KR102069561B1

KR102069561B1 - 외피 비보유 바이러스의 제조 방법

Info

Publication number: KR102069561B1
Application number: KR1020167001867A
Authority: KR
Inventors: 슈헤이 사카모토; 야스히로 카와노; 카츠유키 도도; 타츠지 에노키; 히로후미 요시오카; 히카루 타카쿠라; 준이치 미네노
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 2013-07-11
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2020-01-23
Also published as: JPWO2015005430A1; EP3020808A1; CN116656627A; WO2015005430A1; CN105339495A; US20160152955A1; EP3020808B1; JP5861001B2; US10072250B2; EP3020808A4; KR20160027018A

Abstract

본 발명은 외피 비보유 바이러스를 생산하는 능력을 갖는 세포를 배양하고 이 세포를 산성 용액과 접촉시켜 힘든 조작없이 효율적으로 고순도의 외피 비보유 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 외피 비보유 바이러스와 당해 외피 비보유 바이러스를 유효 성분으로 하는 조성물은 유전자 치료의 기초 연구 및 임상 응용 분야에서 유전자 도입 방법으로서 매우 유용하다.

Description

외피 비보유 바이러스의 제조 방법{METHOD FOR MANUFACTURING NON-ENVELOPED VIRUS}

본 발명은 외피 비보유 바이러스를 복잡한 조작없이 효율적으로 고순도로 제조하는 방법에 관한 것이다.

현재 유전자 재조합 분야와 의료 분야에서는 인간을 포함한 포유동물 세포에 유전자를 도입하는 방법으로 전기 천공이나 금속 미립자를 이용하는 물리적 방법, 핵산, 폴리양이온 또는 리포좀을 이용하는 화학적 방법 뿐만 아니라, 바이러스를 벡터로 이용한 유전자 도입용 벡터 (이하, 바이러스 벡터라 함)를 사용하는 생물학적 방법이 이용되고 있다. 바이러스를 벡터로 사용한 유전자 도입용 벡터는 천연 바이러스를 변경하여 원하는 유전자 등을 대상으로 이입할 수 있도록 한 벡터로, 최근 기술 개발이 진행되고 있다. 일반적으로 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조한 벡터는 재조합 바이러스 벡터로 불린다. 그런 재조합 바이러스 벡터의 유래가 되는 바이러스로는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 센다이 바이러스 및 헤르페스 바이러스 등의 외피를 가지는 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 (이하 AAV로 칭함) 등의 외피를 보유하지 않는 바이러스가 잘 알려져 있다.

특히, AAV는 인간을 포함한 광범위한 종류의 세포를 감염시킬 수 있으며, 심지어는 혈구, 근 세포, 신경 세포 등의 분화를 마친 비-분열 세포를 감염시키기도 한다. 또한, AAV는 인간에 대한 병원성이 없기 때문에 부작용의 위험이 낮다. AAV의 바이러스 입자는 물리화학적으로 안정하다. 이러한 이유로 해서, AAV는 선천성 유전성 질환의 치료뿐 아니라, 암 또는 감염의 치료를 목적으로 한 유전자 치료에 사용되는 유전자 도입용 벡터로서의 이용 가치가 최근 주목받고 있다.

유전자 재조합 바이러스 벡터의 제조 방법은 일반적으로 바이러스 입자 형성에 필수적인 요소를 핵산 작제물(들)의 형태로 세포에 도입하여 바이러스를 생산하는 능력을 갖는 세포 (이하, 바이러스 생산 세포라 함)를 제조하고, 해당 세포를 배양하여 바이러스 입자 형성에 필수적인 요소를 발현시키는 것으로 이루어진다. 일반적으로, 상기 바이러스 입자 형성에 필수적인 요소 중 시스로의 공급을 필요로 하는 요소와 트랜스로 공급 가능한 요소가 분리하여 바이러스 생산을 위한 세포에 도입됨으로써 야생형 바이러스의 생산 및 바이러스 감염 숙주에서 바이러스의 자립 복제가 방지된다 (특허 문헌 1).

이하, AAV로부터 유래한 유전자 재조합 바이러스 벡터 (이하, rAAV 벡터라 함)를 예로 들어 구체적으로 설명한다. 1) 야생형 AAV 게놈의 양단의 ITR을 남기고 rep 및 cap 유전자를 제거한 rAAV 플라스미드의 도입, 2) Rep 및 Cap 단백질을 트랜스에 공급하기 위한 rep 및 cap 유전자 발현용 플라스미드의 도입, 및 AAV는 감염성 바이러스 입자 형성에 헬퍼 바이러스라는 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 우두 바이러스 중에서의 보조 요소의 공급을 필요로 하기 때문에 3) 아데노바이러스로의 감염을 이용하는 방법이 확립되어 있다 (특허 문헌 2). 또한, 상기 방법으로 수득한 벡터 용액 중에는 이론적으로 아데노바이러스가 혼입되기 때문에, 아데노바이러스 혼입을 방지하기 위해 상기 공정 3) 대신 공정 3') 아데노바이러스 유래 요소 중 AAV 바이러스 입자 형성에 필수적인 요소만을 발현하는 헬퍼 플라스미드의 도입을 이용하는 제조 방법 (무헬퍼계)이 개발되었다 (특허 문헌 3).

바이러스 생산이 달성된 바이러스 생산 세포는 그 후, 회수되고, 균질화되어 rAAV 벡터를 포함한 세포 균질액이 얻어진다. 세포 균질액을 필터로의 여과, 초원심분리, 크로마토그래피 또는 한외여과 등의 적절한 공정에 제공함으로써 rAAV 벡터가 정제되고 최종물로 된다.

현재, 바이러스 벡터의 이용이 유전자 치료의 기초 연구 또는 임상 응용 분야로 확산됨에 따라 더 높은 역가와 고순도의 바이러스 벡터를 얻을 수 있는 방법이 필요하다. 다양한 개선 방법이 개시되어 있다. 예를 들어, 배양 배지의 pH를 상승시킨 스트레스 조건에서 바이러스 생산 세포를 배양하는 것을 포함하여 바이러스의 생산과 배양 상청액에 바이러스의 방출 비율을 고무시키는 방법 (특허 문헌 1)이 알려져 있다. 다른 방법들은 생산된 바이러스의 정제 시 및 이후의 공정 개선을 포함한다. 한편, 바이러스를 정제하기 전에 실시되는 바이러스 생산 세포의 처리 방법에 대해서는 여전히 개선의 여지가 남아있다.

인용 목록

특허 문헌

특허 문헌 1: WO00/14205호

특허 문헌 2: WO97/06272호

특허 문헌 3: WO97/17458호

발명의 개요

발명이 이루고자 하는 과제

본 발명의 목적은 복잡한 조작없이 효율적으로 고순도의 외피 비보유 바이러스를 얻을 수 있는 제조 방법을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 복잡한 조작없이 효율적으로 고순도의 외피 비보유 바이러스를 얻을 수 있는 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 예의 연구한 결과 바이러스 생산 세포를 배양하여 당해 세포와 산성 용액을 접촉시키는 것으로, 복잡한 조작없이 효율적으로 고순도의 외피 비보유 바이러스가 얻을 수 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 다음과 같이 설명된다. 본 발명은

[1] (a) 외피 비보유 바이러스를 생산하는 능력을 갖는 세포를 배양하는 공정,

(b) 상기 세포와 산성 용액을 접촉시키는 공정, 및

(c) 외피 비보유 바이러스를 수득하는 공정

를 포함하는, 외피 비보유 바이러스의 제조 방법;

[2] 산성 용액의 pH가 3.0 ~ 6.9인 [1]에 기재된 방법;

[3] 산성 용액이 나트륨 이온 및/또는 칼륨 이온을 함유하는 것을 특징으로 하는 [1] 또는 [2]에 기재된 방법;

[4] (c) 공정이 외피 비보유 바이러스를 정제하는 공정을 포함하는, [1] ~ [3] 중 어느 하나에 기재된 방법;

[5] 외피 비보유 바이러스의 정제가 초원심분리, 크로마토그래피 및 한외여과에서 선택되는 조작으로 실시되는 [4]에 기재된 방법;

[6] 외피 비보유 바이러스가 아데노 관련 바이러스 벡터인 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 방법; 및

[7] 산성 용액이 양이온 및 시트르산을 포함하는 것을 특징으로 하는 [1] ~ [6] 중 어느 하나에 기재된 방법;

에 관한 것이다.

본 발명에 의해, 복잡한 조작없이 효율적으로 고순도의 외피 비보유 바이러스를 제조하는 방법이 제공된다. 또한, 당해 제조 방법에 사용되는 산성 용액 및 당해 제조 방법을 이용하여 제조한 외피 비보유 바이러스가 제공된다. 본 발명의 산성 용액을 사용하여 얻은 바이러스 조 추출액은 기존의 외피 비보유 바이러스의 정제 방법에도 적용 가능하다.

