BR112019025792A2 - agentes de aperfeiçoamento para transfecção de células melhoradas e/ou produção de vetor raav - Google Patents

Abstract

São fornecidos métodos e composições de transdução/transfecção de células com uma molécula, como um ácido nucleico (por exemplo, plasmídeo), com alta eficiência. Células transduzidas/transfectadas de alta eficiência podem, quando transduzidas com um ácido nucleico que codifica uma proteína ou compreende uma sequência que é transcrita em uma transcrição de interesse, produzir altas quantidades de proteína e/ou transcrição. As células transduzidas/transfectadas de alta eficiência podem, quando transduzidas com plasmídeos compreendendo (i) ácidos nucleicos que codificam proteínas de encapsulamento AAV e/ou ácidos nucleicos que codificam proteínas auxiliares e (ii) um transgene que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse, produzir grandes quantidades de vetor rAAV recombinante.

Description

“AGENTES DE APERFEIÇOAMENTO PARA TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS MELHORADAS E / OU PRODUÇÃO DE VETOR rAAV”

INFORMAÇÕES RELACIONADAS AO PEDIDO

[01] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisória dos EUA de No. 62/516.432, depositado em 07 de junho de 2017, e ao Pedido de Patente Provisória dos EUA No. 62/531.626, depositado em 12 de julho de 2017. Todo o conteúdo dos pedidos anteriores é incorporado aqui por referência, incluindo todos os textos, tabelas, listagem de sequência e figuras.

CAMPO DA INVENÇÃO

[02] Esta invenção refere-se aos campos da transdução celular (transfecção) com ácido nucleico, por exemplo, plasmídeos. Mais particularmente, a invenção fornece composições e métodos para a produção de células transduzidas (transfectadas), as referidas células opcionalmente produzindo Vetor Viral Adeno-Associado. (rAAV).

INTRODUÇÃO

[03] Várias publicações e documentos de patentes são citados ao longo do relatório descritivo para descrever o estado da técnica a que esta invenção pertence. Cada uma destas citações é incorporada aqui por referência como se estabelecidas na íntegra.

SUMÁRIO

[04] A invenção apresenta composições e métodos para a transfecção de células com pelo menos uma sequência de ácido nucleico. Em uma modalidade, uma composição ou método de transfecção inclui: (a) colocar em contato células com pelo menos um ácido nucleico formulado com uma solução compreendendo polietilenimina (PEI); (b) incubar ou cultivar células com o ácido nucleico e a solução de polietilenimina (PEI); (c) adicionar um agente de aperfeiçoamento no momento ou imediatamente após a etapa (a) ou até menos de 3 horas após a etapa (a) para produzir uma mistura; e (d) incubar a referida mistura da etapa (c), transfectando assim as células com a sequência de ácido nucleico.

[05] A invenção também fornece composições e métodos para fazer células que produzem vetores virais recombinantes, como o vetor rAAV. Em uma modalidade, uma composição ou método inclui: (a) fornecer uma mistura de PEI/plasmídeo dos componentes (i), (ii) e (iii), em que (i) é um ou mais plasmídeos compreendendo ácidos nucleicos que codificam proteínas de encapsulamento AAV e/ou ácidos nucleicos que codificam proteínas auxiliares; (ii) é um plasmídeo compreendendo um transgene que codifica uma proteína ou é transcrito para uma transcrição de interesse; e (iii) é uma solução de polietilenimina (PEI), (b) colocar em contato as células com a mistura de plasmídeo/PEI da etapa (a) para produzir uma cultura de células de plasmídeo/PEI; (c) adicionar um agente de aperfeiçoamento na cultura de células da mistura de plasmídeo/PEI para produzir uma segunda mistura; e (d) incubar a referida segunda mistura da etapa (c), produzindo assim células transfectadas que produzem vetor rAAV recombinante.

[06] Em várias modalidades adicionais das composições e métodos da invenção, uma ou mais etapas adicionais e opcionais estão incluídas.

[07] Em um aspecto particular, uma etapa adicional compreende (e) colher as referidas células transfectadas produzidas na etapa (d) e/ou meio de cultura a partir das células transfectadas produzidas na etapa (d) para produzir uma colheita de células e/ou meio de cultura.

[08] Em um aspecto particular, uma etapa adicional opcional compreende (e) cultivar, expandir, isolar ou selecionar células que foram transfectadas com o ácido nucleico ou plasmídeos.

[09] Em um aspecto particular, uma etapa adicional opcional compreende (e) isolar e/ou purificar o vetor AAV recombinante a partir das células transfectadas produzidas na etapa (d) e/ou no meio de cultura e/ou a partir das células transfectadas produzidas na etapa (d).

[010] Em um aspecto particular, uma etapa adicional opcional compreende (f) isolar e/ou purificar o vetor AAV recombinante a partir das células transfectadas e/ou da colheita do meio de cultura produzido na etapa (e).

[011] Em uma modalidade adicional, a(s) sequência(s) de ácido nucleico compreende(m) um vetor e/ou um plasmídeo.

[012] Em uma modalidade adicional, a(s) sequência(s) de ácido nucleico compreende(m) um vetor viral e/ou plasmídeo viral. Em um aspecto particular, o vetor viral ou o plasmídeo viral compreende um vetor ou plasmídeo lentiviral, ou um vetor ou plasmídeo viral adeno-associado (AAV).

[013] Em uma modalidade adicional, o vetor compreende um transgene que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse. Em um aspecto particular, o transgene codifica um fator de coagulação sanguínea variante de tipo selvagem ou funcional, apoE2, TPP1, arginininosuccinato sintase, ATPase 2 de transporte de cobre, alfa-glucosidase ácida, -Glucocerebrosidase, α-galactosidase ou inibidor C1 inibidor de serina- protease. Em um aspecto particular, o fator de coagulação sanguínea variante de tipo selvagem ou funcional é Fator VII, Fator VIII ou Fator IX.

[014] Em uma modalidade adicional, o agente de aperfeiçoamento é adicionado antes da etapa (a), no momento da etapa (a) ou imediatamente após a etapa (a).

[015] Em uma modalidade adicional, o agente de aperfeiçoamento é adicionado antes da etapa (a), no momento da etapa (a) ou até 16 horas após a etapa (a).

[016] Em uma modalidade adicional, o agente de aperfeiçoamento é adicionado antes da etapa (a), no momento da etapa (a) ou até menos de 3 horas após a etapa (a).

[017] Em uma modalidade adicional, o agente de aperfeiçoamento é adicionado antes da etapa (a), no momento da etapa (a) o agente de aperfeiçoamento é adicionado duas ou mais vezes antes ou depois das etapas (a) ou (b).

[018] Em uma modalidade adicional, o agente de aperfeiçoamento é adicionado primeiramente no momento ou imediatamente após a etapa (a) ou até 16 horas após a etapa (a) e adicionado novamente 16 a 72 horas após as etapas de (a) ou (b), ou adicionado novamente 16 a 48 horas após as etapas (a) ou (b), ou adicionado novamente 16 a 24 horas após as etapas de (a) ou (b).

[019] Em uma modalidade adicional, o agente de aperfeiçoamento é adicionado primeiramente no momento ou imediatamente após a etapa (a) ou até menos de 3 horas após a etapa (a) e adicionado novamente 12 a 72 horas após as etapas (a) ou (b), ou adicionado novamente 12 a 48 horas após as etapas (a) ou (b), ou adicionado novamente 12 a 24 horas após as etapas (a) ou (b).

[020] Em uma modalidade adicional, o agente de aperfeiçoamento é adicionado primeiramente 12 a 72 horas antes da etapa (a) e adicionado novamente no momento ou imediatamente após a etapa (a) ou até 16 horas após a etapa (a).

[021] Em uma modalidade adicional, o agente de aperfeiçoamento é adicionado primeiramente 12 a 72 horas antes da etapa (a) e adicionado novamente no momento ou imediatamente após a etapa (a) ou até menos de 3 horas após a etapa (a).

[022] Em uma modalidade adicional, plasmídeos (i) e (ii) estão em uma faixa de proporção molar de cerca de 1:0,01 a cerca de 1:100, ou estão em uma faixa de proporção molar de cerca de 100:1 para 1:0,01, e em que a mistura de componentes (i), (ii) e (iii) foi opcionalmente incubada por um período de tempo de cerca de 10 segundos a cerca de 4 horas antes da etapa (b).

[023] Em uma modalidade adicional, o ácido nucleico ou plasmídeos estão na proporção de peso PEI:ácido nucleico ou PEI:plasmídeo na faixa de cerca de 0,1:1 a cerca de 5:1, ou em uma proporção de peso

PEI:ácido nucleico ou PEI:plasmídeo na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 0,1:1.

[024] Em uma modalidade adicional, o ácido nucleico ou plasmídeos estão na proporção de peso PEI: ácido nucleico ou PEI:plasmídeo na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 5:1, ou em proporção de peso PEI:ácido nucleico ou PEI:plasmídeo na faixa de cerca de 5:1 para 1:1.

[025] Em uma modalidade adicional, o ácido nucleico ou plasmídeos estão na proporção de peso PEI: ácido nucleico ou PEI:plasmídeo na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 3:1.

[026] Em uma modalidade adicional, o ácido nucleico ou plasmídeos estão na proporção de peso PEI: ácido nucleico ou PEI:plasmídeo na faixa de cerca de 1:1, cerca de 1,5:1, cerca de 2:1, cerca de 2,5:1 ou cerca de 3:1.

[027] Em uma modalidade adicional, as composições ou métodos incluem ainda a adição de PEI livre às células.

[028] Em uma modalidade adicional, PEI livre é adicionada às células antes, no momento ou após as etapas (a) ou (b), ou antes ou no momento ou após a etapa (c).

[029] Em uma modalidade adicional, PEI livre é adicionada às células no momento ou após as etapas (a) ou (b), ou no momento ou após a etapa (c).

[030] Em uma modalidade adicional, PEI livre é adicionada de modo que a PEI: ácido nucleico ou PEI:plasmídeo está na faixa de cerca de 0,1:1 a cerca de 5:1, ou está na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 0,1:1.

[031] Em uma modalidade adicional, PEI livre é adicionada de modo que a PEI:ácido nucleico ou PEI:plasmídeo está na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 5:1, ou na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 1:1.

[032] Em uma modalidade adicional, a PEI na PEI:ácido nucleico e/ou PEI:plasmídeo e/ou PEI livre compreende polietilenimina linear.

[033] Em uma modalidade adicional, a PEI na PEI:ácido nucleico e/ou PEI:plasmídeo e/ou PEI livre compreende uma polietilenimina linear hidrolisada.

[034] Em uma modalidade adicional, a PEI na PEI:ácido nucleico e/ou PEI:plasmídeo e/ou PEI livre compreende uma polietilenimina linear hidrolisada com um peso molecular na faixa de cerca de 4.000 a cerca de 160.000 e/ou na faixa de cerca de 2.500 a cerca de 250.000 em peso molecular na forma de base livre.

[035] Em uma modalidade adicional, a PEI na PEI:ácido nucleico e/ou PEI:plasmídeo e/ou PEI Livre compreende uma polietilenimina linear hidrolisada com um peso molecular de cerca de 40.000 e/ou cerca de

25.000 em peso molecular na forma de base livre.

[036] Em uma modalidade adicional, a proporção molar de nitrogênio (N) no PEI total para fosfato (P) em ácido nucleico:PEI e/ou plasmídeo:PEI está na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 50:1 (N:P).

[037] Em uma modalidade adicional, a proporção molar de nitrogênio (N) no PEI total para fosfato (P) em ácido nucleico:PEI e/ou plasmídeo:PEI é de cerca de 5:1 para cerca de 10:1.

[038] Em uma modalidade adicional, a proporção molar de nitrogênio (N) no PEI total para fosfato (P) em ácido nucleico:PEI e/ou plasmídeo:PEI é qualquer um dos cerca de 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, ou 10: 1 (N:P).

[039] Em uma modalidade adicional, a quantidade de PEI livre é de cerca de 10% a cerca de 90% do PEI total.

[040] Em uma modalidade adicional, a quantidade de PEI livre é de cerca de 25% a cerca de 75% do PEI total.

[041] Em uma modalidade adicional, a quantidade de PEI livre é de cerca de 50% do PEI total.

[042] Em uma modalidade adicional, a quantidade de PEI livre é de cerca de 0, 1  g/mL para cerca de 10  g/mL.

[043] Em uma modalidade adicional, a quantidade de PEI livre é de cerca de 1, 0  g/mL para cerca de 5 g/mL.

[044] Em uma modalidade adicional, a solução PEI e/ou PEI livre compreende uma solução com um pH de cerca de 7,0 a cerca de 8,0.

[045] Em uma modalidade adicional, a sequência de ácido nucleico e PEI foram incubadas de cerca de 10 segundos para cerca de 4 horas um com o outro antes da etapa (a).

[046] Em uma modalidade adicional, sequência de ácido nucleico e PEI foram incubadas de cerca de 30 segundos a cerca de 4 horas um com o outro antes da etapa (a).

[047] Em uma modalidade adicional, a sequência de ácido nucleico e a PEI foram incubadas de cerca de 1 minuto a cerca de 30 minutos um com o outro antes da etapa (a).

[048] Em uma modalidade adicional, a mistura dos componentes (i), (ii) e (iii) é incubada em conjunto por cerca de 10 segundos a cerca de 4 horas antes da etapa (b).

[049] Em uma modalidade adicional, a mistura de componentes (i), (ii) e (iii) é incubada em conjunto por cerca de 30 segundos a cerca de 4 horas antes da etapa (b).

[050] Em uma modalidade adicional, a mistura de componentes (i), (ii) e (iii) é incubada em conjunto por cerca de 1 minuto a cerca de 4 horas antes da etapa (b).

[051] Em uma modalidade adicional, a incubação da etapa (d) é de pelo menos cerca de 4 horas.

[052] Em uma modalidade adicional, a incubação da etapa (d) é de cerca de 4 horas a cerca de 140 horas.

[053] Em uma modalidade adicional, a incubação da etapa (d) é de cerca de 4 horas a cerca de 96 horas.

[054] Em uma modalidade adicional, as células compreendem células de mamíferos. Em aspectos particulares, as células são células de rim embrionário humano (HEK) ou de ovário de hamster chinês (CHO). Em aspectos particulares, as células compreendem 293 células de rim embrionário humano (HEK). Em aspectos particulares, as células são células HEK 293E, HEK 293F ou HEK 293T.

[055] Em uma modalidade adicional, as células são transfectadas de maneira estável ou transitória.

[056] Em uma modalidade adicional, as células estão em cultura de suspensão.

[057] Em uma modalidade adicional, as células são aderentes.

[058] Em uma modalidade adicional, as células são cultivadas ou mantidas em um meio de cultura isento de soro.

[059] Em uma modalidade adicional, as células têm uma densidade na faixa de cerca de 1×105 células/mL a cerca de 1×108 células/mL quando colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou com a referida mistura plasmídeo/PEI e/ou quando colocadas em contato com a referida PEI livre.

[060] Em uma modalidade adicional, as células têm uma densidade na faixa de cerca de 5×105 células/mL a cerca de 1×107 células/mL quando colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou com a referida mistura plasmídeo/PEI e/ou quando colocadas em contato com a referida PEI livre.

[061] Em uma modalidade adicional, as células têm uma densidade na faixa de cerca de 1×106 células/mL a cerca de 5×106 células/mL quando colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou com a referida mistura plasmídeo/PEI e/ou quando colocadas em contato com a referida PEI livre.

[062] Em uma modalidade adicional, a viabilidade das células quando colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou mistura plasmídeo/PEI ou com a referida PEI livre é de cerca de 60% ou superior a 60%, ou em que as referidas células estão em crescimento de fase logarítmica quando colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou mistura plasmídeo/PEI.

[063] Em uma modalidade adicional, a viabilidade das células quando colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou mistura plasmídeo/PEI ou com a referida PEI livre é de cerca de 90% ou superior a 90%, ou em que as referidas células estão em crescimento de fase logarítmica quando colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou mistura plasmídeo/PEI ou com a referida PEI livre.

[064] Em uma modalidade adicional, a quantidade total da sequência de ácido nucleico ou plasmídeos está na faixa de cerca de 0, 1 µg a cerca de 15 µg por mL de células.

[065] Em uma modalidade adicional, a proporção molar do plasmídeo que compreende o transgene para um ou mais plasmídeos compreendendo ácidos nucleicos que codificam proteínas de encapsulamento AAV e/ou ácidos nucleicos que codificam proteínas auxiliares é de cerca de 1:5 a 1:1 ou é de cerca de 1:1 a cerca de 5:1.

[066] Em uma modalidade adicional, um ou mais plasmídeos compreendem um primeiro plasmídeo que compreende os ácidos nucleicos que codificam proteínas de encapsulamento AAV, e um segundo plasmídeo que compreende os ácidos nucleicos que codificam proteínas auxiliares.

[067] Em uma modalidade adicional, a proporção molar do plasmídeo que compreende o transgene para o primeiro plasmídeo que compreende os ácidos nucleicos que codificam proteínas de encapsulamento AAV para o segundo plasmídeo que compreende os ácidos nucleicos que codificam proteínas auxiliares está na faixa de cerca de 1-5:1:1 ou 1:1-5:1 ou 1:1:1-5.

[068] Em uma modalidade adicional, as proteínas de encapsulamento AAV codificadas incluem o AAV rep e/ou AAV cap.

[069] Em uma modalidade adicional, as proteínas de encapsulamento AAV codificadas compreendem proteínas AAV rep e/ou AAV cap de qualquer sorotipo de AAV.

[070] Em uma modalidade adicional, as proteínas auxiliares codificadas compreendem o adenovírus E2 e/ou E4, proteínas VARNA e/ou proteínas auxiliares não AAV.

[071] Em uma modalidade adicional, o vetor AAV recombinante compreende qualquer um dos sorotipos AAV 1-12, uma proteína capsídea AAV VP1, VP2 e/ou VP3 ou uma proteína capsídea AAV VP1, VP2 e/ou VP3 modificada ou variante ou proteína capsídea AAV VP1, VP2 e/ou VP3 do tipo selvagem.

[072] Em uma modalidade adicional, o vetor viral adeno- associado (AAV) compreende uma sequência de proteína capsídea VP1, VP2 e/ou VP3 ou sequência de repetição terminal invertida com 70% ou mais de identidade de sequência com uma sequência de proteína capsídea ou com uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) de qualquer sequência de proteína capsídea ou ITR selecionada dentre os sorotipos AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 e AAV10.

[073] Em uma modalidade adicional, o vetor viral adeno- associado (AAV) compreende uma sequência de proteína capsídea VP1, VP2 e/ou VP3 com 70% ou mais de identidade de sequência com uma sequência de proteína capsídea selecionada a partir de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2.

[074] Em uma modalidade adicional, o vetor AAV compreende um sorotipo AAV ou um pseudotipo AAV, em que o referido pseudotipo AAV compreende um sorotipo capsídeo AAV diferente do sorotipo ITR.

[075] Em uma modalidade adicional, o vetor AAV compreende uma proteína capsídea VP1, VP2 e/ou VP3 ou repetição terminal invertida de qualquer sorotipo selecionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4,

AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2.

[076] Em uma modalidade adicional, o vetor AAV compreende ainda um íntron, um elemento de controle de expressão, uma ou mais repetições terminais invertidas (ITRs) do vírus adeno-associado (AAV) e/ou uma sequência polinucleotídica de preenchimento.

[077] Em uma modalidade adicional, um íntron está dentro ou flanqueia o ácido nucleico que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse.

[078] Em uma modalidade adicional, um elemento de controle de expressão está ligado operativamente ao ácido nucleico que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse.

[079] Em uma modalidade adicional, a(s) ITR(s) AAV flanqueia(m) o terminal 5' ou 3' do ácido nucleico que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse.

[080] Em uma modalidade adicional, uma sequência polinucleotídica de enchimento flanqueia o terminal 5' ou 3' do ácido nucleico que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse.

[081] Em uma modalidade adicional, o elemento de controle de expressão compreende um elemento de controle regulável ou constitutivo, ou um elemento ou promotor de controle de expressão de tecido específico.

[082] Em uma modalidade adicional, o elemento de controle de expressão compreende um elemento que confere uma expressão no fígado.

[083] Em uma modalidade adicional, uma ITR compreende uma ou mais ITRs de qualquer um dos sorotipos AAV2 ou AAV6, ou uma combinação deles.

[084] Em uma modalidade adicional, as células são subcultivadas a uma densidade celular reduzida antes de serem colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou mistura plasmídeo/PEI.

[085] Em uma modalidade adicional, as células são subcultivadas a uma densidade celular na faixa de cerca de 0,1×106 células/mL a cerca de 5,0×106 células/mL antes de serem colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou mistura plasmídeo/PEI.

[086] Em uma modalidade adicional, as células são colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou mistura plasmídeo/PEI entre um período de 2 a 5 dias após a subcultura.

[087] Em uma modalidade adicional, as células são colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou mistura plasmídeo/PEI entre um período de 3 a 4 dias após a subcultura.

[088] Em uma modalidade adicional, a quantidade de sequência de ácido nucleico ou plasmídeos introduzidos nas referidas células transfectadas é pelo menos 50% maior com a etapa da adição de PEI livre à cultura de células em comparação com a falta da adição de PEI livre à cultura de células.

[089] Em uma modalidade adicional, a quantidade de sequência de ácido nucleico ou plasmídeos introduzidos nas referidas células transfectadas é pelo menos 50% maior com a etapa da adição do agente de aperfeiçoamento em comparação com a falta da adição do agente de aperfeiçoamento.

[090] Em uma modalidade adicional, a quantidade de vetor AAV recombinante produzido é pelo menos 50% ou superior com a etapa da adição de PEI livre à cultura de células plasmídeo/PEI em comparação com a falta da adição de PEI livre à cultura de células plasmídeo/PEI.

