CN114657153A - rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备方法。rAAV重组包装质粒包含pAAV‑RC质粒，以及插入所述pAAV‑RC质粒的P5启动子、真核启动子和mir342基因；P5启动子位于pAAV‑RC质粒rep基因上游，用于调控rep基因的表达；真核启动子位于mir342基因的上游，用于调控mir342基因的表达。本发明通过在pAAV‑RC质粒中插入mir342基因及调控其表达的真核启动子，并同时在其所含rep基因的上游引入P5启动子用于调控rep基因表达，从而构建得到一种rAAV重组包装质粒，采用包含该rAAV重组包装质粒的三质粒产品包装病毒，能够有效提升病毒滴度，提高产生效率，降低生产成本。

Description

rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备方法。

背景技术

腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（parvoviridae）家族的成员之一，是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒，其直径约20-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。

研究中采用的重组腺相关病毒载体（recombination adeno-associated virus,rAAV）是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广（对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力）、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途、哺乳动物最安全的基因研究和基因治疗载体之一。

传统的rAAV制备主要采用三质粒包装病毒法，即采用三质粒共转染包装细胞进行rAAV制备，三质粒包括：含目的基因的pAAV-GOI质粒，提供rep基因、cap基因的pAAV-RC质粒，以及提供E2、E4、VA蛋白基因的pAAV-Ad质粒（也即腺病毒辅助质粒）。传统的三质粒包装病毒法例如CN112888426A公开的病毒包装方法，该包装方法涉及用于重组腺相关病毒载体rAAV产生的质粒系统，其包括：（i）含转基因质粒，其包括由5 ‘和3 ‘AAV反向末端重复序列ITR侧接的至少一种异源核酸和在所述ITR外部的填充序列；（ii）质粒，其包括AAV复制(Rep)和衣壳(Cap)基因序列；和（iii）腺病毒(Ad)辅助质粒。传统的三质粒包装病毒法再例如于水澜、姜颖等发表的“携带人肝癌细胞CDK2基因的rAAV载体的构建与鉴定”提到的：设计能表达CDK2特异性的小干扰RNA（siRNA），构建pAKD-shRNA-CDK2重组质粒，采用磷酸钙共转染法将pAKD-shRNA-CDK2重组质粒、包装质粒pAVV-RC和辅助质粒pHelper共转染AVV-293细胞。然而，采用传统的三质粒包装病毒法，所得病毒滴度较低。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种rAAV重组包装质粒，用其以及含两个末端反向重复序列的质粒和腺病毒辅助质粒包装生产rAAV，能有效提高病毒滴度。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种rAAV重组包装质粒，所述rAAV重组包装质粒包含pAAV-RC质粒，以及插入所述pAAV-RC质粒的P5启动子、真核启动子和mir342基因；

所述P5启动子位于所述pAAV-RC质粒所含rep基因的上游，用于调控rep基因的表达；

所述真核启动子位于所述mir342基因的上游，用于调控所述mir342基因的表达。

在其中一些实施例中，所述P5启动子位于所述pAAV-RC质粒第1个碱基至第481个碱基之间或者第7004个碱基至第7350个碱基之间。

在其中一些实施例中，所述真核启动子为CMV、EF1a、CAG或者SV40。

一种rAAV重组包装质粒的构建方法，所述构建方法包括在pAAV-RC质粒中插入所述P5启动子、所述真核启动子和所述mir342基因的步骤。

在其中一些实施例中，在所述pAAV-RC质粒中插入所述P5启动子、所述真核启动子和所述mir342基因的步骤包括：

用HpaI酶和EagI酶酶切所述pAAV-RC质粒，制备酶切产物Ⅰ；

在所述P5启动子的两端添加HpaI酶和EagI酶的酶切位点片段，用HpaI酶和EagI酶进行双酶切，制备酶切产物Ⅱ；

用连接酶连接所述酶切产物Ⅰ和所述酶切产物Ⅱ，制备重组质粒pAAV-P5-RC；

用XmaI酶和SnaBI酶双酶切所述pAAV-P5-RC，制备酶切产物Ⅲ；

提供包含所述真核启动子和所述mir342基因的连接片段，在所述连接片段的两端添加XmaI酶和SnaBI酶的酶切位点片段，用XmaI酶和SnaBI酶进行双酶切，制备酶切产物Ⅳ；

