CN105765066B - 用于定量腺伴随病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

用于定量腺伴随病毒基因组的方法，包括以下步骤：(a)制备包含样品、用于仅扩增腺伴随病毒的反向末端重复序列中包含的核苷酸序列的至少一个引物对、和嵌入染料的组合物；(b)使用步骤(a)中制备的组合物进行核酸扩增反应；和(c)检测步骤(b)中获得的扩增产物。本发明尤其可用于医学、基因改造和生物学领域。

Description

用于定量腺伴随病毒的方法
技术领域
本发明涉及用于定量腺伴随病毒(AAV)基因组的方法、AAV的效价测定方法、用于定量AAV基因组的组合物、用于定量AAV基因组的试剂盒、用于定量AAV的方法、用于定量AAV的组合物和用于定量AAV的试剂盒。
背景技术
腺伴随病毒(AAV)是属于细小病毒科(Parvovirus)的线性的单链DNA病毒。AAV可感染许多物种(包括人)的细胞，并且还感染其中分化被终止的不分裂的细胞，例如血细胞、肌肉或神经细胞。野生型AAV对人不致病。另外，AAV颗粒在物理化学上非常稳定。根据这些特征，已经进行了AAV作为基因转导的载体的开发。
AAV颗粒包含具有三种衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)的蛋白质衣壳和其中包围的单链DNA基因组。野生型AAV的基因组具有在两个末端处形成称为ITR (反向末端重复序列)的T形发夹结构的核苷酸序列，并且末端之间的线性单链基因组的一半编码Rep蛋白(rep基因)，和剩余的一半编码衣壳蛋白(cap基因)。迄今已知至少十三种血清型(AAV 1-13)作为对人有感染性的野生型AAV。
典型的重组腺伴随病毒载体(rAAV载体)具有其中AAV基因组的rep基因和cap基因被所需的基因等置换的基因组结构。用于制备rAAV载体的方法的一个实例包括以下的方法，其包括共同将其中目的基因插入在AAV的两个末端的ITR之间的载体质粒、用于提供AAV复制或病毒颗粒形成所需的病毒蛋白的辅助质粒和具有用作AAV增殖所需的腺病毒的辅助作用的一部分基因区的腺病毒辅助质粒引入至宿主细胞例如293细胞，以在宿主细胞的细胞核中产生rAAV载体。当rAAV载体用于细胞的基因转导时，有必要制备具有足够高的效价的rAAV载体。因此，在制备rAAV载体中必须测定效价。
作为rAAV的效价的测定方法，已经使用DNA印迹方法、点印迹方法和实时PCR方法等。在它们当中，从操作的便利和快速等的观点上来看，认为利用实时PCR方法是优选的。rAAV载体的ITR具有难以进行PCR扩增的二级结构。因此，作为根据实时PCR测定rAAV载体的效价的靶序列，已经利用插入载体中的外源基因。然而，当外源基因用作靶序列时，有必要对构建的每个载体设计用于PCR的引物。最近，报道了根据使用TaqMan探针的实时PCR的rAAV载体的效价的测定方法，其中仅ITR序列是靶序列(非专利文献1)。然而，与使用嵌入染料的定量实时PCR相比，在使用TaqMan探针的实时PCR中合成双标记的核酸探针是必要的，以致其更加昂贵。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Human Gene Therapy Methods, 2012年2月, Part B 23, 18-28。
发明简述
发明要解决的问题
因此，本发明的目的是提供方便和高度有效的用于定量腺伴随病毒(AAV)的方法、AAV的效价测定方法、用于定量AAV基因组的方法、用于定量AAV的组合物、用于定量AAV基因组的组合物、用于定量AAV的试剂盒和用于定量AAV基因组的试剂盒。
解决问题的手段
本发明人为解决上述问题而深入尝试，结果发现，根据使用嵌入染料并以ITR序列单独作为靶序列的定量实时PCR，有可能进行AAV基因组的定量。本发明藉此完成。
换句话说，本发明涉及以下[1]至[13]：
[1] 用于定量腺伴随病毒基因组的方法，包括以下步骤：
(a) 制备包含样品、用于仅扩增腺伴随病毒的反向末端重复序列中包含的核苷酸序列的至少一个引物对和嵌入染料的组合物；
(b) 使用步骤(a)中制备的组合物进行核酸扩增反应；和
(c) 检测步骤(b)中获得的扩增产物。
[2] 根据[1]的方法，其中所述引物对由以下引物组成：包含序列表的SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的引物和包含序列表的SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列的引物。
[3] 根据[1]或[2]的方法，其中所述引物对由以下引物组成：由序列表的SEQ IDNO: 1或2所示的核苷酸序列组成的引物和由序列表的SEQ ID NO: 7或8所示的核苷酸序列组成的引物。