[091] Em uma modalidade adicional, a quantidade de vetor AAV recombinante produzida é 1 a 5, 5 a 8, 8 a 10 ou 10 a 20 vezes maior com a etapa da adição de PEI livre à cultura de células plasmídeo/PEI em comparação com a falta de adição de PEI livre à cultura de células plasmídeo/PEI.

[092] Em uma modalidade adicional, a quantidade de vetor AAV recombinante produzida é 1 a 5, 5 a 8, 8 a 10 ou 10 a 15 vezes maior com a etapa da adição do agente de aperfeiçoamento em comparação com a falta da adição do agente de aperfeiçoamento à cultura de células plasmídeo/PEI.

[093] Em uma modalidade adicional, as células estão em um volume de cultura de cerca de 10 a 500 mL, 500mL a 2 Litros, 2 a 20 Litros, 20 a 50 Litros, 50 a 100 Litros, 100 a 500 Litros, 500 a 1.000 Litros, ou 1.000 a

2.000 Litros.

[094] Em uma modalidade adicional, o transgene possui um tamanho de cerca de 4,0 Kb a cerca de 6,0 Kb.

[095] Em uma modalidade adicional, o transgene possui um tamanho de cerca de 4,5 Kb a cerca de 6,0 Kb.

[096] Em uma modalidade adicional, o transgene possui um tamanho de cerca de 4,5 Kb a cerca de 5,5Kb.

[097] Em uma modalidade adicional, o transgene possui um tamanho de cerca de 4,5 Kb a cerca de 5,0 Kb.

[098] Em uma modalidade adicional, o agente de aperfeiçoamento compreende o ácido valpróico, um sal ou um derivado do mesmo. Em um aspecto particular, um sal de ácido valpróico compreende um sal de sódio ou potássio. Em um aspecto particular, um derivado do ácido valpróico compreende um aminoácido ligado ou conjugado do mesmo.

[099] Em uma modalidade adicional, o agente de aperfeiçoamento compreende um ácido isobutírico, um sal ou um derivado do mesmo. Em um aspecto particular, um sal de ácido isobutírico compreende um sal de sódio ou potássio. Em um aspecto particular, um derivado do ácido isobutírico compreende um aminoácido ligado ou conjugado do mesmo.

[0100] Em uma modalidade adicional, o agente de aperfeiçoamento compreende um ácido isovalérico, um sal ou um derivado do mesmo. Em um aspecto particular, um sal de ácido isovalérico compreende um sal de sódio ou potássio. Em um aspecto particular, um derivado do ácido isovalérico compreende um aminoácido ligado ou conjugado do mesmo.

[0101] Em uma modalidade adicional, após a adição, o(s) agente(s) de aperfeiçoamento está(ão) em uma concentração de cerca de 0,1 mM a cerca de 25 mM.

[0102] Em uma modalidade adicional, após a adição, o(s) agente(s) de aperfeiçoamento está(ão) em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 10 mM.

[0103] Em uma modalidade adicional, após a adição, o(s) agente(s) de aperfeiçoamento está(ão) em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 5 mM.

[0104] Em outras modalidades adicionais, após a adição, o(s) agente(s) de aperfeiçoamento está(ão) em uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10mM, de cerca de 1mM a cerca de 9mM, de cerca de 1mM a cerca de 8 mM, de cerca de 1mM a cerca de 7 mM, de cerca de 1mM a cerca de 6mM, de cerca de 1mM a cerca de 5mM, de cerca de 1mM a cerca de 4mM, de cerca de 1mM a cerca de 3 mM, ou de cerca de 1mM a cerca de 2mM.

[0105] Em outras modalidades, qualquer uma das etapas (a) a (f) ou condições estabelecidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 94 são realizadas conforme estabelecido em qualquer um dos Exemplos 1 a 3.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0106] A Figura 1 mostra uma comparação da produtividade do vetor rAAV-FVIII. As células HEK 293F em frascos de rotação foram transfectadas com três plasmídeos: plasmídeo auxiliar pAd contendo genes auxiliares do adenovírus para a produção de rAAV; genes AAV rep/cap expressando genes AAV de Reps e Caps; pAAVhFVIII contendo cassete de expressão de fator VIII humano flanqueada por ITRs AAV. A quantidade total de DNA usada foi de 1,86 ug/mL com proporção molar de 1:1:1. A proporção de PEI/DNA de 1:1 (em peso) foi usada para preparar o complexo de PEI/DNA e transfectar as células. PEI livre adicional (a mesma quantidade usada para preparar o complexo de PEI/DNA) também foi adicionada à cultura de células separadamente na transfecção. Os aperfeiçoadores 1 e 2 do kit de transfecção ExpiFectamineTM 293 foram adicionados às células simultaneamente na transfecção ou 16 a 18h após a transfecção (conforme orientado pelo fabricante). Os aperfeiçoadores 1 e 2 foram usados em 1:200 e 1:20 do volume de cultura, respectivamente. A cultura de células foi colhida 72h após a transfecção e o vetor rAAV-FVIII foi determinado pela análise Q-PCR. O grau de vetor rAAV-FVIII foi 2 a 3 vezes maior quando os aperfeiçoadores foram adicionados no momento da transfecção em comparação com a adição dos aperfeiçoadores 16 horas após a transfecção ou sem a adição dos aperfeiçoadores.

[0107] A Figura 2 mostra a otimização da produção vetorial rAAV-FVIII usando diferentes quantidades de DNA e proporções de PEI/DNA. As células HEK 293F nos frascos de rotação foram transfectadas com uma quantidade total de DNA de 1,2, 1,86 ou 2,8 g/mL, respectivamente, usando três plasmídeos. A proporção de DNA do plasmídeo foi a mesma descrita anteriormente. No entanto, as proporções de PEI/DNA usadas neste estudo foram 1:1, 1,5:1, 2:1, 2,5:1 e 3:1. A PEI livre usada foi de 1,5  g/mL. Os aperfeiçoadores 1 e 2 do kit de transfecção ExpiFectamineTM 293 foram usados como descrito acima. A densidade celular era de 2 a 3 x106 células/mL na transfecção. As amostras foram colhidas 48h (#) ou 72h (*) após a transfecção e o grau de vetor rAAV foi determinado pelo ensaio Q-PCR. As taxas mais elevadas de rendimento do vetor rAAV foram observadas em condições de 1,2 g/mL de DNA, com uma proporção de PEI/DNA de 2 a 2,5:1 e com aperfeiçoadores.

[0108] A Figura 3 confirma a produtividade de vetor rAAV-FVIII em um biorreator. As células HEK 293F foram cultivadas em biorreatores em uma escala de 400 mL e transfectadas com três plasmídeos

(quantidade total de DNA do plasmídeo de 1,2 ou 2,8 g /mL). Proporção molar de DNA do plasmídeo de 1:1:1, proporção de PEI/DNA (peso) de 1,5:1, 2:1, 2,5:1 e 3:1 foram usadas. PEI livre de 1,5g/mL e aperfeiçoadores 1 e 2 também foram usados como descrito anteriormente. A densidade celular era de 2 a 3 x106 células/mL na transfecção. A maior produção vetorial (dados de Q- PCR) foi observada em condições de 1,2g/mL de DNA total com proporções de PEI/DNA de 2,5 a 3:1.

[0109] A Figura 4 mostra que a alta produtividade de vetor rAAV permanece em plena escala do biorreator DASGIP. As condições otimizadas de transfecção foram ainda avaliadas para a produção de rAAV a uma escala de 1,2 Litros (L), a plena escala do biorreator DASGIP. As células HEK 293F foram cultivadas em biorreatores DASGIP a uma escala de 1,2 L, com 2 ou 3 impulsores a 130rpm, 150rpm e 170rpm. As células foram transfectadas com três plasmídeos de 1,2g/mL de DNA do plasmídeo total, a proporção de PEI/DNA de 2,5:1 foi usada para preparar o complexo de PEI/DNA; a proporção molar do DNA e a quantidade de PEI livre e aperfeiçoadores de transfecção foram descritos anteriormente. Os dados de Q-PCR indicaram que a produtividade do vetor na escala de 1,2 L permaneceu comparável à observada em escalas menores, indicando que a transfecção otimizada pode ser ampliada. Embora não querendo estar vinculado por qualquer teoria, os dados de Q-PCR também sugeriram que a alta velocidade de agitação pode aumentar ainda mais a produtividade de vetor.

[0110] A Figura 5 mostra que o aperfeiçoador 1 aprimorou, isoladamente, a produtividade de rAAV para o mesmo nível que o produzido quando ambos os aperfeiçoadores 1 e 2 foram usados. Para otimizar ainda mais o método de produção de rAAV, estudos foram realizados usando apenas um aperfeiçoador: ou o aperfeiçoador 1 ou o aperfeiçoador 2, isoladamente, na transfecção, para comparar com a produtividade de vetor quando ambos os aperfeiçoadores foram usados. Os dados de Q-PCR indicaram que a produtividade de rAAV, quando o aperfeiçoador 1 foi usado, era comparável àquela quando ambos os aperfeiçoadores 1 e 2 foram usados. No entanto, o aperfeiçoador 2 resultou apenas em uma menor produção de rAAV, sugerindo que o aperfeiçoador 2 não tem um impacto positivo na produção de rAAV. Além disso, a redução da quantidade de aperfeiçoadores 1 e 2 na transfecção resultou em um menor grau de rAAV.

[0111] A Figura 6 mostra que o uso repetitivo dos aperfeiçoadores 1 e 2, em ambas as tranfecções (TF) e 24h ou 48h após a tranfecção, ou ainda o uso dos aperfeiçoadores 1 e 2 repetidamente por três vezes na transfecção e em 24 horas e 48 horas após a transfecção aumentou ligeiramente os graus de rAAV. Os aperfeiçoadores 1 e 2 foram usados em um volume de cultura de 1:200 e 1:20, respectivamente, primeiro, na transfecção. A quantidade adicional de aperfeiçoadores 1 e 2 foi adicionada às 24h, ou às 48 horas ou ambas às 24h e 48h após a transfecção para a cultura de células. As condições de transfecção usadas neste estudo estão descritas na Figura 5. Os dados de Q-PCR indicaram que a produtividade de vetor rAAV aumentou ligeiramente (menos de 1 vez) com o uso repetitivo de aperfeiçoadores.

[0112] A Figura 7 mostra dados que indicam a produção de rAAV aperfeiçoada com ácido valpróico. As células HEK 293F no frasco de rotação foram transfectadas com três plasmídeos, usando o método de transfecção de PEI, tal como descrito anteriormente. Neste estudo, os aperfeiçoadores do Kit de Transfecção ExpiFectamineTM 293 não foram usados. O ácido valpróico foi adicionado às células por transfecção em diferentes concentrações. As células foram transfectadas com 1,2 g/mL do total de DNAs de três plasmídeos, a proporção molar de DNA de três plasmídeos era de 1:1:1, a relação PEI/DNA (em peso) foi de 2:1 e foram usados 1,5 g/mL de PEI livre . O ácido valpróico de 0,25 mM a 2 mM foi avaliado. Os dados de Q- PCR indicaram que, quando o ácido valpróico de 2 mM foi usado na transfecção, foi observada uma produção de vetores rAAV 10 vezes superior em comparação com a quantidade de vetores produzida na ausência de ácido valpróico.

[0113] A Figura 8 mostra a produção de vetor rAAV- FVIII em diferentes concentrações de ácido valpróico, determinadas por qPCR. O ácido valpróico de 2 mM a 8 mM (2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM e 8 mM) foi usado na transfecção de células HEK 293F em uma cultura de biorreator de 1L. O ácido valpróico ≥4 mM resultou em uma produção de vetores AAV 1,2 a 1,8 vezes mais elevada do que a produção de vetor AAV comparada com 2 mM de ácido valpróico. 1,2 µg/mL de DNA, proporção molar de DNA de 1:1:1, proporção de peso PEI/DNA de 2,5 e 1,5 µg/mL de PEI livre foram usados neste estudo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0114] Aqui são revelados métodos e composições da transdução de células com uma molécula, tal como um ácido nucleico (por exemplo, plasmídeo), com alta eficiência. Tais células transduzidas de alta eficiência podem, quando transduzidas com um ácido nucleico (plasmídeo) que codifica uma proteína ou compreende uma sequência que é transcrita em uma transcrição de interesse, pode produzir uma proteína e/ou uma transcrição em alta eficiência. Além disso, tais células quando transduzidas com sequências, tais como plasmídeos que codificam as proteínas de encapsulamento viral e/ou proteínas auxiliares, e um transgene que codifica uma proteína ou é transcrito para uma transcrição de interesse, podem produzir vetores recombinantes que incluem o transgene que codifica uma proteína ou compreende uma sequência que é transcrita em uma transcrição de interesse, que por sua vez produz vetores virais recombinantes de alto rendimento.

[0115] A invenção fornece uma transfecção/transdução de células, e/ou uma plataforma de produção de vetor viral (por exemplo, AAV) que inclui características que a distinguem dos atuais processos de produção de vetor de padrão industrial viral (por exemplo, AAV). As composições e métodos da invenção são caracterizados pela mistura de

PEI com ácidos nucleicos sob certas condições. A mistura de PEI com ácidos nucleicos resulta em uma compactação eficiente de ácidos nucleicos induzida por PEI para formar complexos estáveis denominados poliplexos. As composições e métodos de transfecção de células com os ácidos nucleicos compreendem o contato das células com o ácido nucleico misturado com PEI sob certas condições.

[0116] As composições e métodos da invenção incluem ainda a adição de um agente de aperfeiçoamento às células. Em certas modalidades, um agente de aperfeiçoamento é adicionado antes, ou em cerca de, ou ao mesmo tempo, as células são colocadas em contato com a mistura de PEI/ácido nucleico. Em certas modalidades, um agente de aperfeiçoamento é adicionado depois de ter sido colocado em contato com as células com a mistura de ácido nucleico/PEI. Em certos aspectos, um agente de aperfeiçoamento é adicionado 5 a 30 ou 30 a 60 segundos após ter sido colocado em contato com as células com a mistura de ácido nucleico/PEI. Em certos aspectos, um agente de aperfeiçoamento é adicionado 1 a 2, 2 a 5, 5 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 60 minutos após ter sido colocado em contato com as células com a mistura ácido nucleico/PEI. Em certos aspectos, um agente de aperfeiçoamento é adicionado 1 a 2, 2 a 4, 4 a 6, 6 a 12, 12 a 24, 24 a 36, 36 a 48 ou 48 a 72 horas após ter sido colocado em contato com células com a mistura de ácido nucleico/PEI.

[0117] Um agente de aperfeiçoamento pode ser mantido em contato com as células durante um período de tempo. Em certas modalidades, um agente de aperfeiçoamento é colocado em contato com as células durante 5 minutos a 72 horas após as células terem sido colocadas em contato com a mistura ácido nucleico/PEI. Em certas modalidades, um agente de aperfeiçoamento é colocado em contato com as células por 1 a 2, 2 a 5, 5 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 60 minutos depois das células serem colocadas em contato com a mistura ácido nucleico/PEI. Em certos aspectos, um agente de aperfeiçoamento é colocado em contato com as células por 1 a 72 horas, 6 a

48 horas, 12 a 36 horas 24 a 48 horas ou 36 a 72 horas após as células serem colocadas em contato com a mistura de ácido nucleico/PEI. Em certos aspectos, um agente de aperfeiçoamento é colocado em contato com as células por 1 a 2, 2 a 4, 4 a 6, 6 a 12, 12 a 24, 24 a 36, 36 a 48 ou 48 a 72 horas após as células serem colocadas em contato com a mistura ácido nucleico/PEI.

[0118] Em certas modalidades, as células são colocadas em contato com a PEI livre, ou os métodos incluem colocar em contato células com PEI livre em uma sequência específica no que diz respeito à etapa de colocar em contato as células com a mistura de ácido nucleico/PEI. Em certas modalidades, as células são colocadas em contato com a PEI livre em cerca de, ou ao mesmo tempo em que as células são colocadas em contato com a mistura de ácido nucleico/PEI. Em uma modalidade particular, as células são colocadas em contato com a PEI livre após as células terem sido colocadas em contato com a mistura de ácido nucleico/PEI.

[0119] Em certas modalidades, as células são colocadas em contato com a PEI livre, ou os métodos incluem colocar em contato as células com a PEI livre em uma sequência particular no que diz respeito à etapa de adição de um agente de aperfeiçoamento às células colocadas em contato com a mistura de ácido nucleico/PEI. Em certas modalidades, as células são colocadas em contato com a PEI livre em cerca de, ou ao mesmo tempo que as células são colocadas em contato com um agente de aperfeiçoamento. Em modalidades particulares, as células são colocadas em contato com a PEI livre após as células terem sido colocadas em contato com um agente de aperfeiçoamento.

[0120] Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usados alternadamente para se referir a todas as formas de ácido nucleico, oligonucleotídeos, incluindo ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). Os ácidos nucleicos e polinucleotídeos incluem o DNA genômico, o cDNA e DNA antisense, o mRNA entrelaçado e não entrelaçado, rRNA, tRNA e RNA ou DNA inibitório (RNAi, por exemplo, gancho de (sh)RNA pequeno ou curto, microRNA (miRNA), (si)RNA interferente pequeno ou curto, e "trans-splicing" de RNA, ou RNA antisense). Os ácidos nucleicos e polinucleotídeos incluem sequências naturais, sintéticas e intencionalmente modificadas ou alteradas (por exemplo, ácido nucleico variante).

[0121] Um ácido nucleico ou plasmídeo também pode referir-se a uma sequência que codifica uma proteína. Tais proteínas podem ser de tipo selvagem ou uma variante, modificada ou quimérica. Uma "proteína variante" pode significar uma proteína modificada tal que a proteína modificada tem uma alteração de aminoácidos em comparação com a proteína de tipo selvagem.

[0122] As proteínas codificadas por um ácido nucleico ou plasmídeo incluem proteínas terapêuticas. Os exemplos não limitantes incluem um fator de coagulação sanguínea (por exemplo, Fator XIII, Fator IX, Fator X, Fator VIII, Fator VIIa, ou proteína C), apoE2, TPP1, argininosuccinato sintase, ATPase 2 de transporte de cobre, ácido alfa- glicosidase, -Glicocerebrosidase, α-galactosidase, inibidor de C1 inibidor de serina protease, CFTR (proteína reguladora transmembranar da fibrose cística), um anticorpo, proteína de 65 kDa específica do epitélio pigmentar da retina (RPE65), eritropoietina, receptor de LDL, lipoproteína lipase, ornitina transcarbamilase, β-globina, α-globina, espectrina, α-antitripsina, adenosina deaminase (ADA), um transportador metálico (ATP7A ou ATP7), sulfamidase, uma enzima envolvida na doença de depósito lisossômico (ARSA), hipoxantina guanina fosforibosil transferase, β-25 glicocerebrosidase, esfingomielinase, hexosaminidase lisossômica, cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada, um hormônio, um fator de crescimento (por exemplo, fatores de crescimento similares à insulina 1 e 2, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento do nervo, fator neurotrófico -3 e -

4, fator neurotrófico derivado do cérebro, fator de crescimento derivado da glia, fator de crescimento transformador α e β, etc.), uma citocina (por exemplo, α- interferon, β-interferon, interferon-γ, interleucina-2, interleucina-4, interleucina 12, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos, linfotoxina, etc.), um produto genético suicida (por exemplo, herpes-vírus simples timidina- quinase, citosina desaminase, toxina da difteria, citocromo P450, desoxicitidina- quinase, fator de necrose tumoral, etc.) uma proteína de resistência a medicamentos (por exemplo, que fornece resistência a um medicamento usado na terapia do câncer), uma proteína supressora de tumor, (por exemplo, p53, Rb, Wt-1, NF1, Von Hippel–Lindau (VHL), polipose coli adenomatosa (APC)), um peptídeo com propriedades imunomoduladoras, um peptídeo tolerogênico ou imunogênico ou proteína tregitopes, ou hCDR1, insulina, glucocinase, guanilato ciclase 2D (LCA-GUCY2D), proteína escolta de Rab 1 (Choroideremia), LCA 5 (LCA-Lebercilina), ornitina cetoácido aminotransferase (Atrofia Girata), Retinosquisina 1 (retinosquise ligada ao X), USH1C (Síndrome de Usher 1C), GTPase retinite pigmentar ligada ao X (XLRP), MERTK (formas AR de RP: retinite pigmentosa), DFNB1 (surdez da Connexin 26), ACHM 2, 3 e 4 (Acromatopsia), PKD-1 ou PKD-2 (Doença renal policística), TPP1, CLN2, deficiências genéticas causadoras de doenças de depósito lisossômico (por exemplo, sulfatases, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferase, catepsina A, GM2-AP, NPC1, VPC2, proteínas ativadoras de esfingolipídios, etc.), uma ou mais nucleases de dedo de zinco para edição de genoma ou sequências de doadores usadas como modelos de reparo para edição de genoma.

[0123] Um ácido nucleico ou plasmídeo também pode referir-se a uma sequência que produz uma transcrição quando transcrita. Tais transcrições podem ser RNA, tais como RNA inibitório (RNAi, por exemplo, (sH)RNA com um gancho pequeno ou curto, microRNA (miRNA), (si)RNA interferente pequeno ou curto, "trans-splicing" de RNA, ou RNA antisense.

