CN116656627A - 制备无包膜病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备无包膜病毒的方法。本发明提供了如下不经辛苦操作有效地制备高纯度无包膜病毒的方法:培养具有生产无包膜病毒的能力的细胞,并使所述细胞和酸性溶液彼此接触。在基因治疗的基础研究和临床应用领域中,通过本发明的方法制备的无包膜病毒载体和含有无包膜病毒载体作为活性成分的组合物作为基因转移方法是非常有用的。
Description
本申请是国际申请日为2014年7月10日的国际申请PCT/JP2014/068438进入中国、申请号为201480039156.9的题为“制备无包膜病毒的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及以高纯度且不经过辛苦操作有效地生产无包膜病毒的方法。
背景技术
在基因重组领域或医学领域中,为了将基因引入哺乳动物(包括人)的细胞中,目前已经使用了使用电穿孔或金属微粒的物理方法、使用核酸、聚阳离子或脂质体的化学方法、以及使用基因转移载体(其中将病毒用作载体(在下文中,被称作病毒载体))的生物学方法。其中将病毒用作载体的基因转移载体意指通过改变天然病毒使得所述病毒可以将期望的基因等转移进靶标中而得到的载体,并且这样的载体的开发最近已经进步。通过基因重组技术制备的载体经常被称作重组病毒载体。用于衍生出重组病毒载体的载体的众所周知的例子包括有包膜病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、仙台病毒和疱疹病毒)和无包膜病毒(例如腺病毒和腺伴随病毒(在下文中,被称作AAV))。
具体地,AAV可以感染多种细胞(包括人细胞),并且AAV甚至会感染其中分化终止的非分裂细胞,包括血细胞、肌细胞和神经细胞。另外,由于AAV对人不是致病性的,它具有低不良作用风险。AAV的病毒颗粒是物理化学上稳定的。因为这些原因,AAV最近作为在基因治疗中所用的基因转移载体已经引起对实用价值的注意,所述基因治疗用于治疗先天性遗传性疾病以及治疗癌症或感染。
一种生产基因重组病毒载体的方法经常包括,将病毒颗粒形成所必需的元件以核酸构建体的形式引入细胞中以产生具有生产病毒的能力的细胞(在下文中,被称作病毒生产细胞),和培养所述细胞以表达所述病毒颗粒形成所必需的元件。一般而言,在所述病毒颗粒形成所必需的元件中,将需要以顺式提供的元件和可以以反式提供的元件分别地引入病毒生产细胞中,由此阻止野生型病毒的产生和被该病毒感染的宿主中病毒的自我复制(专利文献1)。
在下文中,作为一个例子,具体地解释从AAV衍生出的基因重组病毒载体(在下文中,被称作rAAV)。一种确立的生产病毒载体的方法包括:1)引入rAAV质粒,其中保留放置在野生型AAV基因组的每个末端处的ITR,且除去rep和cap基因,2)引入用于表达rep和cap基因的质粒以反式提供Rep和Cap蛋白,且由于AAV需要提供来自所谓的辅助病毒(诸如腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒)的补充元件用于形成传染性病毒颗粒,3)用腺病毒感染(专利文献2)。另外,由于通过上述方法得到的载体溶液在理论上被腺病毒污染,为了避免腺病毒污染,已经开发了一种生产载体的方法,其包括,替代上述步骤3),步骤3')引入辅助质粒,在腺病毒衍生的元件中,其仅表达AAV病毒颗粒的形成所必需的元件(无辅助系统)(专利文献3)。
将已经完成病毒生产的病毒生产细胞收集和均质化以得到含有rAAV载体的细胞匀浆物。对细胞匀浆物进行合适的步骤诸如用过滤器过滤、超速离心、层析或超滤,以将rAAV载体纯化为终产物。
目前,由于病毒载体的用途被延伸至基因治疗的基础研究或临床应用的领域,需要以较高滴度和较高纯度得到病毒载体的方法。公开了多种改善的方法。例如,已知一种增加病毒生产和所述病毒向培养物上清液中的释放速率的方法,其包括,在其中培养基具有升高的pH的胁迫条件下培养病毒生产细胞(专利文献1)。其它方法包括对生产的病毒的纯化及其以后的步骤的改善。另一方面,在病毒纯化之前执行的病毒生产细胞的处理中仍然存在改善的空间。
引文列表
专利文献
专利文献1:WO00/14205
专利文献2:WO97/06272
专利文献3:WO97/17458。
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的一个目的是,提供一种以高纯度和不经过辛苦操作有效地生产无包膜病毒的方法。
问题的解决方案
本发明的发明人专心地研究了提供一种以高纯度和不经过辛苦操作有效地生产无包膜病毒的方法的目的,并因此发现,通过培养病毒生产细胞和使所述细胞与酸性溶液发生接触,不经过辛苦操作有效地得到高纯度的无包膜病毒。因而,完成了本发明。
本发明如下所述。本发明涉及:
[1]一种生产无包膜病毒的方法,所述方法包括:
(a)培养具有生产无包膜病毒的能力的细胞的步骤,
(b)使所述细胞与酸性溶液接触的步骤,和
(c)得到无包膜病毒的步骤;
[2]根据[1]所述的方法,其中所述酸性溶液是在pH 3.0-6.9;
[3]根据[1]或[2]所述的方法,其中所述酸性溶液含有钠离子和/或钾离子,
[4]根据[1]至[3]中的任一项所述的方法,其中步骤(c)包括纯化所述无包膜病毒;
[5]根据[4]所述的方法,其中通过选自超速离心、层析和超滤的操作执行所述无包膜病毒的纯化;
[6]根据[1]至[5]中的任一项所述的方法,其中所述无包膜病毒是腺伴随病毒载体;和
[7]根据[1]至[6]中的任一项所述的方法,其中所述酸性溶液含有阳离子和柠檬酸。
本发明的效果
根据本发明,提供了一种以高纯度和不经过辛苦操作有效地生产无包膜病毒的方法。此外,提供了在所述方法中使用的酸性溶液和通过所述方法生产的无包膜病毒。使用本发明的酸性溶液得到的病毒的粗提取物可以应用于用于纯化无包膜病毒的常规方法。
附图说明
[图1]该照片显示了聚丙烯酰胺凝胶的荧光检测,其中超速离心纯化的级分在实施例2中泳动。