[4] 根据[1]-[3]中任一项的方法，其中所述嵌入染料包含基于花菁的染料。
[5] 腺伴随病毒的效价测定方法，包括根据[1]-[4]中任一项定义的方法定量腺伴随病毒基因组的步骤。
[6] 用于定量腺伴随病毒基因组的组合物，所述组合物包含用于仅扩增腺伴随病毒的反向末端重复序列中包含的核苷酸序列的至少一个引物对和嵌入染料。
[7] 根据[6]的组合物，其中所述引物对由以下引物组成：包含序列表的SEQ IDNO: 1所示的核苷酸序列的引物和包含序列表的SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列的引物。
[8] 根据[6]或[7]的组合物，其中所述引物对由以下引物组成：由序列表的SEQID NO: 1或2所示的核苷酸序列组成的引物和由序列表的SEQ ID NO: 7或8所示的核苷酸序列组成的引物。
[9] 根据[6]-[8]中任一项的组合物，其中所述嵌入染料包含基于花菁的染料。
[10] 用于定量腺伴随病毒基因组的试剂盒，所述试剂盒包含DNA聚合酶、用于仅扩增腺伴随病毒的反向末端重复序列中包含的核苷酸序列的至少一个引物对和嵌入染料。
[11] 根据[10]的试剂盒，其中所述引物对由以下引物组成：包含序列表的SEQ IDNO: 1所示的核苷酸序列的引物和包含序列表的SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列的引物。
[12] 根据[10]或[11]的试剂盒，其中所述引物对由以下引物组成：由序列表的SEQ ID NO: 1或2所示的核苷酸序列组成的引物和由序列表的SEQ ID NO: 7或8所示的核苷酸序列组成的引物。
[13] 根据[10]-[12]中任一项的试剂盒，其中所述嵌入染料包含基于花菁的染料。
在此处，作为用于本发明的基于花菁的染料，可使用CAS登记号163795-75-3的由下式(I)表示的[2-[N-(3-二甲基氨基丙基)-N-丙基氨基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉]或其盐。换句话说，可使用N’,N’-二甲基-N-[4-[(E)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1--2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺或其盐。这些被称为SYBR(注册商标) Green I。此外，基于花菁的染料可以是顺式-反式异构体，和可使用由下式(II)表示的N’,N’-二甲基-N-[4-[(Z)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1--2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺或其盐。
(I)
其中R1是：
，和
R2是：
。
(II)
其中R1是：
，和
R2是：
。
发明效果
根据本发明，可提供方便和高度有效的用于定量腺伴随病毒(AAV)的方法、AAV的效价测定方法、用于定量AAV基因组的方法、用于定量AAV的组合物、用于定量AAV基因组的组合物、用于定量AAV的试剂盒和用于定量AAV基因组的试剂盒。
附图简述
[图1] 显示通过实施例3的实时PCR获得的扩增曲线和解链曲线的分析结果的图表，其中图中的L1_R1显示其中引物L1和引物R1用作引物对的反应。
[图2] 显示通过实施例3的实时PCR获得的扩增曲线和解链曲线的分析结果的图表，其中图中的L3_R1表示其中引物L3和引物R1用作引物对的反应。
[图3] 显示通过实施例3的实时PCR获得的扩增曲线和解链曲线的分析结果的图表，其中图中的L5_R1表示其中引物L5和引物R1用作引物对的反应。
[图4] 显示实施例4的实时PCR的结果的图表，其中图中的L1_R1表示其中引物L1和引物R1用作引物对的反应，和对于各引物组，按从上到下的顺序显示，在其中各拷贝数的质粒DNA用作模板的情况下的扩增曲线，在其中各拷贝数的质粒DNA用作模板的情况下的解链曲线的分析结果，在其中源自rAAV2载体的粗略纯化的基因组溶液用作模板的情况下和阴性对照反应的扩增曲线，在其中源自rAAV2载体的粗略纯化的基因组溶液用作模板的情况下和阴性对照反应的解链曲线的分析结果，以及根据其中各拷贝数的质粒DNA用作模板的实时PCR的结果绘制的校准曲线。
具体实施方式
本发明的用于定量腺伴随病毒基因组的方法包括以下步骤：
(a) 制备包含样品、用于仅扩增腺伴随病毒的反向末端重复序列中包含的核苷酸序列的至少一个引物对和嵌入染料的组合物；
(b) 使用步骤(a)中制备的组合物进行核酸扩增反应；和