[0124] Exemplos não limitantes incluem ácidos nucleicos inibitórios que inibem a expressãode: gene de huntingtina (HTT), um gene associado à atropia dentato-rubro-palido-luisiana (por exemplo, atrofina 1, ATN1); receptor de andrógeno no cromossomo X na atrofia muscular bulbo- espinal, ataxina humana -1, -2, -3 e -7, canal de cálcio dependente de tensão Cav2.1 P/Q é codificado pela (CACNA1A), proteína de ligação a TATA, fita oposta de Ataxina 8, também conhecida como ATXN8OS, Isoforma beta da subunidade reguladora B de serina/treonina-proteína fosfatase 2A de 55 kDa na ataxia espinocerebelar (tipo 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12 17), FMR1 (síndrome do X- frágil 1) na síndrome do X frágil, FMR1 (síndrome do X frágil 1) a síndrome do X frágil associada à síndrome de tremor/ataxia, FMR1 (síndrome do X frágil 2) ou membro de família 2 AF4/FMR2 na síndrome do X frágil; miotonina proteína quinase (MT-PK) na distrofia miotônica; frataxina na ataxia de Friedreich; um mutante do gene da superóxido dismutase 1 (SOD1) na esclerose lateral amiotrófica; um gene envolvido na patogênese da doença de Parkinson e/ou doença de Alzheimer; apolipoproteína B (APOB) e pró-proteína convertase subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), hipercolesterolemia; HIV Tat, gene de transcrição transativador do vírus da imunodeficiência humana, na infecção pelo HIV; HIV TAR, HIV TAR, gene do elemento de resposta do transativador do vírus da imunodeficiência humana, na infecção pelo HIV; receptor de quimiocina C-C (CCR5) na infecção pelo HIV; proteína nucleocapsídica do vírus de sarcoma de Rous (RSV) na infecção por RSV, microRNA específico do fígado (miR-122) na infecção pelo vírus da hepatite C; p53, lesão renal aguda ou transplante renal tardio da função do enxerto ou lesão renal aguda por insuficiência renal; proteína quinase N3 (PKN3) em malignidades sólidas avançadas, recorrentes ou metastáticas; LMP2, LMP2, também conhecido como subunidade proteassoma tipo beta 9 (PSMB 9), melanoma metastático; LMP7, também conhecido como subunidade proteassoma beta tipo 8 (PSMB 8), melanoma metastático; MECL1 também conhecido como subunidade proteassoma beta tipo 10 (PSMB 10), melanoma metastático; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) em tumores sólidos; proteína do fuso de cinesina em tumores sólidos, CLL/linfoma de células B supressoras de apoptose (BCL-2) na leucemia mielóide crônica; ribonucleotídeo redutase M2 (RRM2) em tumores sólidos; furina em tumores sólidos; quinase tipo Polo 1 ("polo-like kinase 1") (PLK1) em tumores hepáticos, diacilglicerol aciltransferase 1 (DGAT1) na infecção pela hepatite C, beta-catenina na polipose adenomatosa familiar; receptor adrenérgico beta2, glaucoma; RTP801/Redd1, também conhecida como proteína transcrita 4 induzível por dano DAN, em edema macular diabético (DME) ou degeneração macular relacionada à idade; receptor I do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR1) na degeneração macular relacionada à idade ou na neovascularização coróide, caspase 2 na neuropatia óptica isquêmica não arterítica; proteína mutante N17K da queratina 6A em paquioníquia congênita; sequências de genoma/gene do vírus influenza A na infecção por influenza; sequências de genoma/gene de coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS) na infecção por SARS; sequências de genoma/gene do vírus sincicial respiratório na infecção pelo vírus sincicial respiratório; sequência de genoma/gene do filovírus do Ebola na infecção pelo Ebola; sequências de genoma/gene do vírus da hepatite B e C na infecção pelas hepatites B e C; sequências de genoma/gene do vírus herpes simplex (HSV) na infecção pelo HSV, sequência de genomas/gene do vírus de coxsackie B3 na infecção por vírus de coxsackie; silenciamento de um alelo patogênico de um gene (silenciamento específico de alelo) como a torsina A (TOR1A) na distonia primária, classe pan I e alelo HLA específico em transplante; gene da rodopsina mutante (RHO) na retinite pigmentosa autossômica dominante (adRP); ou o ácido nucleico inibitório se liga a uma transcrição de qualquer um dos genes ou sequências anteriores.

[0125] Ácidos nucleicos (plasmídeos) podem ser simples, duplos ou triplos, lineares ou circulares, e podem ter qualquer comprimento. Ao discutir ácidos nucleicos (plasmídeos), uma sequência ou estrutura de um polinucleotídeo particular pode ser descrita aqui de acordo com a convenção de fornecer a sequência na direção 5' a 3'.

[0126] Um "plasmídeo" é uma forma de ácido nucleico ou polinucleotídeo que tipicamente tem elementos adicionais para expressão (por exemplo, transcrição, replicação, etc.) ou propagação (replicação) do plasmídeo. Um plasmídeo como usado aqui também pode ser usado para referenciar sequências de ácidos nucleicos e polinucleotídeos. Assim, em todos os aspectos, as composições e métodos da invenção são aplicáveis aos plasmídeos, ácidos nucleicos e polinucleotídeos, por exemplo, para a introdução de plasmídeos, ácido nucleico ou polinucleotídeos nas células, para a transdução (transfecção) das células com o plasmídeo, ácido nucleico ou polinucleotídeo, para a produção de células transduzidas (transfectadas) que possuem um plasmídeo, ácido nucleico ou polinucleotídeo, para produzir células que produzem vetores virais (por exemplo, AAV), para produzir vetores virais (por exemplo, AAV), para produzir meio de cultura de células que possua vetores virais (por exemplo, AAV).

[0127] As composições e métodos da invenção incluem a polietilenoimina (PEI). PEI é um polímero catiônico e é capaz de formar um complexo estável com ácido nucleico, referido como um poliplex. Apesar de não desejar estar vinculado por qualquer teoria, acredita-se que o poliplex seja introduzido nas células através de endocitose.

[0128] PEI pode ser uma PEI linear ou ramificada. PEI pode estar na forma de sal ou de base livre. Em uma modalidade particular, PEI é uma PEI linear, como uma PEI linear opcionalmente hidrolisada. A PEI hidrolisada pode ser total ou parcialmente hidrolisada. A PEI linear hidrolisada tem uma maior proporção de nitrogênio livre (protonável) em comparação com a PEI linear não hidrolisada, especificamente tendo, pelo menos, 1% a 5% mais nitrogênio livre (protonável) em comparação com a PEI linear não hidrolisada, mais especificamente tendo de 5 a 10% a mais de nitrogênio livre (protonável) em comparação com a PEI linear não hidrolisada, ou, mais especificamente, tendo de 10 a 15% a mais de nitrogênio livre (protonável) em comparação com a PEI linear não hidrolisada.

[0129] Em modalidades particulares, a PEI pode ter um peso molecular na faixa de cerca de 4.000 a cerca de 160.000 e/ou na faixa de cerca de 2.500 a cerca de 250.000 em peso molecular na forma de base livre. Em outras modalidades particulares, a PEI pode ter um peso molecular de cerca de 40.000 e/ou cerca de 25.000 em peso molecular na forma de base livre. Especificamente, a PEI linear com um peso molecular de cerca de 40.000 e/ou cerca de 25.000 em peso molecular na forma de base livre. Além disso, a PEI linear quimicamente modificada ou a PEI ramificada também podem ser usadas. A PEI está disponível comercialmente (por exemplo, Polisciences, Inc., Warrington, PA, EUA).

[0130] Nas composições e métodos da invenção, um ácido nucleico, como um plasmídeo, é misturado com a PEI para formar uma mistura ou solução de PEI. Tal mistura ou solução pode ser referida como "uma mistura de plasmídeo/PEI " ou "uma mistura de ácido nucleico/PEI". Os termos "mistura de plasmídeo/PEI" e "mistura de ácido nucleico/PEI" significam, portanto, que a PEI foi misturada com o ácido nucleico/plasmídeo. A PEI, tal como definida aqui, pode, portanto, ser misturada com o ácido nucleico (plasmídeo), antes ou substancialmente em simultâneo com o contato das células para transdução/transfecção.

[0131] Como usado aqui, o termo "PEI livre" significa a PEI que é substancial ou inteiramente livre de ácido nucleico (plasmídeo). A PEI, como estabelecida aqui, pode, portanto, também ser na forma de PEI livre. A "mistura plasmídeo/PEI" ou "mistura de ácido nucleico/PEI" é, portanto, distinta da PEI livre. Se a PEI livre é substancialmente livre, a quantidade de sequências de ácido nucleico (plasmídeo) presente não será superior a 5%, como determinado pelo peso molecular ou pela massa. Claro, a quantidade pode ser menor que 5%, por exemplo, cerca de 4,5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3,5% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2,5% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1,5% ou menos, cerca de 1% ou menos, ou cerca de 0,5% ou menos.

[0132] Tal como usado aqui, o termo "PEI total" significa a soma de PEI presente na mistura PEI/plasmídeo e PEI livre. A PEI Total, portanto, inclui PEI que é misturado com o plasmídeo e PEI que é substancial ou inteiramente livre de sequências de ácido nucleico, como um plasmídeo.

[0133] A revelação das quantidades, proporções, composições, soluções, solventes e tampões, pH, sais e tempo e duração de contato e incubação celular de PEI aplica-se a qualquer um dentre, qualquer dois dentre ou todos os três dentre: 1) PEI em uma mistura plasmídeo/PEI ou em uma mistura de ácido nucleico/PEI; 2) PEI como PEI livre (isto é, PEI que é substancialmente ou inteiramente livre de ácido nucleico ou sequências de polinucleotídeos, como um plasmídeo; e 3) PEI total (PEI em uma mistura de plasmídeo/PEI ou em uma mistura de ácido nucleico/PEI livre + mistura PEI).

[0134] Em modalidades particulares, PEI é uma solução, como uma solução aquosa (por exemplo, água). Em modalidades particulares adicionais, a PEI é uma PEI acidificada ou neutralizada. Por "PEI acidificada" entende-se uma solução de PEI preparada por dissolução de PEI em um solvente ácido. A acidez da solução acidificada de PEI é tipicamente um pH de cerca de 0 a cerca de 3,0, mais tipicamente um pH de cerca de 0,5 a cerca de 2,0. O termo "PEI neutralizada" significa uma solução PEI que é preparada dissolvendo a PEI em um tampão ou solvente neutro. As soluções de PEI neutralizadas podem ter um pH na faixa de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, tipicamente um pH na faixa de cerca de 6,5 a cerca de 7,5, mais tipicamente um pH na faixa de cerca de 6,8 a cerca de 7,2, e mais tipicamente um pH na faixa de cerca de 7,0 a cerca de 7,2, por exemplo, cerca de 7,1.

[0135] Qualquer solvente ou tampão pode ser usado para estabelecer ou manter o pH de uma solução de PEI dentro de um intervalo acima mencionado, sem destruir a atividade de transfecção de PEI. Exemplos de solventes ácidos incluem ácidos minerais tais como ácido clorídrico (HCI), e ácidos orgânicos com pH na faixa ácida, tais como solução de ácido glicina-clorídrico. Exemplos não limitantes de tampões/solventes neutros incluem TRIS (base trizma) e HEPES. Os tampões podem variar de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM, mais tipicamente de cerca de 2 mM a cerca de 50 mM, e mais tipicamente de cerca de 5 mM a cerca de 20 mM.

[0136] As soluções PEI podem, opcionalmente, incluir sais. Exemplos não limitantes de sais incluem sais de sódio (Na), potássio (K) e magnésio (Mg). Em aspectos particulares, as concentrações de sal de uma solução de PEI variam de cerca de 50 mM a cerca de 500 mM, mais tipicamente de cerca de 100 mM a cerca de 250 mM, e mais tipicamente de cerca de 125 mM a cerca de 175 mM.

[0137] Uma mistura de ácidos nucleicos (plasmídeo) e PEI é realizada misturando-se ácidos nucleicos (plasmídeo) e PEI em uma solução. A mistura pode ocorrer em qualquer solução compatível com a transdução de células baseada em PEI. Exemplos não limitantes são como aqui estabelecidos. Após a mistura, a mistura de ácidos nucleicos (plasmídeo)/PEI pode ser incubada durante um período de tempo de cerca de 1 minuto a cerca de 8 horas; de cerca de 10 segundos a cerca de 4 horas; de cerca de 1 minuto a cerca de 60 minutos; de cerca de 1 minuto a cerca de 30 minutos; de cerca de 10 minutos a cerca de 45 minutos; de cerca de 10 minutos a cerca de 30 minutos; e/ou de cerca de 20 minutos a cerca de 30 minutos. Os tempos típicos incluem cerca de 1 minuto, cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 20 minutos e cerca de 30 minutos.

[0138] PEI e ácidos nucleicos (plasmídeo) são misturados a uma proporção que não é limitada. As proporções típicas incluem uma mistura de plasmídeos em uma proporção molar (ou de peso) de cerca de 1:0,01 a cerca de 1:100, ou em uma proporção molar (ou de peso) de cerca de 100:1 a cerca de 1:0,01, para produzir a mistura plasmídeo/PEI. As proporções molares (ou de peso) mais típicos incluem uma mistura de plasmídeos em uma faixa de proporção molar (ou de peso) de cerca de 1:1 a cerca de 1:5, ou em uma faixa de proporção molar (ou de peso) de cerca de 1:2 a cerca de 1:4, para produzir a mistura plasmídeo/PEI. Em modalidades adicionais, a proporção de peso PEI:plasmídeo está na faixa de cerca de 0,1: 1 a cerca de 5:1, ou na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 0,1:1. Em outras modalidades, a cultura de células PEI/plasmídeo/PEI livre tem uma proporção de peso PEI:plasmídeo na faixa de cerca de 0,1: 1 a cerca de 5:1, ou tem uma proporção de peso PEI:plasmídeo na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 0,1:1. Em modalidades particulares, a mistura plasmídeo/PEI tem uma proporção de peso PEI: plasmídeo na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 5:1, ou na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 1:1. Em outras modalidades particulares, a cultura de células PEI/plasmídeo/PEI livre tem uma proporção de peso PEI:plasmídeo na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 5:1, ou na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 1:1.

[0139] A quantidade de ácidos nucleicos (plasmídeo) usados para produzir composições e métodos de transdução celular varia. Em modalidades particulares, a proporção molar de nitrogênio (N) em PEI total para fosfato (P) no plasmídeo está na faixa de cerca de 1:1 a 50:1 (N:P) na cultura de células de PEI/plasmídeo/PEI livre, ou a proporção molar de nitrogênio (N) em PEI total para fosfato (P) no plasmídeo é de cerca de 1:1 a 10:1 (N:P) na cultura de células de PEI/plasmídeo/PEI livre, ou a proporção molar de nitrogênio (N) em PEI total para fosfato (P) no plasmídeo é de cerca de 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, ou 10:1 (N:P) na cultura celular de PEI/plasmídeo/PEI livre, Em modalidades particulares adicionais, a quantidade total de plasmídeo que compreende o ácido nucleico que codifica uma proteína ou é transcrita em uma transcrição de interesse e o um ou mais plasmídeos que compreendem os ácidos nucleicos que codificam as proteínas de encapsulamento AAV e/ou ácidos nucleicos que codificam as proteínas auxiliares está na faixa de cerca de 0,1 µg a cerca 15 µg por mL de células.

[0140] A aplicação de uma mistura de ácidos nucleicos (plasmídeo)/PEI às células é realizada ao adicionar a mistura de ácidos nucleicos (plasmídeo)/PEI às células, de modo a que a mistura de ácidos nucleicos (plasmídeo)/PEI seja colocada em contato com as células. As células às quais se adiciona (coloca-se em contato) a mistura de ácidos nucleicos (plasmídeos)/soluções PEI podem ser células aderentes ou células em suspensão. Tais células podem incluir co-culturas com outras células.

[0141] As células são colocadas em contato durante um período de tempo com uma mistura de ácidos nucleicos (plasmídeos)/PEI que não é limitada, para obter a transdução celular. O contato das células com PEI livre ocorre tipicamente em simultâneo com (ou imediatamente após), ou após as células terem sido colocadas em contato com a mistura de ácidos nucleicos (plasmídeo)/PEI. Deve haver um intervalo de tempo entre o contato das células com a mistura de ácidos nucleicos (plasmídeo)/PEI o e contato das células com a PEI livre, o intervalo de tempo pode ser de cerca de 1 segundo para cerca de 140 horas, tipicamente em cerca de 1 segundo para cerca de 96 horas, mais tipicamente de cerca de 1 segundo para cerca de 48 ou 72 horas, mais tipicamente de cerca de 1 segundo para cerca de 24 horas, ou menos, por exemplo, cerca de 16, cerca de 12, cerca de 8, ou cerca de 6 horas, ou menos.

[0142] Para um contato a longo prazo, as células podem ser afetadas pela citotoxicidade da PEI, resultando em um aumento da quantidade de células mortas (não viáveis), reduzindo assim a eficiência da transfecção. O tempo de incubação depois das células serem colocadas em contato com a PEI total pode variar de segundos a dias. Especificamente, as células podem ser colocadas em contato com ácidos nucleicos (plasmídeo)/PEI, ou PEI totaI, por exemplo, por um período de tempo de aproximadamente 1 minuto para cerca de 48 horas; a partir de cerca de 1 minuto para cerca de 24 horas; a partir de cerca de 1 minuto para cerca de 16 horas; a partir de cerca de 1 minuto para cerca de 8 horas; a partir de cerca de 1 minuto até cerca de 4 horas; a partir de cerca de 1 minuto para cerca de 120 minutos; a partir de cerca de 5 minutos para cerca de 60 minutos; a partir de cerca de 10 minutos para cerca de 45 minutos; ou a partir de cerca de 10 minutos para cerca de 30 minutos.

[0143] Para reduzir a citotoxicidade da PEI, o meio de cultura pode ser substituído por meio de cultura novo após ter sido colocado em contato com as células com ácidos nucleicos (plasmídeo)/PEI. A substituição do meio de cultura após a transfecção pode minimizar a citotoxicidade PEI sem perda significativa de eficiência de transfecção de células.

[0144] As células para transfecção, quer antes, quer no momento do contato com a mistura plasmídeo/PEI, e/ou do contato com agente de aperfeiçoamento e/ou do contato com PEI livre, têm uma densidade na faixa de cerca de 1×105 células/mL a cerca de 1×108 células/mL. Tipicamente, as células têm uma densidade na faixa de cerca de 2×105células/mL a cerca de 5×106 células/mL. Mais tipicamente, as células têm uma densidade na faixa de cerca de 3×105 células/mL para cerca de 4×106 células/mL, por exemplo, cerca de 4×105 células/mL para cerca de 3×106 células/mL, ou cerca de 5×105 células/mL para cerca de 2×106 células/mL. Em outras modalidades, as células têm uma densidade na faixa de cerca de 5×105 células/mL para cerca de 5×106 células/mL, por exemplo, cerca de 6×105 células/mL para cerca de 4×106 células/mL, ou cerca de 7×105 células/mL para cerca de 3×106 células/mL. Em outras modalidades, as células têm uma densidade na faixa de cerca de 1×106 células/mL para cerca de 5×106 células/mL, por exemplo, cerca de 1×106 células/mL para cerca de 4×106 células/mL, ou cerca de 2×106 células/mL para cerca de 3×106 células/mL.

[0145] As células para transfecção, antes ou no momento do contato com a mistura plasmídeo/PEI, e/ou do contato com agente de aperfeiçoamento, e/ou contato com PEI livre, podem, opcionalmente, estar na fase logarítmica (exponencial) de crescimento. As células para transfecção, antes ou no momento do contato com a mistura plasmídeo/PEI, e/ou contato com agente de aperfeiçoamento, e/ou contato com PEI livre, podem, opcionalmente, ter uma viabilidade de 60% ou superior a 60%, por exemplo,

70%, 80% ou 90% ou superior a 90%.

[0146] As células que podem ser contatadas, tal como aqui estabelecido, incluem células de mamíferos, tais como células humanas. Tais células podem ser células primárias ou linhas de células capazes de crescer ou manter a viabilidade in vitro, ou foram adaptadas para cultura de tecidos in vitro. Exemplos de linhas de células incluem células HEK (rim embrionário humano), que incluem células HEK293, tais como células HEK293F(293F) e HEK293T (293T).

[0147] Mais genericamente, tais células quando contatadas como aqui estabelecido, podem ser referidas como "células hospedeiras". Uma "célula hospedeira" denota, por exemplo, microorganismos, células de leveduras, células de inseto, e células de mamíferos que podem ser, ou ter sido, usadas como receptores de proteínas de encapsulamento que codificam o ácido nucleico, tais como as proteínas de encapsulamento AAV, uma proteína auxiliar que codifica um ácido nucleico (plasmídeo), um ácido nucleico (plasmídeo), que codifica uma proteína ou é transcrito para uma transcrição de interesse, ou outro ácido nucleico de transferência (plasmídeo). O termo inclui a descendência da célula original, que foi transduzida ou transfectada. Assim, uma "célula hospedeira" como usada aqui geralmente refere-se a uma célula que foi transduzida ou transfectada com uma sequência de ácido nucleico exógeno. Entende-se que a descendência de uma única célula parental pode não ser, necessariamente, completamente idêntica em morfologia ou no complemento de ácido nucleico genômico ou total como o progenitor original, devido à mutação natural, acidental ou deliberada.

[0148] Numerosos meios de crescimento celular apropriados para sustentar a viabilidade das células ou proporcionar o crescimento e/ou a proliferação das células estão disponíveis comercialmente ou podem ser facilmente produzidos. Exemplos de tal meio incluem meios de crescimento eucarióticos livres de soro, tais como o meio para manter a viabilidade ou proporcionar o crescimento de células de mamíferos (por exemplo, humanas). Exemplos não limitantes incluem o meio Ham's F12 ou F12K (Sigma-Aldrich), o meio F17 FreeStyleTM(FS) (Thermo-Fisher Scientific), MEM, DMEM, RPMI-1640 (Thermo-Fisher Scientific) e suas misturas. Tal meio pode ser complementado com vitaminas e/ou minerais vestigiais e/ou sais e/ou aminoácidos, tais como aminoácidos essenciais para células de mamíferos (por exemplo, humanas).

