAAV2ベクター抽出液とした。得られたrAAV2ベクター抽出液中のAAV2のウイルス粒子外の核酸をDNaseIにて消化した後、タンパク質変性剤を用いてAAV2粒子よりゲノムDNAを遊離させた。こうして得られた溶液を、rAAV2ベクター由来の粗精製ゲノム溶液とした。
実施例1において設計した6種類の5’側プライマーと7種類の3’側プライマーとを組み合わせてプライマーペア(全42通り)とし、AAVゲノムの定量に有効なプライマーペアのスクリーニングを行った。スクリーニングには、SYBR(登録商標) Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(タカラバイオ社製)を使用し、以下の反応組成で行った。SYBR(登録商標) Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×conc.) 12.5μL、各10μM プライマーミックス 0.5μL、鋳型 5.0μLを混合し、滅菌水にて全量を25μLにした。鋳型にはポジティブコントロールとして実施例2で調製したrAAV2ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を用いた。また、鋳型の代わりに滅菌水を使用する以外は上記と同様の反応組成のものを調製し、これをネガティブコントロールの反応液とした。反応は、ネガティブコントロールとポジティブコントロール共に、プライマーペア毎に2反応ずつ行った。反応及び検出は、Thermal Cycler Dice(登録商標) Real Time System IIを使用し、95℃、2分(初期変性)の後、95℃、5秒〜60℃、30秒を1サイクルとする35サイクルのリアルタイムPCRにより行った。また、PCR終了後には、融解曲線分析を行った。
実施例3より有望であったプライマーセットL1/R1、L1/R2、L2/R1、L2/R2の4通りを用いて定量性の確認を行った。定量性の確認には、SYBR(登録商標) Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)を使用し、以下の反応組成で行った。SYBR(登録商標) Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×conc.) 12.5μL、前記4通りの各10μM プライマーミックス 0.5μL、鋳型 5.0μLを混合し、滅菌水にて全量を25μLにした。反応液は、鋳型として実施例2で調製したrAAV2ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を使用したもの、AAV2のITR中の増幅領域を搭載したプラスミドDNAの10倍段階希釈物(1×102コピー/5μL、1×103コピー/5μL、1×104コピー/5μL、1×105コピー/5μL、1×106コピー/5μL、又は1×107コピー/5μL)を使用したもの、及びネガティブコントロールとして鋳型の代わりに滅菌蒸留水を用いたものを調製した。反応及び検出は、95℃、2分(初期変性)の後、95℃、5秒〜60℃、30秒を1サイクルとする35サイクルのリアルタイムPCRにより行った。また、リアルタイムPCRの終了後には融解曲線分析を行った。さらに、各コピー数のプラスミドDNAを鋳型として用いたリアルタイムPCRの結果より検量線を作成し、得られた検量線よりrAAV2ベクター由来の粗精製ゲノムの定量解析を行った。
SEQ ID NO:2 ; Designed PCR primer "L2"
SEQ ID NO:3 ; Designed PCR primer "L3"
SEQ ID NO:4 ; Designed PCR primer "L4"
SEQ ID NO:5 ; Designed PCR primer "L5"
SEQ ID NO:6 ; Designed PCR primer "L6"
SEQ ID NO:7 ; Designed PCR primer "R1"
SEQ ID NO:8 ; Designed PCR primer "R2"
SEQ ID NO:9 ; Designed PCR primer "R3"
SEQ ID NO:10 ; Designed PCR primer "R4"
SEQ ID NO:11 ; Designed PCR primer "R5"
SEQ ID NO:12 ; Designed PCR primer "R6"
SEQ ID NO:13 ; Designed PCR primer "R7"
Claims (10)
- アデノ随伴ウイルスゲノムの定量方法であって、
(a)検体、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも1対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物を調製する工程、
(b)工程(a)により調製した組成物を用いて核酸増幅反応を行う工程、並びに
(c)工程(b)により得られた増幅産物を検出する工程、
を含む方法;
ここで、当該プライマー対は、配列表の配列番号1又は2で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号7又は8で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対である。 - プライマー対が、配列表の配列番号1で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号7で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、請求項1に記載の方法。
- インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 請求項1〜3いずれかに記載の方法によりアデノ随伴ウイルスゲノムを定量する工程を包含する、アデノ随伴ウイルスの力価測定方法。
- アデノ随伴ウイルスゲノムを定量するための組成物であって、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも1対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物;
ここで、当該プライマー対は、配列表の配列番号1又は2で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号7又は8で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対である。 - プライマー対が、配列表の配列番号1で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号7で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、請求項5に記載の組成物。
- インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、請求項5又は6に記載の組成物。
- アデノ随伴ウイルスゲノムの定量用のキットであって、DNAポリメラーゼ、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも1対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含むキット;
ここで、当該プライマー対は、配列表の配列番号1又は2で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号7又は8で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対である。 - プライマー対が、配列表の配列番号1で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号7で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、請求項8に記載のキット。
- インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、請求項8又は9に記載のキット。
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