(c) 检测步骤(b)中获得的扩增产物。
本发明的方法可适用于任何已知血清型的腺伴随病毒(AAV)基因组，其可用于例如，定量选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13的至少一个AVV基因组。本发明的方法中的AAV包括重组腺伴随病毒载体(rAAV载体)，但不特别将本发明限于此。在此处，当本文提及rAAV载体的血清型时，源自衣壳的血清型用作标准。换句话说，假定rAAV载体的血清型根据用于制备rAAV的cap基因的来源来确定，和假定不依赖于包括在rAAV颗粒中的AAV基因组的血清型的来源。例如，在其中衣壳源自AAV6和rAAV颗粒中包括的AVV基因组中的ITR源自AAV2的情况下，在本说明书中假定rAAV载体为血清型6。
本发明的用于定量AAV基因组的方法可用于定量AAV。因此，使用本发明的用于定量AAV基因组的方法的用于定量AAV的方法是本发明的优选实施方案之一。AAV的起始量可通过下述方法来推断：允许在包含AAV的组合物中的AAV颗粒以外的DNA降解或除去，然后从AAV颗粒释放基因组DNA和根据本发明的用于定量AAV基因组的方法定量该基因组DNA。通过按上述测定AAV的量进行的用于rAAV载体的效价测定方法同样是本发明的优选实施方案之一。在此处，通过定量AAV基因组推断的AAV的效价也可称为基因组效价。对于基因组DNA和衣壳而言，rAAV载体可源自不同的AAV血清型。例如，根据本发明的方法，可测定具有带有源自AAV2的ITR和插入在其内部的外源基因的基因组DNA且具有源自非AAV2的血清型的AAV的衣壳的rAAV载体的效价。
本发明的方法中的样品包括通过从其中AAV存在的样品中释放AAV的基因组DNA的步骤获得的样品，或者需要证实AAV的存在或不存在的样品。上述样品包括通过从宿主细胞中提取宿主细胞中产生的AAV的步骤获得的组合物，或者产生AAV的细胞的培养液上清，和优选包括包含通过从产生rAAV载体的细胞提取rAAV载体的步骤获得的rAAV载体的组合物，或者产生rAAV载体的细胞的培养液上清。
用于从宿主细胞提取AAV的方法，例如用于从产生rAAV载体的细胞提取rAAV载体的方法，包括但不特别将本发明限于，例如冻融方法、超声破碎方法和溶液提取方法。溶液提取方法包括使宿主细胞与酸性溶液接触的方法。使宿主细胞与酸性溶液接触的方法可通过下述方式进行：使通过离心或过滤获得的宿主细胞悬浮于酸性溶液中，或加入能够使包含宿主细胞的培养基变酸性的组分至培养基中。酸性溶液的pH包括例如3.0-6.9的pH，优选3.0-6.0的pH和更优选3.0-5.0的pH。此外，酸性溶液包括，但不特别将本发明限于，包含选自以下的至少一个成员的溶液：柠檬酸、乙酸、苹果酸、磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、乳酸、丙酸、丁酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、酒石酸、苯甲酸、磺基水杨酸、甲酸和其盐，和具有pH低于7的缓冲区的Good缓冲剂，例如MES和Bis-Tris，和在本发明中优选包括柠檬酸、乙酸、磷酸和其盐，和其中更优选包括柠檬酸。
用于将宿主细胞与酸性溶液接触的时间包括，但不特别将本发明限于，例如1分钟至48小时，和优选5分钟至24小时。将宿主细胞与酸性溶液接触时的温度条件包括，例如0-40℃和优选4-37℃。从宿主细胞提取的AAV提取物可包含源自宿主细胞的DNA。例如，AAV提取物可经过脱氧核糖核酸酶处理，和该DNA可被降解。
为了从AAV释放基因组DNA，可使用允许破坏AAV的衣壳的已知方法，其包括例如，用包含蛋白变性剂或表面活性剂的溶液处理AAV以释放基因组DNA的方法，和允许通过热处理破坏AAV的衣壳的方法。由此制备的包含释放的AAV基因组的溶液可在本发明的用于定量AAV的方法中用作样品。
在本发明的方法中用于仅扩增腺伴随病毒的反向末端重复序列中包含的核苷酸序列的至少一个引物对不特别受到限制，只要所述引物对能够通过使用利用嵌入染料的定量核酸扩增反应来定量AAV载体的基因组DNA。当本发明的方法用于定量rAAV载体的基因组DNA时，所述引物对是，但不特别将本发明限于，优选用于仅扩增包含AAV的ITR的核苷酸序列的至少一个引物对，所述AAV是选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV6和AAV7的至少一个成员。
上文提及的引物对优选包括，例如
由以下引物组成的引物对：由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列组成的引物和由SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列组成的引物，