用连接酶连接所述酶切产物Ⅲ和所述酶切产物Ⅳ，制备所述rAAV重组包装质粒。

在其中一些实施例中，所述HpaI酶的酶切位点片段添加在所述P5启动子的5’端，所述EagI酶的酶切位点片段添加在所述P5启动子的3’端。

在其中一些实施例中，所述XmaI酶的酶切位点片段添加在所述连接片段的3’端，所述SnaBI酶的酶切位点片段添加在所述连接片段的5’端。

在其中一些实施例中，所述连接酶为T4连接酶。

一种用于rAAV包装的质粒产品，所述质粒产品包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和如上所述的rAAV重组包装质粒。

在其中一些实施例中，所述含两个末端反向重复序列的质粒为pAAV-MCS质粒。

在其中一些实施例中，所述含两个末端反向重复序列的质粒还包含GOI。

一种重组细胞，转染有所述的rAAV重组包装质粒，或者转染有所述的质粒产品。

一种rAAV的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：用如上所述的质粒产品转染包装细胞，培养，收集rAAV。

在其中一些实施例中，所述包装细胞选自HEK293、HEK293T和HEK293F、HEK293A、Hela、Vero和CHO中的一种或者多种。

在其中一些实施例中，培养的条件包括：CO₂含量为4.5%-5.5%（v/v）的气体环境，温度为36.5℃-37.5℃，时间为48小时-96小时。

与传统技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明通过在pAAV-RC质粒中插入mir342基因及调控其表达的真核启动子，并同时在其所含rep基因的上游的引入P5启动子用以调控rep基因表达，从而构建得到一种rAAV重组包装质粒，采用包含该rAAV重组包装质粒的三质粒产品包装病毒，能够有效提升病毒滴度，提高产生效率，降低生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中构建的pAAV-P5-RC质粒的鉴定结果图；

图2为本发明一个实施例中构建的pAAV-P5-RC质粒的酶切图谱；

图3为本发明一个实施例中构建的pAAV-P5-RC-mir342质粒的鉴定结果图；

图4为本发明一个实施例中构建的pAAV-P5-RC-mir342质粒的酶切图谱；

图5为本发明一个实施例中构建的pAAV-P5-RC-mir342质粒的图谱；

图6为本发明一个实施例中不同血清型rAAV病毒质粒改造后滴度对比；

图7为2型AAV滴度检测图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。

本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。

本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。

本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1~10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

GOI：geneof interesting感兴趣的基因，即目的基因。

pAAV-RC质粒中的RC，分别代表质粒结构中含有AAV病毒的rep和cap基因序列，此序列包括但不限于野生型AAV的rep和cap蛋白基因以及经过人工改造的可以用于包装AAV病毒的rep和cap基因。上述质粒中的含有cap基因的质粒，可以对cap基因进行修改，包装出不同血清型的rAAV病毒，血清型包括但不限于1型、2型、3型、4型、5型、6.2型、7型、9型、rh10型等。Rep基因编码Rep蛋白、cap基因编码Cap蛋白，Rep蛋白用于指导病毒复制等功能，Cap蛋白主要构成AAV的衣壳。