[도 1] 실시예 2에서 초원심분리로 정제된 분획들이 영동된 폴리아크릴아미드 겔을 형광 검출한 사진이다.
[도 2] 실시예 3에서 양이온 교환 크로마토그래피로 정제된 분획들이 영동된 폴리아크릴아미드 겔을 형광 검출한 사진이다.
[도 3] 실시예 7에서 헤파린 컬럼 크로마토그래피로 정제된 분획들이 영동된 폴리아크릴아미드 겔을 형광 검출한 사진이다.
[도 4-1] 실시예 10에서의 게놈 역가를 나타내는 그래프이다.
[도 4-2] 실시예 10에서의 단백질 농도 (A280)를 나타내는 그래프이다.
[도 4-3] 실시예 10에서의 AAV 순도를 나타내는 그래프이다.

발명을 실시하기 위한 형태

본 명세서에서 사용된 외피 비보유 바이러스는 외피 보유 바이러스 이외의 바이러스를 말한다. 여기에서 외피 보유 바이러스는 바이러스 표면에 지질층 또는 지질 이중층을 가진 바이러스를 말한다. 외피는 바이러스가 핵, 소포체, 골지체, 원형질막 또는 세포막 등의 막을 관통하고 신진할 때 형성된다. 외피는 일반적으로 숙주 유래 단백질 또는 숙주의 세포막에 발현하는 바이러스의 단백질을 포함하며, 표적 세포로의 감염에 중요한 역할을 담당한다. 외피 비보유 바이러스는 앞서 언급한 바와 같이 외피 보유 바이러스 이외의 바이러스를 말한다. 외피 비보유 바이러스의 대표적인 것으로는 DNA 게놈 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스, 파보바이러스, 파포바바이러스, 인유두종 바이러스, 및 RNA 게놈 바이러스, 예를 들어 로타바이러스, 콕사키 바이러스, 엔테로바이러스, 사포바이러스, 노로바이러스, 폴리오바이러스, 에코바이러스, A형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 리노바이러스, 및 아스트로바이러스 등이 예시된다.

본 발명의 제조 방법으로 제조되는 외피 비보유 바이러스는 생산 방법이 이미 알려져 있는 외피 비보유 바이러스, 천연에서 새롭게 수득한 외피 비보유 바이러스 및 상기 언급된 외피 비보유 바이러스 유래 재조합 바이러스 벡터를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 제조 방법으로 제조되는 외피 비보유 바이러스로는 바람직하게는 아데노바이러스 및 또는 파보바이러스과의 AAV가 예시된다.

본 명세서에서 바이러스를 생산하는 능력을 갖는 세포 (바이러스 생산 세포)는 바이러스 생산에 필요한 요소를 발현하고 바이러스 입자를 생산하는 세포를 가리킨다. 본 발명의 제조 방법에서 사용되는 바이러스 생산 세포에는 환경이나 감염 환자의 임상 검체로부터 얻은 바이러스 생산 세포, 및 인공적으로 제조된 바이러스 생산 세포가 포함되나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는 인공적으로 제조된 바이러스 생산 세포가 본 발명에 사용되며, 그의 예로는 원하는 외피 비보유 바이러스 입자의 형성에 필수적인 요소를 제공하는 핵산 및 외피 비보유 바이러스 입자에 봉입된 핵산을 임의의 세포에 도입하여 제조한 외피 비보유 바이러스 생산 세포와, 원하는 세포에 인공적으로 외피 비보유 바이러스 및/또는 외피 비보유 바이러스를 생산하기 위해 필요한 헬퍼 바이러스를 감염시킨 바이러스 생산 세포를 들 수 있다.

본 명세서에서 바이러스 벡터는 캡시드 (capsid)라고 불리는 단백질 껍질로 구성된 입자, 즉 바이러스 입자를 의미하는 경우 및 상기 바이러스 입자에 포함된 바이러스 게놈 (핵산 모양)을 의미하는 경우가 모두 포함된다. 예를 들어, AAV의 경우, rAAV 벡터는 캡시드를 갖춘 rAAV 입자 또는 rAAV 입자 내에 존재하는 바이러스 게놈 DNA 중 하나를 의미한다. 또한, 본 발명은 바이러스-유사 입자 (예를 들어 AAV 중공 입자: WO2012/144446호)의 경우에도 적용할 수 있다. 따라서 바이러스 입자의 형태는 바이러스-유사 입자 및 바이러스 중공 입자를 포함한다.

이하, rAAV 벡터를 예로 들어 설명한다. rAAV 입자의 형성에 필수적인 요소로서 (A) AAV 유래 Rep 및 Cap 단백질 및 (B) 아데노바이러스 유래 성분, 예를 들면 E1a 단백질, E1b 단백질, E2 단백질, E4 단백질, VA RNA를 제공하는 핵산 서열 등이 예시된다.

"임의의 세포"는 특별한 한정이 없다. "임의의 세포"로는 인간, 원숭이, 설치류 등의 포유동물 세포가 예시되며, 그의 바람직한 예로서는 형질전환 효율이 높은 293 세포 (ATCC CRL-1573), 293T 세포 (ATCC CRL-11268), 293F 세포, 293FT 세포 (모두 Life Technoligies Corp.제), G3T-hi 세포 (WO06/035829호), Sf9 세포 및 상용 바이러스 생산용 세포주, 예를 들어 AAV293 세포 (Stratagene Corp. 제)를 들 수 있다. 예를 들어, 상기 293 세포 등은 아데노바이러스 E1 단백질을 지속적으로 발현한다. 또한, rAAV 생산에 필요한 단백질의 하나 또는 일부를 일시적으로 혹은 지속적으로 발현하도록 변경된 세포도 사용될 수 있다.

상기 rAAV 입자 형성에 필수적인 요소를 제공하는 핵산으로, (a) Rep 단백질을 코딩하는 핵산, Cap 단백질을 코딩하는 핵산, (b) 아데노바이러스 유래 요소를 코딩하는 핵산이 예시된다. 이러한 핵산의 형태에는 제한이 없다. 이들 핵산은 각각의 요소를 제공할 수 있는 1 이상의 핵산 작제물로 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 삽입하여 세포에 도입할 수 있다. (a)에 대한 핵산 작제물로는, 예를 들어 시판 플라스미드인 pRC2-mi342 벡터 및 pHelper 벡터 (TAKARA BIO Inc. 제)가 예시된다. 또한 바큘로바이러스 벡터를 이용하여 (a) 및 (b)의 핵산 작제물을 도입하는 경우는 Bac-Rep 나 Bac-Cap 등의 벡터를 이용할 수 있다. 본 명세서에서 Cap 단백질을 코딩하는 핵산은 Cap 단백질을 코딩하는 것뿐만 아니라, Cap 단백질을 코딩하는 것과 다른 개방형 판독 프레임에서 AAV 입자의 형성에 필요한 어셈블리-활성화 단백질(AAP)도 코딩한다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, Vol. 107, pp. 10220-10225). 별도의 언급이 없으면, 본 명세서에 기재된 "Cap 단백질을 코딩하는 핵산"은 Cap 단백질 외에 AAP도 코딩하는 핵산을 의미한다. Cap 단백질을 코딩하는 핵산에서 AAP의 기능이 손실된 변이가 (자연발생적으로 또는 인공적으로) 발생하는 경우에는, AAP를 코딩하는 핵산이 세포에 추가로 도입될 수 있다. (b)와 관련하여, E1a 및 E1b 단백질을 코딩하는 핵산이 293 세포 등의 게놈에 삽입되어 항시 발현되기 때문에 핵산을 당 세포에 도입할 필요가 없다. E1a 및 E1b 단백질을 코딩하는 핵산은 사용하는 세포에 따라, 필요한 경우 도입될 수 있다.

상기의 rAAV 입자에 봉입된 핵산은 AAV 유래의 ITR 서열과 rAAV 벡터에 탑재하기를 희망하는 핵산으로 구성된다. rAAV 벡터에 탑재하기를 희망하는 핵산으로서는 임의의 외래 유전자, 예를 들어 폴리펩타이드 (효소, 성장 인자, 사이토카인, 리셉터, 구조 단백질 등), 안티센스 RNA, 리보자임, 유인체, RNA 간섭을 유도하는 RNA 등을 제공하는 핵산이 예시된다. 이외에, 외래 유전자의 발현 제어를 위해 적당한 프로모터, 인핸서, 터미네이터 및 기타 전사 조절 요소가 상기 핵산에 삽입될 수 있다. 예를 들어, rAAV 입자에 봉입되는 핵산은 두 ITR 서열 사이에 rAAV 벡터에 탑재하기를 희망하는 임의의 외래 유전자를 포함할 수 있거나, 또는 두 ITR 서열 사이에 rAAV 벡터에 탑재하기를 희망하는 임의의 외래 유전자 및 외래 유전자의 발현 제어를 위한 1종 이상의 요소를 포함할 수 있다. 바이러스 입자에 봉입된 핵산은 핵산 작제물로서 플라스미드의 형태로 세포에 도입될 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들어 시판 pAAV-CMV 벡터 (TAKARA BIO Inc. 제) 등을 사용하여 작제할 수 있다.

