JP6093358B2

JP6093358B2 - アデノ随伴ウイルスベクターの産生細胞

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Publication number: JP6093358B2
Application number: JP2014523690A
Authority: JP
Inventors: 敏和西江; 扶有子高島; 榎　竜嗣; 竜嗣榎; 峰野　純一; 純一峰野
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2012-07-06
Filing date: 2013-06-26
Publication date: 2017-03-08
Anticipated expiration: 2033-06-26
Also published as: CN104603272B; EP2871239B1; KR20150027803A; WO2014007120A1; KR101738438B1; US9422576B2; EP2871239A4; EP2871239A9; CN104603272A; EP2871239A1; US20150291980A1; JPWO2014007120A1

Description

本発明は、遺伝子治療の研究又は臨床の分野において、ヒトへの遺伝子導入に特に有用なアデノ随伴ウイルスベクターを高力価で産生する細胞に関する。

現在、先天性遺伝子疾患の治療のほか、癌や感染症の治療を目的としてウイルスベクターを用いた遺伝子治療が多数試みられている。ウイルスベクターとしては、従来、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターが多く用いられている。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は線状１本鎖ＤＮＡウイルスで、ヒトを含む広範な種の細胞に感染可能であり、血球、筋、神経細胞など分化を終えた非分裂細胞にも感染する。また、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が安定であることなどから近年遺伝子導入用のベクターとして開発が進んできた。

遺伝子導入用のＡＡＶベクターの製造には他のウイルスベクターと同様、野生型ＡＡＶゲノム上にあるウイルス粒子形成に必須な要素のうち、シス供給を要するものとトランス供給可能なものを分離してウイルス産生用の細胞に導入し、発現させることで、野生型ＡＡＶ産生とＡＡＶベクターの感染先での自立複製を防ぐ方法がとられる（特許文献１）。
従来のＡＡＶベクターの製造方法としては、１）野生型ＡＡＶゲノムの両端のＩＴＲを残して、ｒｅｐ、ｃａｐ遺伝子を除いたＡＡＶベクタープラスミドの導入、２）Ｒｅｐ、Ｃａｐタンパク質をトランスに供給するためのｒｅｐ、ｃａｐ遺伝子発現プラスミドの導入、加えてＡＡＶはその感染性ウイルス粒子形成にヘルパーウイルスと呼ばれる、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルスなどのいずれかからの補助要素の供給を要するため、３）アデノウイルス感染、を用いる方法が確立している（特許文献２）。
しかし上記方法によって得られるＡＡＶベクターは、理論上アデノウイルスが混入する。このことは、混入アデノウイルスの除去・不活性化の作業を要するため、ＡＡＶベクター力価の低減の要因となる。更に、ヒトに投与した場合にアデノウイルス感染症、炎症などの副作用の発生の懸念が残る。そこで、上記３）に代わって３’）アデノウイルス由来要素のうち、ＡＡＶウイルス粒子形成に必須な要素のみを発現するヘルパープラスミドの導入、を用いる製造方法（ヘルパーフリー系）が開発された（特許文献３）。この方法によれば、製造されたＡＡＶベクターへのアデノウイルスの混入がないため、安全性に優れる。

一方、遺伝子治療の研究又は臨床の分野に使用することを目的としたＡＡＶベクターの製造では、高力価のウイルスベクター液の取得が必要とされており、ヒト由来ＨｅＬａ細胞やＡ５４９細胞をもとにｒｅｐ、ｃａｐ遺伝子の恒常発現株を作製して、当該遺伝子の発現量を調節する工夫などが行われている。しかし、得られるＡＡＶベクターの力価は充分でなく、更に高力価のＡＡＶベクターの製造方法が求められている。

米国特許第６０９３５７０号明細書国際公開第９７／０６２７２号パンフレット国際公開第９７／１７４５８号パンフレット

本発明の目的は、煩雑な操作なく高力価のＡＡＶベクター液を得るための細胞、及び当該細胞を用いたＡＡＶベクター製造方法、キットを提供することにある。

上述のとおり、遺伝子治療の研究又は臨床に使用することを目的としたＡＡＶベクターの製造においては、より高力価なＡＡＶベクターの製造が可能となる方法が求められている。本発明者らは鋭意研究の結果、人為的に導入されたｍｉＲＮＡ、例えばｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２を発現する細胞をＡＡＶベクター製造に使用することにより、従来よりも高力価のＡＡＶベクターが得られることを見出し、本発明を完成させた。