[图2]该照片显示了聚丙烯酰胺凝胶的荧光检测,其中阳离子交换层析纯化的级分在实施例3中泳动。
[图3]该照片显示了聚丙烯酰胺凝胶的荧光检测,其中肝素柱层析纯化的级分在实施例7中泳动。
[图4-1]该图显示了实施例10中的基因组滴度。
[图4-2]该图显示了实施例10中的蛋白浓度(A280)。
[图4-3]该图显示了实施例10中的AAV纯度。
具体实施方式
本文中使用的无包膜病毒指的是除了有包膜病毒以外的病毒。所述有包膜病毒指的是在病毒表面上具有脂质层或脂质双层的病毒。当病毒穿过核膜、内质网、高尔基体、质膜或细胞膜而出芽时,形成包膜。包膜通常包括从宿主衍生出的蛋白或在宿主的细胞膜上表达的病毒蛋白,并且在对靶细胞的感染中起重要作用。如上所述的无包膜病毒指的是除了有包膜病毒以外的病毒。无包膜病毒的代表性例子包括DNA基因组病毒,例如腺病毒、细小病毒、乳多泡病毒和人乳头瘤病毒,和RNA基因组病毒,例如轮状病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒、扎幌病毒、诺如病毒、脊髓灰质炎病毒、埃可病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒和星状病毒。
通过本发明的生产方法生产的无包膜病毒包括、但不限于,已知其生产方法的无包膜病毒,从自然界新得到的无包膜病毒,和从上述无包膜病毒衍生出的重组病毒载体。通过本发明的生产方法生产的无包膜病毒的优选例子包括腺病毒以及属于细小DNA病毒科的AAV。
本文中使用的具有生产病毒的能力的细胞(病毒生产细胞)指的是表达病毒生产所必需的元件并生产病毒颗粒的细胞。在本发明的生产方法中使用的病毒生产细胞包括、但不限于,从环境或得自具有感染的患者的临床样品得到的病毒生产细胞,以及人工制备的病毒生产细胞。在本发明中优选地使用人工制备的病毒生产细胞,且其例子包括通过将提供期望的无包膜病毒的颗粒形成所必需的元件的核酸和要包封在无包膜病毒颗粒中的核酸引入任何细胞中制备的无包膜病毒生产细胞,和通过用无包膜病毒和/或无包膜病毒生产所需的辅助病毒人工感染期望的细胞而制备的病毒生产细胞。
本文中使用的病毒载体意指由蛋白壳(被称作衣壳)组成的颗粒(也就是说,病毒颗粒)和在所述病毒颗粒中包括的病毒基因组(核酸的形式)。例如,在AAV的情况下,rAAV载体意指具有衣壳的rAAV颗粒或存在于所述rAAV颗粒中的病毒基因组DNA。本发明还可以应用于病毒样颗粒(例如,AAV空颗粒:WO2012/144446)。因而,病毒颗粒的方面包括病毒样颗粒和病毒的空颗粒。
在下文中,作为一个例子,解释了rAAV载体。rAAV颗粒的形成所必需的元件的例子包括:(A)AAV-衍生的Rep和Cap蛋白,和(B)腺病毒衍生的元件,例如,用于提供E1a蛋白、E1b蛋白、E2蛋白、E4蛋白的核酸序列和VARNA。
“任何细胞”没有特别限制。“任何细胞”的例子包括哺乳动物(诸如人、猴和啮齿动物)的细胞,且其优选例子包括293细胞(ATCC CRL-1573)、293T细胞(ATCC CRL-11268)、293F细胞、293FT细胞(都由Life Technologies Corp.制造)、G3T-hi细胞(WO06/035829)、Sf9细胞和商购可得的用于病毒生产的细胞系,例如AAV293细胞(由Stratagene Corp.制造),其具有高转化效率。例如,293细胞等恒定地表达腺病毒E1蛋白。并且,可以使用这样的细胞:其被修饰成短暂地或恒定地表达rAAV生产所需的一种或一些蛋白。
用于提供rAAV颗粒形成所需的元件的核酸的例子包括:(a)编码Rep蛋白的核酸,编码Cap蛋白的核酸,和(b)编码腺病毒衍生的元件的核酸。这些核酸的形式没有限制。可以将这些核酸作为一个或多个能够提供所述元件的核酸构建体插入质粒或病毒载体中,然后可以将所述质粒或所述病毒载体引入细胞中。用于(a)的核酸构建体的例子包括pRC2-mi342载体和pHelper载体(由TAKARA BIO Inc.制造),它们是商购可得的质粒。在将杆状病毒载体用于引入(a)和(b)的核酸构建体的情况下,可以使用载体诸如Bac-Rep和Bac-Cap。本文中使用的编码Cap蛋白的核酸不仅编码Cap蛋白,而且在开放读码框中编码AAV颗粒形成所必需的装配活化蛋白(AAP),所述开放读码框不同于编码的Cap蛋白的开放读码框(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2010,第107卷,第10220-10225页)。除非另外指出,否则“编码Cap蛋白的核酸”意指除了Cap蛋白以外还编码AAP的核酸。当在编码Cap蛋白的核酸中(自发地或人工地)发生破坏AAP的功能的突变时,可以将编码AAP的核酸进一步引入细胞中。关于(b),由于将编码E1a和E1b蛋白的核酸插入293细胞等的基因组中且恒定地表达,不一定将所述核酸引入这样的细胞中。如果必要的话,可以根据使用的细胞引入编码E1a和E1b蛋白的核酸。
要包封在rAAV颗粒中的核酸由从AAV衍生出的ITR序列和期望被rAAV载体负载的核酸组成。期望被rAAV载体负载的核酸的例子包括任何外源基因,例如用于提供多肽(酶、生长因子、细胞因子、受体、结构蛋白等)的核酸、反义RNA、核酶、诱饵(decoy)、诱导RNA干扰的RNA等。另外,为了控制外源基因的表达,可以将合适的启动子、增强子、终止子和其它转录调节元件插入核酸中。例如,要包封在rAAV颗粒中的核酸可以含有期望被rAAV载体在2个ITR序列之间负载的任何外源基因,或可以含有期望被rAAV载体负载的任何外源基因和至少一个元件,所述元件用于控制2个ITR序列之间的外源基因的表达。要包封在病毒颗粒中的核酸可以作为核酸构建体以质粒的形式引入细胞中。例如,通过使用商购可得的pAAV-CMV载体(由TAKARABIO Inc.制造)等,可以构建质粒。
一种用于引入核酸构建体的方法的例子包括短暂引入方法和恒定引入方法。