由以下引物组成的引物对：由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列组成的引物和由SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列组成的引物，
由以下引物组成的引物对：由SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列组成的引物和由SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列组成的引物，和
由以下引物组成的引物对：由SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列组成的引物和由SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列组成的引物。
这些引物基于源自AAV2和AAV6的ITR序列而设计，和引物可用于定量AAV1、AAV2、AAV3、AAV6和AAV7的AAV基因组或具有源自这些血清型的AAV的ITR的rAAV载体的基因组。从通过实时PCR计算的Ct值和模板量之间的关系、用于获得高相关性的模板量的范围和PCR的扩增效率的观点来看，引物对更优选包括由以下引物组成的引物对：由序列表的SEQ IDNO: 1所示的核苷酸序列组成的引物和由序列表的SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列组成的引物。在本发明的方法中用于核酸扩增反应的各引物的量包括，但不将本发明限于，每25 μL的核酸扩增反应的反应溶液，0.5-15 pmol，优选1-10 pmol和更优选2-8 pmol，例如5pmol。
本文使用的嵌入染料是指通过嵌入双链核酸中增强其荧光的染料。本发明的嵌入染料不特别受到限制，和本发明的嵌入染料包括通过嵌入核酸增强荧光的任何染料。染料包括，但不特别限于例如，溴化乙锭和基于花菁的染料。上述基于花菁的染料包括SYBR(注册商标) Green I、PicoGreen、YOYO、TOTO、SYTO9、LCGreen、EvaGreen和其类似物等。其中，本发明的方法中的嵌入染料优选是SYBR(注册商标) Green I。
SYBR(注册商标) Green I是不对称的基于花菁的染料，其结构由Zipper H等阐明(Nucleic Acids Research, 2004, 32(12), e103)。在该出版物中，其被分析为由下式(I)表示的[2-[N-(3-二甲基氨基丙基)-N-丙基氨基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉]或其盐。换句话说，其是N’,N’-二甲基-N-[4-[(E)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1--2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺或其盐。这些被称为SYBR(注册商标) Green I。此外，所述染料可以是由上式(I)表示的化合物的顺式-反式异构体，和也可使用由下式(II)表示的N’,N’-二甲基-N-[4-[(Z)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1--2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺或其盐。
(I)
其中R1是：
，和
R2是：
。
(II)
其中R1是：
，和
R2是：
。
根据Zipper H等，由Life Technologies出售的SYBR(注册商标) Green I，其是在SYBR (注册商标) Green I的DMSO溶液中摩尔浓度10,000-倍稀释(× 1浓度)的SYBR(注册商标) Green I，为大约2 μM。适合于定量核酸扩增反应的嵌入染料的浓度可以由本领域普通技术人员参照已知信息适当测定，和浓度包括例如，× 0.025浓度(大约50 nM)或更高，优选× 0.05浓度(大约100 nM)至× 2浓度(大约4 μM)，和更优选× 0.1浓度(大约200nM)至× 1浓度(大约2 μM)。
可用于本发明的方法的核酸扩增反应包括，但不特别将本发明限于，例如本领域众所周知的核酸扩增反应，例如聚合酶链反应(PCR)、ICAN、LAMP和SDA，和其中优选包括PCR，只要所述反应用DNA作为模板合成与其互补的DNA。