本発明を概説すれば、本発明は
［１］ＡＡＶベクターを産生する能力を有する細胞であって、人為的に導入されたｍｉＲＮＡを発現している細胞、
［２］人為的に導入されたｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２からなる群より選択された少なくとも１種である、［１］に記載の細胞、
［３］［１］又は［２］に記載の細胞にウイルスに封入される核酸を導入したＡＡＶベクター産生細胞、
［４］ＡＡＶベクターの製造方法であって、［３］に記載の細胞を培養する工程を含む方法、
［５］ｍｉＲＮＡを供給する核酸と、ＡＡＶベクターのウイルス粒子形成に必須な要素を供給する核酸を含むＡＡＶベクター製造用のキット、
［６］［４］に記載の方法を用いて得られるＡＡＶベクター、
［７］ＡＡＶベクター産生細胞内で発現することによってＡＡＶベクター産生細胞のＡＡＶベクター産生能力を向上させることが可能なｍｉＲＮＡの選択方法であって、ｍｉＲＮＡを発現するＡＡＶベクターの混合物を作製し、細胞において高産生されるＡＡＶベクターを選抜する工程を包含する選択方法、
［８］下記工程（ａ）〜（ｅ）を包含する［７］に記載の選択方法であって、
（ａ）ｍｉＲＮＡを発現するＡＡＶベクター混合物を得る工程、
（ｂ）ｍｉＲＮＡを発現するＡＡＶベクター混合物を細胞へ感染させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を培養し、当該細胞より産生されたＡＡＶベクター混合物を取得する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られたＡＡＶベクター混合物を使用した上記（ｂ）、（ｃ）の工程を１回以上繰り返す工程、及び
（ｅ）工程（ｄ）により得られたＡＡＶベクター混合物中のｍｉＲＮＡをコードする核酸を得る工程、
に関する。

本発明により、ＡＡＶベクターを産生する能力を有する細胞が提供される。当該細胞を使用することにより、煩雑な操作なく従来に比べて高力価のＡＡＶベクターを製造することが可能となる。更に、当該細胞を用いたＡＡＶベクターの製造方法、キットが提供される。

本発明のＡＡＶベクターを産生する能力を有する細胞（以下、本発明の細胞）は、ＡＡＶベクター産生に必要な要素、並びに人為的に導入したｍｉＲＮＡを発現する細胞である。また本発明のＡＡＶベクター産生細胞は、前記本発明の細胞にウイルス粒子に封入される核酸を導入した細胞である。

本発明の細胞の作製において、材料として使用する細胞には特に限定はない。前記細胞としては、ヒト、サル、げっ歯類などの哺乳動物細胞、好適には形質転換効率が高く、アデノウイルスＥ１遺伝子を恒常的に発現する２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７３）や２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１１２６８）、２９３Ｆ細胞、２９３ＦＴ細胞（いずれもライフテクノロジーズ社製）、Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞（国際公開第０６／０３５８２９号パンフレット）、市販のＡＡＶベクター産生用細胞株、ＡＡＶ２９３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）が例示される。またＡＡＶベクター産生に必要なタンパク質のいくつかを一過的もしくは恒常的に発現するように改変した細胞が使用できる。

前記ＡＡＶベクター産生に必要な要素として、（Ａ）ＡＡＶ由来Ｒｅｐタンパク質、Ｃａｐタンパク質、（Ｂ）アデノウイルス由来要素、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、Ｅ４、ＶＡＲＮＡ遺伝子、などが例示される。本発明の細胞にＡＡＶベクターのウイルス粒子形成に必須な要素を供給する核酸として、（ａ）Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸、Ｃａｐタンパク質をコードする核酸、（ｂ）アデノウイルス由来要素をコードする核酸が例示される。これらの核酸の形態には限定はなく、使用される細胞においてそれぞれの要素を供給可能な１又は複数の核酸構築物として、プラスミドやウイルスベクターに搭載して、細胞に導入することができる。例えば市販のプラスミドであるｐＡＡＶ−ＲＣ１ｐｌａｓｍｉｄ、ｐＨｅｌｐｅｒｐｌａｓｍｉｄ（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ社製）の使用が例示される。Ｃａｐタンパク質をコードする核酸は、Ｃａｐタンパク質をコードするものとは異なる読取り枠でＡＡＶ粒子の形成に必要なＡｓｓｅｍｂｌｙ−ＡｃｔｉｖａｔｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ（ＡＡＰ）をコードしている［プロシーディングオブザナショナルアカデミーオブサイエンシーズオブジＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１０７巻、第１０２２０〜１０２２５頁（２０１０）］。特に断らない限り、本明細書に記載された「Ｃａｐタンパク質をコードする核酸」はＡＡＰをもコードしている核酸を指す。Ｃａｐタンパク質をコードする核酸においてＡＡＰの機能が失われるような変異が（自然発生的に、もしくは人為的に）生じている場合には、さらにＡＡＰをコードする核酸を本発明の細胞に導入すればよい。Ｅ１ａ、Ｅ１ｂタンパク質をコードする核酸は、先述の通り２９３細胞などにおいてはゲノム中に挿入され、恒常発現しているため、別途導入する必要はない。Ｅ１ａ、Ｅ１ｂタンパク質をコードする核酸は、使用する細胞に応じて必要であれば導入すればよい。

核酸構築物の導入の方法としては、一過性、又は恒常的な導入方法が例示される。一過性に導入する方法は特に限定はなく、公知の一過性導入方法、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、ポリエチレンイミン法、エレクトロポレーション法などが使用可能である。また市販の試薬、例えばＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２９３Ｒｅａｇｅｎｔ、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２０２０（Ｍｉｒｕｓ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ＣＤＲｅａｇｅｎｔ（以上、ライフテクノロジーズ社製）、ＦｕＧｅｎｅ（登録商標）ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（プロメガ社製）などを用いてもよい。
また核酸を細胞に恒常的に導入する方法は特に限定はなく、公知の恒常的導入方法、例えばレトロウイルスベクターを用いる方法、プラスミドの一過性導入方法と同様の方法で導入し、染色体に組み込まれた細胞を選択する方法などが使用可能である。レトロウイルスベクターを用いる方法においては、市販の試薬、例えばＲｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅＳｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）を用いてもよい。