所述短暂引入方法没有特别限制,且可以使用已知的短暂引入方法,包括磷酸钙方法、脂转染方法、DEAE葡聚糖方法、聚乙烯亚胺方法和电穿孔方法。并且,可以使用商购可得的试剂,例如TransIT(注册商标)-293试剂(由Mirus Bio LLC制造)、TransIT(注册商标)-2020(由Mirus Bio LLC制造)、Lipofectamine 2000试剂(由Life TechnologiesCorp.制造)、Lipofectamine 2000CD试剂(由Life Technologies Corp.制造)、FuGene(注册商标)转染试剂(由Promega Corp.制造)等。也可以使用包括杆状病毒和昆虫细胞的应用的引入方法。
所述恒定引入方法没有特别限制,且可以使用已知的恒定引入方法,包括包含逆转录病毒载体的应用的方法、和包含以与质粒短暂引入方法相同的方式将核酸引入细胞中并选择其中所述核酸整合进染色体中的细胞的方法。关于包括逆转录病毒载体的应用的方法,可以使用商购可得的试剂,例如Retrovirus Constructive System(由TAKARABIO Inc.制造)。
如上所述,作为一个例子,解释了rAAV载体。本发明的无包膜病毒的生产的第一步包括,培养如上所述制备的无包膜病毒生产细胞。可以在已知的培养条件下培养无包膜病毒生产细胞。培养条件的例子包括、但不限于,在30-37℃的温度、95%的湿度和5-10%的CO2浓度的培养。所述细胞培养可以在上述范围以外的温度、湿度和CO2浓度进行,只要完成期望的细胞生长和无包膜病毒生产即可。培养期没有特别限制。例如,将培养持续12-150小时,优选48-120小时。用于培养无包膜病毒生产细胞的培养基没有特别限制,只要所述培养基含有细胞培养所必需的组分即可。培养基的例子包括基础合成培养基,例如DMEM、IMDM和DMEM:F-12(都可商购得自Sigma-Aldrich Co.LLC,等)。这些基础合成培养基可以进一步含有胎牛血清、生长因子或肽,或在必要时可以含有增加的量的氨基酸。
第二步包括,使如上所述培养的无包膜病毒生产细胞与酸性溶液接触。所述第二步如下进行:将无包膜病毒生产细胞的沉淀物悬浮于酸性溶液中,其中在细胞培养以后通过离心或过滤除去培养溶液而收集沉淀物,或通过将组分加入无包膜病毒生产细胞的培养溶液中,其中所述组分能够使所述培养溶液呈酸性。在使所述无包膜病毒生产细胞与酸性溶液接触时,所述无包膜病毒生产细胞已经完成病毒生产。在与酸性溶液接触的过程中,没有观察到病毒生产和细胞生长。与酸性溶液接触的温度和时间的例子包括、但不特别限于0-40℃,优选4-37℃,和1分钟至48小时,优选5分钟至24小时。可以将无包膜病毒生产细胞在超深冰柜(例如在-80℃)中以与酸性溶液接触的状态长时间储存。该接触步骤导致在生产细胞外面的无包膜病毒的释放。本发明的方法可以包括或不包括物理细胞破碎方法诸如超声破碎或冻融(它是常规方法)。
本文中使用的酸性溶液指的是呈现酸性的溶液。本发明的酸性溶液没有限制,只要所述酸性溶液显示的pH比培养的无包膜病毒生产细胞的pH更低,且没有限制,只要通过用所述酸性溶液处理已经完成病毒生产的无包膜病毒生产细胞得到含有无包膜病毒的粗提取物即可。在本发明中使用的酸性溶液具有,例如,3.0-6.9的pH,优选3.0-6.0的pH,更优选3.0-5.0的pH。在本发明中使用的酸性溶液的例子包括含有选自以下的化合物的溶液:柠檬酸、乙酸、苹果酸、磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、乳酸、丙酸、丁酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、酒石酸、苯甲酸、磺基水杨酸、甲酸和它们的盐,以及具有在pH 7或更低的缓冲区域的Good氏缓冲液,诸如MES和Bis-Tris。在本发明中,优选地使用含有柠檬酸、乙酸、磷酸或其盐的酸性溶液。在酸性溶液中所含的化合物的浓度优选地是5mM至1M,更优选10-500mM。用于制备在本发明中所用的酸性溶液的溶剂没有特别限制。所述溶剂可以适当地选自水、缓冲液、用于细胞培养的培养基等。所述溶剂可以含有一种不同的离子,取决于后续操作。这样的离子的例子包括、但不限于,阳离子诸如钠离子、钾离子和镁离子。用于在本发明中所用的酸性溶液的溶剂的优选例子包括水、含有钠离子、钾离子和/或镁离子的水溶液,诸如氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化镁溶液和生理盐水,以及含有糖的溶液诸如葡萄糖溶液和蔗糖溶液。酸性溶液的钠离子浓度和/或钾离子浓度没有特别限制,且它是例如5mM至2.7M,优选5mM至1M,更优选20-800mM。根据如下所述的第三步,可以适当地确定这些离子浓度。例如,当对通过使用本发明的酸性溶液得到的无包膜病毒的粗提取物进行层析以纯化无包膜病毒时,将所述酸性溶液调节成具有合适的盐浓度,例如3M或更低的钠离子浓度,优选地使用50mM至2M。例如,所述酸性溶液可以是含有200-500mM钠离子的30-40mM柠檬酸盐缓冲溶液。所述酸性溶液可以是含有300mM至2.5M钠离子的40-60mM柠檬酸盐缓冲溶液。
当加入培养溶液中时能够使无包膜病毒生产细胞的培养溶液呈酸性的组分没有限制,只要所述组分将培养溶液的pH改变成比培养的无包膜病毒生产细胞的pH更低的pH即可,并且没有限制,只要从已经完成病毒生产的无包膜病毒生产细胞得到含有无包膜病毒的粗提取物即可。在本发明中使用的能够使培养溶液呈酸性的组分的例子包括柠檬酸、乙酸、苹果酸、磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、乳酸、丙酸、丁酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、酒石酸、苯甲酸、磺基水杨酸、甲酸和它们的盐,以及与上述的酸性溶液相同的溶液。能够使培养溶液呈酸性的组分的添加量没有特别限制,只要从已经完成病毒生产的无包膜病毒生产细胞得到含有无包膜病毒的粗提取物即可,并且可以由本领域技术人员适当地确定。另外,可以将多种离子组分与能够使培养溶液呈酸性的组分一起加入。例如,可以使用与上面关于酸性溶液所述的那些相同的离子的溶液。