핵산 작제물의 도입 방법으로는 일시적 도입 방법 및 지속적 도입 방법이 예시된다.

일시적 도입 방법은 특별한 한정이 없으며, 인산칼슘 방법, 리포펙션 방법, DEAE 덱스트란 방법, 폴리에틸렌이민 방법 및 전기천공 방법 등을 비롯한 공지의 일시적 도입 방법이 사용가능하다. 또한 시판 시약, 예를 들어 TransIT (등록상표)-293 시약 (Mirus Bio LLC 제), TransIT (등록상표)-2020 (Mirus Bio LLC 제), 리포펙타민 2000 시약(Life Technologies Corp. 제), 리포펙타민 2000CD 시약 (Life Technologies Corp. 제), FuGene (등록상표) 형질감염 시약 (Promega Corp.) 등을 사용할 수 있다. 또한 바큘로바이러스 및 곤충 세포의 이용을 포함하는 도입 방법을 이용할 수도 있다.

지속적인 도입 방법은 특별한 한정이 없으며, 레트로바이러스 벡터의 이용을 포함하는 방법 및 플라스미드의 일시적 도입 방법과 동일한 방법으로 세포에 핵산을 도입하고 핵산이 염색체에 통합된 세포를 선택하는 것을 포함하는 방법을 비롯한 공지의 지속적 도입 방법이 사용가능하다. 레트로바이러스 벡터의 이용을 포함하는 방법에 있어서는, 시판 시약, 예를 들어 Retorovirus Constructive System (TAKARA BIO Inc. 제)이 이용될 수 있다.

이상 rAAV 벡터를 예로 들어 설명하였다. 이렇게하여 제조된 외피 비보유 바이러스 생산 세포를 배양하는 것이 본 발명의 외피 비보유 바이러스 생산의 첫 공정이다. 외피 비보유 바이러스 생산 세포의 배양은 공지의 배양 조건으로 수행할 수 있다. 배양 조건으로 예를 들어 온도 30 ~ 37 ℃, 습도 95%, CO₂ 농도 5 ~ 10%에서의 배양이 예시되지만, 이러한 조건에 한정되는 것은 아니다. 원하는 외피 비보유 바이러스 생산 세포의 증식 및 생산을 달성할 수 있다면 세포 배양은 상기 범위 이외의 온도, 습도, CO₂ 농도에서 실시될 수도 있다. 또한 배양 기간은 특별히 한정이 없다. 예를 들어, 배양은 12 ~ 150 시간, 바람직하게는 48 ~ 120 시간동안 지속된다. 외피 비보유 바이러스 생산 세포 배양에 사용되는 배지로는 세포 배양에 필요한 성분을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 배지는 예를 들어, DMEM, IMDM, DMEM: F-12 등의 기본 합성 배지 (이상, Sigma-Aldrich Co. LLC에서 판매)를 포함한다. 또한 필요에 따라 이러한 기본 합성 배지에 소 태아 혈청, 성장 인자류 또는 펩티드류를 첨가하거나, 아미노산류를 증량한 것이 포함될 수 있다.

두 번째 공정은, 상기와 같이 배양된 외피 비보유 바이러스 생산 세포를 산성 용액과 접촉시키는 것으로 이루어진다. 두 번째 공정은 세포 배양 후 원심분리 또는 여과에 의해 배양액을 제거하고 회수된 외피 비보유 바이러스 생산 세포 펠렛을 산성 용액에 현탁하는 조작 또는 외피 비보유 바이러스 생산 세포의 배양액에 배양액을 산성화할 수 있는 성분을 첨가하는 작업에 의해 실시된다. 산성 용액과 접촉시키는 시점에서의 외피 비보유 바이러스 생산 세포는 이미 바이러스 생산이 달성된 상태이다. 산성 용액과 접촉하고 있는 동안 바이러스의 생산과 세포의 증식은 보이지 않는다. 산성 용액과 접촉하고 있을 때의 온도와 시간은 특별히 한정은 없고, 온도로는 예를 들어 0 ~ 40 ℃, 바람직하게는 4 ~ 37 ℃, 시간으로는 예를 들어 1 분 ~ 48 시간, 바람직하게는 5 분 ~ 24 시간이 예시된다. 외피 비보유 바이러스 생산 세포는 산성 용액과 접촉시킨 상태에서 -80 ℃ 등의 초저온 냉동고에서 장기 저장할 수 있다. 이 접촉 조작에 의해 외피 비보유 바이러스가 생산 세포 밖으로 방출된다. 본 발명의 방법은 기존의 방법으로서 일반적인 초음파 파쇄 또는 동결-융해 등의 물리적인 세포 파쇄 방법을 포함해도 되고 포함하지 않아도 된다.

본 명세서에서 산성 용액은 산성을 나타내는 용액을 말한다. 본 발명의 산성 용액은 외피 비보유 바이러스 생산 세포 배양시의 pH 보다 낮은 pH를 나타내고 산성 용액으로 바이러스 생산이 달성된 외피 비보유 바이러스 생산 세포를 처리하여 외피 비보유 바이러스를 포함한 조 추출액이 수득되는 용액이면 제한이 없다. 본 발명에 사용되는 산성 용액으로는 예를 들어, pH 3.0 ~ 6.9, 바람직하게는 pH 3.0 ~ 6.0, 더욱 바람직하게는 pH 3.0 ~ 5.0의 용액이 예시된다. 본 발명에 사용되는 산성 용액으로는, 예를 들어, 시트르산, 아세트산, 말산, 인산, 염산, 황산, 질산, 락트산, 프로피온산, 부티르산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 타르타르산, 벤조산, 설포살리실산, 포름산 및 그 염, 및 MES, Bis-Tris 등의 완충 영역이 pH7 이하인 굿 버퍼(Good's buffer)에서 선택되는 화합물을 함유하는 용액이 예시된다. 본 발명에서 바람직하게는 시트르산, 아세트산, 인산 및 그 염을 함유하는 산성 용액이 사용된다. 해당 산성 용액에 함유된 화합물의 농도로는 바람직하게는 5mM ~ 1M, 보다 바람직하게는 10 ~ 500mM이 예시된다. 또한, 본 발명에 사용되는 산성 용액을 제조하기 위한 용매는 특별히 한정은 없다. 용매를 물, 완충 용액, 세포 배양용 배지 등이 적절히 선택될 수 있다. 용매는 후속 작업에 따라 각종 이온을 포함할 수 있다. 이러한 이온으로 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온 등의 양이온을 들 수 있다. 본 발명에 사용되는 산성 용액의 용매로는 바람직하게는 물과, 염화나트륨 용액, 염화칼륨 용액, 염화마그네슘 용액, 생리 식염수 등의 나트륨 이온, 칼륨 이온, 및/또는 마그네슘 이온을 포함하는 수용액, 및 포도당 용액, 자당 용액 등의 당류를 함유하는 용액 등이 예시된다. 해당 용액 중의 나트륨 이온 및/또는 칼륨 이온 농도로는 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 5mM ~ 2.7M, 바람직하게는 5mM ~ 1M, 보다 바람직하게는 20 ~ 800mM이 예시된다. 또한, 이러한 이온 농도는 후술하는 세 번째 공정에 따라 적절히 설정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 산성 용액을 사용하여 수득한 외피 비보유 바이러스의 조 추출액을 이용하여 크로마토그래피에 의해 외피 비보유 바이러스를 정제할 경우 적절한 염 농도로 조정된 산성 용액을 사용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 나트륨 이온 농도를 3M 이하, 바람직하게는 50mM ~ 2M로 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 30 ~ 40mM의 시트르산 완충 용액으로 200 ~ 500mM의 나트륨 이온을 함유하는 산성 용액을 이용해도 좋다. 또한 40 ~ 60mM의 시트르산 완충 용액으로 300mM ~ 2.5M의 나트륨 이온을 함유하는 산성 용액이어도 좋다.