[0149] "Agentes de aperfeiçoamento", de outra forma referidos aqui como "aperfeiçoadores de transfecção" ou no mesmo contexto simplesmente como "aperfeiçoadores" são compostos que aumentam a transdução/transfecção celular com um ácido nucleico (plasmídeo). Em modalidades particulares, um agente de aperfeiçoamento compreende ou consiste em um ácido valpróico, um sal ou um derivado destes. Em certas modalidades, um sal de ácido valpróico compreende ou consiste em um sal de sódio ou potássio. Em certas modalidades, um derivado do ácido valpróico compreende ou consiste em um aminoácido a ele ligado ou conjugado. Outros exemplos de agentes de aperfeiçoamento incluem, por exemplo e sem limitação, os descritos nas Publicações de Patentes dos EUA Nos. 2013/0316400 e 2017/0016043, incorporadas aqui por referência em sua totalidade, bem como outros aperfeiçoadores de transfecção conhecidos na técnica.

[0150] Os agentes de aperfeiçoamento, incluindo o ácido valpróico, podem ser usados em uma concentração, por exemplo, e sem limitação, em uma faixa de cerca de 0,1 mM a cerca de 25 mM, ou quaisquer subfaixas ou valores de concentração englobados dessa forma. Em certas modalidades, uma concentração de um agente de aperfeiçoamento é de cerca de 0,5 mM a cerca de 10 mM. Em certas modalidades, uma concentração de um agente de aperfeiçoamento é de cerca de 0,5 mM a 5 mM. Em certas modalidades, uma concentração de um agente de aperfeiçoamento é de cerca de 1 mM até cerca de 4mM, de cerca de 1 mM até cerca de 3 mM, ou de cerca de 1 mM a 2 mM.

[0151] Os termos "transduzir" e "transfectar" referem-se à introdução de uma molécula como um ácido nucleico (plasmídeo) em uma célula hospedeira. Uma célula foi "transduzida" ou "transfectada" quando o ácido nucleico exógeno foi introduzido dentro da membrana celular. Assim, uma "célula transduzida" é uma célula na qual um "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" foi introduzido, ou uma progênie na qual um ácido nucleico exógeno foi introduzido. Em modalidades particulares, a célula "transduzida" (por exemplo, em um mamífero, como uma célula ou um célula de órgão ou tecido) é uma alteração genética em uma célula após a incorporação de uma molécula exógena, por exemplo, um ácido nucleico (por exemplo, um transgene). Célula(s) "transduzida(s)" ou "transfectada(s)" pode(m) ser propagada(s) e o ácido nucleico introduzido transcrito e/ou a proteína expressa.

[0152] Em uma célula "transduzida" ou "transfectada", o ácido nucleico (plasmídeo) pode ou não ser integrado ao ácido nucleico genômico da célula receptora. Se um ácido nucleico introduzido for integrado ao ácido nucleico (DNA genômico) da célula ou organismo receptor, ele pode ser mantido de forma estável nessa célula ou organismo e posteriormente transferido para ou herdado por organismos ou células descendentes do organismo ou célula receptora. Finalmente, o ácido nucleico introduzido pode existir na célula receptora ou organismo hospedeiro extracromossomicamente, ou apenas transitoriamente. São conhecidas várias técnicas (vide, por exemplo, Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197. Tais técnicas podem ser usadas para introduzir uma ou mais moléculas exógenas de DNA em células hospedeiras adequadas.

[0153] O termo "vetor" refere-se a pequenas moléculas de ácido nucleico transportadoras, um plasmídeo, vírus (por exemplo, vetor AAV), ou outro veículo que pode ser manipulado pela inserção ou incorporação de um ácido nucleico. Tais vetores podem ser usados para manipulação genética (i.e., "vetores de clonagem"), para introduzir/transferir polinucleotídeos em células, e para transcrever ou traduzir o polinucleotídeo inserido em células. Um "vetor de expressão" é um vetor especializado que contém um gene ou sequência de ácido nucleico com as regiões reguladoras necessárias para a expressão em uma célula hospedeira. Uma sequência de ácido nucleico de vetor, geralmente, contém pelo menos uma origem de replicação para a propagação de uma célula e, opcionalmente, elementos adicionais, tais como uma sequência de polinucleotídeos heterólogos, elementos de controle de expressão, (por exemplo, um promotor, aperfeiçoador), íntron, ITR(s), marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos), sinal de poliadenilação. Para fins da invenção, um "vetor" como definido aqui está dentro do escopo de um "plasmídeo" como este termo é usado aqui.

[0154] Um vetor viral é derivado ou baseado em um ou mais elementos de ácido nucleico que compreendem um genoma viral. Vetores virais particulares incluem os vetores de lentivírus, lentivírus pseudo- tipado e parvovírus, tais como os vetores virais adeno-associados (AAV).

[0155] O termo "recombinante", como um modificador de vetor, tal como o viral recombinante, por exemplo, vetores do lentivirus ou parvovírus (por exemplo, AAV), bem como um modificador de sequências, como polinucleotídeos e polipeptídeos recombinantes, significa que as composições foram manipuladas (isto é, engendradas) de uma forma que geralmente não ocorre na natureza. Um exemplo particular de um vetor recombinante, como um vetor AAV, seria em que um polinucleotídeo que não está normalmente presente no genoma viral de tipo selvagem (por exemplo, AAV) é inserido dentro do genoma viral, isto é, é heterólogo. Embora o termo "recombinante" nem sempre seja usado aqui em referência a vetores, tais como vetores AAV e virais, bem como sequências como polinucleotídeos, formas recombinantes incluindo polinucleotídeos são expressamente incluídos,

apesar de qualquer omissão.

[0156] Um "vetor" viral recombinante ou "vetor AAV " é derivado do genoma do tipo selvagem de um vírus, como o AAV por meio de métodos moleculares para remover o genoma do tipo selvagem do vírus (por exemplo, AAV), e substituir por um ácido nucleico não-nativo, como um ácido nucleico transcrito em uma transcrição ou que codifica uma proteína. Tipicamente, para o AAV, uma ou ambas as sequências de repetição terminal invertida (ITR) do genoma AAV são retidas no vetor AAV. Um vetor viral "recombinante" (por exemplo, AAV) é distinguido de um genoma viral (por exemplo, AAV), uma vez que toda ou uma parte do genoma viral foi substituída por uma sequência não-nativa isto é, heteróloga) em relação ao ácido nucleico genômico viral (por exemplo, AAV). A incorporação de uma sequência não- nativa, portanto, define o vetor viral (por exemplo, AAV) como um vetor "recombinante", que no caso de AAV pode ser referido como um "vetor rAAV".

[0157] Uma sequência vetorial recombinante (por exemplo, lenti-, parvo-, AAV) pode ser encapsulada - referida aqui como uma "partícula" para subsequente infecção (transdução) de uma célula, ex vivo, in vitro ou in vivo. Quando uma sequência vetorial recombinante é encapsidada ou encapsulada em uma partícula AAV, a partícula também pode ser referida como "rAAV".” Tais partículas incluem proteínas que encapsidam ou encapsulam o genoma vetorial. Exemplos particulares incluem proteínas de envelope viral, e no caso de AAV, proteínas capsídicas, tais como AAV VP1, VP2 e VP3.

[0158] O "genoma" do vetor refere-se à porção da sequência plasmídica recombinante que é finalmente encapsulada ou encapsidada para formar uma partícula viral (por exemplo, AAV). Nos casos em que plasmídeos recombinantes são usados para construir ou fabricar vetores recombinantes, o genoma vetorial não inclui a porção do "plasmídeo" que não corresponde à sequência do genoma vetorial do plasmídeo recombinante. Esta porção de genoma não vetorial do plasmídeo recombinante é referida como a "espinha dorsal do plasmídeo", que é importante para a clonagem e amplificação do plasmídeo, um processo que é necessário para a propagação e produção do vírus recombinante, mas não é ele próprio encapsulado ou encapsidado em partículas do vírus (por exemplo, AAV). Assim, um "genoma" vetorial refere-se ao ácido nucleico que é encapsulado ou encapsidado pelo vírus (por exemplo, AAV).

[0159] Os termos "capsídeo vazio" e "partícula vazia" referem-se a um vírion AAV que inclui uma casca de proteína AAV, mas que carece, no todo ou em parte, de um ácido nucleico que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse flanqueada por AAV ITRs. Assim, o capsídeo vazio não funciona para transferir um ácido nucleico que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse para a célula hospedeira. No entanto, formulações de capsídeos vazios têm utilidade em outras aplicações, como em ELISA.

[0160] O termo "proteínas de encapsulamento" refere-se a funções celulares e/ou virais não derivadas de AAV, das quais a AAV é dependente para a sua replicação. Assim, o termo captura proteínas e RNAs que são necessários na replicação de AAV, incluindo aqueles grupos envolvidos na ativação da transcrição do gene AAV, etapa específica de "splicing" de AAV mRNA, replicação de DNA AAV, síntese de produtos de expressão de cap e montagem de capsídeo AAV. As funções acessórias baseadas em vírus podem ser derivadas de qualquer um dos vírus auxiliares conhecidos, tais como o adenovírus, herpesvírus (que não o vírus herpes simplex tipo 1) e o vírus vaccinia.

[0161] Como usado aqui, "proteínas de encapsulamento AAV" refere-se a sequências derivadas de AAV que funcionam em trans para replicação de AAV produtiva. Assim, as proteínas de encapsulamento AAV são codificadas pelas principais fases de leitura aberta (ORFs) de AAV, rep e cap. As proteínas rep têm demonstrado possuir muitas funções, incluindo, entre outras: reconhecimento, ligação e entalhe da origem de AAV da replicação de DNA; atividade de DNA helicase; e modulação da transcrição a partir de promotores de AAV (ou outros heterólogos). As proteínas cap (capsídeo) fornecem as funções de encapsulamento necessárias. Proteínas de encapsulamento AAV são usadas aqui para complementar funções AAV em trans que estão faltando de vetores AAV.

[0162] Os "ácidos nucleicos que codificam proteínas de encapsulamento AAV" referem-se, geralmente, a uma molécula de ácido nucleico que inclui sequências de nucleotídeo que fornecem funções AAV deletadas de um vetor AAV que é para ser usado para produzir um vetor AAV transdutor recombinante. Os ácidos nucleicos que codificam proteínas de encapsulamento AAV são comumente usados para fornecer expressão transitória de genes AAV rep e/ou cap para complementar funções AAV ausentes que são necessárias para a replicação AAV; no entanto, os constructos de ácido nucleico carecem de ITRs AAV, e não podem replicar-se nem encapsular-se. Ácidos nucleicos que codificam proteínas de encapsulamento AAV podem estar na forma de plasmídeo, fago, transposon, cosmídeo, vírus ou vírion. Um número de constructos de ácido nucleico foram descritos, tais como os plasmídeos pAAV/Ad e pIM29+45 comumente usados que codificam produtos de expressão Rep e Cap. Vide, por exemplo, Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; e McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-

2945. Um número de vetores foram descritos que codificam produtos de expressão Rep e/ou Cap (por exemplo, Patente dos EUA Nos. 5.139.941 e

6.376.237).

[0163] O termo "ácidos nucleicos que codificam proteínas auxiliares" refere-se geralmente a molécula(s) de ácido nucleico que inclui(em) sequências de nucleotídeo que codificam proteínas que fornecem função(ões) auxiliar(es). Um vetor com ácido(s) nucleico(s) que codifica(m) proteínas auxiliares pode(m) ser transfectado(s) em uma célula hospedeira adequada, em que o vetor é, então, capaz de suportar a produção de vírion AAV na célula hospedeira. Expressamente excluídas do termo estão as partículas virais infecciosas, como existem na natureza, tais como partículas de vírus vaccina, vírus herpes ou adenovírus.

[0164] Assim, vetores de proteínas auxiliares podem estar na forma de plasmídeo, fago, transposon ou cosmídeo. Em particular, foi demonstrado que o complemento completo dos genes do adenovírus não é necessário para funções auxiliares. Por exemplo, mutantes de adenovírus incapazes de replicação de DNA e síntese tardia de genes têm sido mostrados como permissivos para a replicação AAV. Ito et al., (1970) J. Gen. Virol. 9:243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45:317.

[0165] Mutantes dentro das regiões E2B e E3 demonstram apoiar a replicação AAV, o que indica que as regiões E2B e E3 provavelmente não estão envolvidas no fornecimento de função auxiliar. Carter et al:, (1983) Virology 126:505. No entanto, adenovírus defeituosos na região E1, ou tendo uma região E4 deletada, são incapazes de apoiar a replicação AAV. Assim, para as proteínas auxiliares adenovirais, as regiões E1A e E4 são provavelmente necessárias para replicação AAV, direta ou indiretamente. Laughlin et al., (1982) J. Virol. 41:868; Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 78:1925; Carter et al., (1983) Virology 126:505. Outros mutantes Ad caracterizados incluem: E1B (Laughlin et al. (1982), supra; Janik et al. (1981), supra; Ostrove et al., (1980) Virology 104:502); E2A (Handa et al., (1975) J. Gen. Virol. 29:239; Strauss et al., (1976) J. Virol. 17:140; Myers et al., (1980) J. Virol. 35:665; Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 78:2927; Myers et al., (1981) J. Biol. Chem. 256:567); E2B (Carter, adeno-Associated Virus Helper Functions, em I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter et al. (1983), supra); e E4 (Carter et al.(1983), supra; Carter (1995)).

[0166] Estudos das proteínas auxiliares fornecidas por adenovírus com mutações na E1B relataram que a E1B 55k é necessária para a produção de vírion AAV, enquanto a E1B 19k não é. Além disso, a Publicação Internacional WO 97/17458 e Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938-945, descrevem vetores de função auxiliar que codificam vários genes Ad. Um exemplo de um vetor auxiliar compreende uma região de codificação de adenovírus VA RNA, uma região de codificação de adenovírus E4 ORF6, uma região de codificação de adenovírus E2A 72 kD, uma região de codificação de adenovírus E1A e uma região de codificação de adenovírus E1B, ausente uma região de codificação E1B 55k intacta (vide, por exemplo, Publicação Internacional No. WO 01/83797).

[0167] Um "transgene" é usado aqui para se referir convenientemente a um ácido nucleico que destina-se ou foi introduzido em uma célula ou organismo. Os transgenes incluem qualquer ácido nucleico, como um gene, que é transcrito em uma transcrição ou que codifica um polipeptídeo ou proteína.

[0168] Um "elemento de controle de expressão" refere-se à(s) sequência(s) de ácido nucleico que influenciam a expressão de um ácido nucleico ligado operativamente. Os elementos de controle, incluindo os elementos de controle de expressão como aqui definidos, tais como promotores e aperfeiçoadores, as sequências de vetores que incluem vetores de AAV, podem incluir um ou mais "elementos de controle de expressão.” Tipicamente, tais elementos são incluídos para facilitar a correta transcrição de polinucleotídeo heterólogo e, se apropriado, tradução (por exemplo, um promotor, aperfeiçoador, sinal de "splicing" para íntrons, manutenção da correta fase de leitura do gene para permitir a tradução na fase do mRNA e códons de terminação, etc.). Tais elementos normalmente atuam em cis, referidos como um elemento de "atuação cis", mas também podem atuar em trans.

[0169] Controle de expressão pode estar no nível de transcrição, tradução, "splicing", estabilidade de mensagem, etc. Tipicamente, um elemento de controle de expressão que modula a transcrição é justaposto perto da extremidade 5' (ou seja, "a montante") de um ácido nucleico transcrito. Os elementos de controle de expressão também podem ser localizados na extremidade 3' (ou seja, "a jusante") da sequência transcrita ou dentro da transcrição (ou seja, em um íntron). Os elementos de controle de expressão podem ser localizados adjacentes ou a uma distância da sequência transcrita (por exemplo, 1 a 10, 10 a 25, 25 a 50, 50 a 100, 100 a 500, ou mais nucleotídeos do polinucleotídeo), mesmo a distâncias consideráveis. No entanto, devido às limitações de comprimento de certos vetores, tais como vetores AAV, os elementos de controle de expressão normalmente estarão dentro de 1 a 1000 nucleotídeos a partir do ácido nucleico transcrito.

[0170] Funcionalmente, a expressão de ácido nucleico ligado operativamente é pelo menos parcialmente controlável pelo elemento (por exemplo, promotor), de modo que o elemento modula a transcrição do ácido nucleico e, se for caso, a tradução da transcrição. Um exemplo específico de um elemento de controle de expressão é um promotor que está geralmente localizado a 5' da sequência transcrita. Um promotor aumenta tipicamente uma quantidade expressa a partir de ácido nucleico ligado operativamente em comparação com uma quantidade expressa quando não existe promotor.

[0171] Um "aperfeiçoador", como usado aqui, pode referir-se a uma sequência que está localizada adjacente ao polinucleotídeo heterólogo. Elementos aperfeiçoadores são tipicamente localizados a montante de um elemento promotor, mas também funcionam e podem ser localizados a jusante ou dentro de uma sequência de ácido nucleico. Assim, um elemento aperfeiçoador pode estar localizado a uma distância de 100 pares de base, 200 pares de base, ou 300 ou mais pares de base a montante ou a jusante de um ácido nucleico. Os elementos aperfeiçoadores aumentam tipicamente expressando-se de um ácido nucleico ligado operativamente acima da expressão oferecida por um elemento promotor.

[0172] Um constructo de expressão pode compreender elementos reguladores que servem para acionar a expressão em um determinado tipo de célula ou tecido. Os elementos de controle de expressão (por exemplo, promotores) incluem os ativos num determinado tipo de tecido ou célula, referidos aqui como "elementos/promotores de controle de expressão de tecido específico.” Os elementos de controle de expressão de tecido específico estão tipicamente ativos em células ou tecidos específicos (por exemplo, fígado). Os elementos de controle de expressão são tipicamente ativos em determinadas células, tecidos ou órgãos porque são reconhecidos por proteínas ativadoras de transcrição, ou outros reguladores de transcrição, que são únicos para um tipo específico de célula, tecido ou órgão. Tais elementos reguladores são conhecidos pelos técnicos no assunto (vide, por exemplo, Sambrook et al. (1989) e Ausubel et al. (1992).

[0173] A incorporação de elementos reguladores de tecidos específicos nos plasmídeos da invenção fornece pelo menos um tropismo parcial dos tecidos para a expressão do ácido nucleico. Exemplos de promotores que são ativos no fígado são o promotor TTR (por exemplo, promotor TTR mutante), promotor (hAAT) 1-antitripsina alfa humano; albumina, Miyatake, et al. J. Virol., 71:5124-32 (1997); promotor de núcleo de vírus da hepatite B, Sandig, et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996); alpha-fetoproteína (AFP), Arbuthnot, et al., Hum. Gene. Ther., 7:1503-14 (1996)], entre outros. Um exemplo de um aperfeiçoador ativo no fígado é a apolipoproteína E (apoE) HCR-1 e HCR-2 (Allan et al., J. Biol. Chem., 272:29113-19 (1997)).

[0174] Os elementos de controle de expressão também incluem promotores/aperfeiçoadores ubíquos ou promíscuos que são capazes de acionar a expressão de um polinucleotídeo em muitos tipos de células diferentes. Tais elementos incluem, mas não estão limitados às sequências de promotor/aperfeiçoador precoces imediatas do citomegalovírus (CMV), as sequências de promotor/aperfeiçoador do vírus de sarcoma de Rous (RSV) e os outros promotores/aperfeiçoadores virais ativos em uma variedade de tipos de células de mamíferos ou elementos sintéticos que não estão presentes na natureza (vide por exemplo, Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)), o promotor SV40, o promotor de di-hidrofolato redutase, o promotor de β-actina citoplasmático e o promotor fosfoglicerol cinase (PGK).

[0175] Elementos de controle de expressão também podem conferir expressão de uma maneira regulável, ou seja, um sinal ou estímulo aumenta ou diminui a expressão do polinucleotídeo heterólogo ligado operativamente. Um elemento regulável que aumenta a expressão do polinucleotídeo ligado operativamente em resposta a um sinal ou estímulos também é referido como um "elemento de indução" (isto é, é induzido por um sinal). Exemplos particulares incluem, mas não se limitam a, um promotor induzido por hormônio (por exemplo, esteróide). Tipicamente, a quantidade de aumento ou diminuição conferida por tais elementos é proporcional à quantidade de sinal ou estímulos presentes; quanto maior a quantidade de sinal ou estímulos, maior o aumento ou diminuição na expressão. Alguns exemplos não limitantes particulares incluem o promotor da metalotionina (MT) ovina induzida por zinco; o promotor do vírus tumoral mamário (MMTV) de rato induzido por hormônio esteróide; o sistema promotor da polimerase T7 (WO 98/10088); o sistema repressivo da tetraciclina (Gossen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 89:5547-5551 (1992)); sistema indutor de tetraciclina (Gossen, et al., Science. 268:1766-1769 (1995); see also Harvey, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518 (1998)); o sistema indutor de RU486 (Wang, et al., Nat. Biotech. 15:239-243 (1997) e Wang, et al., Gene Ther. 4:432-441 (1997)]; e o sistema indutor de rapamicina (Magari, et al., J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997); Rivera, et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996)). Outros elementos reguláveis de controle que podem ser úteis neste contexto são os que são regulados por um estado fisiológico específico, por exemplo, temperatura, fase aguda, desenvolvimento.

[0176] Os elementos de controle de expressão também incluem o(s) elemento(s) nativo(s) para o ácido nucleico. Um elemento de controle nativo (por exemplo, promotor) pode ser usado quando for desejado que a expressão do polinucleotídeo heterólogo imite a expressão nativa. O elemento nativo pode ser usado quando a expressão do polinucleotídeo heterólogo é para ser regulada temporariamente ou desenvolvidamente, ou de uma maneira de tecido específico, ou em resposta a estímulos transcricionais específicos. Outros elementos de controle de expressão nativos, tais como íntrons, locais de poliadenilação ou sequências de consenso de Kozak também podem ser usados.

[0177] O termo "ligado operativamente" significa que as sequências reguladoras necessárias para a expressão de uma sequência de codificação são colocadas nas posições apropriadas em relação à sequência de codificação, de modo a efetuar a expressão da sequência de codificação. Esta mesma definição é, às vezes, aplicada ao arranjo de sequências de codificação e elementos de controle de transcrição (por exemplo, promotores, aperfeiçoadores e elementos de terminação) em um vetor de expressão. Esta definição também é, às vezes, aplicada ao arranjo de sequências de ácido nucleico de uma primeira e uma segunda molécula de ácido nucleico em que uma molécula de ácido nucleico híbrido é gerada.