本発明におけるｍｉＲＮＡとしては、ＡＡＶベクター産生細胞内で発現することによってＡＡＶベクター産生細胞のＡＡＶベクター産生能力を向上させることが可能なｍｉＲＮＡが好適に例示される。

前記ＡＡＶベクター産生細胞内で発現することによってＡＡＶベクター産生細胞のＡＡＶベクター産生能力を向上させることが可能なｍｉＲＮＡは、本明細書に開示される選択方法（以下、本発明の選択方法）によって、当業者であれば容易に選択可能である。本発明の選択方法は、細胞中で各々異なるｍｉＲＮＡ（例えばヒトｍｉＲＮＡ）を発現するＡＡＶベクターのライブラリー（混合物）を作製し、その中から細胞において高産生されるＡＡＶベクターを選抜する工程を含む。
前記ＡＡＶベクターライブラリーの作製方法としては、ｍｉＲＮＡライブラリーをコードする核酸をウイルス粒子に封入される核酸に連結した核酸構築物を作製し、この核酸構築物に公知の方法を適用してｍｉＲＮＡライブラリー搭載ＡＡＶベクターを取得する方法が例示される。前記の核酸構築物の作製は、例えば市販のＡＡＶベクタープラスミドであるｐＡＡＶ−ＭＣＳＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒ（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ社製）等を利用することができる。次に上記ｍｉＲＮＡライブラリー搭載ＡＡＶベクターをＡＡＶベクター産生細胞の作製に適した細胞（例えばＡＡＶ２９３細胞）に感染させる。ついでこの細胞にＡＡＶベクター産生に必要な要素をコードする核酸構築物を一過性に導入して培養し、当該細胞が産生するＡＡＶベクター混合物を取得する。ここで得られたＡＡＶベクターを用いて上述の工程（感染、培養、ベクター取得）を１サイクル以上行う。このサイクルを繰り返すことで、ＡＡＶベクター混合物中にＡＡＶベクター産生を向上させるｍｉＲＮＡを発現する核酸を搭載するＡＡＶベクターが濃縮されていく。こうして得られたＡＡＶベクター混合物中のＡＡＶベクターについて、搭載されたｍｉＲＮＡの塩基配列の解読を行う。上記サイクルを繰り返すことにより得られる頻度が高くなるｍｉＲＮＡを同定し、それらをＡＡＶベクター産生を向上させるｍｉＲＮＡとみなす。このようにして選択されるｍｉＲＮＡは、本発明の細胞におけるｍｉＲＮＡとして好適に利用でき、例えばｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３４２が例示される。

前記ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２を構成するＲＮＡの塩基配列は公知であり、それぞれをコードするＤＮＡ配列はＮＣＢＩＧＥＮＥＩＤ：４０６９７２、４４２８９８、４４２９０９として登録されている。当該配列を搭載したｍｉＲＮＡ発現プラスミドベクターは市販されており、タカラバイオ社などから入手可能である。

本発明の細胞は、前述のようなｍｉＲＮＡを発現する核酸が人為的に導入されて作製されている。人為的に導入する方法には特に限定はなく、例えばプラスミド等の核酸構築物の形態で一過性又は恒常的に導入される。又、核酸構築物への搭載の形態にも限定はなく、単独で、あるいはＡＡＶベクター産生に必要な要素を供給する核酸、又はウイルス粒子に封入される核酸と同一の核酸構築物に搭載されていても良い。

本発明のＡＡＶベクターを産生する能力を有する細胞にウイルス粒子に封入される核酸が導入されることにより、本発明のＡＡＶベクター産生細胞が作製される。こうして作製されるＡＡＶベクター産生細胞も本発明の態様の一つである。前記のウイルス粒子に封入される核酸は、ＡＡＶ由来のＩＴＲ配列とＡＡＶベクターに搭載することが望まれる核酸で構成される。前記のＡＡＶベクターに搭載することが望まれる核酸としては、任意の外来遺伝子、例えばポリペプチド（酵素、成長因子、サイトカイン、レセプター、構造タンパク質など）、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、デコイ、ＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡなどをコードする核酸が例示される。前記の外来遺伝子の発現の制御のため、適当なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターやその他の転写調節要素が前記の核酸に挿入されていてもよい。ウイルス粒子に封入される核酸はプラスミドの形態で細胞に導入することができる。前記のプラスミドは、例えば市販のＡＡＶベクタープラスミドであるｐＡＡＶ−ＭＣＳＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ等（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ社製）を使用して構築することができる。

本発明のＡＡＶベクターの製造は、本発明の細胞にウイルス粒子に封入される核酸を一過性又は恒常的に導入する工程を含む方法により得られた、ＡＡＶベクター産生細胞を培養することで実施される。核酸を一過性又は恒常的に導入する方法としては、特に限定はなく、例えば、核酸構築物の導入方法として上記した公知の一過性導入方法又は恒常的導入方法を用いてもよい。
好適にはｍｉＲＮＡを発現する核酸は、単独で、もしくはＲｅｐタンパク質及び／又はＣａｐタンパク質をコードする核酸と同一の発現プラスミドに搭載して一過性に導入することにより、本発明はより高い効果を発揮する。