对通过上述步骤得到的在细胞外面释放的无包膜病毒的粗提取物进行用于得到无包膜病毒的第三步。例如,对通过第二步得到的粗提取物进行离心或用过滤器过滤以得到上清液或滤液。因而,从细胞和残余物分别制备部分地纯化的无包膜病毒载体,并由此得到无包膜病毒。在本发明的方法中,通过上述方法得到的部分地纯化的无包膜病毒载体可以原样稳定地储存,或可以在加入中和溶液以后稳定地储存。所述中和溶液是能够将部分地纯化的无包膜病毒载体溶液的pH调至中性的溶液。中和溶液的例子包括、但不特别限于,碱性溶液诸如氢氧化钠和氢氧化钾,和具有8.5-10.0的pH的高度浓缩的缓冲液。例如,使用1-3MTris-HCl缓冲液、TAPS缓冲液、Bicine缓冲液或甘氨酸缓冲液,可以中和部分地纯化的无包膜病毒载体。在本发明的方法中,随后可以通过超速离心、层析、超滤或其它已知方法纯化部分地纯化的无包膜病毒载体,以得到浓缩的或纯化的无包膜病毒作为终产物。用离子交换柱(例如,Pall Corp.制造的Mustang Q)、亲和柱(例如,GE Healthcare Ltd.制造的AVB Sepharose或肝素柱)、羟磷灰石柱等,可以执行通过层析对无包膜病毒的纯化。另外,可以用较高浓度的酸处理部分地纯化的无包膜病毒载体或通过第二步得到的粗提取物,以沉淀在部分地纯化的无包膜病毒载体或粗提取物中所含的杂质。用较高浓度的酸处理部分地纯化的无包膜病毒载体或粗提取物的步骤包括,例如,加入酸性溶液或组分,其中所述酸性溶液或所述组分的例子与作为在第二步中使用的能够使培养溶液呈酸性的酸性溶液或组分的例子引用的那些相同。所述“较高浓度的酸”是其浓度高于部分地纯化的无包膜病毒载体或通过第二步得到的粗提取物的酸浓度的酸,且没有特别限制。例如,当通过用30-40mM柠檬酸盐缓冲溶液处理细胞而得到粗提取物时,将柠檬酸或柠檬酸盐缓冲溶液加入粗提取物中,使得柠檬酸的终浓度增加至50-200mM,由此可以沉淀在粗提取物中所含的污染蛋白。通过合适的方法(例如冷冻)储存如此得到的病毒,直到用于期望的目的之前。
本文中使用的无包膜病毒的收率被显示为无包膜病毒的滴度。将无包膜病毒的滴度表达为,但不限于,在某一量的样品中,a)无包膜病毒的基因组的数目(基因组滴度),b)通过实验确定的无包膜病毒对细胞的感染能力(感染滴度),或c)测量的构成无包膜病毒的蛋白的量(或蛋白的纯度),其在必要时被指出。
一种用于确定基因组滴度的方法的例子包括这样的方法,其包括通过PCR确定含有无包膜病毒的样品中的病毒基因组的拷贝数。
一种用于确定感染滴度的方法的例子包括:包括用系列稀释的无包膜病毒溶液感染合适的靶细胞和检测细胞的形式的变化(细胞病)的方法,包括检测引入的基因的表达的方法,和包括确定引入细胞中的病毒基因组的拷贝数的方法。
一种用于确定构成无包膜病毒的蛋白的量(或蛋白的纯度)的方法的例子包括了包括通过免疫学技术定量测定蛋白的方法。
将本发明的方法适当地用于具有酸抗性的无包膜病毒,包括、但不限于,1型至6型AAV。
根据本发明,除了生产无包膜病毒的方法以外,还提供了在所述方法中使用的酸性溶液和通过所述方法生产的无包膜病毒。另外,提供了一种药物组合物,其包含通过本发明的方法生产的无包膜病毒作为活性成分。根据用于生产基因治疗所用的病毒制剂的技术,可以适当地制备所述药物组合物。例如,可以将通过本发明的生产方法得到的无包膜病毒通过已知方法进一步浓缩、纯化和加工,然后配制成药物组合物。所述药物组合物可以离体用于得自患者的细胞,或直接施用给患者。
本发明的另一个方面提供了一种用于生产无包膜病毒的试剂盒,其包含:
包含核酸的载体,所述核酸提供无包膜病毒颗粒形成所必需的元件,
包含核酸的载体,所述核酸要包封在无包膜病毒颗粒中,和
酸性溶液。所述试剂盒还可以包含用于中和得到的含有无包膜病毒的溶液的中和溶液。
本发明的再另一个方面提供了一种试剂盒,其包含酸性溶液和中和溶液。
本发明的再另一个方面提供了一种试剂盒,其包含:
酸性溶液,
中和溶液,
用于纯化病毒的柱,和
用在柱纯化中的各种缓冲液。
实施例
在下文中,通过实施例更具体地解释本发明,本发明不限于所述实施例。
实施例1:在粗提取物制备步骤中用酸性溶液处理的作用
(1)用于生产rAAV载体的细胞的接种
在含有10%FBS(由NichireiBiosciences Inc.制造)的DMEM/F12(由Gibco Corp.制造)中,悬浮293细胞。将混悬液接种至两个10cm细胞培养皿(由Corning Inc.制造),然后在CO2培养箱中在37℃培养过夜。确认细胞是70%汇合的。
(2)用于生产rAAV载体的质粒的转染
用各23.1μg的pRC质粒(由Cell Biolabs,Inc.制造)、pHLP质粒(由Cell Biolabs,Inc.制造)和pAAV-AcGFP质粒转染通过实施例1-(1)得到的细胞,所述pRC质粒编码Rep蛋白和2型AAV(在下文中,被称作AAV2)的Cap蛋白,所述pHLP质粒含有腺病毒-衍生的E2A、VA和V4序列,所述pAAV-AcGFP质粒在AAV2的2个ITR之间含有“CMV启动子序列、编码AcGFP1的序列和PolyA序列”作为荧光蛋白AcGFP1的表达盒。转染7小时后,将培养基完全除去,并将15mL/皿的DMEM/F12加入所述皿中。将细胞在CO2培养箱中在37℃培养2天。
(3)rAAV载体生产细胞的收集
从通过实施例1-(2)得到的皿完全除去培养基。然后,将3mL含有含有20mM EDTA(由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)的PBS(由Gibco Corp.制造)加入每个皿中,并在室温反应几分钟进行细胞脱离。然后,将含有细胞的溶液收集,并在4℃和1,750x g离心10分钟。除去上清液。将细胞沉淀物再悬浮于4mLPBS中。将混悬液以各2mL的量放入两个离心管中。将每个离心管在4℃和1,750x g离心10分钟。然后,除去上清液。