mir342是一种miRNA序列，miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。miRNA由RNA聚合酶II转录，作为加帽和多腺苷酸化初级转录本(pri-miRNA) 的一部分，可以是蛋白质编码或非编码。初级转录物被核糖核酸酶 III 酶切割产生大约70 nt的茎环前体miRNA（pre-miRNA），它被细胞质的核糖核酸酶进一步切割以产生成熟的miRNA和反义miRNA 星（miRNA*）产品。成熟的miRNA被整合到RNA诱导的沉默复合物 (RISC) 中，它通过与miRNA的不完美碱基配对识别目标mRNA，最常见的是导致目标mRNA的翻译抑制或不稳定。Mir342在肿瘤细胞中，会对一些基因表达有调节作用，进而影响细胞整体状态。Mir342可以同一个真核启动子插入质粒中不影响P5、cap基因、rep基因的任意位置。上述所说的真核启动子，可以是任意一种真核细胞启动子，包括但是不限于：CMV、SV40、CAG等，只要能表达调控mir342即可。以pAAV-P5-RC质粒为骨架为例，mir-342可插入Cap蛋白基因序列后。利用质粒本身存在的酶切位点，能使操作相对简单。可以使用XmaI和SnaBI酶切位点，通过酶切将质粒开环，将较长的部分与含XmaI和SnaBI酶切位点的连接上CMV启动子的mir342基因序列用T4连接酶进行连接。连接回收质粒即为构建的pAAV-P5-RC-mir342质粒。上述所示的CMV和mir342插入质粒的位点，以pAAV-P5-RC为例，可以插入的位置包括但是不限于1bp-481bp，3967bp-5853bp，7004bp-7350bp，只要是能表达mir342又不影响治理本身其它元件功能即可。

P5启动子是AAV本身的启动子之一，其涉及病毒复制等一系列重要功能的Rep蛋白，皆由此启动子开始引发翻译。P5启动子主要调控rep基因，因而需要插入在Rep蛋白前端，以pAAV-RC质粒为例，P5启动子可插入位置可以在1bp-481bp之间或者7004bp-7350bp之间。

作为本发明的第一方面

本发明提供一种rAAV重组包装质粒，所述rAAV重组包装质粒包含pAAV-RC质粒，以及插入所述pAAV-RC质粒的P5启动子、真核启动子和mir342基因；

所述P5启动子位于所述pAAV-RC质粒所含rep基因的上游，调控rep基因的表达；

所述真核启动子位于所述mir342基因的上游，调控所述mir342基因的表达。

在其中一个示例中，所述P5启动子位于所述pAAV-RC质粒第1个碱基至第481个碱基之间或者第7004个碱基至第7350个碱基之间。

在其中一个示例中，所述真核启动子为CMV、EF1a、CAG或者SV40。

作为本发明的第二方面

本发明提供一种rAAV重组包装质粒的构建方法，所述构建方法包括在pAAV-RC质粒中插入所述P5启动子、所述真核启动子和mir342基因的步骤。

本发明提供的构建方法中，P5启动子和mir342基因的插入没有先后顺序之分，即，可以先插入mir342基因再插入P5启动子，也可以先插入P5启动子再插入mir342基因。

与传统技术相比，本发明具备如下有益效果：本发明通过在pAAV-RC质粒中插入mir342基因及调控其的真核启动子，并同时在其所含rep基因的上游的引入P5启动子调控rep基因的表达，从而构建得到一种rAAV重组包装质粒，采用包含该rAAV重组包装质粒的三质粒产品包装病毒，能够有效提升病毒滴度，提高产生效率，降低生产成本。

在其中一个示例中，在所述pAAV-RC质粒中插入所述P5启动子、所述真核启动子和所述mir342基因的步骤包括：

用HpaI酶和EagI酶双酶切所述pAAV-RC质粒，制备酶切产物Ⅰ；

在所述P5启动子的两端添加HpaI酶和EagI酶的酶切位点片段，用HpaI酶和EagI酶进行双酶切，制备酶切产物Ⅱ；

用连接酶连接所述酶切产物Ⅰ和所述酶切产物Ⅱ，制备重组质粒pAAV-P5-RC；

用XmaI酶和SnaBI酶双酶切所述pAAV-P5-RC，制备酶切产物Ⅲ；

提供包含所述真核启动子和所述mir342基因的连接片段，在所述连接片段的两端添加XmaI酶和SnaBI酶的酶切位点片段，用XmaI酶和SnaBI酶进行双酶切，制备酶切产物Ⅳ；