本発明によるＡＡＶベクターの製造において、ＡＡＶベクター産生細胞の培養は、公知の培養条件で行うことができる。例えば温度３０〜３７℃、湿度９５％、ＣＯ_２濃度５〜１０％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。所望の細胞の増殖、ＡＡＶベクターの産生が達成できるのであれば前記の範囲以外の温度、湿度、ＣＯ_２濃度で実施してもよい。

培養用培地は、本発明のＡＡＶベクター産生細胞が培養されＡＡＶベクター製造が達成される物であれば特に限定はなく、例えば公知の培地や無血清培地、例えばＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ハムＦ１２、ＲＰＭＩ−１６４０などを使用してもよく、これらはＬｏｎｚａ社、ライフテクノロジーズ社、シグマ・アルドリッチ社などから市販品として入手することができる。培地には、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）やヒト血清由来のアルブミン等を添加してもよい。

培養期間は特に限定はなく、例えば１２〜７２時間、好適には４８〜７２時間が好ましい。また、ＡＡＶベクター液は、培養上清や回収した細胞を適当な緩衝液に再懸濁して破砕したもの（細胞破砕液）の遠心上清から取得することができる。本発明では、こうして得られた培養上清や遠心上清は、そのまま、あるいは更に、例えばフィルターろ過して、又は公知の方法により濃縮もしくは精製してＡＡＶベクター液とし、適切な方法、例えば凍結して所望の用途に使用するまで保存される。

本発明のＡＡＶベクター産生細胞を用いて製造するＡＡＶベクターには特に限定はなく、既存の血清型もしくは天然から新たに取得した野生型ＡＡＶに由来する組換えＡＡＶベクターが例示される。本発明の細胞を作製する際に適切な材料、例えばＲｅｐタンパク質をコードする核酸やＣａｐタンパク質をコードする核酸を選択することにより、使用したい血清型のＡＡＶに基づく組換えＡＡＶベクターを作成することができる。またウイルス粒子に封入される核酸からＲｅｐタンパク質をコードする核酸を欠損させることで、ウイルス粒子に封入されたＤＮＡの標的細胞ゲノムへの挿入を防止し、任意の外来遺伝子の挿入領域を増加させたＡＡＶベクターも例示される。

本明細書では、ＡＡＶベクター産生の程度はＡＡＶベクターの力価を用いて示される。前記ＡＡＶベクターの力価は、一定量の試料におけるａ）正常に形成されたＡＡＶベクター粒子から得られたゲノムの個数（ゲノム力価）、又はｂ）実験的に測定されるＡＡＶベクターの細胞への感染能力（感染力価）のいずれかであり、必要に応じて明記して示される。

ゲノム力価の測定方法としては、例えば核酸分解酵素処理とそれに引き続くプロテアーゼ処理を行うことで核酸不純物が分解されたＡＡＶベクター含有試料中のウイルスゲノムのコピー数をＰＣＲ法で検定する方法が例示される。
感染力価の測定方法としては、例えばＡＡＶベクター含有試料の系列希釈液を適当な標的細胞に感染させ、導入遺伝子の発現、細胞の形状変化（細胞変性）の検出、細胞に導入されたプロウイルスのコピー数の測定、といった方法が例示される。

本発明により、本発明のＡＡＶベクター産生細胞を用いて取得したＡＡＶベクターを有効成分として含有する医薬組成物も提供される。当該医薬組成物は、遺伝子治療用ＡＡＶベクター製剤の製造技術に従って適宜調製することができる。例えば、本発明の製造方法により得られたＡＡＶベクターを公知の方法で濃縮、精製して得られたＡＡＶベクターを医薬組成物とすることができる。当該医薬組成物は、患者由来の細胞に体外で使用するか、もしくは患者へ直接投与することもできる。
したがって、本発明は、本発明のＡＡＶベクター産生細胞を用いて取得したＡＡＶベクターを有効成分として含有する医薬組成物を投与することを特徴とする治療方法も提供する。さらに、本発明は、医薬の製造における、本発明のＡＡＶベクター産生細胞を用いて取得したＡＡＶベクターの使用を提供する。また、本発明は、治療において使用するための、本発明のＡＡＶベクター産生細胞を用いて取得したＡＡＶベクターを提供する。

本発明の細胞の作製に使用されるｍｉＲＮＡを発現する核酸と、ＡＡＶベクターのウイルス粒子形成に必須な要素を供給する核酸（Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸、Ｃａｐタンパク質をコードする核酸、アデノウイルス由来タンパク質をコードする核酸）を組み合わせることにより、ＡＡＶベクター産生細胞作製用のキットとすることができる。前記の核酸はそれぞれ、もしくは適宜組み合わせて、細胞内で所望のＲＮＡやタンパク質を供給可能な核酸構築物としてキットに含有させることができる。当該キットには、更にウイルス粒子に封入される核酸を作成するためのベクターや適切な細胞を含有させてもよい。