(4)通过超声破碎方法制备粗提取物向通过实施例1-(3)得到的离心管之一,加入1mL PBS,并将该试管进行5个循环,每个循环由用超声破碎设备(由BM Equipment Co.Ltd.制造)破碎和暂停组成,以制备含有rAAV载体的细胞匀浆物。将细胞匀浆物在4℃和14,000xg离心10分钟。收集上清液以得到rAAV载体的粗提取物。
(5)通过用酸性溶液(ACD-A溶液)处理来制备粗提取物向通过实施例1-(3)得到的其它离心管,加入1mL ACD-A溶液(由TERUMO Corp.制造),随后用涡旋混合器混合15秒。将混合物在水浴中在37℃静置5分钟,再次用涡旋混合器混合15秒,然后在4℃和14,000x g离心10分钟。将如此得到的上清液用作粗提取物。ACD-A溶液包含2.2w/v%柠檬酸钠水合物、0.8w/v%柠檬酸水合物和2.2w/v%葡萄糖,且具有4.5-5.5的pH。
(6)粗提取物的基因组滴度和蛋白浓度(A280)的确定
将2μL通过实施例1-(4)和实施例1-(5)制备的粗提取物用DNA酶I缓冲液(由TAKARA BIO Inc.制造)稀释50倍以后,将经稀释的粗提取物用DNA酶I(由TAKARABIO Inc.制造,以在说明书中指定的浓度)处理以除去游离的基因组DNA和质粒DNA。在75℃热处理30分钟以灭活DNA酶I以后,得到含有rAAV载体的DNA酶I处理过的溶液,并在4℃或-20℃保存。向100μL含有rAAV载体的DNA酶I处理过的溶液中,加入100μL缓冲液AL(由QIAGEN GmbH制造),并在56℃维持10分钟。将溶液用注射用水(由Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.制造)稀释100倍,并将2μL稀释液用于确定rAAV载体的基因组滴度。为了确定基因组滴度,使用SYBR Premix ExTaqII(由TAKARA BIO Inc.制造),并按照试剂盒附带的说明书进行操作,包括反应溶液的制备等。作为标准品,使用通过用限制性酶EcoRI(由TAKARA BIO Inc.制造)消化pAAV-AcGFP质粒得到的线性化的DNA。在实时PCR中使用的引物序列是与放置在AcGFP1表达盒中的CMV启动子序列对合的序列。另外,通过在蛋白测量模式的NanoDrop1000(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造),将通过实施例1-(4)和实施例1-(5)制备的粗提取物的蛋白浓度确定为A280。这些结果显示在表1中。
[表1]
VG=载体基因组。
如从表1所见,在ACD-A溶液处理的条件下制备的粗提取物的基因组滴度是在超声破碎的条件下制备的粗提取物的基因组滴度的2.8倍。另外,在ACD-A溶液处理的条件下制备的粗提取物的A280测量结果低于在超声破碎的条件下制备的粗提取物的A280测量结果。这些结果表明,通过ACD-A溶液处理有效地提取rAAV载体,并且通过ACD-A溶液处理制备的粗提取物含有较低量的污染蛋白。
实施例2:在纯化步骤(通过超速离心纯化)中用酸性溶液粗提取的作用(1)rAAV载体的生产和用ACD-A溶液制备粗提取物
除了将CellBIND(注册商标)T225烧瓶(由Corning Inc.制造)用作培养容器和将有关的反应系统放大以外,以与实施例1-(1)至(3)相同的方式收集rAAV载体生产细胞。向收集的细胞沉淀物中,加入10mLACD-A溶液,随后用涡旋混合器混合15秒。将混合物在水浴中在37℃静置5分钟,再次用涡旋混合器混合15秒,然后在4℃和14,000x g离心10分钟。将如此得到的上清液用作粗提取物。作为可比较的对照,对在相同条件下培养的rAAV载体生产细胞进行冻融方法(这是rAAV载体的常规提取方法),以制备粗提取物,并将粗提取物用BENZONASE(注册商标)(由Merck Millipore Corp.制造)(终浓度:250U/mL)处理,然后超速离心2次以得到纯化的rAAV载体溶液。
(2)部分纯化
将通过实施例2-(1)得到的粗提取物在4℃和14,000x g离心20分钟。收集上清液。将收集的上清液用具有0.2μm孔径的posidyne过滤器(由Pall Corp.制造)过滤以得到部分地纯化的产物。
(3)通过超速离心纯化
将通过实施例2-(2)得到的部分地纯化的产物放入Ultra-Clear试管(由BeckmanCoulter,Inc.制造)中,并通过常规方法通过使用氯化绝的密度梯度超速离心方法纯化。
(4)级分的收集和折射率(RI)的测量
用注射针穿入通过实施例2-(3)超速离心的试管的最下部分,并收集3-6滴流出试管的每个液体级分。当可见的漂浮物污染所述级分时,停止收集。通过折光计(由ReichertTECHNOLOGIES制造)测量每种级分的折射率(RI)。
(5)收集的级分的基因组滴度的确定
以与实施例1-(6)相同的方式确定通过实施例2-(4)得到的级分的基因组滴度。结果与通过实施例2-(4)测量的折射率一起显示在表2中。
[表2]
如从表2所见,rAAV载体积累在级分4-10中。
(6)收集的级分中蛋白纯度的确定
将通过实施例2-(4)得到的级分5-10(其中积累了更多的rAAV载体)放在透析膜(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)中,并用PBS透析。向10μL如此得到的每种级分中,加入10μL2X样品缓冲液(由TAKARA BIO Inc.制造),并在95℃混合5分钟。作为可比较的对照,使用通过如实施例2-(1)中所述的冻融方法纯化的rAAV载体溶液。将每个样品(10μL)应用在12.5%丙烯酰胺凝胶(由ATTO Corp.制造)上并电泳。电泳终止以后,将凝胶浸渍在合适量的Oriole荧光凝胶染色溶液(由Bio-RadLaboratories,Inc.制造)中,并在光屏蔽下摇动90分钟。摇动以后,用Luminoshot 400(由TAKARA BIO Inc.制造)拍摄凝胶的照片。结果显示在图1中。