외피 비보유 바이러스 생산 세포의 배양액에 첨가하여 배양액을 산성으로 할 수 있는 성분은, 상기 배양액의 pH를 외피 비보유 바이러스 생산 세포 배양시 pH 보다 낮은 pH로 하는 성분이며, 또한 바이러스 생산이 달성된 외피 비보유 바이러스 생산 세포에서 외피 비보유 바이러스를 포함한 조 추출액을 얻을 수 있는 성분이면 제한은 없다. 본 발명에 사용되는 배양액을 산성으로 할 수 있는 성분으로는, 예를 들어, 시트르산, 아세트산, 말산, 인산, 염산, 황산, 질산, 락트산, 프로피온산, 부티르산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 타르타르산, 벤조산, 설포살리실산, 포름산 및 그 염, 및 상기 산성 용액과 같은 용액을 들 수 있다. 배양액을 산성으로 할 수 있는 성분의 첨가량으로는 바이러스 생산이 달성된 외피 비보유 바이러스 생산 세포에서 외피 비보유 바이러스를 포함한 조 추출액을 얻을 수 있는 양이면 특별히 제한되지 않고 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다. 또한, 상기 배양액을 산성으로 할 수 있는 성분과 함께 각종 이온 성분이 첨가될 수도 있다. 예를 들어, 위의 산성 용액에 대해 설명된 것과 같은 이온 용액을 사용할 수 있다.

상기의 공정을 거쳐 얻어진 세포에 외피 비보유 바이러스가 방출된 바이러스의 조 추출액은 외피 비보유 바이러스를 수득하기 위한 세 번째 공정에 제공된다. 예를 들어, 두 번째 공정에 의해 얻어진 조 추출액을 원심분리나 필터 여과하고 상청액 또는 여액을 수득한다. 세포와 잔사로부터 부분 정제된 외피 비보유 바이러스 벡터를 별도로 제조하여 외피 비보유 바이러스를 얻을 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서는, 상술된 방법으로 얻은 부분 정제된 외피 비보유 바이러스 벡터를 그대로 안정적으로 저장할 수 있거나, 또는 중화 용액을 첨가한 후 안정적으로 저장할 수 있다. 해당 중화 용액은 부분 정제된 외피 비보유 바이러스 벡터 용액의 pH를 중성으로 조정할 수 있는 용액이다. 중화 용액은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 염기성 용액이나 pH 8.5 ~ 10.0의 고농도 완충 용액이 예시된다. 예를 들어, 1 ~ 3M 농도의 트리스 염산 (Tris-HCl) 완충 용액, TAPS 완충 용액, 비신(Bicine) 완충 용액 또는 글리신 완충 용액 등을 사용하여 부분 정제된 외피 비보유 바이러스 벡터의 중화를 실시할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서는, 이어서 상기 부분 정제된 외피 비보유 바이러스 벡터를 초원심분리, 크로마토그래피, 한외여과 또는 기타 공지의 방법으로 정제하여 농축 또는 정제된 외피 비보유 바이러스를 최종물로 얻을 수 있다. 크로마토그래피에 의한 외피 비보유 바이러스의 정제는 이온 교환 컬럼 (예를 들어, Mustang Q (Pall Corp 제), 친화성 컬럼 (예를 들어, AVB Sepharose (GE Healthcare Ltd. 제) 또는 헤파린 컬럼), 하이드록시아파타이트 컬럼 등에 의해 실시할 수 있다. 또한, 부분 정제된 외피 비보유 바이러스 벡터 또는 두 번째 공정에 의해 얻어진 조 추출액을 더 높은 농도의 산으로 처리함으로써 상기의 부분 정제된 외피 비보유 바이러스 벡터 또는 조 추출액에 포함된 불순물을 침전시킬 수 있다. 부분 정제된 외피 비보유 바이러스 벡터 또는 조 추출액을 더 높은 농도의 산으로 처리하는 공정은 예를 들어, 두 번째 공정에서 사용되는 배양액을 산성 용액 또는 산성화할 수 있는 성분에 예시된 것과 동일한 산성 용액 또는 성분의 첨가 작업을 포함한다. 상기의 "더 높은 농도의 산"은 부분 정제된 외피 비보유 바이러스 벡터 또는 두 번째 공정에 의해 얻어진 조 추출액의 산 농도보다 높은 농도의 산이면 되고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 30 ~ 40mM의 시트레이트 완충 용액으로 세포를 처리하여 조 추출액을 얻는 경우, 시트르산의 최종 농도가 50 ~ 200mM로 상승하도록 시트르산 또는 시트레이트 완충 용액을 첨가함으로써 조 추출액 중에 함유된 오염 단백질을 침전시킬 수 있다. 이렇게 얻어진 바이러스는 적절한 방법, 예를 들어 동결하고 원하는 용도에 사용할 때까지 저장된다.

본원에서 외피 비보유 바이러스의 수율은 외피 비보유 바이러스의 역가로서 표시된다. 상기 외피 비보유 바이러스의 역가는 특별히 제한은 없지만, 일정량의 샘플 중의 a) 외피 비보유 바이러스의 게놈의 수 (게놈 역가), b) 실험적으로 측정되는 외피 비보유 바이러스의 세포에의 감염 능력 (감염 역가) 또는 c) 외피 비보유 바이러스를 구성하는 단백질의 양 (또는 단백질 순도)를 측정하는 방법 중 하나이며, 필요에 따라 명시된다.

게놈 역가의 측정 방법으로는, 예를 들어 외피 비보유 바이러스 함유 샘플 중의 바이러스 게놈의 카피수를 PCR 법으로 측정하는 방법이 예시된다.

감염 역가의 측정 방법으로는, 예를 들어 외피 비보유 바이러스의 일련의 희석액을 적당한 표적 세포에 감염시켜 세포의 형태 변화 (세포 변성)을 검출하는 방법, 도입 유전자의 발현을 검출하는 방법 및 세포에 도입된 바이러스 게놈의 카피수를 측정하는 방법 등이 예시된다.

외피 비보유 바이러스를 구성하는 단백질의 양 (또는 단백질 순도)을 측정하는 방법으로는 예를 들어 해당 단백질을 면역학적 방법으로 정량하는 방법 등이 예시된다.

본 발명의 방법은 내산성을 가지는 외피 비보유 바이러스에 사용하는 것이 적합하며, 특히 한정되지 않지만 1형 ~ 6형 AAV 등이 예시된다.

본 발명에 따라, 외피 비보유 바이러스의 제조 방법 외에, 그 제조 방법에 사용되는 산성 용액 및 해당 제조 방법으로 제조한 외피 비보유 바이러스도 제공된다. 또한, 본 발명의 제조 방법을 이용하여 수득한 외피 비보유 바이러스를 유효 성분으로 하는 약학 조성물도 제공된다. 해당 약학 조성물은 유전자 치료용 바이러스 제제의 제조 기술에 따라 적절히 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어진 외피 비보유 바이러스를 공지의 방법으로 더욱 농축, 정제, 가공하고, 약학 조성물로 제제화할 수 있다. 해당 약학 조성물은 환자 유래의 세포에 체외로 사용되거나, 또는 환자에 직접 투여될 수도 있다.

본 발명의 다른 양태로서,

외피 비보유 바이러스 입자 형성에 필수적인 요소를 공급하기 위한 핵산을 포함하는 벡터,

외피 비보유 바이러스 입자에 봉입되는 핵산을 포함하는 벡터, 및

산성 용액,

을 포함하는, 외피 비보유 바이러스를 제조하기 위한 키트가 제공된다.

상기 키트는 얻어진 외피 비보유 바이러스 함유 용액을 중화하기 위한 중화 용액을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양태로서, 산성 용액과 중화 용액을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서

산성 용액,

중화 용액,

바이러스 정제용 컬럼, 및

컬럼 정제 작업에 사용하기 위한 각종 완충 용액,

을 포함한 키트가 제공된다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 조 추출액의 제조 공정에서 산성 용액에 의한 처리의 효과

(1) rAAV 벡터 제조를 위한 세포의 파종(seeding)

10% FBS (Nichirei Biosciences Inc. 제)을 포함한 DMEM/F12 (Gibco Corp. 제)에 293 세포를 현탁시켰다. 현탁액을 세포 배양용 10cm 접시 (Corning Inc. 제) 2개에 파종한 후, 37 ℃의 CO₂ 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 세포가 70% 합류되어 있는지를 확인하였다.

(2) rAAV 벡터 제조를 위한 플라스미드의 형질감염

실시예 1-(1)에서 얻은 세포에 제2 형 AAV (이하 AAV2로 칭함)의 Rep 단백질 및 Cap 단백질을 코딩하는 pRC 플라스미드 (Cell Bio Labs 제), 아데노바이러스 유래 E2A, VA, V4 서열을 포함하는 pHLP 플라스미드 (Cell Bio Labs 제), AAV2의 두 ITR 사이에 형광 단백질 AcGFP1 발현 카세트로 "CMV 프로모터 서열, AcGFP1을 코딩하는 서열, PolyA 서열"을 포함하는 pAAV-AcGFP 플라스미드를 각각 23.1μg 씩 형질감염시켰다. 형질감염의 7 시간 후, 배지를 완전히 제거하고, DMEM/F12를 접시에 접시 1개 당 15mL씩 첨가하였다. 세포를 37 ℃의 CO₂인큐베이터에서 2 일간 배양하였다.