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２−ｍｉＲＮＡライブラリープラスミドの構築
ｐＡｓＲｅｄ２−Ｃ１Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック社製）の、ＣＭＶプロモーターからｐｏｌｙＡシグナルにわたる約１．６ｋｂの断片をＰＣＲ法によって得た。この際、ＮｏｔＩの認識部位を有する増幅用プライマーを使用し、ＰＣＲ産物の両端にＮｏｔＩの認識部位を付加した。この断片をＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）で処理して、インサート断片とした。一方ｐＡＡＶ−ＭＣＳＶｅｃｔｏｒ（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ社製）をＮｏｔＩで処理して約２．９ｋｂの断片を得、これをベクター断片とした。このベクター断片とインサート断片をＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドでＥ．ｃｏｌｉＨＳＴ０８ＰｒｅｍｉｕｍＣｏｍｐｉｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（タカラバイオ社製、以下大腸菌と記載する）を形質転換した。得られた形質転換体から抽出したプラスミドＤＮＡのうち、上流からＣＭＶプロモーター、ＡｓＲｅｄ２コード領域、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、ｐｏｌｙＡシグナルの順に挿入されたものを選んでｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２Ｖｅｃｔｏｒとした。
ｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２ＶｅｃｔｏｒをＢｇｌＩＩ（タカラバイオ社製）とＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で処理した。一方、ｐＢＡｐｏ−ＣＭＶＤＮＡにクローニングされたヒトｍｉＲＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）をＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）とＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたｍｉＲＮＡコード領域の断片をＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて前記のｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２Ｖｅｃｔｏｒに連結した。ただし、内部にＢａｍＨＩ又はＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を持つｍｉＲＮＡに関しては、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＡｄｖａｎｔａｇｅＰＣＲクローニングキット（クロンテック社製）を用いたディレクショナルクローニングによりｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２Ｖｅｃｔｏｒに連結した。こうして得られた組換えプラスミドをｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２−ｍｉＲＮＡライブラリープラスミドとして以下の実験に使用した。

実施例２ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクターの製造
（１）ＡＡＶ２９３細胞の播種
ＡＡＶ２９３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を１０％ＦＢＳ（サーモサイエンティフィック社製）、２ｍＭＬ−グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ（シグマ・アルドリッチ社製）に２．５ｘ１０^５細胞／ｍＬとなるように懸濁した。この懸濁液４ｍＬを細胞培養用６０ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）に添加し、５％ＣＯ_２存在下、３７℃のインキュベーター（以下３７℃のＣＯ_２インキュベーター）で一夜培養した。
（２）ＡＡＶ２９３細胞へのプラスミド導入
実施例１で得たｐＡＡＶ２−ＡｓＲｅｄ２−ｍｉＲＮＡライブラリープラスミド及びｐＨｅｌｐｅｒｐｌａｓｍｉｄとｐＡＡＶ−ＲＣ１ｐｌａｓｍｉｄ（いずれもＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ社製）をそれぞれ４μｇずつ使用し、リン酸カルシウム法を用いて実施例２−（１）のＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションした。６時間後、培地を完全に除去し、２％ＦＢＳ及び２ｍＭＬ−グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ４ｍＬを添加し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで更に４８時間培養した。

（３）ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクターの回収
実施例２−（２）で培養したＡＡＶ２９３細胞より培地を除去し、ＰＢＳ（ナカライテスク社製）を１ｍＬ添加した。ピペッティングでＡＡＶ２９３細胞を１．５ｍＬチューブに回収し、４℃、７００×ｇ、５分間遠心後、上清を除去した。ＰＢＳ０．１ｍＬにＡＡＶ２９３細胞を再懸濁後、エタノール／ドライアイスで２分間、３７℃のウォーターバスで２分間、ボルテックス・ミキサーでの撹拌１分間の処理を３回繰り返し、ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクターを含む細胞破砕液を回収した。この細胞破砕液を４℃、１０，０００×ｇ、１０分間遠心後、上清を回収しＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクター液とした。

実施例３ＡＡＶベクターのゲノム力価測定
（１）ＤＮａｓｅ処理
ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクター液２μＬに、１０ｘＤＮａｓｅＩバッファー２μＬ、注射用水（大塚製薬社製）１５．２μＬ、ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）０．８μＬを添加した反応液を調製した。ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅ（登録商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ（タカラバイオ社製）を用いて３７℃で一時間インキュベートし、遊離のゲノムやプラスミドを分解した。その後、ＤＮａｓｅＩを不活化するために９９℃、１０分間の熱処理した後、実施例３−（２）の処理まで４℃あるいは−２０℃にて保存した。

（２）ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理
実施例３−（１）で得られた反応液２０μＬに、注射用水１５μＬ、１０×ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫバッファー（０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．１ＭＥＤＴＡ、５％ＳＤＳ）４μＬ、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（タカラバイオ社製）１μＬを加え、ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅ（登録商標）Ｓｔａｎｄａｒｄを用いて５５℃で一時間インキュベートし、ＡＡＶベクターのゲノムを遊離させた。その後、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを不活化するためにこの溶液を９５℃で１０分間処理した。こうして調製した溶液をＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクターゲノム液として、リアルタイムＰＣＲに供するまで４℃又は−２０℃にて保存した。