如从图1所见,在使用包括ACD-A溶液处理的纯化方法的情况下,与可比较的对照相比,超速离心以后的rAAV载体溶液(级分5-10)含有较低量的污染蛋白和较高纯度的rAAV载体。如从表2所见,包括ACD-A溶液处理的纯化方法的回收率是57.7%,其中所述回收率如下计算:[(级分5-10的总基因组滴度的总和)x 100]/超速离心之前的总基因组滴度。
(7)收集的级分中的污染dsDNA的量的确定
根据在PicoGreen dsDNAQuantitation Kit(由Invitrogen Inc.制造)中描述的方案,确定在以下物质中所含的dsDNA的量:在实施例2-(1)中通过ACD-A溶液处理得到的粗提取物,通过实施例2-(2)得到的超速离心之前的部分地纯化的产物,通过实施例2-(6)得到的透析之后的级分6和级分10,和作为可比较的对照在实施例2-(1)中通过冻融方法纯化的rAAV载体溶液。结果显示在表3中。
[表3]
如从表3的结果所见,尽管事实上级分6和级分10在超速离心之前没有用BENZONASE处理,级分6和级分10的dsDNA量低于可比较的对照(其用BENZONASE处理)的dsDNA量。这些结果表明,当通过用ACD-A溶液处理而得到粗提取物并通过超速离心纯化时,会得到与常规方法相比具有高纯度的rAAV载体溶液。
实施例3:在纯化步骤中用酸性溶液粗提取的作用(阳离子交换层析纯化)
(1)用于层析的粗提取物的制备
以与实施例2-(1)和(2)相同的方式制备部分地纯化的产物。将部分地纯化的产物用注射用水(由OtsukaPharmaceutical Co.,Ltd.制造)稀释5倍,并将稀释液用作要应用的样品。
(2)通过阳离子交换层析纯化
以该顺序连接注射器(由TERUMO Corp.制造)、具有0.2μm孔径的posidyne过滤器和阳离子交换膜(Mustang S;由Pall Corp.制造),以建立阳离子交换层析设备。给注射器充入5mL用注射用水稀释5倍的ACD-A溶液,并使溶液以约4mL/分钟的流速穿过过滤器和膜。然后,更换注射器,并使10mL通过实施例3-(1)制备的要应用的样品以与上述相同的方式穿过设备。在此时,将透过的液体收集为流通级分。更换注射器,并使5mL用注射用水稀释5倍的ACD-A溶液以与上述相同的方式穿过设备。在此时,将透过的液体收集为洗液级分。进一步,更换注射器,并使(1)3mL 50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9)、(2)3mL PBS和(3)3mL2M NaCl以与上述相同的流速穿过设备。在此时,将透过的液体收集为(1)洗脱液1、(2)洗脱液2或(3)洗脱液3。
(3)每个级分中的基因组滴度的确定
以与实施例1-(6)相同的方式,确定通过实施例3-(2)得到的每个级分的基因组滴度。结果显示在表4中。
[表4]
如从表4所见,大部分(71.3%)应用的rAAV载体被洗脱进洗脱液2(PBS)中。
(4)每个级分中蛋白纯度的确定
将通过实施例3-(2)得到的每个洗脱液放在透析膜(由Thermo FisherScientific Inc.制造)中,并用PBS透析。以与实施例2-(6)相同的方式确定蛋白纯度。作为可比较的对照,以相同方式对用酸性溶液提取、然后通过实施例2-(4)中的超速离心纯化的rAAV载体溶液(级分10)进行蛋白纯度的确定。结果显示在图2中。
如从图2所见,大部分污染蛋白被洗脱进洗脱液1中。如在表4中所示,在洗脱液1中难以检测到rAAV载体。这些结果表明,可以以与常规方法相同的方式通过阳离子交换柱层析纯化通过ACD-A溶液处理得到的粗提取物,并可以用阳离子交换柱层析设备从污染蛋白分离rAAV载体。
实施例4:酸性溶液处理的温度的研究
(1)rAAV载体生产细胞的收集
除了将CellBIND(注册商标)T75烧瓶(由CorningInc.制造)用作培养容器和将有关的反应系统放大以外,以与实施例1-(1)至(3)相同的方式收集rAAV载体生产细胞。
(2)在每个温度的ACD-A溶液处理
向通过实施例4-(1)得到的rAAV载体生产细胞中,加入1mLACD-A溶液,随后用涡旋混合器混合15秒。将混合物在(1)37℃、(2)21℃或(3)4℃静置5分钟,再次用涡旋混合器混合15秒,然后在4℃和14,000x g离心10分钟。将如此得到的上清液用作粗提取物。
(3)粗提取物的基因组滴度的确定
以与实施例1-(6)相同的方式,确定通过实施例4-(2)得到的每种粗提取物的基因组滴度。结果显示在表5中。
[表5]
处理温度 | 基因组滴度(x10^10VG/mL) |
37℃ | 5.32 |
21℃ | 5.79 |
4℃ | 7.06 |
。
如从表5所见,粗提取物的基因组滴度在处理温度37℃、21℃和4℃之间没有显著差异。这些结果表明,可以通过在宽温度范围用ACD-A溶液处理来提取rAAV载体。
实施例5:293T细胞的粗提取物的研究
(1)rAAV载体生产细胞的收集
除了使用293T细胞作为宿主以外,以与实施例4-(1)相同的方式收集rAAV载体生产细胞。
(2)粗提取物的制备
从通过实施例5-(1)得到的rAAV载体生产细胞,在如下所述的三种条件下得到粗提取物。以与实施例1-(4)相同的方式,执行通过超声破碎进行的提取。以与实施例1-(5)相同的方式,执行通过用ACD-A溶液处理进行的提取。如下执行通过冻融进行的提取:将细胞沉淀物再悬浮于300μL PBS中,并重复由“在干冰-乙醇溶液中静置5分钟,在水浴中在37℃静置3分钟,和用涡旋混合器混合1分钟”组成的处理3次,以制备含有rAAV载体的细胞匀浆物。将如此得到的细胞匀浆物在4℃和14,000x g离心20分钟,并收集上清液。向上清液中,加入700μLPBS以制备粗提取物。
(3)粗提取物的基因组滴度的确定
以与实施例1-(6)相同的方式确定通过实施例5-(2)得到的每种粗提取物的基因组滴度。结果显示在表6中。
[表6]
提取条件 | 基因组滴度(x10^12VG/mL) |
超声破碎 | 1.53 |
冻融 | 0.59 |
ACD-A溶液处理 | 2.26 |
。