(3) rAAV 벡터 생산 세포의 회수

실시예 1-(2)에서 얻은 접시에서 배지를 완전히 제거하였다. 이어, 20mM EDTA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제)를 포함한 PBS (Gibco Corp. 제) 3mL를 각 접시에 첨가하고. 실온에서 수 분간 반응시킴으로써 세포를 박리시켰다. 그 후, 세포를 함유하는 용액을 회수하여 4 ℃에서 1,750 × g으로 10 분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하였다. 세포 펠렛을 4mL의 PBS에 재현탁하였다. 현탁액을 각각 2mL 씩 2 개의 원심관에 분주하였다. 각각의 원심관을 4 ℃에서 1,750 × g으로 10 분간 원심분리하였다. 이어, 상청액을 제거하였다.

(4) 초음파 파쇄법에 의한 조 추출액의 제조

실시예 1-(3)에서 얻은 원심관의 한쪽에 PBS를 1mL 첨가하고, 그 원심관을 초음파 분쇄기 (BM Equipment Co. Ltd. 제)에 의한 파쇄 및 정지로 구성된 사이클에 5회 반복 적용하여 rAAV 벡터를 포함하는 세포 균질물을 제조하였다. 세포 균질물을 4 ℃에서 14,000 × g으로 10분간 원심분리하였다. 그 후, 상청액을 회수하여 rAAV 벡터의 조 추출액을 수득하였다.

(5) 산성 용액 (ACD-A 용액) 처리에 의한 조 추출액의 제조

실시예 1-(3)에서 얻은 원심관의 다른 한쪽에 산성 용액으로 ACD-A 용액 (TERUMO Corp. 제)을 1mL 첨가하여 15초 간 보텍스 믹서로 혼합하였다. 혼합물을 37 ℃ 수조에서 5 분간 방치한 후, 다시 15초 간 보텍스 믹서로 혼합을 실시하고, 4 ℃에서 14,000 × g으로 10분 간 원심하였다. 얻어진 상청액을 조 추출액으로 사용하였다. 또한, ACD-A 용액은 2.2 w/v% 시트르산나트륨 수화물, 0.8 w/v% 시트르산 수화물, 2.2 w/v% 포도당을 포함하고, pH는 4.5 ~ 5.5이다.

(6) 조 추출액의 게놈 역가 측정 및 단백질 농도 (A280) 측정

실시예 1-(4) 및 실시예 1-(5)에서 제조한 조 추출액 2μL를 DNaseI 완충제 (TAKARA BIO Inc. 제)로 50배 희석한 후, 설명서에 기재된 농도의 DNaseI (TAKARA BIO Inc. 제)로 처리하여 유리 게놈 DNA와 플라스미드 DNA를 제거하였다. DNaseI를 불활성화하기 위해 75 ℃에서 30분 간 열처리를 실시하여 DNaseI-처리된 rAAV 벡터 함유 용액을 얻은 후, 4 ℃ 또는 -20 ℃에서 보관하였다. 이렇게 DNaseI-처리된 rAAV 벡터 함유 용액 100μL에 완충제 AL (QIAGEN GmbH 제)을 100μL 첨가하고, 56 ℃에서 10분 간 유지하였다. 이 용액을 주사용수 (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. 제)로 100배 희석하고, 이 희석액 2μL을 rAAV 벡터의 게놈 역가 측정에 사용하였다. 게놈 역가 측정에는, SYBR Premix ExTaqII (TAKARA BIO Inc. 제)를 사용하고, 반응 용액의 제조 등의 조작은 키트에 첨부된 설명서에 따랐다. 제한 효소 EcoRI (TAKARA BIO Inc. 제)로 pAAV-AcGFP 플라스미드를 소화시켜 수득한 선형 DNA를 표준으로 사용하였다. 실시간 PCR에 사용한 프라이머 서열은 AcGFP1 발현 카세트에 탑재된 CMV 프로모터 서열에 어닐링하는 서열이다. 또한, 실시예 1-(4) 및 실시예 1-(5)에서 제조된 조 추출액의 단백질 농도를 NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific 제)에 의해 단백질 농도 측정 모드에서 A280로서 측정하였다. 이들 결과를 표 1에 나타내었다.

추출 조건	게놈 역가 (× 10¹¹ VG/mL)	A280 측정
초음파 파쇄 (비교 대조군)	3.6	9.40
ACD-A 용액 처리	10.2	1.46

VG = 벡터 게놈

표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 조 추출액의 게놈 역가는 ACD-A 용액 처리 조건의 것이 초음파 파쇄 조건보다 2.8배 높은 수치를 나타냈다. 또한, 조 추출액의 A280 측정 값은 ACD-A 용액 처리 조건이 초음파 처리 조건보다 더 낮았다. 이것은 ACD-A 용액 처리에 의해 얻어진 조 추출액에 rAAV 벡터가 효과적으로 추출되고, 또한 단백질 오염의 양이 더 적은 것을 나타낸다.

실시예 2: 정제 공정에서 산성 용액에 의한 조 추출 효과 (초원심분리에 의한 정제)

(1) rAAV 벡터의 생산 및 ACD-A 용액에 의한 조 추출액의 제조

배양 용기를 CellBIND (등록상표) T225 플라스크 (Corning Inc. 제)로 변경하고 관련된 반응계를 이에 맞춰 확장한 것을 제외하고, 실시예 1- (1) ~ (3)과 동일한 방법으로 rAAV 벡터 생산 세포를 회수하였다. 회수한 세포 펠렛에 10mL의 ACD-A 용액을 넣고 15초 간 보텍스 믹서로 혼합하였다. 혼합물을 37 ℃ 수조에서 5분 간 방치한 후, 다시 15초 간 보텍스 믹서로 혼합하고, 그 후 14,000 × g 4 ℃에서 10분 간 원심하였다. 얻어진 상청액을 조 추출액으로 사용하였다. 또한, 비교 대조군으로 동일한 조건에서 배양한 rAAV 벡터 생산 세포를 통상적인 rAAV 벡터 추출법인 동결 융해법에 적용하여 조 추출액을 준비하고, 그것을 벤조네이즈(BENZONASE) (등록상표) (Merck Millipore Corp. 제)로 처리 (최종 농도 250U/mL)한 후, 2 회 초원심분리하여 정제된 rAAV 벡터 용액을 수득하였다.

(2) 부분 정제

실시예 2-(1)에서 얻어진 조 추출액을 4 ℃에서 14,000 × g으로 20분 간 원심분리하였다. 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액을 기공 크기 0.2μm의 포지다인 필터 (Pall Corp. 제)로 여과하여 부분 정제물을 수득하였다.

(3) 초원심분리에 의한 정제

실시예 2-(2)에서 얻어진 부분 정제물을 Ultra-Clear 튜브 (Beckman Coulter, Inc. 제)에 넣고 염화세슘을 이용한 밀도 구배 초원심분리법으로 통상적인 방법에 의해 정제하였다.

(4) 분획 회수 및 굴절률 (RI) 측정

실시예 2-(3)에 의해 초원심분리된 튜브의 하단을 주사 바늘로 관통하고 관에서 유출되는 액체를 분획 당 3-6 방울씩 회수하였다. 육안적인 부유물이 분획에 혼입되면 회수를 종료하였다. 각 분획의 굴절률 (RI)을 굴절률 측정기 (Reichert TECHNOLOGIES 제)로 측정하였다.

(5) 회수한 분획의 게놈 역가 측정

실시예 2-(4)에서 얻은 분획의 게놈 역가를 실시예 1-(6)과 동일한 방법으로 측정하였다. 결과를 2-(4)에서 측정한 굴절률과 함께 표 2에 나타내었다.

분획	게놈 역가 (x10¹¹ VG/mL)	총 게놈 역가 (x10¹¹ VG)	굴절률 (RI)
1	0.318	0.0636	1.3786
2	0.783	0.157	1.3765
3	3.62	0.725	1.3748
4	10.5	2.10	1.3735
5	20.0	3.99	1.3721
6	30.9	6.17	1.3713
7	29.3	5.86	1.3701
8	18.6	3.72	1.3689
9	21.3	4.26	1.3680
10	26.7	5.35	1.3667
초원심분리 전 (부분 정제물)	1.70	50.9	-

표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, rAAV 벡터는 분획 4 ~ 10에 걸쳐 축적을 보였다.