在其中PCR用于本发明的方法的情况下，一般性条件可适用作PCR的温度循环条件。PCR通过例如下述反应进行：包含以下三个步骤的反应：解离双链模板DNA为单链(变性)，退火引物至单链模板DNA和从引物合成互补链(延伸)；或者包含两个步骤反应的反应，其中在上述的三个步骤反应中引物的退火和延伸在相同温度下进行，称为“穿梭PCR”[“PCR Ho Saizensen (Front Line of PCR Method),” “(Tanpakushitsu Kakusan Koso (Proteins, Nucleic Acids and Enzymes)” Supplement, 41(5), 425 to 428 (1996)]。PCR的温度循环为，但不特别将本发明限于，小于40个循环，和例如优选35个循环左右，以避免产生非特异性扩增产物。温度循环包括，但不特别限于，在95℃处理2分钟和之后35个反应循环(一个循环包括95℃ 5秒和60℃ 30秒)。
在本发明的方法中通过核酸扩增反应获得的扩增产物可通过测定嵌入染料的荧光强度来检测。嵌入染料的荧光强度的测定可在进行核酸扩增反应的步骤过程中进行，在该情况下，可监测核酸扩增过程。在监测核酸扩增过程中，可使用例如市售可得的用于实时PCR的仪器，例如Thermal Cycler Dice(注册商标) Real Time System II (由TAKARA BIOINC.制造)。
在使用核酸扩增过程的监测结果来定量DNA中，可使用本领域已知的方法。尽管不特别限制本发明，但例如，制备具有根据用于核酸扩增反应的引物对用作核酸扩增的模板的核苷酸序列的连续稀释的标准DNA (阳性对照DNA)，Ct值根据实时PCR计算，其中稀释系列用作模板，以绘制校准曲线，和样品中的DNA可基于曲线来定量。作为上述标准核酸，可使用例如质粒DNA。作为用于计算Ct值的方法，可使用例如，其中阈值和扩增曲线的相交点被定义为Ct值的方法(交叉点方法)，或者其中获得扩增曲线的二阶导数函数和二阶导数处于最大值的点被定义为Ct值的方法(二阶导数最大值方法)。
本发明的方法可包括进一步进行解链曲线分析的步骤。在解链曲线分析中，在核酸扩增反应后反应混合物的温度逐渐增加，和在温度升高期间监测嵌入染料的荧光信号。核酸扩增产物形成双链，和在低温时显示强的荧光信号，但在达到某一温度时它们离解成单链，其中嵌入染料的荧光信号的强度显著降低。此时的温度是解链温度(Tm值)。根据解链曲线分析，可检查扩增产物的Tm值以证实扩增产物是否是特异性的扩增产物。
本发明的用于定量腺伴随病毒基因组的组合物包含用于仅扩增腺伴随病毒的反向末端重复序列中包含的核苷酸序列的至少一个引物对和嵌入染料，其可用于进行本发明的方法。本发明的组合物还可包含选自DNA聚合酶、反应缓冲剂、二价金属离子和脱氧核糖核苷酸三磷酸的至少一个成员。
用于本发明的DNA聚合酶不特别受到限制，只要所述聚合酶具有以DNA作为模板合成与其互补的DNA的活性。尽管不特别限制本发明，但用于本发明的DNA聚合酶优选是热稳定的DNA聚合酶。上述的DNA聚合酶包括源自真细菌的热稳定的DNA聚合酶，例如源自属于栖热菌属(Thermus)的细菌的DNA聚合酶(源自栖热水生菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶等)，和源自属于芽孢杆菌属(Bacillus)的嗜热细菌的DNA聚合酶(源自热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)的DNA聚合酶等)；和源自古细菌的热稳定的DNA聚合酶，例如源自属于火球菌属(Pyrococcus)的古细菌的DNA聚合酶(源自火球菌(Pyrococcussp.)的DNA聚合酶等)和源自属于热球菌属(Thermococcus)的古细菌的DNA聚合酶(源自Thermococcus kodakaraensis的DNA聚合酶等)。此外，任何天然存在的酶和重组酶的DNA聚合酶可用于本发明，和其中天然存在的氨基酸序列在具有DNA聚合酶活性的范围内被修饰的DNA聚合酶也可用于本发明。
本发明的组合物可包含两个或更多个类型的DNA聚合酶。所述两个或更多个类型的DNA聚合酶包括具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶和基本上不具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的组合。在此处，用包含上述的两种类型的DNA聚合酶的反应混合物进行PCR的技术被称为LA-PCR (Long and Accurate PCR)。尽管不特别限制本发明，但在本发明中，具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶和基本上不具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的组合是优选的。