（３）リアルタイムＰＣＲ
実施例３−（２）で調製したＡＡＶベクターゲノム液を注射用水で５０倍希釈したもの２μＬを鋳型とし、配列表の配列番号１（Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ１）及び配列番号２（Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ１）に記載のプライマー、ＳＹＢＲ（登録商標）ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。反応液調製はキットに添付の説明書に従った。標準品として、ＡＡＶベクターゲノム液に替えて、ｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２をＥｃｏＲＩで処理して線状化したＤＮＡ液を用いた。リアルタイムＰＣＲ反応はＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅ（登録商標）ＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍＳｉｎｇｌｅ（タカラバイオ社製）を用い、装置推奨の条件で行った。その後、装置添付の説明書に従ってＡＡＶベクターゲノムの定量を行い、ゲノム力価をＡＡＶベクター産生細胞１個当たりのＡＡＶベクターゲノム数（ｖｉｒａｌｇｅｎｏｍｅ／ｃｅｌｌ、以下ＶＧ／ｃｅｌｌ）で表した。

実施例４ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーのスクリーニング
（１）ＡＡＶ２９３細胞の播種
ＡＡＶ２９３細胞を１０％ＦＢＳ、２ｍＭＬ−グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭに２．５ｘ１０^５細胞／ｍＬとなるように懸濁した。この懸濁液４ｍＬを細胞培養用６０ｍｍディッシュに添加し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで一夜培養した。

（２）ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクターのＡＡＶ２９３細胞への感染
実施例４−（１）で培養したＡＡＶ２９３細胞より培地を完全に除去した後、実施例２で調製したＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクター溶液をゲノム力価換算値でｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）約８５０になるように２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに希釈して２ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで２時間培養した。その後、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを２ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで一夜培養した。

（３）ｐＡＡＶ−ＲＣ１ｐｌａｓｍｉｄ及びｐＨｅｌｐｅｒｐｌａｓｍｉｄのＡＡＶ２９３細胞へのトランスフェクション
実施例４−（２）で培養したＡＡＶ２９３細胞に、リン酸カルシウム法を用いて、ｐＡＡＶ−ＲＣ１ｐｌａｓｍｉｄ及びｐＨｅｌｐｅｒｐｌａｓｍｉｄを４μｇずつトランスフェクションした。６時間後、培地を完全に除去した後に２％ＦＢＳ及び２ｍＭＬ−グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ４ｍＬを添加した細胞を、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで更に４８時間培養した。

（４）ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクターの再回収
実施例４−（３）で培養したＡＡＶ２９３細胞より培地を除去し、ＰＢＳを１ｍＬ添加した。ピペッティングでＡＡＶ２９３細胞を１．５ｍＬチューブに回収し、４℃、７００×ｇ、５分間遠心後、上清を除去した。ＰＢＳ０．１ｍＬに細胞を再懸濁後、エタノール／ドライアイスで２分間、３７℃のウォーターバスで２分間、ボルテックス・ミキサーでの撹拌１分間の処理を３回繰り返し、ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクターを含む細胞破砕液を回収した。この細胞破砕液を４℃、１０，０００×ｇ、１０分間遠心後、上清を回収しＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクター液とした。

（５）ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクターの濃縮
上記実施例４−（１）〜（４）を計８回繰り返し、ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクターを濃縮した。各ラウンドにおける感染時ウイルス量（ｍｏｉ）及び回収ウイルス量をゲノム力価換算値を用いて表１に示す。

上記の表より、ラウンド５以降はＡＡＶ−ｍｉＲＮＡウイルスが複製しやすくなっており、ＡＡＶベクター産生を向上させるｍｉＲＮＡが濃縮されたと考えられた。

実施例５ＡＡＶベクター産生を向上させるｍｉＲＮＡの選択
（１）ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡベクターゲノムの調製
実施例４の各ラウンドで回収したＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクター液２μＬを用いて実施例３−（１）、（２）と同様の方法でＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクターゲノム液を得た。

（２）ｍｉＲＮＡのクローニング
実施例５−（１）で得たＡＡＶ−ｍｉＲＮＡライブラリーベクターゲノム液を鋳型とし、配列表の配列番号３（Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ２）及び配列番号４（Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ２）に記載のプライマー、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてｍｉＲＮＡコード領域周辺をＰＣＲ法により増幅させた。反応は、９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃３０秒を３０サイクル繰り返した後、更に同じ条件を１回繰り返した。得られた断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＡｄｖａｎｔａｇｅＰＣＲクローニングキットを用いてＨｉｎｃＩＩ（タカラバイオ社製）及びＢＡＰ（タカラバイオ社製）処理済のｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）に連結した。

（３）ｍｉＲＮＡの塩基配列の解読
実施例５−（２）で得られた組換えプラスミドで大腸菌を形質転換後、アンピシリンを含むＬＢプレートに播種して３７℃で一夜培養し、コロニーを多数得た。コロニーをいくつか選び、それぞれをアンピシリンを含むＬＢ液体培地で一夜培養し、ＭｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドについて塩基配列の解読を行い、プラスミド上にコードされているｍｉＲＮＡ名を同定した。その結果を表２に示す。

上記の表に示す通り、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ１、３２４、３４２等が複数回同定されたことから、ラウンドを繰返すことで、ＡＡＶベクター産生を向上させるｍｉＲＮＡが取得されたと考えられた。