用连接酶连接所述酶切产物Ⅲ和所述酶切产物Ⅳ，制备所述rAAV重组包装质粒。

在其中一个示例中，所述HpaI酶的酶切位点片段添加在所述P5启动子的5’端，所述EagI酶的酶切位点片段添加在所述P5启动子的3’端。

在其中一个示例中，所述XmaI酶的酶切位点片段添加在所述连接片段的3’端，所述SnaBI酶的酶切位点片段添加在所述连接片段的的5’端。

在其中一个示例中，所述连接酶为T4连接酶。

本发明的第一方面和第二方面中：P5启动子的碱基序列如SEQ ID No.1所示；mir342基因的碱基序列如SEQ ID No.2所示；在所述P5启动子的序列两端添加HpaI酶和EagI酶的酶切位点片段，对应形成碱基序列如SEQ ID No.3所示的片段；所述真核启动子和所述mir342基因的连接片段的碱基序列如SEQ ID No.4所示；在所述连接片段的两端添加XmaI酶和SnaBI酶的酶切位点片段，对应形成碱基序列如SEQ ID No.5的片段。

作为本发明的第三方面

本发明提供一种用于rAAV包装的质粒产品，所述质粒产品包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和如上所述的rAAV重组包装质粒。

本发明提供的质粒产品中，腺病毒辅助质粒（即pAAV-Ad质粒）中含有腺病毒的E2a基因序列、E4基因序列以及VA基因序列。

在其中一个示例中，所述含两个末端反向重复序列（ITR）的质粒为pAAV-MCS质粒。pAAV-MCS质粒中含有AAV的ITR序列。

在其中一个示例中，所述含两个末端反向重复序列的质粒还包含GOI。

作为本发明的第四方面

本发明提供一种重组细胞，转染有所述的rAAV重组包装质粒，或者转染有所述的质粒产品。

作为本发明的第五方面

本发明提供一种rAAV的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：用如上所述的质粒产品转染包装细胞，培养，收集rAAV。

本发明所述的包装细胞是能够以直接或者间接方式提供腺病毒E1a和E1b蛋白的细胞。例如可以为HEK293、HEK293T和HEK293F、HEK293A、Hela、Vero、CHO中的一种或者多种或根据此细胞系进行的改种。

在其中一个示例中，培养的条件包括：CO₂含量为4.5%-5.5%（v/v）的气体环境，温度为36.5℃-37.5℃，时间为48小时-96小时。CO₂含量例如为4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%、5.0%、5.1%、5.2%、5.3%、5.4%、5.5%。温度可以为36.5℃、37℃、37.5℃。时间可以为48小时、50小时、52小时、54小时、56小时、58小时、60小时、65小时、70小时、75小时、80小时、85小时、90小时、96小时。

本发明提供的rAAV的制备方法，包装AAV病毒的过程中，将3个质粒转染到细胞后，即开始蛋白翻译和病毒包装，这将会利用包装细胞内部的各种元件。正常情况下，此时细胞还在进行增殖，这与病毒包装正好相抵触，自然影响病毒包装。事实上，在病毒包装的工艺中，病毒包装工艺开始后，细胞增殖水平与最终滴度往往成反比。例如包装细胞293是一种肾癌上皮细胞，mir342在293细胞中，会对一些细胞通路的蛋白如MYC进行负调节作用，进而影响细胞增殖，从而减少细胞增殖对病毒包装的影响，提高病毒滴度。其中，MYC：c-myc基因是myc基因家族的重要成员之一，c-myc基因既是一种可易位基因，又是一种多种物质调节的可调节基因，也是一种可使细胞无限增殖，获永生化功能，促进细胞分裂的基因，myc基因参与细胞凋零，c-myc基因与多种肿瘤发生发展有关。

本发明提供的制备方法中，转染所用的转染试剂，不限于使用Lipo3000，使用市场上常见的转染试剂及其对应的包装方法都可以，比如mirus公司的trans系列，polyplus公司的PEIpro系列，Thermo公司的Lipo系列等。