(6) 회수 분획의 단백질 순도 측정

rAAV 벡터가 더 많이 축적된 실시예 2-(4)에서 얻어진 분획 5 ~ 10을 투석막 (Thermo Fisher Scientific Inc. 제)에 넣고 PBS로 투석을 실시하였다. 얻어진 각 분획의 10μL에 각각 2 × 샘플 완충제 (TAKARA BIO Inc. 제)를 10μL 가하여 혼합하고 95 ℃에서 5분 간 혼합하였다. 비교 대조군로서 실시예 2-(1)에서 설명한 동결 융해법으로 정제한 rAAV 벡터 용액을 사용하였다. 각 샘플 (10μL)을 12.5% 폴리아크릴아미드 겔 (ATTO Corp. 제)에 적용하고, 전기영동을 실시하였다. 전기영동 종료 후, 겔을 적당량의 Oriole 형광 겔 염색 용액 (Bio-Rad Laboratories, Inc. 제)에 담가 차광하여 90분 간 진탕하였다. 진탕 후, 겔을 Luminoshot 400 (TAKARA BIO Inc.)으로 촬영하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, ACD-A 용액 처리를 포함한 정제 방법의 경우, 비교 대조군보다 초원심분리 정제 후 rAAV 벡터 용액 (분획 5 ~ 10)은 오염 단백질의 양이 적고, rAAV 벡터의 순도가 높은 것으로 나타났다. 또한, 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, ACD-A 용액 처리를 포함한 정제 방법의 회수율 [(분획 5 내지 10의 총 게놈 역가 합계) × 100) / 초원심분리 전의 총 게놈 역가]은 57.7%이었다.

(7) 회수 분획중 dsDNA 오염량 측정

실시예 2-(1)에서 ACD-A 용액 처리로 얻어진 조 추출액, 실시예 2-(2)에서 얻어진 초원심분리 정제 전의 부분 정제물, 실시예 2-(6)에서 얻어진 투석 후 분획 6과 분획 10, 및 비교 대조군으로서 실시예 2-(1)에서 얻어진 동결 융해법으로 정제된 rAAV 벡터 용액의 dsDNA 양을 PicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Invitrogen Inc. 제)에 기재된 프로토콜에 따라 측정하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.

분획	dsDNA의 양 (ng/mL)
ACD-A 용액 처리에 의한 조 추출물	2480.65
초원심분리 전의 부분 정제물	706.16
분획 6	9.19
분획 10	20.11
동결 융해법으로 정제된 rAAV 벡터 용액 (비교 대조군)	61.34

표 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 분획 6과 분획 10은 초원심분리 전에 벤조네이즈 처리를 하지 않음에도 불구하고, dsDNA 량이 비교 대조군 (벤조네이즈로 처리됨) 보다 더 낮았다. 이 결과는 조 추출액을 ACD-A 용액 처리로 얻고 초원심분리에 의해 정제하면 종래의 방법보다 고순도의 rAAV 벡터 용액을 얻을 수 있음을 나타낸다.

실시예 3: 정제 공정 (양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제)에서 산성 용액에 의한 조 추출의 효과

(1) 크로마토그래피용 조 추출액의 제조

실시예 2-(1)과 (2)와 같은 방법으로 부분 정제물을 제조하였다. 이 부분 정제물을 주사용수 (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. 제)로 5배 희석하고, 이 희석액을 적용 샘플로 사용하였다.

(2) 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제

주사기 (TERUMO Corp. 제), 기공 크기 0.2μm의 포지다인 필터, 양이온 교환막 (Mustang S; Pall Corp. 제)의 순으로 연결하여 양이온 교환 크로마토그래피 장치를 준비하였다. 주사용수로 5배 희석한 ACD-A 용액을 주사기에 5mL 충전하고, 1 분에 약 4mL의 유속이 되도록 용액을 필터에 통과시켰다. 다음 주사기를 교환하고, 실시예 3-(1)에서 제조한 적용 샘플 10mL를 상기와 동일한 방식으로 장치에 통과시켰다. 이 때의 투과액을 통과 분획으로 회수하였다. 주사기를 교환하고 주사용수로 5배 희석한 ACD-A 용액 5mL를 상기와 동일한 방식으로 장치에 통과시켰다. 이 때의 투과액을 세척 분획으로 회수하였다. 또, 주사기를 교환하고, 각각 (1) 50mM 글리신-수산화나트륨 완충 용액 (pH9) 3mL, (2) PBS 3mL, 및 (3) 2M NaCl 3mL를 동일 유속으로 장치에 통과시켰다. 이 때의 투과액을 (1) 용출액 1, (2) 용출액 2 또는 (3) 용출액 3으로 회수하였다.

(3) 각 분획의 게놈 역가 측정

실시예 3-(2)에서 얻어진 각 분획의 게놈 역가를 실시예 1-(6)과 동일한 방법으로 측정하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.

분획	총 게놈 역가 (x10⁹ VG)
적용 샘플	5.79
통과 분획	측정 한계 아래
세척 분획	측정 한계 아래
용출액 1	0.38
용출액 2	4.13
용출액 3	0.72

표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 적용된 rAAV 벡터의 대부분 (71.3%)이 용출액 2 (PBS)로 용출되었다.

(4) 각 분획의 단백질 순도 측정

실시예 3-(2)에서 얻어진 용출액을 투석막 (Thermo Fisher Scientific Inc. 제)에 넣고 PBS로 투석을 실시하였다. 실시예 2-(6)과 동일한 방법으로 단백질 순도를 측정하였다. 비교 대조군으로서 실시예 2-(4)에서 산성 용액으로 추출한 후, 초원심분리로 정제된 rAAV 벡터 용액 (분획 10)도 동일한 방법으로 순도 측정을 실시하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 대부분의 오염 단백질이 용출액 1에 용출되었다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 용출액 1에 rAAV 벡터는 거의 검출되지 않았다. 이러한 결과는 ACD-A 용액 처리에 의해 얻어진 조 추출액은 통상적인 방법과 동일한 방식으로 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 정제에 적용 가능하며, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 장치에 의해 rAAV 벡터와 오염 단백질이 분리 가능하다는 것을 보여준다.

실시예 4: 산성 용액 처리를 위한 온도 검토

(1) rAAV 벡터 생산 세포의 회수

배양 용기로 CellBIND (등록상표) T75 플라스크 (Corning Inc. 제)를 사용하고 관련 반응계를 이에 맞춰 확장하는 것을 제외하고, 실시예 1-(1) 내지 (3)과 동일한 방법으로 rAAV 벡터 생산 세포를 회수하였다.

(2) 각 온도에서 ACD-A 용액 처리

실시예 4-(1)에서 얻어진 rAAV 벡터 생산 세포에 ACD-A 용액 1mL를 첨가한 후, 15초 간 보텍스 믹서로 혼합하였다. 혼합물을 (1) 37 ℃ (2) 21 ℃ 또는 (3) 4 ℃에서 5분 간 정치하고 다시 15초 간 보텍스 믹서로 혼합한 후, 4 ℃에서 14,000 × g으로 10분 간 원심분리하였다. 얻어진 상청액을 조 추출액으로 사용하였다.

(3) 조 추출액의 게놈 역가 측정

실시예 4-(2)에서 얻어진 조 추출액의 게놈 역가를 실시예 1-(6)과 동일한 방법으로 측정하였다. 결과를 표 5에 나타내었다.

처리 온도	게놈 역가 (×10¹⁰ VG/mL)
37 ℃	5.32
21 ℃	5.79
4 ℃	7.06

표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 조 추출액의 게놈 역가는 처리 온도 37 ℃, 21 ℃, 4 ℃ 사이에서 현저한 차이가 없었다. 이러한 결과는 ACD-A 용액 처리가 광범위 온도 영역에서 rAAV 벡터의 추출이 가능하다는 것을 보여준다.

실시예 5: 293T 세포에서의 조 추출 검토

(1) rAAV 벡터 생산 세포의 회수

숙주 세포로 293T 세포를 사용하는 것을 제외하고 실시예 4-(1)과 동일한 방법으로 rAAV 벡터 생산 세포를 회수하였다.

(2) 조 추출액 제조

실시예 5-(1)에서 얻어진 rAAV 벡터 생산 세포로부터 다음 세 조건 하에 조 추출액을 수득하였다. 초음파 파쇄 추출은 실시예 1-(4)와 동일한 방법으로 수행하였다. ACD-A 용액 처리에 의한 추출은 실시예 1-(5)와 같은 동일한 방법으로 수행하였다. 동결 융해에 의한 추출을 300μL의 PBS에 세포 펠렛을 재현탁시키고, "드라이아이스-에탄올 용액에 5 분간 정치, 37 ℃ 수조에서 3 분간 정치, 보텍스 믹서로 1 분간 혼합"의 공정을 3회 반복하는 것으로 실시하여 rAAV 벡터를 포함한 세포 균질액을 제조하였다. 이 세포 균질액을 4 ℃에서 14,000 × g으로 20분 간 원심분리한 후, 상청액을 회수하였다. 상청액에 700μL의 PBS를 첨가하여 조 추출액을 제조하였다.