本发明的组合物中DNA聚合酶的浓度不特别受到限制，只要所述浓度是DNA合成反应可得以进行的浓度，和所述浓度包括例如，PCR可得以进行的浓度。在其中以25 μL的反应混合物使用源自栖热水生菌的DNA聚合酶进行PCR的情况下，反应混合物中的DNA聚合酶的量可调整至0.125-5 U左右。在此处，本文所述的热稳定的DNA聚合酶的活性基于市售可得的酶的指示，和例如，用于在74℃在30分钟内在活性测定的反应混合物(25 mM TAPS缓冲液(pH 9.3, 25℃)、50 mM KCl、2 mM MgCl2、1 mM 2-巯基乙醇、200 μM各dATP、dGTP和dTTP；100 μM [α-32P]dCTP、0.25 mg/mL活化的鲑鱼精DNA)中使用活化的鲑鱼精DNA作为模板/引物掺入10 nmol的呈酸不溶性沉淀的所有核苷酸的活性被定义为1 U。
本文使用的反应缓冲剂是指具有缓和反应溶液的氢离子浓度(pH)的变动的作用的化合物或混合物。一般而言，因为弱酸或其盐或者弱碱或其盐的混合溶液具有强的缓冲作用，所以该混合溶液已广泛用作反应缓冲剂用于pH控制的目的。尽管不特别限制本发明，但本发明的组合物的pH合适设置到进行PCR的普通范围，例如pH范围为8.0-9.5。
本发明的组合物中包含的二价金属离子包括镁离子、锰离子和钴离子。适合于各DNA聚合酶的二价金属离子和其浓度是本领域众所周知的。二价金属离子可以盐的形式提供，例如盐酸盐、硫酸盐或乙酸盐。尽管不特别限制本发明，但本发明的组合物中的二价金属离子的浓度包括例如0.5-20 mM。
脱氧核糖核苷酸是其中磷酸基团与结合至有机碱的脱氧核糖通过磷酸二酯桥结合的化合物。在天然存在的DNA中发现四种类型的脱氧核糖核苷酸，各自具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶碱。在许多情况下腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶碱分别简写为A、G、C和T。脱氧核糖核苷酸包括释放的一磷酸类型、二磷酸类型和三磷酸类型(换句话说，具有分别具有一个、二个或三个磷酸基团的磷酸部分)。此外，已知碱部分具有次黄嘌呤或尿嘧啶的脱氧核糖核苷三磷酸可用于核酸扩增反应。在本发明的组合物中，可使用脱氧核糖核苷三磷酸(例如dATP、dCTP、dITP、dGTP、dTTP和dUTP)和其衍生物的至少一个成员。本发明的组合物中可包含的脱氧核糖核苷三磷酸优选包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP (或dUTP)的混合物。
本发明的用于定量腺伴随病毒的试剂盒包含DNA聚合酶、用于仅扩增腺伴随病毒的反向末端重复序列中包含的核苷酸序列的至少一个引物对和嵌入染料。DNA聚合酶、用于仅扩增腺伴随病毒的反向末端重复序列中包含的核苷酸序列的至少一个引物对和嵌入染料可以在其中它们的一部分或全部被混合的情况下包含在试剂盒中，或者可以在其中各自为单一组分的情况下包括在试剂盒中。
本发明的试剂盒还可包含选自以下的至少一个成员：反应缓冲剂、二价金属离子、脱氧核糖核苷酸三磷酸、用于从宿主细胞提取AAV的试剂、用于降解或除去AAV的病毒颗粒以外的DNA的试剂、用于从AAV释放AAV基因组的试剂、用于稀释DNA溶液的试剂和用于绘制校准曲线的阳性对照DNA。
用于从上述宿主细胞提取AAV的试剂包括，但不将本发明限于，具有pH为3.0-6.9、优选pH为3.0-6.0和更优选pH为3.0-5.0的酸性溶液。此外，酸性溶液包括，但不特别将本发明限于，包含选自以下的至少一个成员的溶液：柠檬酸、乙酸、苹果酸、磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、乳酸、丙酸、丁酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、酒石酸、苯甲酸、磺基水杨酸、甲酸和其盐，和具有pH小于7的缓冲区的Good缓冲剂，例如MES和Bis-Tris。在本发明中，其中优选包括柠檬酸、乙酸、磷酸和其盐，和更优选包括柠檬酸。
上述用于降解或除去AAV的病毒颗粒以外的DNA的试剂包括例如，脱氧核糖核酸酶(DNase)，例如DNase I。当DNase用作用于降解或除去AAV的病毒颗粒以外的DNA的试剂时，本发明的试剂盒可进一步包含用于DNase的反应缓冲液。
上述用于从AAV的颗粒释放AAV基因组DNA的试剂包括例如，包含蛋白变性剂或表面活性剂的溶液。
上述用于绘制校准曲线的阳性对照DNA包括包含能够用本发明的试剂盒中包含的引物对进行核酸扩增的核苷酸序列的核酸。上述核酸包括例如质粒DNA。
实施例