[0178] No exemplo de um elemento de controle de expressão em ligação operável com um ácido nucleico, a relação é tal que o elemento de controle modula a expressão do ácido nucleico. Mais especificamente, por exemplo, duas sequências de DNA ligadas operativamente significam que os dois DNAs estão dispostos (cis ou trans) em uma relação tal que pelo menos uma das sequências de DNA é capaz de exercer um efeito fisiológico sobre a outra sequência.

[0179] Assim, elementos adicionais para vetores incluem, sem limitação, um elemento de controle de expressão (por exemplo, promotor/aperfeiçoador), um sinal de terminação de transcrição ou um códon de terminação, regiões não traduzidas de 5' ou 3' (por exemplo, sequências de poliadenilação (polyA)) que flanqueiam uma sequência, como uma ou mais cópias de uma sequência ITR AAV, ou um íntron.

[0180] Outros elementos incluem, por exemplo, sequências de polinucleotídeo de "filler" ou "stuffer", por exemplo, para aprimorar o encapsulamento e reduzir a presença de ácido nucleico contaminante. Vetores AAV tipicamente aceitam inserções de DNA com uma faixa de tamanho que é geralmente de cerca de 4 kb a cerca de 5,2 kb, ou um pouco mais. Assim, para sequências mais curtas, a inclusão de um "stuffer" ou "filler" para ajustar o comprimento para perto ou no tamanho normal da sequência genômica de vírus aceitável para o encapsulamento de vetor AAV em partícula do vírus. Em várias modalidades, uma sequência de ácido nucleico de "filler"/"stuffer" é um segmento de ácido nucleico não traduzido (codificação não proteica). Para uma sequência de ácido nucleico inferior a 4,7 Kb, a sequência de polinucleotídeos de "filler" ou "stuffer" tem um comprimento que, quando combinado (por exemplo, inserido em um vetor) com a sequência, tem um comprimento total entre cerca de 3,0 a 5,5 Kb, ou entre cerca de 4,0 a 5,0 Kb, ou entre cerca de 4,3 a 4,8 Kb.

[0181] Um íntron também pode funcionar como uma sequência de polinucleotídeos de "filler" ou "stuffer" para alcançar um comprimento para o encapsulamento de vetor AAV em uma partícula de vírus. Íntrons e fragmentos de íntrons que funcionam como uma sequência de polinucleotídeos de "stuffer" ou "filler" também podem aperfeiçoar a expressão.

[0182] Os "polipeptídeos", "proteínas" e "peptídeos" codificados pelo "ácido nucleico" ou "plasmídeos", incluem sequências nativas de comprimento completo, como com proteínas de tipo selvagem de ocorrência natural, bem como subsequências funcionais, formas modificadas ou variantes de sequência, desde que a subsequência, forma modificada ou variante retenham algum grau de funcionalidade da proteína de comprimento completo nativa. Por exemplo, uma proteína pode ter uma eliminação, substituição ou adição e reter pelo menos uma função ou atividade parcial.

[0183] Os termos "modificar" ou "variante" e suas respectivas variações gramaticais significam que um ácido nucleico ou um polipeptídeo desviam-se de uma sequência de referência. As sequências modificadas e variantes podem, portanto, ter substancialmente a mesma, maior ou menor expressão, atividade ou função do que uma sequência de referência,

mas pelo menos retêm função ou atividade parcial da sequência de referência.

[0184] Exemplos não limitantes de modificações incluem um ou mais substituições de aminoácido ou nucleotídeo (por exemplo, 1 a 3, 3 a 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 100, 100 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 500, 500 a 750, 750 a 850 ou mais nucleotídeos ou resíduos).

[0185] Um exemplo de modificação de aminoácidos é uma substituição de aminoácido conservadora ou uma eliminação (por exemplo, subsequências ou fragmentos) de uma sequência de referência. Em modalidades particulares, uma sequência modificada ou variante retém pelo menos parte de uma função ou atividade de sequência não modificada.

[0186] Incluem-se todas as formas de ácidos nucleicos de mamíferos e não mamíferos que são transcritos e os ácidos nucleicos que codificam proteínas. Assim, a invenção inclui genes e proteínas de não mamíferos, mamíferos que não sejam humanos, e humanos, cujos genes e proteínas funcionam de uma forma substancialmente semelhante aos genes e proteínas humanos.

[0187] Após a transfecção celular e/ou produção de vetores virais recombinantes (por exemplo, AAV) como aqui definido, se desejado, os vírions virais (por exemplo, rAAV) podem ser coletados/colhidos a partir de células/cultura de células e, opcionalmente, purificados e/ou isolados a partir das células transfectadas, usando uma variedade de métodos convencionais. Tais métodos incluem cromatografia em coluna, gradientes de CsCI, e semelhantes. Por exemplo, uma pluralidade de etapas de purificação de coluna, como a purificação sobre uma coluna de troca de ânions, uma coluna de afinidade e/ou uma coluna de troca de cátions podem ser usadas. (Vide, por exemplo, a Publicação Internacional No. WO 02/12455 e Publicação de Pedido dos EUA No. 20030207439). Alternativamente, ou adicionalmente, etapas de gradiente CsCl podem ser usadas. (Vide, por exemplo, Publicação de Pedido dos EUA Nos. US 20120135515; e US 20130072548). Além disso,

se o uso de vírus infeccioso é empregado para expressar as proteínas auxiliares e/ou de encapsulamento, o vírus residual pode ser inativado, usando vários métodos. Por exemplo, o adenovírus pode ser inativado por aquecimento a temperaturas de aproximadamente 60°C, durante, por exemplo, 20 minutos ou mais. Este tratamento inativa eficazmente o vírus auxiliar, uma vez que AAV é estável ao calor, enquanto o adenovírus auxiliar é instável ao calor.

[0188] O termo "isolado", quando usado como um modificador de uma composição, significa que as composições são feitas pela mão do homem ou são separadas, completamente ou pelo menos em parte, de seu ambiente in vivo que ocorre naturalmente. As composições isoladas costumam ser substancialmente livres de um ou mais materiais com os quais normalmente se associam na natureza, por exemplo, um ou mais contaminantes tais como proteínas, ácido nucleico, lipídio, carboidrato, membrana celular.

[0189] Com relação às moléculas de RNA, o termo "isolado" refere-se primariamente a uma molécula de RNA codificada por uma molécula de DNA isolada, como definido acima. Alternativamente, o termo pode referi-se a uma molécula de RNA que foi suficientemente separada das moléculas de RNA com as quais estaria associada em seu estado natural (ou seja, em células ou tecidos), tal que exista em uma forma "substancialmente pura" (o termo "substancialmente pura" é definido abaixo).

[0190] No que diz respeito à proteína, o termo "proteína isolada" ou "proteína isolada e purificada" é por vezes usado aqui. Este termo refere-se principalmente a uma proteína produzida pela expressão de uma molécula de ácido nucleico isolada. Alternativamente, este termo pode referir-se a uma proteína que foi suficientemente separada de outras proteínas com as quais seria naturalmente associada, de modo a existir na forma "substancialmente pura".

[0191] O termo "isolada" não exclui combinações produzidas pela mão do homem, por exemplo, uma sequência de vetor recombinante (por exemplo, rAAV), ou partícula de vírus que encapsula ou encapsida um genoma vetorial e uma formulação farmacêutica. O termo "isolada" também não exclui formas físicas alternativas da composição, tais como híbridos/quimeras, multímeros/oligômeros, modificações (por exemplo, fosforilação, glicosilação, lipidação) ou formas derivadas, ou formas expressas em células hospedeiras produzidas pela mão do homem.

[0192] O termo "substancialmente pura" refere-se a uma preparação que compreende pelo menos 50 a 60% em peso do composto de interesse (por exemplo, ácido nucleico, oligonucleotídeo, proteína, etc.). A preparação pode compreender pelo menos 75% em peso, ou cerca de 90 a 99% em peso do composto de interesse. A pureza é medida por métodos adequados ao composto de interesse (por exemplo, métodos cromatográficos, eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose, análise por HPLC, e similares).

[0193] Moléculas de ácido nucleico, vetores de expressão (por exemplo, genomas de vetor), plasmídeos, podem ser preparados usando métodos de tecnologia de DNA recombinante. A disponibilidade de informação de sequência nucleotídica permite a preparação de moléculas de ácido nucleico isoladas por uma variedade de meios. Por exemplo, os ácidos nucleicos (por exemplo, plasmídeos) podem ser feitos usando várias clonagem padrão, tecnologia de DNA recombinante, via expressão celular ou técnicas de síntese química e tradução in vitro. A pureza pode ser determinada através de sequenciamento, eletroforese em gel e similares. Por exemplo, ácidos nucleicos podem ser isolados usando hibridização ou técnicas de triagem de banco de dados baseadas em computador. Tais técnicas incluem, mas não se limitam a: (1) hibridização de bibliotecas de cDNA ou DNA genômico com sondas para detectar sequências nucleotídicas homólogas; (2) triagem de anticorpos para detectar polipeptídeos tendo características estruturais compartilhadas, por exemplo, usando uma biblioteca de expressão; (3) reação em cadeia de polimerase (PCR) no cDNA ou DNA genômico usando iniciadores capazes de emparelhar com uma sequência de ácidos nucleicos de interesse; (4) pesquisas em computador de bancos de dados de sequências para sequências relacionadas; e (5) triagem diferencial de uma biblioteca de ácido nucleico subtraída.

[0194] Os ácidos nucleicos podem ser mantidos como DNA em qualquer vetor de clonagem conveniente. Em uma modalidade, ácidos nucleicos são mantidos em um plasmídeo. Alternativamente, os ácidos nucleicos podem ser mantidos em vetor adequado para expressão em células de mamíferos.

[0195] Ácidos nucleicos, plasmídeos, vetores, vetores de expressão (por exemplo, rAAV), partículas de vírus recombinante, métodos e usos permitem o tratamento de doenças genéticas. Para doenças de estado de deficiência, a transferência de gene pode ser usada para trazer um gene normal aos tecidos afetados para terapia de substituição, bem como para criar modelos animais para a doença usando mutações "antisense". Para estados de doença desequilibrados, a transferência de gene poderia ser usada para criar um estado de doença em um sistema modelo, que poderia então ser usado em esforços para neutralizar o estado de doença. O uso de integração específica do local de sequências de ácido nucleico para corrigir defeitos também é possível.

[0196] Vetores virais, tais como os vetores de lenti e parvovírus, incluindo os sorotipos de AAV e variantes dos mesmos, fornecem um meio para a entrega de ácido nucleico em células ex vivo, in vitro e in vivo, que codificam proteínas de tal forma que as células expressam a proteína codificada. AAV são vírus úteis como vetores de terapia genética, uma vez que podem penetrar células e introduzir ácido nucleico/material genético, de modo que o ácido nucleico/material genético pode ser mantido de forma estável em células. Além disso, estes vírus podem introduzir ácido nucleico/material genético em locais específicos, por exemplo. Uma vez que AAV não está associada à doença patogênica em humanos, os vetores AAV são capazes de entregar sequências polinucleotídicas heterólogas (por exemplo, agentes e proteínas terapêuticas) para pacientes humanos sem causar doença ou patogênese de AAV substancial.

[0197] Vetores virais, que podem ser usados, incluem, mas não estão limitados a, vetores de vírus adeno-associados (AAV) de múltiplos sorotipos (por exemplo, AAV-1 a AAV-12 e outros) e vetores AAV híbridos/quiméricos, vetores de lentivírus e vetores de lentivírus pseudotipados (por exemplo, vírus Ebola, vírus da estomatite vesicular (VSV) e vírus da imunodeficiência felina (FIV)), vetores de vírus herpes simplex, vetores adenovirais (com ou sem promotores/aperfeiçoadores de tecido específico), vetores de vírus vaccinia, vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores não virais e outros.

[0198] Partículas lentivirais e AAV podem ser usadas com vantagem como veículos para a entrega eficaz de genes. Tais vírions possuem um número de características desejáveis para tais aplicações, incluindo tropismo para células divisórias e não divisórias. A experiência clínica inicial com estes vetores também demonstrou não haver toxicidade sustentada e as respostas imunes foram mínimas ou indetectáveis. Sabe-se que AAV infecta uma grande variedade de tipos de células in vivo e in vitro por endocitose mediada por receptores ou por transcitose. Estes sistemas vetoriais foram testados em seres humanos visando epitélio da retina, fígado, músculo esquelético, vias aéreas, cérebro, articulações e células-tronco hematopoiéticas. Vetores não virais, por exemplo, baseados no DNA plasmídeo ou minicírculos, também são vetores de transferência de gene adequados.

[0199] Assim, em várias modalidades da invenção, um vetor inclui um vetor lenti ou parvoviral, como um vetor adeno-viral. Em modalidades particulares, um vetor recombinante é um vetor de parvovírus. Parvovírus são pequenos vírus com um genoma de DNA de cadeia única. Os vírus "adeno-associados" (AAV) estão na família parvovírus.

[0200] Os vetores AAV e os vetores lentivirais não incluem normalmente genes virais associados à patogênese. Tais vetores possuem normalmente um ou mais genes AAV do tipo selvagem excluídos no todo ou em parte, por exemplo, genes rep e/ou cap, mas retêm pelo menos uma sequência ITR de flanqueamento funcional, conforme necessário para a recuperação, replicação e encapsulamento do vetor recombinante em uma partícula de vetor AAV. Por exemplo, apenas as partes essenciais do vetor, por exemplo, os elementos ITR e LTR, respectivamente, são incluídas. Um genoma de vetor AAV incluiria, portanto, sequências requeridas em cis para replicação e encapsulamento (por exemplo, sequências ITR funcionais).

[0201] O vetor AAV recombinante, bem como métodos e usos do mesmo, incluem qualquer cepa ou sorotipo viral. Como um exemplo não limitante, um vetor AAV recombinante pode ser baseado em qualquer genoma AAV, tal como AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, ou AAV-2i8, por exemplo. Tais vetores podem ser baseados na mesma cepa ou sorotipo (ou subgrupo ou variante), ou ser diferentes um do outro. Como um exemplo não limitante, um vetor AAV recombinante baseado em um genoma de sorotipo pode ser idêntico a uma ou mais das proteínas de capsídeo que encapsulam o vetor. Além disso, um genoma vetorial AAV recombinante pode ser baseado em um genoma de sorotipo AAV (por exemplo, AAV2) distinto de uma ou mais proteínas de capsídeo AAV que encapsulam o vetor. Por exemplo, o genoma vetorial AAV pode ser baseado no AAV2, enquanto pelo menos uma das três proteínas de capsídeo pode ser uma AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 ou AAV- 2i8 ou uma variante das mesmas, por exemplo. As variantes de AAV incluem variantes e quimeras de capsídeos AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 AAV-2i8, SEQ ID NO1 e SEQ ID NO:2.

[0202] Em modalidades particulares, os vetores de vírus adeno-associado (AAV) incluem AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6,

AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, SEQ ID NO1 e SEQ ID NO:2, assim como variantes (por exemplo, variantes de capsídeo, tais como inserções, adições, substituições e eliminações de aminoácidos) dos mesmos, por exemplo, como estabelecido nas patentes WO 2013/158879 (Pedido Internacional PCT/US2013/037170), WO 2015/013313 (Pedido Internacional PCT/US2014/047670) e US 2013/0059732 (Pedido dos EUA Nº 13/594.773, divulga LK01, LK02, LK03, etc.).

[0203] AAV e sorotipos (por exemplo, sequências VP1, VP2, e/ou VP3) variantes de AAV (por exemplo, variantes de capsídeo) podem ou não ser diferentes dos outros sorotipos de AAV, incluindo, por exemplo, AAV1-AAV12 (por exemplo, distintos de sequências VP1, VP2, e/ou VP3 de quaisquer sorotipos de AAV1-AAV12).

[0204] Como usado aqui, o termo "sorotipo" é uma distinção usada para referir-se a um AAV tendo um capsídeo que é sorologicamente distinto de outros sorotipos de AAV. A distinção sorológica é determinada com base na falta de reatividade cruzada entre anticorpos para um AAV em comparação com outro AAV. Tais diferenças de reatividade cruzada são normalmente devidas a diferenças em sequências de proteína de capsídeo/determinantes antigênicos (por exemplo, devido a diferenças de sequência VP1, VP2 e/ou VP3 dos sorotipos de AAV). Apesar da possibilidade de que as variantes de AAV, incluindo as variantes de capsídeo, não sejam sorologicamente distintas de um AAV de referência ou de outro sorotipo de AAV, elas diferem pelo menos por um resíduo de aminoácido ou nucleotídeo em comparação com a referência ou outro sorotipo de AAV.

[0205] De acordo com a definição tradicional, um sorotipo significa que o vírus de interesse foi testado contra o soro específico para todos os sorotipos existentes e caracterizados para atividade neutralizante e não foram encontrados anticorpos que neutralizem o vírus de interesse. À medida que os isolados de vírus de ocorrência mais natural são descobertos e/ou mutantes de capsídeo são gerados, pode ou não haver diferenças sorológicas com qualquer um dos sorotipos atualmente existentes. Assim, nos casos em que o novo vírus (por exemplo, AAV) não tem diferença sorológica, este novo vírus (por exemplo, AAV) seria um subgrupo ou variante do sorotipo correspondente. Em muitos casos, o teste sorológico para atividade neutralizante ainda tem que ser realizado em vírus mutantes com modificações da sequência de capsídeo para determinar se eles são de outro sorotipo de acordo com a definição tradicional de sorotipo. Assim, por uma questão de conveniência e para evitar repetição, o termo "sorotipo" refere-se amplamente a ambos os vírus sorologicamente distintos (por exemplo, AAV), bem como vírus (por exemplo, AAV) que não são sorologicamente distintos que podem estar dentro de um subgrupo ou uma variante de um determinado sorotipo.

[0206] Em várias modalidades exemplares, um vetor AAV relacionado a um sorotipo de referência tem um polinucleotídeo, polipeptídeo ou subsequência dos mesmos que inclui ou consiste em uma sequência de pelo menos 80% ou mais (por exemplo:, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, etc.) idêntico a um ou mais AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, SEQ ID NO1 ou SEQ ID NO:2 (por exemplo, tais como sequências VP1, VP2, e/ou VP3, ou uma ITR).

[0207] Composições, métodos e usos da invenção incluem sequências de AAV (polipeptídeos e nucleotídeos), e subsequências dos mesmos que exibem menos de 100% de identidade sequencial a um sorotipo de AAV de referência, tais como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, ou AAV-2i8, mas são distintas e não são idênticas aos conhecidos genes ou proteínas de AAV, tais como genes ou proteínas AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, ou AAV-2i8, etc. Em uma modalidade, um polipeptídeo de AAV ou uma subsequência do mesmo inclui ou consiste em uma sequência de, pelo menos, 75% ou mais idêntica, por exemplo, 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,

99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, etc., até 100% idêntica a qualquer sequência de AAV de referência ou subsequência da mesma, tais como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, SEQ ID NO1 ou SEQ ID NO:2 (por exemplo, ITR ou capsídeo de VP1, VP2 e/ou VP3). Em aspectos particulares, uma variante de AAV tem 1, 2, 3, 4, 5, 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20 ou mais substituições de aminoácido.

[0208] Vetores AAV recombinantes, incluindo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, SEQ ID NO1 ou SEQ ID NO:2 e sequências quiméricas e híbridas, relacionadas, variantes podem ser construídos usando técnicas recombinantes que são conhecidas por técnicos no assunto, para incluir uma ou mais sequências de ácido nucleico (transgenes) flanqueadas com uma ou mais sequências AAV ITR funcionais.

[0209] Os ácidos nucleicos (plasmídeos), os vetores, os vetores recombinantes (por exemplo, rAAV) e as partículas de vírus recombinante podem ser incorporados em composições farmacêuticas. Tais composições farmacêuticas são úteis para, entre outras coisas, administração e entrega a um paciente in vivo ou ex vivo. Em modalidades particulares, as composições farmacêuticas contêm um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais excipientes incluem qualquer agente farmacêutico que não induza uma resposta imune prejudicial para o indivíduo que receba a composição e que possa ser administrado sem toxicidade indevida.

[0210] Como usado aqui, os termos "farmaceuticamente aceitável" e "fisiologicamente aceitável" significam uma formulação biologicamente aceitável, gasosa, líquida ou sólida, ou mistura das mesmas, que é adequada para uma ou mais vias de administração, entrega ou contato in vivo. Uma composição "farmaceuticamente aceitável" ou "fisiologicamente aceitável" é um material que não é biologicamente ou de outra forma indesejável, por exemplo, o material pode ser administrado a um paciente sem causar efeitos biológicos indesejáveis substanciais. Assim, tal composição farmacêutica pode ser usada, por exemplo, na administração de um ácido nucleico, vetor, partícula viral ou proteína a um paciente.

[0211] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, líquidos tais como água, solução salina, glicerol, açúcares e etanol. Sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser incluídos nos mesmos, por exemplo, sais de ácidos minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e similares; e os sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e similares. Além disso, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, substâncias tampão de pH e similares, podem estar presentes em tais veículos.

[0212] A composição farmacêutica pode ser fornecida como um sal e pode ser formada com muitos ácidos, incluindo, mas não limitado a, clorídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Os sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros solventes protônicos do que as formas de base livre correspondentes. Em outros casos, uma preparação pode ser um pó liofilizado que pode conter qualquer um ou todos os seguintes: 1 a 50 mM de histidina, 0,1% a 2% de sacarose e 2 a 7% de manitol, a uma faixa de pH de 4,5 a 5,5, que é combinada com o tampão antes do uso.