実施例６取得したｍｉＲＮＡの評価
（１）ｍｉＲＮＡ発現プラスミドの調製
ｐＢＡｐｏ−ＣＭＶＤＮＡにクローニングされたヒトｍｉＲＮＡライブラリーからｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２が挿入されたプラスミドを選択し、それぞれを用いて大腸菌を形質転後、プラスミドを大量調製した。プラスミド調製にはＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄＸｔｒａＭｉｄｉＥＦ（マッハライナーゲル社製）を用いた。得られたプラスミドをそれぞれｐＢａｐｏ−ｍｉＲ１９６ａ１、ｐＢａｐｏ−ｍｉＲ３２４、ｐＢａｐｏ−ｍｉＲ３４２と名付けた。

（２）ＡＡＶベクターの製造
実施例６−（１）で得られたプラスミドを、ｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２−Ｃ１ｖｅｃｔｏｒ、ｐＡＡＶ−ＲＣ１ｐｌａｓｍｉｄ、ｐＨｅｌｐｅｒｐｌａｓｍｉｄと同時にＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションした。コントロールとして、実施例６−（１）で得られたプラスミドに替えてｐＢＡｐｏ−ＣＭＶをトランスフェクションした群も設定した。トランスフェクション及びＡＡＶベクター回収までの操作は、実施例２−（１）〜（３）と同様の方法で行った。

（３）ＡＡＶベクターのゲノム力価測定
得られたＡＡＶベクターのゲノム力価を実施例３と同様の方法で測定した。その結果を表３に示す。

上記の表に示すとおり、ｐＢＡｐｏ−ｍｉＲ３２４、ｐＢＡｐｏ−ｍｉＲ１９６ａ１、ｐＢＡｐｏ−ｍｉＲ３４２を用いたところ、コントロールと比較して高いゲノム力価のＡＡＶベクターが得られた。とくにｐＢＡｐｏ−ｍｉＲ３２４では数倍高いゲノム力価のＡＡＶベクターが得られた。

実施例７ｐＲＣ−ｍｉＲ３４２プラスミドの評価
（１）ｐＲＣ−ｍｉＲ３４２プラスミドの調製
ｐＢＡｐｏ−ｍｉＲ３４２を鋳型として、配列表の配列番号５（Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ３）及び配列番号６（Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ３）に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法によりＣＭＶプロモーターからｍｉＲ３４２コード領域までを含む領域を増幅した。得られた断片を、ＳｎａＢＩ（タカラバイオ社製）処理したｐＡＡＶ−ＲＣ１ｐｌａｓｍｉｄにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＡｄｖａｎｔａｇｅＰＣＲクローニングキットを用いて連結した。得られた組換えプラスミドの塩基配列を解読しＣＭＶ−ｍｉＲ３４２断片が挿入されていることを確認後、プラスミドを調製した。得られたプラスミドをｐＲＣ−ｍｉＲ３４２とした。

（２）ｐＲＣ−ｍｉＲ３４２の評価
実施例７−（１）で得られたｐＲＣ−ｍｉＲ３４２を、ｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２ｖｅｃｔｏｒ、ｐＨｅｌｐｅｒｐｌａｓｍｉｄと同時にＡＡＶ２９３にトランスフェクションした。コントロールとして、ｐＲＣ−ｍｉＲ３４２に替えてｐＡＡＶ−ＲＣ１ｐｌａｓｍｉｄをトランスフェクションクションした群も設定した。こうして得られたＡＡＶベクター産生細胞を２９３−ＲＣ−ｍｉＲ３４２細胞、２９３−ＲＣ細胞と名付けた。トランスフェクションの方法及びＡＡＶベクター回収までの操作は、実施例２−（１）〜（３）と同様の方法で行った。

（３）ＡＡＶベクターのゲノム力価測定
実施例７−（２）で得られた各ＡＡＶベクター産生細胞から得られたＡＡＶベクターのゲノム力価を実施例３と同様の方法で測定した。その結果を表４に示す。

上記の表に示すように、ｐＲＣ−ｍｉＲ３４２を用いて作製したＡＡＶベクター産生細胞からは、コントロールと比較して６割高いゲノム力価のＡＡＶベクターが得られたことが示された。

実施例８得られたＡＡＶベクターの評価
（１）標的細胞の播種
ＡＡＶ２９３細胞を１０％ＦＢＳ、２ｍＭＬ−グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭに４ｘ１０４細胞／ｍＬとなるように懸濁した。この懸濁液１ｍＬを細胞培養用２４ウェルプレート（コーニング社製）に添加し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで一夜培養した。

（２）ウイルス感染
実施例８−（１）のＡＡＶ２９３細胞より培地を除去した後、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭＬ−グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭを５００μＬ添加し、実施例７−（２）で得られたＡＡＶベクター溶液を１μＬ添加した。３７℃のＣＯ_２インキュベーターで６時間培養後、培地を除去し、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭＬ−グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭを５００μＬ添加し、一夜培養した。