(3) 조 추출액의 게놈 역가 측정

실시예 5-(2)에서 얻어진 각 조 추출액의 게놈 역가를 실시예 1-(6)과 동일한 방법으로 측정하였다. 결과를 표 6에 나타내었다.

추출 조건	게놈 역가 (× 10¹² VG/mL)
초음파 파쇄	1.53
동결 융해	0.59
ACD-A 용액 처리	2.26

표 6로부터 알 수 있는 바와 같이, 293T 세포로부터 제조된 rAAV 벡터 생산 세포를 사용한 경우, ACD-A 용액 처리에 의한 rAAV 벡터의 추출 효율이 초음파 파쇄와 비교하여 1.5배 더 높고, 동결 융해에 비해 3.8배 더 높은 것으로 나타났다.

실시예 6: 산성 용액의 염 농도 검토 - 1

(1) ACD-A 용액과 등가의 시트레이트 완충제 제조 및 각 염 농도의 시트레이트 완충제 제조

ACD-A 용액의 첨부 문서를 참고하여 38.1mM의 시트르산과 74.8mM의 시트르산나트륨을 함유하는 38.1mM 시트레이트 완충제 (pH4.9)를 제조하였다. 이 시트레이트 완충제의 시트레이트 이온 농도는 ACD-A 용액의 것과 동일하다. 또한, 이 완충제에 최종 농도 50mM 또는 200mM로 염화나트륨을 첨가하였다. 이 완충제를 사용하여 조 추출액을 수득하였다.

(2) 각 산성 용액으로 조 추출액 제조

실시예 5-(1)과 동일한 방법으로 rAAV 벡터 생산 세포를 회수하였다. 회수한 세포에 실시예 6-(1)에서 제조한 각 완충제 및 ACD-A 용액을 첨가하였다. 실시예 1-(5)와 유사한 방식으로 조 추출액을 수득하였다. 비교 대조군으로서, 실시예 1-(4)와 동일한 방식으로 초음파 파쇄에 의해 조 추출액을 제조하였다.

(3) 조 추출액의 게놈 역가 측정

실시예 6-(2)에서 얻어진 각 조 추출액의 게놈 역가를 실시예 1-(6)과 동일한 방법으로 측정하였다. 결과를 표 7에 나타내었다.

추출 조건	나트륨 이온 농도 (mM)	게놈 역가 (× 10⁹ VG/mL)
ACD-A 용액	224	8.13
시트레이트 완충제	224	6.13
시트레이트 완충제 + 50mM NaCl	274	9.41
시트레이트 완충제 + 200mM NaCl	424	14.4
초음파 파쇄 (비교 대조군)	161	2.78

표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 산성 용액 (ACD-A 용액 또는 각 시트레이트 완충제)를 이용하여, 초음파 파쇄로 얻어진 조 추출액 (비교 대조군)의 것에 비해 게놈 역가가 더 높은 조 추출액을 수득하였다. 시트레이트 완충제의 나트륨 이온 농도가 높을수록 수득한 조 추출액의 게놈 역가가 높아졌다. 이 결과는 산성 용액을 이용하여 rAAV 벡터를 효율적으로 추출할 수 있고, 또한 산성 용액에 나트륨 이온 농도가 높을수록 rAAV 벡터의 추출 효율이 높음을 나타낸다.

(4) 조 추출액을 이용한 HT1080 세포에 대한 감염 역가 측정

HT1080 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM (Sigma-Aldrich Co. LLC. 제)에 5 × 10⁴ 세포/웰로 현탁시키고, 현탁액을 24-웰 플레이트 (Corning Inc. 제)에 1mL 씩 파종하여 37 ℃의 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 다음날, 실시예 6-(2)에서 얻어진 rAAV 벡터를 포함한 조 추출액을 각각 각 웰에 2μL 씩 첨가하여 세포를 감염시켰다. 이틀 후, trypLE Select (Invitrogen Inc. 제)를 사용해 세포를 분산시켰다. 이어, FACS CantoII (Becton, Dickinson and Company 제)를 이용하여 rAAV 벡터 감염에 의해 세포에 도입된 형광 단백질 (AcGFP1)을 발현하는 세포를 검출하였다. AcGFP1 양성 세포의 비율 (%)을 계산하였다. 계산 값은 각 조 추출액 중 rAAV 벡터의 감염 역가로 간주될 수 있다. 결과를 표 8에 나타내었다.

추출 조건	AcGFP1 양성 세포의 비율 (%)
ACD-A 용액	16.9
시트레이트 완충제	12.7
시트레이트 완충제 + 50mM NaCl	18.8
시트레이트 완충제 + 200mM NaCl	24.3
초음파 파쇄 (비교 대조군)	6.4

표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 산성 용액 (ACD-A 용액 또는 각 시트레이트 완충제)를 이용하여, 초음파 파쇄로 얻어진 조 추출액 (비교 대조군)의 것에 비해 rAAV 벡터의 감염 효율이 더 높은 조 추출액을 수득하였다. 시트레이트 완충제의 나트륨 이온 농도가 높을수록 수득한 조 추출액의 감염 역가가 높아졌다. 이 결과는 산성 용액을 이용하여 rAAV 벡터를 효율적으로 추출할 수 있고, 또한 산성 용액에 나트륨 이온 농도가 높을수록 rAAV 벡터의 추출 효율이 높음을 나타낸다.

실시예 7: 헤파린 컬럼을 이용한 rAAV 벡터의 정제

(1) rAAV 벡터 생산 세포의 배양

CellBIND (등록상표) T225 플라스크 (Corning Inc. 제)를 배양 용기로 사용하고 관련된 반응계를 이에 맞춰 확장하는 것을 제외하고 실시예 1-(1) 내지 (2)와 동일한 방법으로 rAAV 벡터 생산 세포를 배양하였다.

(2) 각 산성 용액으로 조 추출액 제조

형질감염 48 시간 후 rAAV 벡터 생산 세포에 0.5M EDTA (pH8.0)를 첨가하였다. 10분 간 정치한 후, rAAV 벡터 생산 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 4 ℃에서 1,750 × g으로 10분 간 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액을 제거하였다. 그 후, 세포 펠렛에 2mL의 실시예 6-(1)에서 제조한 시트레이트 완충제 + 50mM NaCl을 첨가하여 보텍스 믹서로 혼합하였다. 혼합물을 5분 간 정치시키고 다시 보텍스 믹서로 혼합한 후에 4 ℃에서 1,750 × g으로 10분 간 원심분리하였다. 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액에 중화 목적으로 1/13 양의 2M Tris-Cl (pH9.5)을 첨가하고, 이어 1/100 양의 1M MgCl₂를 첨가하여 조 추출액을 수득하였다. 상기 세포 펠렛에 2mL의 DMEM을 첨가한 후, 액체 질소와 37 ℃ 수조를 사용하여 3회 동결 융해시켰다. 얻은 조 추출물액을 비교 대조군으로 사용하였다.

(3) 적용 샘플 제조

실시예 7-(2)에서 얻어진 각 조 추출액에 냉-활성 뉴클레아제(Cold-active Nuclease) (TAKARA BIO Inc. 제)를 최종 농도 0.2 단위/μL가 되도록 첨가하고, 37 ℃에서 30분 간 유지하였다. 반응 후, 반응 혼합물을 2,380 × g, 4 ℃에서 10 분간 원심분리하였다. 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액에 1/10 양의 5% 데옥시콜산나트륨을 첨가하고, 반응을 위해 37 ℃에서 30분 간 유지하였다. 반응 후, 2,380 × g, 4 ℃에서 10분 간 원심분리하였다. 상청액을 적용 샘플로서 사용하였다.