[0213] Composições farmacêuticas incluem solventes (aquosos ou não aquosos), soluções (aquosas ou não aquosas), emulsões (por exemplo, óleo em água ou água em óleo), suspensões, xaropes, elixires, meios de suspensão e dispersão, revestimentos, agentes isotônicos e promotores ou retardadores de absorção, compatíveis com a administração farmacêutica ou contato ou entrega in vivo. Os solventes, soluções e suspensões aquosos e não aquosos podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. Tais transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem comprimidos (revestidos ou não revestidos), cápsulas (duras ou moles), microesferas, pó, grânulos e cristais. Compostos ativos suplementares (por exemplo, conservantes, agentes antibacterianos, antivirais e antifúngicos) também podem ser incorporados nas composições.

[0214] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para serem compatíveis com uma determinada via de administração ou de entrega. Assim, as composições farmacêuticas incluem transportadores, diluentes ou excipientes adequados para administração por várias vias.

[0215] As composições e os métodos podem ser estéreis. As composições podem ser feitas e os métodos podem ser executados em recipientes adequados a tais processos. Tais recipientes incluem pratos, frascos, garrafas roller, sacos, biorreatores, vasos, tubos, pequenos frascos, etc. Os recipientes podem ser feitos de materiais que incluam, mas não são limitados a, vidro, plástico e polímeros, tais como poliestireno, polibutileno, polipropileno, etc.

[0216] As composições e os etapas de método podem ser realizados em uma ordem designada ou em uma ordem reorganizada. Os etapas de método podem ser realizadas em etapas ou em intervalos com períodos de tempo intermediários. Em outras palavras, uma etapa de método pode ser realizada, e então um intervalo de tempo entre a próxima etapa pode ocorrer, tais intervalos variando, por exemplo, de cerca de 1 segundo a cerca de 60 segundos; de cerca de 1 minuto a cerca de 60 minutos; de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas; de cerca de 1 dia a cerca de 7 dias; ou de cerca de 1 semana a cerca de 48 semanas.

[0217] Protocolos para a geração de vetores adenovirais foram descritos nas Patentes dos EUA Nº 5.998.205; 6.228.646;

6.093.699; e 6.100.242; e nas Pedidos de Patente Internacionais Nº WO 94/17810 e WO 94/23744, que são incorporadas na presente invenção por referência na sua totalidade.

[0218] A invenção é útil na produção de células e vetores para aplicações médicas humanas e veterinárias. Os pacientes adequados incluem, portanto, mamíferos, tais como humanos, bem como mamíferos não humanos. O termo "paciente" refere-se a um animal, normalmente um mamífero, tais como humanos, primatas não humanos (símios, gibões, gorilas, chimpanzés, orangotangos, macacos), um animal doméstico (cães e gatos), uma animal de fazenda (aves tais como galinhas e patos, cavalos, vacas, cabras, ovelhas, porcos), e animais experimentais (camundongo, rato, coelho, porquinho-da-índia). Os pacientes humanos incluem pacientes fetais, neonatais, infantis, juvenis e adultos. Os pacientes incluem modelos de doenças animais, por exemplo, camundongo e outros modelos animais de doenças da coagulação do sangue, tal como HemA e outros conhecidos pelos técnicos no assunto.

[0219] Uma "forma de dosagem unitária", como usado aqui, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o paciente a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada, opcionalmente, em associação com um transportador farmacêutico (excipiente, diluente, veículo ou agente de enchimento) que, quando administrado em uma ou mais doses, é calculado para produzir um efeito desejado (por exemplo, um efeito profilático ou terapêutico). As formas de dosagem unitária podem estar dentro, por exemplo, de ampolas e tubos, que podem incluir uma composição líquida, ou uma composição em estado seco por congelamento ("freeze-dried") ou liofilizado; um transportador líquido estéril, por exemplo, pode ser adicionado antes da administração ou entrega in vivo. As formas de dosagem de unidade individual podem ser incluídas em kits ou recipientes de dose múltipla. As sequências de vetor recombinante (por exemplo, rAAV), partículas de vírus recombinante e composições farmacêuticas dos mesmos podem ser encapsuladas sob a forma de dosagem de unidade simples ou múltipla, para facilitar a administração e uniformidade da dosagem.

[0220] A invenção fornece kits com material de encapsulamento e um ou mais componentes no mesmo. Um kit inclui normalmente um rótulo ou um folheto de encapsulamento, incluindo uma descrição dos componentes ou instruções de uso dos componentes contidos no mesmo. Um kit pode conter uma coleção de tais componentes, por exemplo, um ácido nucleico (plasmídeo), PEI, agente de aperfeiçoamento, células.

[0221] Um kit refere-se a uma estrutura física que aloja um ou mais componentes do kit. O material de encapsulamento pode manter os componentes de forma estéril, e pode ser feito de material comumente usado para tais fins (por exemplo, papel, fibra corrugada, vidro, plástico, folha, ampolas, frascos, tubos, etc.).

[0222] Os rótulos ou folhetos podem incluir elementos de identificação de um ou mais componentes. Os rótulos ou folhetos podem incluir informações que identificam o fabricante, números de lote, local e data de fabricação, datas de validade. Os rótulos ou folhetos podem incluir informações que identificam o fabricante, números de lote, localização e data do fabricante. Os rótulos ou folhetos podem incluir instruções para usar um ou mais dos componentes de kit em um método, uso ou protocolo de fabricação. As instruções podem incluir instruções para produzir as composições ou praticar qualquer um dos métodos descritos aqui.

[0223] Os rótulos ou folhetos incluem "material impresso", por exemplo, papel ou papelão, ou separado ou afixado a um componente, a um kit ou a um material de encapsulamento (por exemplo, uma caixa), ou anexado a uma ampola, tubo ou frasco contendo um componente de kit. Os rótulos ou folhetos podem incluir adicionalmente um meio legível por computador, tais como um rótulo impresso codificado por barra, um disco, disco óptico, como CD ou DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, fita magnética, ou uma mídia de armazenamento elétrico tais como RAM e ROM ou híbridos destes, tais como mídia de armazenamento magnético/óptico, mídia FLASH ou cartões do tipo memória.

[0224] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado comumente entendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos aqui.

[0225] Todas as patentes, pedidos de patentes, publicações e outras referências, citações GenBank e citações ATCC aqui citados são incorporados por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o relatório descritivo, incluindo as definições, prevalecerá.

[0226] Vários termos relacionados às moléculas biológicas da invenção são usados acima e também em todo o relatório descritivo e reivindicações.

[0227] Todas as características aqui divulgadas podem ser combinadas em qualquer combinação. Cada característica divulgada no relatório descritivo pode ser substituída por uma característica alternativa que serve a uma mesma finalidade, equivalente ou similar. Assim, a menos que expressamente indicado de outra forma, características divulgadas (por exemplo, PEI, plasmídeo, vetor (por exemplo, rAAV, ou partícula de vírus recombinante)) são um exemplo de um gênero de características equivalentes ou semelhantes.

[0228] Conforme usado na presente invenção, as formas singulares "um(a)", "e" e "o(a)" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um plasmídeo" ou "um ácido nucleico" inclui uma pluralidade de tais plasmídeos ou ácidos nucleicos, a referência a "um vetor" inclui uma pluralidade de tais vetores, a referência a "um vírus" ou "partícula" inclui uma pluralidade de tais vírus/partículas e a referência a "um agente de aperfeiçoamento" inclui uma pluralidade de tais agentes.

[0229] Conforme usado na presente invenção, todos os valores numéricos ou faixas numéricas incluem números inteiros dentro de tais faixas e frações dos valores ou os números inteiros dentro das faixas, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, para ilustrar, a referência a 80% ou mais de identidade inclui 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, etc., bem como 81,1%, 81,2%, 81,3%, 81,4%, 81,5%, etc., 82,1%, 82,2%, 82,3%, 82,4%, 82,5%, etc., e assim por diante.

[0230] A referência a um número inteiro com mais (maior) ou menos que inclui qualquer número maior ou menor que o número de referência, respectivamente. Assim, por exemplo, uma referência a menos de 100, inclui 99, 98, 97, etc. até o número um (1); e menos de 10, inclui 9, 8, 7, etc. até o número um (1).

[0231] Conforme usado na presente invenção, todos os valores ou faixas numéricos incluem frações dos valores e números inteiros dentro dessas faixas e frações dos números inteiros dentro de tais faixas, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, para ilustrar, a referência a uma faixa numérica, tal como 1 a 10 inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, bem como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, etc., e assim por diante. Por conseguinte, a referência a uma faixa de 1 a 50 inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc., até 50 inclusive, bem como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, etc., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, etc., e assim por diante.

[0232] A referência a uma série de faixas inclui faixas que combinam os valores dos limites de diferentes faixas dentro da série. Assim, para ilustrar a referência a uma série de faixas, por exemplo, de 1 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 75, 75 a 100, 100 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 300 a 400, 400 a 500, 500 a 750, 750 a 850, inclui faixas de 1 a 20, 1 a 30, 1 a 40, 1 a 50, 1 a 60, 10 a 30, 10 a 40, 10 a 50, 10 a 60, 10 a 70, 10 a 80, 20 a 40, 20 a 50, 20 a 60, 20 a 70, 20 a 80, 20 a 90, 50 a 75, 50 a 100, 50 a 150, 50 a 200, 50 a 250, 100 a 200, 100 a 250, 100 a 300, 100 a 350, 100 a 400, 100 a 500, 150 a 250, 150 a 300, 150 a 350, 150 a 400, 150 a 450, 150 a 500, etc.

[0233] A invenção costuma ser divulgada aqui usando linguagem afirmativa para descrever as inúmeras modalidades e aspectos. A invenção também inclui especificamente modalidades em que determinado assunto é excluído, total ou parcialmente, tais como substâncias ou materiais, etapas e condições de método, protocolos ou procedimentos. Por exemplo, em certas modalidades ou aspectos da invenção, materiais e/ou etapas de métodos são excluídos. Assim, mesmo que a invenção geralmente não seja aqui expressa em termos do que a invenção não inclui, aspectos que não são expressamente excluídos na invenção, são, no entanto, aqui divulgados.

[0234] Um número de modalidades da invenção foi descrito. No entanto, um técnico no assunto, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção, pode fazer várias alterações e modificações da invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Assim, os exemplos a seguir são destinados a ilustrar, mas não limitar o escopo da invenção reivindicada de qualquer forma. EXEMPLO 1 Materiais e métodos representativos

[0235] Cultura de células: As células FreeStyleTM 293F (HEK 293F) adquiridas da Thermo Fisher Scientific (R79007) foram cultivadas em meio de expressão FreeStyleTM F17 (F17) (Thermo Fisher Scientific, A1383501) suplementado com 1x GlutaMAXTM(Thermo Fisher Scientific, 35050-061) e 1x antibiótico-antimicótico (Thermo Fisher Scientific, 15240). As células foram cultivadas em frascos de rotação (Corning, 3152 ou 3153), frasco de agitação (Corning 431143, ou 431145) ou biorreatores. Para frascos de rotação/agitação, as células foram cultivadas a 37°C em incubadora com agitação a 170rpm e uma atmosfera umidificada de 8% de CO2; para biorreatores (Eppendorf, sistema de Biorreator Paralelo DASGIP, vasos de vidro e vasos de uso único), a cultura de células foi controlada por parâmetros programados (DO 40%, pH 7,2, agitação a 130 rpm, 150 rpm ou 170 rpm).

Normalmente, as células foram semeadas a 0,25 a 0,5 x 106/mL, e subcultivadas a cada 2 a 3 dias adicionando-se meio de cultura de células fresco quando a densidade celular atingiu aproximadamente 2 a 3 x 106/mL. A densidade e a viabilidade celular foram determinadas usando um analisador de viabilidade de células Vi-cellTM XR (Beckman Coulter).

[0236] Plasmídeos: Três plasmídeos foram usados para produzir vetores virais adeno-associados recombinantes (rAAV): 1) Plasmídeo transgene contendo hFVIII flanqueado por ITRs, 2) Um plasmídeo de encapsulamento contendo genes rep e cap, 3) Um plasmídeo auxiliar adenoviral contendo genes E2, E4 e VARNA de adenovírus. Todos os plasmídeos foram adquiridos e fabricados pela Aldevron.

[0237] Preparação de soluções de PEI: Polietilenimina linear (PEI) "Max" 40KDa (Polysciences, 24765-2, sal cloridrato de PEI 25KDa linear) foi usada como reagente de transfecção. Para os estudos de otimização de transfecção, a PEI "Max" foi dissolvida em 5 mM Tris para formar uma solução de 0,5 mg/mL e a solução foi ajustada para diferentes pH, incluindo pH 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,6, 7,8 ou 8,0. Após vários estudos, a solução de PEI a pH 7,1 foi selecionada para todos os estudos, se não especificado, devido à melhor transfecção e produção de rAAV.

[0238] Uso de agentes de aperfeiçoamento na transfecção mediada por PEI: Os potenciais agentes de aperfeiçoamento de transfecção avaliados quanto ao seu efeito na transfecção e na produção de rAAV foram o aperfeiçoador 1 e 2 no Kit de Transfecção ExpiFectamineTM 293 (Thermo Fisher Scientific, A14525), o reagente P3000 no Kit de Transfecção Lipofectamine® 3000 (Thermo Fisher Scientific, L3000015), o aperfeiçoador em Kit de Reagente deTransfecção Effectene™ (Qiagen, 301427). Também foram estudadas uma variedade de compostos, incluindo ácido valpróico, etoposídeo, teniposídeo, siomicina A e vorinostat para testar sua eficácia na transfecção de células PEI e produção de rAAV.

[0239] As células HEK 293F foram cultivadas em meio F17 mais 1x Suplemento GlutaMAX™ e 1x Antibiótico-antimicótico em frascos de rotação ou frascos de agitação. No dia anterior à transfecção, as células foram semeadas a 0,5-2 x 106 células/mL adicionando-se meio fresco. Após 24 horas, as células foram transfectadas a uma densidade celular de 1-4 x 106 células/mL. Três plasmídeos para transfecção, hFVIII, Rep/cap, auxiliar Ad2, foram usados em uma proporção molar de 1:1:1, 0,5:1:1 e 1:2:2, e em uma proporção de peso de 0,75:0,75:0,75, 1:1:1 e 1,5:1,5:1,5. A quantidade total de DNA usada para transfecção foi de 0,5 a 4,2 µg por mL em volume de cultura de células. O complexo de PEI/DNA foi preparado com diferentes proporções em peso de PEI e DNA, a 1:1, 1,5:1, 2:1, 2,5:1 e 3:1, incubado à temperatura ambiente por 1, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos, então, os complexos de DNA/PEI foram adicionados à cultura de célula. A PEI livre (sem DNA) de 0,5 a 5,6 µg/mL foi adicionada à cultura de célula imediatamente após complexos de PEI/DNA. Agentes de aperfeiçoamento foram adicionados diretamente às células no momento da transfecção ou 24h antes da transfecção ou 16-18h após a transfecção. Foram estudadas diferentes quantidades de agentes de aperfeiçoamento. Amostras, incluindo células e meios de cultura de célula, foram colhidas a 48 e 72 horas após a transfecção para a contagem de célula e viabilidade de célula e a cultura de célula foi colhida a 72 horas após a transfecção.

[0240] Produção de vetores rAAV em biorreatores: Um sistema de biorreator paralelo DASGIP de 2L (Eppendorf) equipado com dois ou três impulsores de lâminas inclinadas foi usado para aumentar o processo de produção de vetor. O volume final de trabalho foi ajustado para 400 ml ou 1,2 L. A agitação foi definida a 130rpm, 150 rpm ou 170rpm; a temperatura foi mantida a 37°C; o pH foi testado em 6,3, 6,8, 7,2, 7,4, 7,6 ou 8; o pH 7,2 foi selecionado devido ao melhor crescimento de células e produção de rAAV. O oxigênio dissolvido foi mantido a 40% por suplementação com uma mistura gasosa de oxigênio, dióxido de carbono e ar. Todos estes parâmetros foram monitorados e controlados pelo DASGIP Control System com o software DASGIP Control 4.0. As células de HEK 293F cultivadas em meio F17 foram inoculadas a uma densidade celular de 0,4 x 106 células/mL, com viabilidade superior a 95%. As células foram subcultivadas no dia 3 após a semeadura, adicionando-se meio fresco. A densidade celular foi ajustada para aproximadamente 0,5-1,7 x 106 células/mL após a subcultura. Vinte e quatro horas após a subcultura, as células foram transfectadas com complexo de PEI/DNA, PEI livre e aperfeiçoadores de transfecção, como descrito acima e nas legendas da figura. A densidade celular foi de aproximadamente 1-3 x106 células/mL na transfecção. 1,2 a 4,2 µg/mL de DNA, proporção de peso de PEI/DNA de 1:1, 1,5:1, 2:1, 2,5:1 ou 3:1 com 0,5-4,2 µg/ml de PEI livre e agentes de aperfeiçoamento foram analisados quanto à transfecção de plasmídeo e produção de rAAV. A cultura de células foi colhida 72 horas após a transfecção.

[0241] Quantificação de vetores rAAV: os vetores rAAV foram liberados da colheita de células HEK 293F transfectadas por microfluidização (microfluidizerTM, Microfluidics) ou três vezes sonicação. Os detritos de células foram granulados por centrifugação e os sobrenadantes foram coletados e analisados por PCR em tempo real.

[0242] O número de cópias do genoma vetorial rAAV foi determinado com reação em cadeia de polimerase em tempo real (Q-PCR) (Thermo Fisher Scientific, QuanStudio 7) usando TaqMan Master Mix (Thermo Fisher Scientific, 4304437). Primeiro, 10 μL de lisado de células foram tratados com 2 µl de RNA universal (Biochain, R423565) e, em seguida, com 7,6 U de DNase I (Qiagen, 79254) para digerir o DNA não encapsulado e contaminado. A solução foi então tratada com 0,2% de SDS/5mM de EDTA/0,2 Mde NaCl e aquecida a 95° C por 10 min para inativar a DNase I e liberar o DNA de vetor. Os iniciadores e a sonda detectaram a sequência de transgene hFVIII: Iniciador direto: 5’- TGAGGAGGCTGAAGACTAT -3’ (SEQ ID NO:3), iniciador reverso 5’- CCACAGACCTGATCTGAATGAA ‐3’ (SEQ ID NO:4) e sonda/5’- 6FAM/TGGATGTGG /ZEN/TGAGGTTTGATGATGACA /3IABkFQ/-3’ (SEQ ID

NO:5). O padrão foi gerado pela linearização do plasmídeo pAAV-hFVIII. Todas as amostras foram realizadas em triplicado.

[0243] Análise de Western blot: os vetores rAAV foram liberados da colheita de células HEK 293F transfectadas por microfluidização (microfluidizerTM, Microfluidics) ou três vezes sonicação. Os detritos de células foram granulados por centrifugação e os sobrenadantes foram recolhidos para Western blot O lisado de células foi misturado com 4x tampão de amostra NuPAGE LDS (Thermo Fisher Scientific, NP0007) e depois aquecido a 95°C por 5 min. As amostras foram separadas por SDS-PAGE e transferidas para a membrana PVDF (Thermo Fisher Scientific, LC2002). Após o bloqueio com o tampão de bloqueio Odyssey (Li-COR Biosciences, 927- 50000) por 1 hora, as membranas foram incubadas à temperatura ambiente por 2 horas com um anticorpo monoclonal de camundongo anti-AAV VP1,2,3 a uma diluição de 1:500 (American Research Products, Inc., 03-65158). Após três enxágues, as membranas foram incubadas à temperatura ambiente durante uma hora com IgG anticamundongo de cabra, anticorpo secundário conjugado Alexa Fluo 680, a uma diluição de 1:5000 (Invitrogen, A21057). As membranas foram escaneadas com o dispositivo de captura de imagens Odyssey CLx (Li-COR Biosciences). EXEMPLO 2 Aperfeiçoadores de transfecção aumentaram a produtividade do vetor rAAV-FVIII.

[0244] Um método de transfecção baseado em PEI altamente eficiente usando PEI "Max" como reagente de transfecção foi desenvolvido para transfectar três plasmídeos em células HEK 293F em meio F17 para produzir vetores de rAAV. Foi descrita a melhor janela de cultura de células para a transfecção de plasmídeos para obter a maior produtividade de rAAV. No entanto, quando usado para gerar vetores rAAV-FVIII, a produtividade de vetor foi relativamente baixa (grau de vetor A 2-3E+10vg/mL).

A causa da baixa produtividade pode ser porque o transgene FVIII é bastante grande em comparação com outros transgenes como eGFP, FIX.

[0245] Foi realizada uma busca por agentes que possam aprimorar a eficiência de transfecção. Foram avaliados vários aperfeiçoadores de transfecção em vários kits de transfecção, incluindo o kit de transfecção ExpiFectamineTM 293, o kit de transfecção Lipofectamine® 3000 e o kit de reagente de transfecção Effectene™. Os dados mostram que os aperfeiçoadores de transfecção no kit de transfecção ExpiFectamineTM 293 podem aumentar significativamente a produção de vetor rAAV. Aperfeiçoadores em outros kits de transfecção não aprimoraram significativamente a produção de rAAV. Aperfeiçoador ExpiFectamineTM 293 1 e 2 foi usado a 1:200 e 1:20 de volume de cultura, respectivamente. Os

TM aperfeiçoadores 1 e 2 no kit de transfecção ExpiFectamine 293 no momento de transfecção aumentaram o grau de rAAV em 2-3 vezes em comparação com a adição às 16-18 horas após a transfecção ou sem aperfeiçoadores (Fig. 1). A adição dos aperfeiçoadores 1 e 2 antes da transfecção não aumentou de forma detectável a produção de rAAV. O Aperfeiçoador 1 e Aperfeiçoador 2 são componentes do kit de transfecção ExpiFectamineTM 293, que é um kit de reagente de transfecção catiônico à base de lipídios para expressão de proteínas de células Expi293F™ cultivadas em meio de expressão Expi293™. Os aperfeiçoadores são declarados pelo fabricante como reagentes isentos de origem animal, quimicamente definidos, isentos de proteínas e isentos de soro. Estes aperfeiçoadores foram usados em uma nova aplicação que é diferente do projeto original para este kit. Estes aperfeiçoadores foram usados para gerar vetores rAAV em vez de expressar proteínas. O kit sugere usar o aperfeiçoador 1 e 2 em 16 a 18 horas após a transfecção para aumentar a transfecção e a expressão de proteína. No entanto, os estudos divulgados aqui mostram que o aperfeiçoador 1 e o aperfeiçoador 2 adicionados simultaneamente no momento de transfecção resultaram na maior produção de rAAV, 2 a 3 vezes maior do que o uso após a transfecção, sugerindo que os aperfeiçoadores desempenham um papel diferente na produção de rAAV a partir da expressão de proteínas. A adição desses aperfeiçoadores a um método de transfecção mediado por PEI estabelecido na presente invenção e em PCT/US16/64414 aumentou a transfecção de um plasmídeo de transgene grande em células, resultando em um aumento substancial de rAAVs.