（３）フローサイトメーター解析と感染力価の算出
実施例８−（２）で培養したＡＡＶ２９３細胞より培地を除去し、ＰＢＳを５００μＬ添加した。トリプシン処理後、培地を５００μＬ添加しピペッティングでＡＡＶ２９３細胞を１．５ｍＬチューブに回収した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメーターＣｙｔｏｍｉｃｓＦＣ５００（ベックマン・コールター社製）でＡｓＲｅｄ２陽性率を測定した。得られた値をもとに感染力価を算出し、ＡＡＶベクター液１ｍＬ当たりの感染性ＡＡＶベクター数（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｖｉｒａｌｐａｒｔｉｃｌｅ／ｍＬ、以下ｉｖｐ／ｍＬ）で示した。その結果を表５に示す。

上記の表に示すように、ｐＲＣ−ｍｉＲ３４２を用いて製造したＡＡＶベクターは、ゲノム力価だけでなく、感染力価も高く、ｐＲＣ−ｍｉＲ３４２はＡＡＶベクター産生細胞に導入されたことで、正常な感染能を持ったＡＡＶベクターの産生能力を向上させることが明らかとなった。

実施例９ｐＲＣ６-ｍｉＲ３４２、ｐＲＣ９-ｍｉＲ３４２プラスミドの評価
（１）ｐＲＣ-ｍｉＲＮＡプラスミドの作製
ｐＡＡＶ―ＲＣ１をＳｍｉＩとＳｎａＢＩで処理し、９型ＡＡＶのＣａｐ遺伝子の同部位を人工合成の上、連結して、ｐＲＣ９を構築した。実施例７−（１）で増幅したＣＭＶプロモーターからｍｉＲ３４２コード領域まで含む断片を、ＳｎａＢＩ処理したｐＲＣ９に実施例７−（１）と同様の方法により連結し、ｐＲＣ９−ｍｉＲ３４２を得た。即ち、ｐＲＣ９−ｍｉＲ３４２は９型ＡＡＶのＣａｐ遺伝子及びＣＭＶ−ｍｉＲ３４２断片を含むヘルパープラスミドである。また、ｐＢａｐｏ−ｍｉＲ３４２を鋳型として、配列表の配列番号７（Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ４）及び配列番号８（Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ４）に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法によりＣＭＶプロモーターからｍｉＲ３４２コード領域までを含む領域を別途増幅した。この断片を、ＳｍａＩ（タカラバイオ社製）処理したｐＲｅｐ−ＣａｐＡＡＶ６プラスミド（ＡｐｐｌｉｅｄＶｉｒｏｍｉｃｓ社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＡｄｖａｎｔａｇｅＰＣＲクローニングキットを用いて連結し、ｐＲＣ６−ｍｉＲ３４２を得た。即ち、ｐＲＣ６−ｍｉＲ３４２は６型ＡＡＶのＣａｐ遺伝子及びＣＭＶ−ｍｉＲ３４２断片を含むヘルパープラスミドである。

（２）ｐＲＣ-ｍｉＲＮＡの評価
実施例９−（１）で得られたプラスミドまたはコントロールプラスミドを、ｐＡＡＶ−ＡｓＲｅｄ２、ｐＨｅｌｐｅｒｐｌａｓｍｉｄと同時にＡＡＶ２９３へトランスフェクションした。トランスフェクションの方法及びＡＡＶベクター回収までの操作は、実施例２−（１）〜（３）と同様の方法で行った。

（３）ＡＡＶベクターのゲノム力価測定
実施例３と同様の方法で、製造したＡＡＶベクターのゲノム力価を定量した。その結果を表６に示す。

表６に示すように、ｍｉＲ３４２を挿入したｐＲＣを用いると、６型及び９型ＡＡＶであってもコントロールと比較して高いゲノム力価のＡＡＶベクターが得られることが示された。

本発明の細胞を用いることにより、従来に比べ高力価のＡＡＶベクターを製造することができる。本発明の細胞を用いて製造されたＡＡＶベクターや当該ＡＡＶベクターを有効成分とする組成物は、遺伝子治療の研究又は臨床の分野における遺伝子導入方法として非常に有用である。

SEQ ID NO:1: Forward primer 1
SEQ ID NO:2: Reverse primer 1
SEQ ID NO:3: Forward primer 2
SEQ ID NO:4: Reverse primer 2
SEQ ID NO:5: Forward primer 3
SEQ ID NO:6: Reverse primer 3
SEQ ID NO:7: Forward primer 4
SEQ ID NO:8: Reverse primer 4

Claims

ＡＡＶベクター産生細胞であって、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ１、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３４２からなる群より選択された少なくとも１種の外来性ｍｉＲＮＡを含み、かつ、発現しており、ＡＡＶベクターのウイルス粒子形成に必須な要素を発現する核酸をさらに含む、ＡＡＶベクターを産生する細胞、ただし前記ｍｉＲＮＡを発現する核酸がウイルス粒子に封入される核酸に含まれている細胞を除く。
請求項１に記載の細胞にウイルスに封入される核酸を導入したＡＡＶベクター産生細胞。
ＡＡＶベクターの製造方法であって、請求項２に記載の細胞を培養する工程を含む方法。
ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ１、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３４２からなる群より選択された少なくとも１種のｍｉＲＮＡを発現する核酸と、ＡＡＶベクターのウイルス粒子形成に必須な要素を発現する核酸とを組み合わせて含むキット。