如从表6所见,在使用从293T细胞制备的rAAV载体生产细胞的情况下,通过ACD-A溶液处理对rAAV载体的提取效率是超声破碎的提取效率的1.5倍,且是冻融提取效率的3.8倍。
实施例6:酸性溶液-1的盐浓度的研究
(1)与ACD-A溶液等同的柠檬酸盐缓冲液的制备和具有每种盐浓度的柠檬酸盐缓冲液的制备参考ACD-A溶液的包装说明书,制备含有38.1mM柠檬酸和74.8mM柠檬酸钠的38.1mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.9)。柠檬酸盐缓冲液的柠檬酸盐离子浓度与ACD-A溶液的柠檬酸盐离子浓度相同。除了柠檬酸盐缓冲液以外,以50mM或200mM的终浓度加入氯化钠。使用这些缓冲液得到粗提取物。
(2)用每种酸性溶液制备粗提取物
以与实施例5-(1)相同的方式收集rAAV载体生产细胞。向收集的细胞中,加入通过实施例6-(1)制备的每种缓冲液或ACD-A溶液。以与实施例1-(5)相同的方式得到粗提取物。作为可比较的对照,以与实施例1-(4)相同的方式通过超声破碎制备粗提取物。
(3)粗提取物的基因组滴度的确定
以与实施例1-(6)相同的方式确定通过实施例6-(2)得到的每种粗提取物的基因组滴度。结果显示在表7中。
[表7]
如从表7所见,与通过超声破碎得到的粗提取物的基因组滴度(可比较的对照)相比,通过使用酸性溶液(ACD-A溶液或每种柠檬酸盐缓冲液)得到具有较高基因组滴度的粗提取物。当柠檬酸盐缓冲液中的钠离子浓度较高时,得到的粗提取物的基因组滴度较高。这些结果表明,通过使用酸性溶液可以有效地提取rAAV载体,并且酸性溶液中较高的钠离子浓度会导致较高的rAAV载体提取效率。
(4)使用粗提取物确定对HT1080细胞的感染滴度
将HT1080细胞以5x 10^4个细胞/孔悬浮于含有10%FBS的DMEM(由Sigma-AldrichCo.LLC.制造)中,将1mL混悬液接种在24-孔板(由Corning Inc.制造)中,随后在37℃在CO2培养箱中培养。次日,将2μL通过实施例6-(2)得到的每种含有rAAV载体的粗提取物加入每个孔中以感染细胞。2天后,使用trypLE Select(由Invitrogen Inc.制造)分散细胞。然后,使用FACS CantoII(由Becton,Dickinson and Company制造)检测表达荧光蛋白(AcGFP1)的细胞,所述荧光蛋白通过用rAAV载体感染而引入细胞中。计算AcGFP1阳性细胞的比率(%)。可以将计算的值视作每种粗提取物中的rAAV载体的感染滴度。结果显示在表8中。
[表8]
提取条件 | AcGFP1阳性细胞比率(%) |
ACD-A溶液 | 16.9 |
柠檬酸盐缓冲液 | 12.7 |
柠檬酸盐缓冲液+50mMNaCl | 18.8 |
柠檬酸盐缓冲液+200mMNaCl | 24.3 |
超声破碎(可比较的对照) | 6.4 |
。
如从表8所见,与通过超声破碎得到的粗提取物的rAAV载体感染效率(可比较的对照)相比,通过使用酸性溶液(ACD-A溶液或每种柠檬酸盐缓冲液)得到具有较高rAAV载体感染效率的粗提取物。当柠檬酸盐缓冲液中的钠离子浓度较高时,得到的粗提取物的感染滴度较高。这些结果表明,通过使用酸性溶液可以有效地提取rAAV载体,并且酸性溶液中较高的钠离子浓度会导致较高的rAAV载体提取效率。
实施例7:使用肝素柱纯化rAAV载体
(1)rAAV载体生产细胞的培养
除了使用CellBIND(注册商标)T225烧瓶(由Corning Inc.制造)作为培养容器和将有关的反应系统放大以外,以与实施例1-(1)至(2)相同的方式培养rAAV载体生产细胞。
(2)用每种酸性溶液制备粗提取物向转染后48小时的rAAV载体生产细胞中,加入0.5M EDTA(pH 8.0)。静置10分钟以后,收集rAAV载体生产细胞。将收集的细胞在4℃和1,750xg离心10分钟。离心以后,除去上清液。然后,向细胞沉淀物中,加入2mL通过实施例6-(1)制备的柠檬酸盐缓冲液+50mM NaCl,随后用涡旋混合器混合。将混合物静置5分钟,再次用涡旋混合器混合,然后在4℃和1,750xg离心10分钟。收集上清液。向收集的上清液中,加入1/13量的2MTris-HCl(pH9.5)用于中和目的,然后,加入1/100量的1MMgCl2以得到粗提取物。向如上所述的细胞沉淀物中,加入2mL DMEM,随后使用液氮和37℃水浴冻融3次。将如此得到的粗提取物用作可比较的对照。
(3)要应用的样品的制备向通过实施例7-(2)得到的每种粗提取物中,以0.2单位/μL的终浓度加入Cold-activeNuclease(由TAKARA BIO Inc.制造),并在37℃维持30分钟进行反应。反应以后,将反应混合物在4℃和2,380x g离心10分钟。收集上清液。向收集的上清液中,加入1/10量的5%脱氧胆酸钠,并在37℃维持30分钟进行反应。反应以后,将反应混合物在4℃和2,380xg离心10分钟。使用上清液作为要应用的样品。
(4)通过肝素树脂柱层析纯化向HisTALON重力柱(由Clontech laboratoriesInc.制造)中,加入0.7mL肝素树脂(由Nihon Pall Ltd.制造)50%浆,以制备肝素树脂柱。然后,将肝素树脂柱用3.5mL PBS平衡,并将2.8mL如上所述的要应用的病毒样品应用于柱。将树脂用3.5mL含有NaCl的PBS以0.1M的终浓度洗涤。洗涤以后,使1mL终浓度为0.4M的含有NaCl的PBS穿过柱。在此时,收集透过的液体作为含有rAAV载体的洗脱液。将含有rAAV载体的洗脱液加给具有Ultracel-100膜(由MerckMillipore Corp.制造)的Amicon Ultra-0.5离心过滤器单元,在4℃和2,000x g离心5分钟,脱盐,并浓缩。重复如上所述的相同操作。将所有洗脱液脱盐并浓缩以后,用200μL含有0.5%山梨醇的PBS收集膜上的rAAV载体。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实收集的rAVV载体溶液的纯度。结果显示在图3中。