[0246] Os parâmetros de transfecção, incluindo densidade celular na transfecção, quantidade de DNA, proporção de PEI/DNA, quantidade de PEI livre na presença ou ausência destes aperfeiçoadores, foram ainda otimizados. Os dados mostram que o aumento da densidade celular na transfecção e proporção de PEI/DNA, usando menos DNA e PEI livre, rendeu a maior produtividade de rAAV na presença dos aperfeiçoadores.

[0247] A Figura 2 mostra a produção de vetor rAAV- FVIII usando diferentes quantidades de DNA e proporção de PEI/DNA no frasco de rotação determinado por qPCR. As células HEK 293F em frascos de rotação foram transfectadas com 1,2, 1,86, 2,8 g/mL de DNA, a proporção de PEI/DNA (N/P) usada foi 1:1, 1,5:1, 2:1, 2,5:1, 3:1 e 1,5 g/mL de PEI livre. Os aperfeiçoadores 1 e 2 no kit de transfecção ExpiFectamineTM 293 foram adicionados às células na transfecção. Aperfeiçoador 1 e aperfeiçoador 2 foram usados a 1:200 e 1:20 do volume de cultura, respectivamente. A densidade celular era de 2,5-3 x 106 células/mL na transfecção. A melhor condição para a produção de vetor resultou do uso de 1,2 g/mL de DNA com proporção de PEI/DNA 2-2,5:1 e 1,5 g/mL de PEI livre e aperfeiçoador 1 (diluição de 1:200) e 2 (diluição de 1:20) na transfecção.

[0248] As condições nos biorreatores de 2L DASGIP foram avaliadas e ainda otimizadas em maior escala. A Figura 3 mostra a produção de vetor rAAV-FVIII usando diferentes quantidades de DNA e proporção PEI/DNA em biorreatores determinados por qPCR. As células HEK 293F foram cultivadas em 400 ml em F17 a 37°C, pH 7,2, DO 40%, agitação de 150 RPM em biorreatores. As células foram transfectadas com uma proporção molar de DNA de 1:1:1 e 1,2 ou 2,8 g/mL de DNA, a proporção PEI/DNA (N/P) de 1,5:1, 2:1, 2,5:1 ou 3:1 e 1,5 g/mL de PEI livre. Os aperfeiçoadores 1 e 2 no kit de transfecção ExpiFectamineTM 293 foram adicionados às células na transfecção. Aperfeiçoador 1 e aperfeiçoador 2 foram usados a 1:200 e 1:20 do volume de cultura, respectivamente. A densidade celular foi de 2-3 x 106 células/mL na transfecção. A condição que resultou na maior produtividade de vetor rAAV foi o uso de uma proporção molar de DNA de 1:1:1 e 1,2 g/mL de DNA com uma proporção PEI/DNA de 2,5-3:1 e 1,5 g/mL de PEI livre e aperfeiçoadores.

[0249] O volume de cultura de células foi aumentado de 400 ml para 1,2 L em biorreatores para produzir rAAVs. As células HEK 293F foram cultivadas a 37°C, pH 7,2, DO 40%, agitação de 130rpm, 150rpm ou 170rpm com 2 ou 3 impulsores. As células foram transfectadas com uma proporção molar de DNA de 1:1:1, 1,2 g/mL de DNA, proporção PEI/DNA (N/P) de 2,5:1 e 1,5 g/mL de PEI livre. Os aperfeiçoadores 1 e 2 no kit de transfecção ExpiFectamineTM 293 foram usados tal como descrito acima. A Figura 4 mostra graus de rAAV destes estudos. Os dados demonstraram que as condições otimizadas a partir de uma pequena escala de 50 ml no frasco de rotação podem ser ampliadas para 400 mL e depois para uma escala de 1,2 L. O uso de agentes aperfeiçoadores nas condições de transfecção otimizada mediada por PEI pode aumentar a produtividade do vetor rAAV em 8-10 vezes na cultura de suspensão isenta de soro. Este processo é altamente eficiente, seguro e escalável.

[0250] Para determinar se ambos os aperfeiçoadores 1 e 2 foram necessários na transfecção para aprimorar a produção de rAAV e definir ainda mais a quantidade destes aperfeiçoadores, eles foram avaliados individualmente. Os dados mostram que o aperfeiçoador 1 isolado pode aprimorar a produtividade de rAAV para o mesmo nível que os aperfeiçoadores 1 e 2 combinados. O aperfeiçoador 2 isolado não aumentou de forma detectável a produção de rAAV (Figura 5). A quantidade de aperfeiçoadores 1 e 2 também foi reduzida para definir ainda mais a condição ideal do processo. A quantidade reduzida de aperfeiçoadores 1 e 2 resultou em um grau de rAAV inferior (Figura 5). A quantidade aumentada dos aperfeiçoadores 1 (diluição 1:100 ou 1:150) e 2 (diluição 1:10 ou 1:15) na transfecção não aprimorou de forma detectável a produtividade de rAAV. Além do uso dos aperfeiçoadores 1 e 2 na transfecção, os mesmos foram avaliados às 24h ou 48h ou às 24h e 48h após a transfecção para determinar se podem aumentar ainda mais o grau de rAAV. A Figura 6 mostra que o uso repetitivo de aperfeiçoadores aumentou ligeiramente a produção de rAAV. EXEMPLO 3 O ácido valpróico aprimora produtividade de vetor rAAV- FVIII.

[0251] Uma variedade de compostos, incluindo ácido valpróico, etoposídeo, teniposídeo, siomicina A e vorinostat foram avaliados para determinar seu efeito na transfecção e na produção de rAAV. Entre estes compostos, o ácido valpróico aumentou significativamente a produtividade de rAAV. O ácido valpróico é um inibidor da histona deacetilase e também um medicamento aprovado pela FDA para tratar convulsões. Diferentes concentrações de ácido valpróico, 0,25 mM, 0,5 mM, 1mm, 1,5 mM, 2mM, 5 mM, 7,5 mM e 10mM foram usadas na transfecção em cultura de frasco de rotação/agitação e também na cultura de biorreator DASGIP. O uso de ácido valpróico na transfecção otimizada mediada por PEI aumentou o grau de vetor rAAV-FVIII em cerca de 10 vezes em comparação com o sem aperfeiçoadores, e atingiu o mesmo nível de produtividade de rAAV ou superior aos dos aperfeiçoadores 1 e 2 no sistema de cultura de suspensão livre de soro (Figura 7). Foram usados 1,2 g/mL de DNA, proporção molar de DNA de 1:1:1, proporção de peso de PEI/DNA de 2:1 ou 2,5:1 e 1,5 g/mL de PEI nestes estudos com ácido valpróico. Após o complexo de PEI/DNA e a PEI livre serem adicionados às células na transfecção, ácido valpróico foi adicionado em diferentes concentrações. Neste estudo, os aperfeiçoadores do Kit de Transfecção ExpiFectamineTM 293 não foram usados. A Figura 8 mostra uma produção aprimorada de vetor AAV em concentrações aumentadas de ácido valpróico em uma cultura de biorreator de 1L, por exemplo, 4 mM ou mais de ácido valpróico, tal como 5 a 8 mM. EXEMPLO 4

[0252] O aperfeiçoador 1 isolado do kit de transfecção ExpiFectamineTM 293 e o ácido valpróico usado isoladamente no método de transfecção otimizada baseada em PEI pode aumentar substancialmente a produtividade de vetor rAAV, cerca de 10 vezes mais do que o protocolo de produção atualmente relatado usando tecnologias semelhantes. O uso de aperfeiçoador 1 ou ácido valpróico isolado no sistema de produção de rAAV fornece uma nova plataforma de produção de rAAV escalável que pode ser usada para produzir eficientemente qualquer sorotipo de vetores rAAV na cultura de células de suspensão isenta de soro. Este processo é especialmente aplicável à produção de vetores rAAV com grandes transgenes e para produção de vetores rAAV que são difíceis de gerar. Este processo é totalmente escalável, compatível com o GMPC e tem um versátil sistema de produção de rAAV, o que é viável para a fabricação em grande escala de rAAV. EXEMPLO 5

[0253] Os dados da Figura 4 demonstram que as condições otimizadas a partir de uma pequena escala de 50 ml em frasco de rotação podem ser escalonadas para até 400 ml e, em seguida, até uma escala de 1,2 L. Uma escalabilidade adicional até maiores volumes pode ser alcançada. Por exemplo, é contemplado que os métodos sejam escalonáveis até 2 litros, 2 a 20 litros, 20 a 50 litros ou 50 a 100 litros. Volumes ainda maiores são contemplados, tais como, 100 a 500 litros, 500 a 1.000 litros, ou

1.000 ou mais litros. Tal escala pode incluir clonagem de células e seleção de clones que produzem grandes quantidades de vetor rAAV. A criação de bancos de células mestres de tais clones que expressam o vetor rAAV em grande quantidade fornece uma fonte confiável e reproduzível de células aplicáveis às composições e métodos da invenção aqui descritos.

[0254] Refinamentos adicionais nas condições de cultura de células, condições de transfecção, lise de células e/ou coleta de sobrenadante da cultura de colheitas de vetores rAAV, remoção de impurezas e subsequentes condições de purificação a jusante podem também contribuir para aumentos substanciais na escalabilidade. EXEMPLO 6

1.0 Critérios de aceitação de desenvolvimento de processo exemplares, não limitativos, visão geral, descrição e parâmetros de fluxo variados para aumentar a escala de produção de vetor rAAV (por exemplo, LK03-FVIII) usando células de suspensão

1.1 Descongelamento e expansão celular Critérios do Processo Unidades Instrumento usado para análise Densidade celular viável Células/mL viáveis Vi-CELL™ XR (VCD) suficientes para avançar para a etapa de expansão subsequente

1.2 Produção de vetor rAAV em uma escala de biorreator de 1,2 L Critérios do Processo Unidades Ensaio usado para análise 10 Produção na colheita ≥ 5 x 10 vg/mL Grau de genoma viral por qPCR

2.0 Visão geral do processo

2.1 Processo de descongelamento e expansão celular

2.1.1 Diagrama do Fluxo de Processo O seguinte é um diagrama de fluxo de processo representativo para a porção de descongelamento celular e expansão celular de um processo de vetor rAAV a montante: Passagem 1 4 dias Densidade celular é 2-3x106 vc/mL Descongelar 1 frasco Transferir as células para 29mL Tendo ~ 30mL de células a ~ 2.5 x 106 (1 ml) de células 293F de meio F 17 pré-aquecido em vc/mL= 7.5x 107 TVC a 37°C um frasco de 125 mL Subcultura de células para ~ 10x 106 vc/mL Cultura a 37° C, 8% de CO2, 0,3 - 0,5 x 106 vc/mL Assumir Viabilidade 125 rpm por 4 dias usando meio F 17 pré-aquecido com volume > 75% Densidade celular inicial ~ 0,3 x de trabalho de 150 mL (wv) em frascos de 106 vc/Ml 500 mL Cultura a 37°C, 8% CO2, 125 rpm ~ 30 mL de cultura em frasco por 3-4 dias de agitação de 1 x 125 mL ~ 150 ml de cultura em frasco de agitação de 1 x 500 mL Passagem 2 3-4 dias Densidade celular é 3-5x106 vc/mL Semear 3-4 dias Passagem 3 DAS GIP 3-4 dias Densidade celular é Biorreatores 3-5x106 vc/mL Densidade celular é Tendo ~ 800mL de células a ~ 4 x 106 Tendo ~ 150mL de células a ~ 4 x 106 3-5x106 vc/mL vc/mL = 3.2 x 109 TVC vc/ml = 6 x 108 TVC Subcultura de células para 0,3 - 0,5 x Subcultura de células para 0,3 - 0,5 x 106 vc/mL usando meio F 17 pré- 106 vc/mL usando meio F 17 pré- aquecido com 3 x 400 mL (wv) em aquecido com 2 x 400 mL (wv) em balões de agitação de 3 x 1L balões de agitação de 2 x 1L Cultura a 37° C, 8% de CO2, 125 rpm Cultura a 37° C, 8% de CO2, 125 rpm por 3-4 dias por 3-4 dias ~ 1200 mL de cultura em frascos de ~ 800 mL de cultura em frascos de agitação de 3 x 1L agitação de 2 x 1L

2.1.2 Descrição do fluxo de processo O seguinte é uma descrição representativa do fluxo de processo para a porção de descongelamento celular e expansão celular de um processo de vetor rAAV a montante (por exemplo, LK03-FVIII):

Etapa ou Descrição Operação Descongelamento  Descongelar as células a 37°C durante ≥ 2,5 min celular  Colocar as células em meio F17 FreestyleTM pré- aquecido de 29 mL com 1X GlutaMAX™  30 ml de células em um frasco de agitação de 125 mL  Células de cultura a 37°C durante 4 dias a 8% de CO2 a 125 rpm Passagem 1  Células de subcultura a 0,3 – 0,5 x 106 vc/mL usando meio F17 FreestyleTM pré-aquecido com 1X GlutaMAX™  150 mL de células em um frasco de agitação de 500 ml  Células de cultura a 37°C durante 3 a 4 dias a 8% de CO2 a 125 rpm Passagem 2  Células de subcultura a 0,3 – 0,5 x 106 vc/mL usando meio F17 FreestyleTM pré-aquecido com 1X GlutaMAX™  400 mL de células em cada um dos frascos de agitação de 2 x 1000 mL (total de 800 mL)  Células de cultura a 37°C durante 3 a 4 dias a 8% de CO2 a 125 rpm Passagem 3  Células de subcultura a 0,3 – 0,5 x 106 vc/mL usando meio F17 FreestyleTM pré-aquecido com 1X GlutaMAX™  400 mL de células em cada um dos frascos de agitação de 3 x 1000 mL (total de 1200 mL)  Células de cultura a 37°C durante 3 a 4 dias a 8% de CO2 a 125 rpm Próxima etapa  As células dos frascos de agitação são usadas para semear os biorreatores DAS GIP para o vetor rAAV, por exemplo, produção de LK03-FVIII

2.1.3 Parâmetros variados durante os estudos de descongelamento e expansão celular Os seguintes parâmetros foram avaliados durante o desenvolvimento do processo de expansão celular e descongelamento celular 293-F: Etapa ou Operação Parâmetro Estudado Faixas Estudadas (se aplicável) Descongelamento Tempo mínimo de Tempo necessário celular descongelamento para ver um cristal de gelo restante no frasco Descongelamento Tempo máximo de 2X e 3X do tempo celular descongelamento mínimo determinado Descongelamento Os frascos de banco de 0 – 2 horas celular células temporais ficam em gelo seco antes do descongelamento Expansão celular Densidade de semeadura 0.1 – 1.1 x 106 vc/mL Expansão celular Limite superior de densidade 4 – 6 x 106 vc/mL celular para cultura em "seed train" Expansão celular Faixa de velocidade do 125 ± 15 rpm agitador (arremesso de 2,5 cm) EXEMPLO 7

2.3 Produção exemplar e não limitante de vetor rAAV (por exemplo, LK03-FVIII) na escala de biorreator de 1,2 L, fluxo de processo e parâmetros variados para escala aumentada da proteína de vetor rAAV

2.3.1. Diagrama do fluxo de processo O seguinte é um diagrama do fluxo de processo representativo para a produção de vetor rAAV de biorreator de 1,2 L (por exemplo, LK03-FVIII): Da expansão 3 dias de sementes Densidade y é 3 - 4 x 106 vc/ml Tendo ~ 1200 mL de células em Dilua cada biorreator até um volume ~ 4x 106 vc/mL = 4,8 x 109 TVC final de trabalho de 1200 mL com meio F17 pré-aquecido a densidade Semeia cada um de 8 x 2L de biorreatores DAS celular é de 1-1,5 x 106 vc/mL GIP em um volume de trabalho de 400 mL com Cultura a 37 ° C, pH 7,2, DO 40%, 150 rpm por 1 dia uma densidade de semeadura de ~ 1200 mL de cultura em cada um dos 8 x ~ 0,4x 106 vc/mL usando cultura F17 pré- biorreatores DAS GIP aquecida a 37 ° C, pH 7,2, DO 40%, 150 rpm por 3 dias ~ 400 mL de cultura em cada um dos 8 x biorreatores DAS G IP 1 dia Para colher e 3 dias processar a jusante O fim da produção ocorre Transfectar cada biorreator por ~ 72 horas após a transfecção adição de 3 plasmídeos / PEI, PEI Cultura a 37° C, pH 7,2, DO 40%, 150 rpm livre e aperfeiçoadores a densidade ~ 1200 mL de cultura em cada um dos 8 x celular é de 2-3 x 106 vc / ml biorreatores DAS GIP Cultura a 37° C, pH 7,2, DO 40%, 150 rpm por 3 dias ~ 1200 ml de cultura em cada um dos 8 x biorreatores DAS GIP

2.3.2 Descrição do fluxo do processo O seguinte é uma descrição do fluxo de processo para a produção de vetor rAAV de biorreator de 1,2L (por exemplo, LK03-FVIII): Etapa ou Operação Descrição Semear biorreatores  Semear cada um dos biorreatores DAS GIP de DAS GIP 8 x 2L com uma densidade de semeadura de 0,4 x 106 (Dia 0) vc/mL usando o meio F17 FreestyleTM pré-aquecido com 1X GlutaMAX™  F-68 PluronicTM adicionado ao meio, final 0,1%  O volume de trabalho é de 400 ml  Células de cultura a 37° C, pH 7,2, DO 40%, 150 rpm por 3 dias Diluir e levar os  Diluir cada biorreator até um volume de biorreatores ao trabalho final de 1200mL usando um meio F17 volume de trabalho FreestyleTM pré-aquecido com 1X GlutaMAX™ total  A densidade celular é de 1-1,5 x 106vc/mL (Dia 3)  Células de cultura a 37° C, pH 7,2, DO 40%, 150 rpm por 1 dia Transfecção  Transfectar cada biorreator adicionando 3 (Dia 4) plasmídeos/PEI, PEI livre e aperfeiçoador(es)  A densidade celular é de 2-3 x 106 vc/mL  Células de cultura a 37° C, pH 7,2, DO 40%, 150 rpm por 3 dias Fim de produção  Cada biorreator é amostrado ~ 72 horas após a (Dia 7) transfecção para produção usando o grau do genoma viral através do ensaio qPCR Próxima etapa  O material de cada biorreator procede à colheita e processamento a jusante

2.3.3 Os parâmetros variaram durante os estudos de desenvolvimento de produção de vetor rAAV (por exemplo, LK03-FVIII) Foram avaliados os seguintes parâmetros durante o desenvolvimento do processo de produção de biorreator de 1,2 L para o vetor rAAV (por exemplo, LK03-FVIII): Etapa ou Parâmetro Estudado Faixas Estudadas (se aplicável) Operação Células de Densidade de semeadura 0,25-0,5 x 106 vc/mL cultura nos Taxa de agitação 130-170 rpm biorreatores pH 6,3-8,0 DAS GIP Volume final de trabalho 400ml, 1200mL Transfecção PH da solução PEI 7,0-8,0 Proporções molares de plasmídeos: 1:1:1, 0,5:1:1, 1:2:2

FVIII: Rep/cap: Auxiliar Ad2 Proporções em peso de plasmídeos: 0,75:0,75:0,75, 1:1:1, 1,5:1,5:1,5 FVIII: Rep/cap: Auxiliar Ad2 Proporção de peso de complexo de 1:1, 1,5:1, 2:1, 2,5:1, 3:1 PEI/DNA Tempo de incubação do complexo de 1-30 minutos PEI/DNA Quantidade total de DNA 0,5–4,2 g/mL Quantidade de PEI livre 0,5-5,6 g/mL Aperfeiçoadores Faixa Momento de adição Kit 1:100 – 24 horas antes da Expifectamine™ 1:800 transfecção - 18 293 horas após a Usados Aperfeiçoador 1 transfecção juntos Kit 1:10 – 24 horas antes da Expifectamine™ 1:80 transfecção - 18 293 horas após a Aperfeiçoador 2 transfecção Tipo Kit ExpiFectamine™ 293 1:200 – 24 horas antes da Aperfeiçoador 1 1:800 transfecção - 18 horas após a transfecção Ácido Valpróico 0,25 – 24 horas antes da 10 mM transfecção - 18 horas após a transfecção Fim de Tempo de colheita 48, 72 horas após a transfecção produção EXEMPLO 8

[0255] Proteínas representativas de capsídeo AAV (VP1).