在不旨在限制本发明的范围至以下实施例的情况下，本发明将通过下文提供的实施例进行更具体描述。在此处，作为在以下实施例中实时PCR的反应器，使用ThermalCycler Dice(注册商标) Real Time System II (由TAKARA BIO INC.制造)。
实施例1：设计引物
基于AAV2的基因组核苷酸序列信息(RefSeq Acc. No. NC 001401)设计针对AAV2型(下文称AAV2)的ITR的5’-端引物和3’-端引物。存在六种5’-端引物：L1 (SEQ ID NO:1)、L2 (SEQ ID NO: 2)、L3 (SEQ ID NO: 3)、L4(SEQ ID NO: 4)、L5(SEQ ID NO: 5)和L6(SEQ ID NO: 6)，和七种3’-端引物：R1 (SEQ ID NO: 7)、R2 (SEQ ID NO: 8)、R3 (SEQ IDNO: 9)、R4 (SEQ ID NO: 10)、R5 (SEQ ID NO: 11)、R6 (SEQ ID NO: 12)和R7 (SEQ IDNO: 13)。
实施例2：制备粗略纯化的源自rAAV2载体的基因组
(1) 接种细胞以产生rAAV2载体
将悬浮在包含10% FBS (由GIBCO制造)的DMEM (由Sigma制造)中的293细胞接种到用于细胞培养的10 cm平皿(由Corning制造)中。之后，用CO2培养箱在37℃将细胞培养过夜，并证实细胞接近70%汇合。
(2) 转染质粒用于产生rAAV2载体
使用磷酸钙方法，用下述质粒转染在上述实施例2-(1)中制备的细胞：编码AAV2的Rep蛋白和Cap蛋白的质粒；带有腺病毒的E2A、VA和V4序列的质粒；和在AAV2的两个ITR之间带有荧光蛋白ZsGreen1的表达盒的质粒。在细胞转染7小时后，完全除去培养基，然后以体积15 mL/平皿加入包含10% FBS的DMEM，和在CO2培养箱中在37℃培养细胞2天。
(3) 收获产生rAAV2载体的细胞
在终止(2)的培养后，加入3 mL的包含20 mM EDTA的PBS溶液至各平皿，和在室温下反应几分钟以除去细胞。之后，连同溶液一起收获细胞和在4℃以1,750 × g离心10分钟，然后除去上清液。加入包含柠檬酸的酸性缓冲液至细胞沉淀，将混合物离心，将其上清液称为rAAV2载体提取物。获得的rAAV2载体提取物中AAV2的病毒颗粒以外的核酸用DNaseI消化，和然后使用蛋白变性剂从AAV2颗粒释放基因组DNA。由此获得的溶液被称为粗略纯化的源自rAAV2载体的基因组溶液。
实施例3：用于选择引物对的筛选
实施例1中设计的六种5’-端引物和七种3’-端引物经组合以得到引物对(总共42种组合)，和筛选有效定量AAV基因组的引物对。当筛选时，使用SYBR(注册商标) Premix ExTaq II(Tli RNaseH Plus) (由TAKARA BIO INC.制造)，和用以下反应组合物进行筛选。将量12.5 μL的SYBR(注册商标) Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2 ×浓度)、0.5 μL的各10 μM引物混合物和5.0 μL的模板混合，和向其中加入无菌水，补足总体积25 μL。作为模板，在实施例2中制备的源自rAAV2载体的粗略纯化的基因组溶液用作阳性对照。制备除了使用无菌水代替模板之外具有相同反应组成的反应混合物并用作阴性对照。对每个引物对以及阴性对照和阳性对照，以两次运行进行反应。使用Thermal Cycler Dice(注册商标) Real Time System II，根据实时PCR进行反应和检测，其包括95℃ 2分钟(起始变性)和之后35个反应循环，其中一个反应循环包括95℃ 5秒和60℃ 30秒。此外，在终止PCR后，进行解链曲线分析。
对每个引物对概述的通过实时PCR获得的扩增曲线和解链曲线的分析结果显示在图1、2和3中。此外，根据结果，对于在阳性对照中的反应性，对各引物对进行的判断显示在表1中，和对于在阴性对照中存在或不存在非特异性扩增，对各引物对进行的判断显示在表2中。在表1中，“○”代表发现具有优异的扩增信号的组合，和“×”代表未发现如此的组合。在表2中，分别地，“○”代表发现不具有非特异性扩增信号的组合，和“×”代表发现具有非特异性扩增信号的组合。
[表1]
表1
[表2]
表2
根据这些结果，关于引物组合，在所有42种组合中仅L1/R1、L1/R2、L2/R1和L2/R2的组合有前景。
实施例4：定量的证实