如从图3所见,与可比较的对照相比,从用柠檬酸盐缓冲液+50mM NaCl处理得到的粗提取物开始的、肝素树脂柱层析纯化的rAAV载体含有更低量的污染蛋白,且具有更高的rAAV载体纯度。
实施例8:酸性溶液-2的盐浓度的研究
(1)酸性缓冲液的制备
作为得到rAAV载体粗提取物的缓冲液,制备了含有53.4mM柠檬酸和53.4mM柠檬酸钠的柠檬酸盐缓冲液(pH 4.2)。另外,向该柠檬酸盐缓冲液中,以200mM、400mM、600mM、800mM、1.0M、1.5M、2.0M或2.5M的终浓度加入氯化钠。使用这些缓冲液得到粗提取物。
(2)用每种酸性溶液制备粗提取物
以与实施例5-(1)相同的方式收集rAAV载体生产细胞。向收集的细胞中,加入通过实施例8-(1)制备的每种缓冲液或ACD-A溶液。以与实施例1-(5)相同的方式得到粗提取物。
(3)粗提取物的基因组滴度的确定
以与实施例1-(6)相同的方式,确定通过实施例8-(2)得到的每种粗提取物的基因组滴度。结果显示在表9中。
[表9]
如从表9所见,当柠檬酸盐缓冲液的钠离子浓度较高(具体地,760-1660mM的范围)时,得到的粗提取物的基因组滴度较高。这些结果表明,酸性溶液中的约0.6-2M钠离子浓度会增加rAAV载体的提取效率。
实施例9:通过加入柠檬酸-1来除去污染蛋白
(1)用柠檬酸盐缓冲液制备粗提取物
除了使用通过在实施例6-(1)中描述的方法制备的柠檬酸盐缓冲液+200mM NaCl作为提取缓冲液以外,以与实施例6-(2)相同的方式得到含有rAAV载体的粗提取物。
(2)柠檬酸沉淀
向通过实施例9-(1)得到的含有rAAV载体的粗提取物中,加入1/10量的1M柠檬酸溶液并充分悬浮,随后在4℃静置60分钟。静置以后,将混悬液在4℃和1,750x g离心20分钟。收集上清液以得到柠檬酸沉淀之后的溶液。
(3)在柠檬酸沉淀之前和之后基因组滴度和蛋白浓度(A280)的确定以与实施例1-(6)相同的方式,确定粗提取物和柠檬酸沉淀之后的溶液的基因组滴度和蛋白浓度(A280)。结果显示在表10中。
[表10]
如从表10所见,基因组滴度在柠檬酸沉淀之前和之后几乎没有变化。柠檬酸沉淀之后,蛋白浓度(A280)下降。这些结果表明,当对用酸性溶液处理得到的粗提取物进行柠檬酸沉淀时,得到具有高纯度的rAAV载体溶液。
实施例10:通过加入柠檬酸-2来除去污染蛋白
(1)用每种酸性溶液制备粗提取物
除了使用“柠檬酸盐缓冲液+200mM NaCl((i)和(ii))”或“柠檬酸盐缓冲液+200mMNaCl,进一步含有1/10量的1M柠檬酸((iii))”作为提取缓冲液以外,以与实施例6-(2)相同的方式得到含有rAAV载体的粗提取物,其中所述“柠檬酸盐缓冲液+200mM NaCl”通过在实施例6-(1)中描述的方法制备。作为可比较的对照,以与实施例1-(4)相同的方式通过超声破碎制备粗提取物((iv))。
(2)柠檬酸沉淀
取通过实施例10-(1)得到的粗提取物(i)至(iv)中的每一种的一部分,并命名为前(Before)溶液(i)至(iv)。向粗提取物(ii)的剩余部分中,加入1/10量的1M柠檬酸溶液并充分悬浮,随后在4℃静置60分钟。另一方面,向粗提取物(i)、粗提取物(iii)和粗提取物(iv)中的每一种的剩余部分中,加入1/10量的用于它们的提取的提取缓冲液并充分悬浮,随后在4℃静置60分钟。静置以后,将每种混悬液在4℃和1,750x g离心20分钟并收集上清液。将上清液命名为后(After)溶液(i)至(iv)。
(3)基因组滴度的确定、蛋白浓度(A280)的确定和AAV纯度的计算以与实施例1-(6)相同的方式确定前溶液(i)至(iv)和后溶液(i)至(iv)的基因组滴度和蛋白浓度(A280)。另外,通过“基因组滴度/A280测量”来计算AAV纯度。结果显示在图4-1至图4-3中。
如从图4-3所见,后溶液(ii)的AAV纯度是最高的。这表明,当对通过酸性溶液处理得到的粗提取物进行柠檬酸沉淀时,得到具有高纯度的rAAV载体溶液。
工业适用性
根据本发明的生产无包膜病毒的方法,可以不经辛苦操作有效地得到含有高纯度无包膜病毒的溶液。在基因治疗的基础研究研究和临床应用领域中,通过本发明的方法生产的无包膜病毒和包含无包膜病毒作为活性成分的组合物在基因转移方法中是非常有用的。
Claims (9)
1.一种生产无包膜病毒的方法,所述方法包括:
(a)培养具有生产无包膜病毒的能力的细胞的步骤,
(b)使所述细胞与酸性溶液接触的步骤,其中所述酸性溶液是在pH3.0-6.9,和
(c)得到无包膜病毒的步骤,
其中所述方法不包括物理细胞破碎方法,
其中所述无包膜病毒是腺伴随病毒载体,且
其中所述细胞是哺乳动物细胞。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述酸性溶液含有钠离子和/或钾离子。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中步骤(c)包括纯化所述无包膜病毒。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述无包膜病毒的纯化通过选自超速离心、层析和超滤的操作执行。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法,其中所述酸性溶液含有阳离子和柠檬酸。
6.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法,其中所述酸性溶液处于pH4.2-5.5。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述酸性溶液是在pH4.5-5.5。
8.根据权利要求6所述的方法,其中所述酸性溶液是在pH4.2。
9.根据权利要求6所述的方法,其中所述酸性溶液是在pH4.9。
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