Capsídeo AAV-SPK VP1 (SEQ ID NO:1) 1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLD 61 KGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ 121 AKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDS 181 ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV 241 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ 301 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA 361 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFED 421 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNW 481 LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSS 541 GVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNS 601 QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADP 661 PTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTE 721 GTYSEPRPIGTRYLTRNL Capsídeo AAV-LK03 VP1 (SEQ ID NO:2)

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGY KYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQ ERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEP DSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMA SGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNN HLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWG FRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQ GCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQ FSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLF SQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNG RDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEI RTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGP IWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFI TQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSE PRPIGTRYLTRPL

Claims (98)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a transfecção de células com pelo menos uma sequência de ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar em contato células com pelo menos um ácido nucleico formulado com uma solução compreendendo polietilenimina (PEI); (b) incubar ou cultivar as células com a solução de ácido nucleico e de polietilenimina (PEI); (c) adicionar um agente de aperfeiçoamento no momento ou imediatamente após a etapa (a) ou até menos de 3 horas após a etapa (a) para produzir uma mistura; e (d) incubar a referida mistura da etapa (c), transfectando assim as células com a sequência de ácido nucleico.

2. Método para produção de células que produzem vetor viral adeno-associado recombinante (rAAV) caracterizado pelo fato de que compreende as etapas: (a) fornecer uma mistura de PEI/plasmídeo de componentes (i), (ii) e (iii): (i) um ou mais plasmídeos compreendendo ácidos nucleicos que codificam proteínas de encapsulamento AAV e/ou ácidos nucleicos que codificam proteínas auxiliares; (ii) um plasmídeo compreendendo um transgene que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse; e (iii) uma solução de polietilenimina (PEI), (b) colocar em contato as células com a mistura de plasmídeo/PEI da etapa (a) para produzir uma cultura de células de plasmídeo/PEI; (c) adicionar um agente de aperfeiçoamento à cultura de células de plasmídeo/PEI para produzir uma segunda mistura; e (d) incubar a referida segunda mistura da etapa (c), produzindo assim células transfectadas que produzem vetor rAAV recombinante.

3. Método para produção de células que produzem vetor viral adeno-associado recombinante (rAAV) caracterizado pelo fato de que compreende as etapas: (a) fornecer uma mistura de PEI/plasmídeo de componentes (i), (ii) e (iii): (i) um ou mais plasmídeos compreendendo ácidos nucleicos que codificam proteínas de encapsulamento AAV e/ou ácidos nucleicos que codificam proteínas auxiliares; (ii) um plasmídeo compreendendo um transgene que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse; e (iii) uma solução de polietilenimina (PEI), (b) colocar em contato as células com a mistura de plasmídeo/PEI da etapa (a) para produzir uma cultura de células de plasmídeo/PEI; (c) adicionar ácido valpróico, um sal ou um derivado do mesmo à cultura de células de plasmídeo/PEI para produzir uma segunda mistura; e (d) incubar a referida segunda mistura da etapa (c), produzindo assim células transfectadas que produzem vetor rAAV recombinante.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa (e) de colher as referidas células transfectadas produzidas na etapa (d) e/ou no meio de cultura a partir das células transfectadas produzidas na etapa (d) para produzir uma colheita de células e/ou meio de cultura.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa (e) de cultivar, expandir, isolar ou selecionar células que foram transfectadas com o ácido nucleico ou plasmídeos.

6. Método, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa (e) de isolar e/ou purificar o vetor AAV recombinante a partir das células transfectadas produzidas na etapa (d) e/ou meio de cultura e/ou a partir das células transfectadas produzidas na etapa (d).

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que inclui ainda a etapa (f) de isolar e/ou purificar o vetor AAV recombinante a partir da colheita de células transfectadas e/ou meio de cultura produzidos na etapa (e).

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a(s) sequência(s) de ácido nucleico compreende(m) um vetor e/ou um plasmídeo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a(s) sequência(s) de ácidos nucleicos compreende(m) um vetor viral e/ou plasmídeo viral.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o vetor viral ou plasmídeo viral compreende um vetor ou plasmídeo lentiviral, ou um vetor ou plasmídeo viral adeno-associado (AAV).

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um transgene que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um fator de coagulação sanguínea de tipo selvagem ou funcional, apoE2, TPP1,

argininosuccinato sintase, ATPase 2 transportadora de cobre, alfa-glucosidase ácida, -Glucocerebrosidase, α-galactosidase ou inibidor C1 inibidor de serina- protease.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o fator de coagulação sanguínea do tipo selvagem ou funcional é o Fator VII, o Fator VIII ou o Fator IX.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4 a 13, caracterizado pelo fato de que o agente de aperfeiçoamento é o ácido valpróico, um sal ou um derivado do mesmo.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4 a 14, caracterizado pelo fato de que o agente de aperfeiçoamento é adicionado antes da etapa (a), no momento da etapa (a) ou imediatamente após a etapa (a) ou até menos de 3 horas após a etapa (a).

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4 a 15, caracterizado pelo fato de que o agente de aperfeiçoamento é adicionado duas ou mais vezes após as etapas (a) ou (b).

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o agente de aperfeiçoamento é primeiramente adicionado no momento ou imediatamente após a etapa (a) ou até menos de 3 horas após a etapa (a) e adicionado novamente 12 a 72 horas após as etapas (a) ou (b), ou adicionado novamente 12 a 48 horas após as etapas (a) ou (b), ou adicionado novamente 12 a 24 horas após as etapas (a) ou (b).

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 17, caracterizado pelo fato de que os referidos plasmídeos (i) e (ii) estão em uma faixa de proporção molar de cerca de 1:0,01 a cerca de 1:100, ou estão em uma faixa de proporção molar de cerca de 100:1 para 1:0,01, e em que a mistura de componentes (i), (ii) e (iii) foi opcionalmente incubada por um período de tempo de cerca de 10 segundos a cerca de 4 horas antes da etapa (b).

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que os referidos ácido nucleico ou plasmídeos estão na proporção de peso PEI:ácido nucleico ou PEI:plasmídeo na faixa de cerca de 0,1:1 a cerca de 5:1, ou em uma proporção de peso PEI:ácido nucleico ou PEI:plasmídeo na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 0,1:1.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que os referidos ácido nucleico ou plasmídeos estão na proporção de peso PEI:ácido nucleico ou PEI plasmídeo na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 5:1, ou em uma proporção de peso PEI:ácido nucleico ou PEI:plasmídeo na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 1:1.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende ainda adicionar PEI Livre às células antes, no momento ou após as etapas (a) ou (b), ou antes ou no momento da ou após a etapa (c).

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende ainda adicionar PEI Livre às células no momento ou após as etapas (a) ou (b), ou no momento ou após a etapa (c).

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a referida PEI Livre é adicionada de modo que a proporção de peso PEI:ácido nucleico ou PEI:plasmídeo esteja na faixa de cerca de 0,1:1 a cerca de 5:1, ou esteja na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 0,1:1.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a referida PEI Livre é adicionada de modo que a proporção de peso PEI:ácido nucleico ou PEI:plasmídeo esteja na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 5:1, ou na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 1:1.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a PEI na PEI:ácido nucleico e/ou PEI:plasmídeo e/ou PEI Livre compreende polietilenimina linear.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a PEI na PEI:ácido nucleico e/ou PEI:plasmídeo e/ou PEI Livre compreende uma polietilenimina linear hidrolisada.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a PEI na PEI:ácido nucleico e/ou PEI:plasmídeo e/ou PEI Livre compreende uma polietilenimina linear hidrolisada com um peso molecular na faixa de cerca de 4.000 a cerca de 160.000 e/ou na faixa de cerca de 2.500 a cerca de 250.000 pesos moleculares na forma de base livre.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a PEI no PEI:ácido nucleico e/ou PEI:plasmídeo e/ou PEI Livre compreende uma polietilenimina linear hidrolisada com um peso molecular de cerca de 40.000 e/ou cerca de

25.000 pesos moleculares na forma de base livre.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que a proporção molar de nitrogênio (N) na PEI Total para fosfato (P) em ácido nucleico:PEI e/ou plasmídeo:PEI está na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 50:1 (N:P).

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que a proporção molar de nitrogênio (N) na PEI Total para fosfato (P) em ácido nucleico:PEI e/ou plasmídeo:PEI está na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 10:1.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que a proporção molar de nitrogênio (N) na PEI Total para fosfato (P) em ácido nucleico:PEI e/ou plasmídeo:PEI é qualquer um de cerca de 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, ou 10:1 (N:P).

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 31, caracterizado pelo fato de que a quantidade de PEI Livre é de cerca de 10% a cerca de 90% do PEI Total.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 31, caracterizado pelo fato de que a quantidade de PEI Livre é de cerca de 25% a cerca de 75% do PEI Total.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 31, caracterizado pelo fato de que a quantidade de PEI Livre é de cerca de 50% do PEI Total.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 34, caracterizado pelo fato de que a quantidade de PEI Livre é de cerca de 0,1 g/mL a cerca de 10 g/mL.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 33, caracterizado pelo fato de que a quantidade de PEI Livre é de cerca de 1,0 g/mL a cerca de 5 g/mL.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que a solução de PEI e/ou a PEI Livre compreendem uma solução contendo um pH de cerca de 7,0 a cerca de 8,0.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 36, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico e PEI foram incubadas de cerca de 10 segundos a cerca de 4 horas entre si antes da etapa (a).

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 4 a 37, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico e PEI foram incubadas de cerca de 30 segundos a cerca de 4 horas entre si antes da etapa (a).

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 4 a 37, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico e PEI foram incubadas de cerca de 1 minuto a cerca de 4 horas entre si antes da etapa (a).

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 40, caracterizado pelo fato de que a mistura dos componentes (i), (ii) e (iii) é incubada em conjunto por cerca de 10 segundos a cerca de 4 horas antes da etapa (b).

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 40, caracterizado pelo fato de que a mistura dos componentes (i), (ii) e (iii) é incubada em conjunto por cerca de 30 segundos a cerca de 4 horas antes da etapa (b).

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 40, caracterizado pelo fato de que a mistura dos componentes (i), (ii) e (iii) é incubada em conjunto por cerca de 1 minuto a cerca de 4 horas antes da etapa (b).

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 43, caracterizado pelo fato de que a incubação da etapa (d) é de, pelo menos, cerca de 4 horas.

45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 43, caracterizado pelo fato de que a incubação da etapa (d) é de cerca de 4 horas a cerca de 140 horas.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que a incubação da etapa (d) é de cerca de 4 horas a cerca de 96 horas.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 46, caracterizado pelo fato de que as células compreendem células de mamíferos.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado pelo fato de que as células são células de um rim embrionário humano (HEK) ou de ovário de hamster chinês (CHO).

49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado pelo fato de que as células compreendem células 293 de rim embrionário humano (HEK).

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de que as referidas células são células HEK 293E, HEK 293F ou HEK 293T.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que as células são transfectadas de maneira estável ou transitória.

52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 51, caracterizado pelo fato de que as células estão em cultura de suspensão.

53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 51, caracterizado pelo fato de que as células são aderentes.

54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizado pelo fato de que as referidas células são cultivadas ou mantidas num meio de cultura isento de soro.

55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 54, caracterizado pelo fato de que as referidas células têm uma densidade na faixa de cerca de 1×105 células/mL a cerca de 1×108 células/mL quando colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou com a referida mistura plasmídeo/PEI e/ou quando colocadas em contato com a referida PEI Livre.

56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 54, caracterizado pelo fato de que as referidas células têm uma densidade na faixa de cerca de 5×105 células/mL a cerca de 1×107 células/mL quando colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou com a referida mistura plasmídeo/PEI e/ou quando colocadas em contato com a referida PEI Livre.

57. Método, de qualquer uma das reivindicações 1 a 54,

caracterizado pelo fato de que as referidas células têm uma densidade na faixa de cerca de 1×106 células/mL a cerca de 5×106 células/mL quando colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou com a referida mistura plasmídeo/PEI e/ou quando colocadas em contato com a referida PEI Livre.

58. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 57, caracterizado pelo fato de que a viabilidade das referidas células quando colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou com a mistura plasmídeo/PEI ou com a referida PEI Livre é de cerca de 60% ou superior a 60%, ou em que as referidas células estão em crescimento de fase logarítmica quando colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou mistura plasmídeo/PEI.

59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 57, caracterizado pelo fato de que a viabilidade das referidas células quando colocadas em contato com a referida sequência de ácidos nucleicos ou com a mistura de plasmídeo/PEI ou com a referida PEI Livre é de cerca de 90% ou superior a 90%, ou em que as referidas células estão em crescimento de fase logarítmica, quando colocadas em contato com a sequência de ácidos nucleicos ou a mistura plasmídeo/PEI ou com a referida PEI Livre.

60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizado pelo fato de que a quantidade total da sequência de ácido nucleico ou plasmídeos está na faixa a cerca de 0,1 µg a cerca de 15 µg por mL de células.

61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 59, caracterizado pelo fato de que a proporção molar do plasmídeo que compreende o transgene para um ou mais plasmídeos compreendendo ácidos nucleicos que codificam proteínas de encapsulamento AAV e/ou ácidos nucleicos que codificam proteínas auxiliares é de cerca de 1:5 a 1:1, ou é de cerca de 1:1 a cerca de 5:1.

62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 61, caracterizado pelo fato de que o referido um ou mais plasmídeos compreendem um primeiro plasmídeo compreendendo os ácidos nucléicos que codificam proteínas de encapsulamento AAV, e um segundo plasmídeo compreendendo os ácidos nucleicos que codificam proteínas auxiliares.

63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a proporção molar do plasmídeo compreendendo o transgene para o primeiro plasmídeo compreendendo os ácidos nucleicos que codificam proteínas de encapsulamento AAV para o segundo plasmídeo compreendendo os ácidos nucleicos que codificam proteínas auxiliares está na faixa de cerca de 1-5:1:1 ou 1:1-5:1 ou 1:1:1-5.

64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 63, caracterizado pelo fato de que as proteínas de encapsulamento AAV codificadas compreendem rep de AAV e/ou cap de AAV.

65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 64, caracterizado pelo fato de que as proteínas de encapsulamento AAV codificadas compreendem proteínas rep e/ou cap de AAV de qualquer sorotipo de AAV.

66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 66, caracterizado pelo fato de que as proteínas auxiliares codificadas compreendem o adenovírus E2 e/ou E4, proteínas VARNA e/ou proteínas auxiliares não AAV.

67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 65, caracterizado pelo fato de que o vetor AAV recombinante compreende qualquer um dos sorotipos AAV 1-12, uma proteína capsídea AAV VP1, VP2 e/ou VP3 ou uma proteína capsídea AAV VP1, VP2 e/ou VP3 modificada ou variante ou proteína capsídea AAV VP1, VP2 e/ou VP3 do tipo selvagem.

68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 67, caracterizado pelo fato de que o vetor viral adeno- associado (AAV) compreende uma sequência de proteína capsídea VP1, VP2 e/ou VP3 ou sequência de repetição terminal invertida com 70% ou mais de identidade de sequência com uma sequência de proteína capsídea ou com uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) de qualquer sequência de proteína capsídea ou ITR selecionada dentre os sorotipos AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 e AAV10.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 67, caracterizado pelo fato de que o vetor viral adeno- associado (AAV) compreende uma sequência de proteína capsídea VP1, VP2 e/ou VP3 com 70% ou mais de identidade de sequência com uma sequência de proteína capsídea selecionada a partir de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2.

70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 69, caracterizado pelo fato de que o vetor AAV compreende um sorotipo AAV ou um pseudotipo AAV, em que o referido pseudotipo AAV compreende um sorotipo capsídeo AAV diferente do sorotipo ITR.

71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 70, caracterizado pelo fato de que o vetor AAV compreende uma proteína capsídea VP1, VP2 e/ou VP3 ou repetição terminal invertida de qualquer sorotipo selecionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2.

72. Método, de qualquer uma das reivindicações 2 a 71, caracterizado pelo fato de que o vetor AAV compreende ainda um íntron, um elemento de controle de expressão, uma ou mais repetições terminais invertidas (ITRs) do vírus adeno-associado (AAV) e/ou uma sequência polinucleotídica de preenchimento.

73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o íntron está dentro ou flanqueia o ácido nucleico que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse, ou em que o elemento de controle de expressão está operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse, ou em que o(s) ITR(s) AAV flanqueia(m) o terminal 5' ou 3' do ácido nucleico que codifica uma proteína ou é transcrito em uma transcrição de interesse, ou em que a sequência polinucleotídica de preenchimento flanqueia o terminal 5' ou 3' do ácido nucleico que codifica uma proteína ou é transcrita em uma transcrição de interesse.

74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 73, caracterizado pelo fato de que o elemento de controle de expressão compreende um elemento de controle regulável ou constitutivo, ou um elemento ou promotor de controle de expressão específico dos tecidos.

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 73, caracterizado pelo fato de que o elemento de controle de expressão compreende um elemento que confere uma expressão no fígado.

76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 68, 70, 72 ou 73, caracterizado pelo fato de que a ITR compreende uma ou mais ITRs de qualquer um dos: Sorotipos AAV2 ou AAV6, ou uma combinação destes.

77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 76, caracterizado pelo fato de que as células são subculturadas a uma densidade celular reduzida antes de entrar em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou mistura plasmídeo/PEI.

78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 77, caracterizado pelo fato de que as células são subculturadas a uma densidade celular na faixa de cerca de 0,1×106 células/mL a cerca de 5,0×106 células/mL antes do contato com a referida sequência de ácido nucleico ou mistura plasmídeo/PEI.

79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 78, caracterizado pelo fato de que as células são colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou mistura plasmídeo/PEI entre um período de 2 dias a 5 dias após a subcultura.

80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 78, caracterizado pelo fato de que as células são colocadas em contato com a referida sequência de ácido nucleico ou mistura plasmídeo/PEI entre um período de 3 dias a 4 dias após a subcultura.

81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80, caracterizado pelo fato de que a quantidade da sequência de ácido nucleico ou plasmídeos introduzidos nas referidas células transfectadas é pelo menos 50% maior com a etapa de adição da PEI Livre para a cultura celular em comparação com a falta de adição da PEI Livre para a cultura celular.

82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80, caracterizado pelo fato de que a quantidade da sequência de ácidos nucleicos ou plasmídeos introduzida nas referidas células transfectadas é pelo menos 50% maior com a etapa de adição do agente de aperfeiçoamento, ácido valpróico, sal ou derivado do mesmo, comparado com a falta de adição desse agente de aperfeiçoamento, ácido valpróico, sal ou derivado do mesmo.

83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 82, caracterizado pelo fato de que a quantidade de vetor AAV recombinante produzida é pelo menos 50% ou mais com a etapa de adição da PEI Livre à cultura de células plasmídeas/PEI, em comparação com a falta de adição de PEI Livre à cultura de células plasmídeas/PEI.

84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 82, caracterizado pelo fato de que a quantidade de vetor AAV recombinante produzido é 1-5, 5-8, 8-10 ou 10-20 vezes maior com a etapa de adição da PEI Livre à cultura de células plasmídeas/PEI em comparação com a falta de adição da PEI Livre à cultura de células plasmídeas/PEI.

85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 84, caracterizado pelo fato de que a quantidade de vetor AAV recombinante produzida é 1-5, 5-8, 8-10 ou 10-15 vezes maior com a etapa de adição do agente de aperfeiçoamento, ácido valpróico, sal ou derivado do mesmo em comparação com a falta de adição do agente de aperfeiçoamento, ácido valpróico, sal ou derivado do mesmo à cultura de células plasmídicas/PEI.

86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 85, caracterizado pelo fato de que as células estão em um volume de cultura de cerca de 10-500 mL, 500 mL-2 Litros, 2-20 Litros, 20-50 Litros, 50-100 Litros, 100-500 Litros, 500-1.000 Litros, ou 1.000-2.000 Litros.

87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 86, caracterizado pelo fato de que o transgene possui um tamanho de cerca de 4.0 Kb a cerca de 6.0 Kb.

88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 86, caracterizado pelo fato de que o transgene possui um tamanho de cerca de 4.5 Kb a cerca de 6.0 Kb.

89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 86, caracterizado pelo fato de que o transgene possui um tamanho de cerca de 4.5 Kb a cerca de 5.5 Kb.

90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 86, caracterizado pelo fato de que o transgene possui um tamanho de cerca de 4.5 Kb a cerca de 5.0 Kb.

91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 4 a 90, caracterizado pelo fato de que o agente de aperfeiçoamento compreende ou é constituído por ácido valpróico, um sal ou um derivado do mesmo; ácido isobutírico, um sal ou um derivado do mesmo; ou ácido isovalérico, um sal ou um derivado do mesmo.

92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o sal do ácido valpróico, sal do ácido isobutírico ou sal do ácido isovalérico compreende um sal de sódio ou de potássio.

93. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o derivado do ácido valpróico, o derivado do ácido isobutírico ou o derivado do ácido isovalérico compreende um aminoácido ligado ou conjugado a este.

94. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 93, caracterizado pelo fato de que após a etapa (c) o agente de aperfeiçoamento, ácido valpróico, sal ou derivado do mesmo se encontram a uma concentração de cerca de 0,1 mM a cerca de 25 mM.

95. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 93, caracterizado pelo fato de que após a etapa (c) o agente de aperfeiçoamento, o ácido valpróico, o sal ou derivado do mesmo se encontram numa concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 10 mM.

96. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 93, caracterizado pelo fato de que após a etapa (c) o agente de aperfeiçoamento, o ácido valpróico, o sal ou derivado do mesmo se encontram numa concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 5 mM.

97. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 93, caracterizado pelo fato de que após a etapa (c) o agente de aperfeiçoamento, o ácido valpróico, sal ou derivado do mesmo estão em uma concentração de cerca de 1 mM até cerca de 10 mM, de cerca de 1 mM para cerca de 9 mM, de cerca de 1 mM para cerca de 8 mM, a partir de cerca de 1 mM para cerca de 7 mM, a partir de cerca de 1 mM para cerca de 6 mM, de cerca de 1 mM para cerca de 5 mM, a partir de cerca de 1 mM para cerca de 4 mM, de cerca de 1 mM de cerca de 3 mM, ou de cerca de 1 mM para cerca de 2 mM.

98. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 97, caracterizado pelo fato de que qualquer uma das etapas (a) a (f) ou condições estabelecidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 97 são realizadas conforme estabelecido em qualquer um dos Exemplos 1 a 7.