用根据实施例3具有前景的引物组L1/R1、L1/R2、L2/R1和L2/R2的4种组合进行定量的证实。使用SYBR(注册商标) Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)，用以下反应组合物进行定量的证实：将12.5 μL的SYBR(注册商标) Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2 ×浓度)、0.5 μL的上述四种组合的各10 μM引物混合物和5.0 μL的模板混合，和向其中加入无菌水以补足总体积25 μL。制备的反应混合物用作模板：一份使用实施例2中制备的粗略纯化的源自rAAV2载体的基因组溶液，一份使用10倍连续稀释(1 × 102拷贝/ 5 μL、1× 103拷贝/ 5 μL、1 × 104拷贝/ 5 μL、1 × 105拷贝/ 5 μL、1 × 106拷贝/5 μL或1 ×107拷贝/5 μL)的带有AAV2的ITR中的扩增区的质粒DNA，和一份作为阴性对照使用无菌蒸馏水代替模板。按照实时PCR进行反应和检测，其包括95℃ 2分钟(起始变性)和之后35个反应循环，其中一个反应循环包括95℃ 5秒和60℃ 30秒。此外，在终止实时PCR后，进行解链曲线分析。此外，根据实时PCR的结果使用各拷贝数的质粒DNA作为模板绘制校准曲线，和根据获得的校准曲线进行粗略纯化的源自rAAV2载体的基因组的定量分析。
结果显示在图4中。关于各引物组，按从上到下的次序，图4显示，在其中各拷贝数的质粒DNA用作模板的情况下的扩增曲线、在其中各拷贝数的质粒DNA用作模板的情况下的解链曲线的分析结果、在其中粗略纯化的源自rAAV2载体的基因组溶液用作模板的情况下或阴性对照的反应的扩增曲线、在其中粗略纯化的源自rAAV2载体的基因组溶液用作模板的情况下或阴性对照的反应的解链曲线的分析结果、和校准曲线。如根据图4清楚可见，所有引物组具有优异的定量，以致rAAV2的基因组DNA可被定量。此外，未发现非特异性扩增。在L1/R1的组合中，在1 × 103拷贝至1 × 107拷贝的模板量的范围内获得其相关系数(R2)为1.000的校准曲线。另外，在其中在该模板量的范围内L1/R1用作引物组的情况下的反应效率为99.7%，其为在使用四种引物组的反应中最接近100%的反应效率。根据该实施例可见，引物组L1/R1、L1/R2、L2/R1和L2/R2的四种组合作为用于定量AAV2的基因组DNA的引物组是优异的，其中L1/R1的组合是最优异的。
工业适用性
本发明可尤其用于医学、基因工程和生物学领域。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1：设计的PCR引物"L1"
SEQ ID NO: 2：设计的PCR引物"L2"
SEQ ID NO: 3：设计的PCR引物"L3"
SEQ ID NO: 4：设计的PCR引物"L4"
SEQ ID NO: 5：设计的PCR引物"L5"
SEQ ID NO: 6：设计的PCR引物"L6"
SEQ ID NO: 7：设计的PCR引物"R1"
SEQ ID NO: 8：设计的PCR引物"R2"
SEQ ID NO: 9：设计的PCR引物"R3"
SEQ ID NO: 10：设计的PCR引物"R4"
SEQ ID NO: 11：设计的PCR引物"R5"
SEQ ID NO: 12：设计的PCR引物"R6"
SEQ ID NO: 13：设计的PCR引物"R7"。

Claims (7)

1.用于定量腺伴随病毒基因组的方法，包括以下步骤：
(a) 制备包含样品、用于仅扩增腺伴随病毒的反向末端重复序列中包含的核苷酸序列的至少一个引物对、和嵌入染料的组合物；
(b) 使用步骤(a)中制备的组合物进行核酸扩增反应；和
(c) 检测步骤(b)中获得的扩增产物，
其中所述引物对由以下引物组成：由序列表的SEQ ID NO: 1或2所示的核苷酸序列组成的引物和由序列表的SEQ ID NO: 7或8所示的核苷酸序列组成的引物。
2.权利要求1的方法，其中所述嵌入染料包含基于花菁的染料。
3.腺伴随病毒的效价测定方法，包括根据权利要求1或2定义的方法定量腺伴随病毒基因组的步骤。
4.用于定量腺伴随病毒基因组的组合物，所述组合物包含用于仅扩增腺伴随病毒的反向末端重复序列中包含的核苷酸序列的至少一个引物对和嵌入染料，
其中所述引物对由以下引物组成：由序列表的SEQ ID NO: 1或2所示的核苷酸序列组成的引物和由序列表的SEQ ID NO: 7或8所示的核苷酸序列组成的引物。
5.权利要求4的组合物，其中所述嵌入染料包含基于花菁的染料。
6.用于定量腺伴随病毒基因组的试剂盒，所述试剂盒包含DNA聚合酶、用于仅扩增腺伴随病毒的反向末端重复序列中包含的核苷酸序列的至少一个引物对和嵌入染料，
其中所述引物对由以下引物组成：由序列表的SEQ ID NO: 1或2所示的核苷酸序列组成的引物和由序列表的SEQ ID NO: 7或8所示的核苷酸序列组成的引物。
7.权利要求6的试剂盒，其中所述嵌入染料包含基于花菁的染料。
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