(4) 헤파린 수지 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제

0.7mL의 헤파린 수지 (Nihon Pall Ltd. 제) 50% 슬러리를 HisTALON Gravity Columns (Clontech laboratories Inc. 제)에 첨가하여 헤파린 수지 컬럼을 제조하였다. 그 후, 헤파린 수지 컬럼을 3.5mL의 PBS로 평형화시키고, 상기 적용 바이러스 샘플 2.8mL를 컬럼에 적용하였다. 최종 농도 0.1M로 NaCl을 함유한 PBS 3.5mL로 수지를 세척하였다. 세척 후, 최종 농도 0.4M로 NaCl을 함유한 PBS 1mL를 컬럼에 통과시켰다. 이 때의 투과액을 rAAV 벡터를 함유하는 용출액으로 회수하였다. rAAV 벡터를 함유하는 용출액을 Ultracel-100 멤브레인을 갖춘 Amicon Ultra-0.5 원심 필터 유닛 (Merck Millipore Corp. 제)에 첨가한 후, 4 ℃에서 2,000 × g으로 5분 간 원심분리하고, 탈염시킨 다음, 농축하였다. 같은 조작을 반복하였다. 모든 용출액을 탈염, 농축한 후, 0.5% 소르비톨을 함유한 PBS 200μL로 멤브레인의 rAAV 벡터를 회수하였다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 회수한 rAAV 벡터 용액의 순도를 확인하였다. 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 시트레이트 완충제 + 50mM NaCl 처리에 의해 수득한 조 추출액으로부터 출발하여 헤파린 수지 컬럼 크로마토그래피로 정제된 rAAV 벡터는 비교 대조군보다 오염 단백질의 양이 적고, rAAV 벡터의 순도가 높았다.

실시예 8: 산성 용액의 염 농도 검토 - 2

(1) 산성 완충제 제조

rAAV 벡터 조 추출액을 수득하기 위한 완충제로 53.4mM의 시트르산과 53.4mM의 시트르산나트륨을 함유하는 시트레이트 완충제 (pH4.2)를 준비하였다. 또한, 이 완충제에 최종 농도 200mM, 400mM, 600mM, 800mM, 1.0M, 1.5M, 2.0M, 2.5M이 되도록 염화나트륨을 첨가하였다. 이들 완충제를 사용하여 조 추출액을 수득하였다.

(2) 각 산성 용액으로 조 추출액 제조

실시예 5-(1)과 동일한 방법으로 rAAV 벡터 생산 세포를 회수하였다. 회수한 세포에 실시예 8-(1)에서 제조한 각 완충제 및 ACD-A 용액을 첨가하였다. 실시예 1-(5)와 유사한 방식으로 조 추출액을 수득하였다.

(3) 조 추출액의 게놈 역가 측정

실시예 8-(2)에서 얻어진 조 추출액의 게놈 역가를 실시예 1-(6)과 동일한 방법으로 측정하였다. 결과를 표 9에 나타내었다.

추출 조건	나트륨 이온 농도 (mM)	게놈 역가 (× 10⁹ VG/mL)
시트레이트 완충제	160.2	13.2
시트레이트 완충제 + 200mM NaCl	360.2	11.3
시트레이트 완충제 + 400mM NaCl	560.2	21.2
시트레이트 완충제 + 600mM NaCl	760.2	36.8
시트레이트 완충제 + 800mM NaCl	960.2	41.4
시트레이트 완충제 + 1.0M NaCl	1160.2	35.8
시트레이트 완충제 + 1.5M NaCl	1660.2	34.4
시트레이트 완충제 + 2.0M NaCl	2160.2	30.7
시트레이트 완충제 + 2.5M NaCl	2660.2	26.2

표 9로부터 알 수 있는 바와 같이, 시트레이트 완충제의 나트륨 이온 농도가 높은 경우 (특히 760 ~ 1660mM의 범위)에 수득한 조 추출액의 게놈 역가가 더 높았다. 이러한 결과는 산성 용액에 0.6 ~ 2M 정도의 나트륨 이온 농도를 함유시킴으로써, rAAV 벡터의 추출 효율이 상승하는 것을 보여준다.

실시예 9: 시트르산 첨가에 의한 오염 단백질의 제거 - 1

(1) 시트레이트 완충제에 의한 조 추출액의 제조

실시예 6-(1)의 방법으로 제조된 시트레이트 완충제 + 200mM NaCl을 추출 완충제로 사용하는 것을 제외하고 실시예 6-(2)와 동일한 방법으로 rAAV 벡터를 함유하는 조 추출액을 수득하였다.

(2) 시트르산 침전

실시예 9-(1)에서 얻어진 rAAV 벡터를 함유하는 조 추출액에 1/10 양의 1M 시트르산 용액을 첨가하여 잘 현탁시키고, 4 ℃에서 60분 간 정치시켰다. 정치 후, 4 ℃에서 1,750 × g으로 20분 간 원심분리하였다. 상청액을 회수하고 시트르산 침전 후 용액을 수득하였다.

(3) 시트르산 침전 전, 후의 게놈 역가 측정 및 단백질 농도 (A280) 측정

조 추출액과 시트르산 침전 후 용액의 게놈 역가 및 단백질 농도 (A280)를 실시예 1-(6)과 동일한 방법으로 측정하였다. 결과를 표 10에 나타내었다.

	게놈 역가 (× 10¹² VG/mL)	280 측정
조 추출액	2.25	4.92
시트르산 침전 후 용액	2.41	2.22

표 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, 시트르산 침전 전후로 게놈 역가는 거의 변화가 없다. 시트르산 침전 후 단백질 농도 (A280)가 감소하였다. 이러한 결과는 산성 용액 처리로 얻은 조 추출액을 시트르산 침전시키는 경우 고순도의 rAAV 벡터 용액을 얻을 수 있음을 나타낸다.

실시예 10: 시트르산 첨가에 의한 오염 단백질의 제거 - 2

(1) 각 산성 용액으로 조 추출액의 제조

실시예 6-(1)의 방법으로 제조한 "시트레이트 완충제 + 200mM NaCl ((i) 및 (ii))" 또는 "시트레이트 완충제 + 200mM NaCl에 1/10 양의 1M 시트르산을 추가한 용액 ((iii))"을 추출 완충제로 사용한 것을 제외하고 실시예 6-(2)와 동일한 방법으로 rAAV 벡터를 함유하는 조 추출액을 수득하였다. 비교 대조군으로서, 실시예 1-(4)와 동일한 방식으로 초음파 파쇄에 의해 조 추출액을 제조하였다 ((iv)).

(2) 시트르산 침전

실시예 10-(1)에서 얻어진 각 조 추출액 (i) 내지 (iv)의 일부를 분취하고, 사전 용액(Before solution) (i) 내지 (iv)로 하였다. 조 추출액 (ii) 나머지에 1/10 양의 1M 시트르산 용액을 첨가하고 잘 현탁시키고, 4 ℃에서 60분 간 정치시켰다. 한편, 조 추출액 (i), 조 추출액 (iii) 및 조 추출액 (iv) 나머지 각각에 그의 추출을 위해 사용되는 추출 완충제 1/10 양을 첨가하여 잘 현탁시키고, 4 ℃에서 60분 간 정치시켰다. 정치 후, 각 현탁액을 4 ℃에서 1,750 × g으로 20분 간 원심분리하였다. 상청액을 회수하여 사후 용액(After solution) (i) 내지 (iv)로 하였다.

(3) 게놈 역가 측정, 단백질 농도 (A280) 측정 및 AAV 순도 산출

사전 용액 (i) 내지 (iv)와 사후 용액 (i) 내지 (iv)의 게놈 역가 및 단백질 농도 (A280)를 실시예 1-(6)과 동일한 방법으로 측정하였다. 이어 AAV 순도를 "게놈 역가 / A280 측정"으로 산출하였다. 결과를 도 4-1 내지 도 4-3에 나타내었다.

도 4-3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 사후 용액 (ii)의 AAV 순도가 가장 높았다. 이것은 산성 용액 처리로 얻은 조 추출액을 시트르산 침전시키면 고순도의 rAAV 벡터 용액을 얻을 수 있다는 것을 나타내는 것이다.

산업상 이용가능성

본 발명의 외피 비보유 바이러스의 제조 방법에 의해, 복잡한 조작없이 효율적으로 고순도의 외피 비보유 바이러스 용액을 얻을 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 외피 비보유 바이러스와 당해 외피 비보유 바이러스를 유효 성분으로 하는 조성물은 유전자 치료의 기초 연구 및 임상 응용 분야에서 유전자 도입 방법에 매우 유용하다.

Claims

(a) 아데노 관련 바이러스를 생산하는 능력을 갖는 세포를 배양하는 공정,
(b) 배지 제거 후에 상기 세포와 pH 3.0 내지 6.9의 산성 용액을 접촉시키는 공정, 및
(c) 아데노 관련 바이러스를 수득하는 공정,
을 포함하는 아데노 관련 바이러스의 제조 방법.
제1항에 있어서, 산성 용액이 나트륨 이온 및/또는 칼륨 이온을 추가로 함유하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, (c) 공정이 아데노 관련 바이러스를 정제하는 공정을 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 아데노 관련 바이러스를 정제하는 공정이 초원심분리, 크로마토그래피 및 한외 여과에서 선택되는 조작에 의해 실시되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 산성 용액이 양이온 및 시트르산을 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 산성 용액이 양이온 및 시트르산을 포함하는 방법.
제4항에 있어서, 산성 용액이 양이온 및 시트르산을 포함하는 방법.