实施例1：P5启动子基因序列和mir342基因序列

P5启动子序列来自ATCC，具有如下SEQ ID No.1所示的基因序列：

agtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttg

mir342序列来自ATCC，具有如下SEQ ID No.2所示的基因序列：

gaaactgggctcaaggtgaggggtgctatctgtgattgagggacatggttaatggaattgtctcacacagaaatcgcacccgtcaccttggcctactta

P5启动子序列和mir342序列，全部由生工生物进行化学合成得到。

实施例2：pAAV-P5-RC质粒的构建

本实施例涉及的基本原理及操作步骤可以参考《分子克隆实验指南》（MolecularCloning/A laboratory manaul）记载的分子生物学通用方法所述进行。pAAV-P5-RC质粒由pAAV-RC质粒和P5序列通过分子生物学实验构建而成。

其中，pAAV-RC质粒可购自Addgene，P5启动子的基因序列通过化学合成，并在序列两端添加内切酶HpaI酶的酶切位点序列（5’-GTTAAC-3’）和EagI酶的酶切切位点序列（5’-CGGCCG-3’），对应核苷酸序列如下SEQ ID No.3所示：

gttaacagtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgcggccg

其中，下划线标识部分为添加的酶切位点序列。

将pAAV-RC质粒和P5启动子基因序列用HpaI酶和EagI酶内切酶进行酶切，酶切体系及反应条件详细如下：

酶切的体系为：pAAV-RC质粒或者P5启动子基因序列4μL、HpaI酶和EagI酶各1μL、10×缓冲液2μL、双蒸水12μL，酶切条件为37℃水浴4小时。

将双酶切后的产物用T4连接酶（购自Invitrogen）进行连接反应，反应体系为：加入酶切后的pAAV-RC质粒载体10μL、加入酶切后的P5启动子基因序列1μL、T4连接酶1μL、10×缓冲液2.5μL、双蒸水10.5μL，连接条件为16℃过夜。pAAV-P5-RC即构建成功，具体鉴定结果请参见图1和图2。

实施例3：pAAV-P5-RC-mir342质粒的构建

本实施例涉及的基本原理及操作步骤可以参考《分子克隆实验指南》（MolecularCloning/A laboratory manaul）记载的分子生物学通用方法所述进行。

pAAV-P5-RC-mir342质粒由pAAV-P5-RC质粒和CMV启动子序列和mir342序列通过分子生物学实验构建而成。

其中，pAAV-P5-RC质粒在实施例1构建完成，CMV和mir342基因序列（SEQ ID No.4）通过化学合成，并在序列两端添加内切酶XmaI酶的酶切位点序列（5’-CCCGGG-3’）和SnaBI酶的酶切位点序列（5’-TACGTA-3’），对应序列如下SEQ ID No.5所示。

SEQ ID No.4：

gtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccggatcctgccattgcatccttctctgcagactaagatggagttcctgaaccaagaccgcttgctggccaacctgtgaaactgggctcaaggtgaggggtgctatctgtgattgagggacatggttaatggaattgtctcacacagaaatcgcacccgtcaccttggcctactta

SEQ ID No.5：

tacgtagtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccggatcctgccattgcatccttctctgcagactaagatggagttcctgaaccaagaccgcttgctggccaacctgtgaaactgggctcaaggtgaggggtgctatctgtgattgagggacatggttaatggaattgtctcacacagaaatcgcacccgtcaccttggcctacttacccggg

其中，下划线标识部分为添加的酶切位点。

将pAAV-P5-RC质粒和（CMV与mir342基因序列，即SEQ ID No.5）分别用XmaI和SnaBI酶内切酶进行酶切，酶切体系及反应条件详见如下：

酶切的体系为：pAAV-P5-RC/CMV+mir342序列4μL、XmaI酶和SnaBI酶各1μL、10×缓冲液2μL、双蒸水12μL，酶切条件为37℃水浴4小时。

将双酶切后的产物用T4连接酶（购自Invitrogen）进行连接反应，反应体系为：加入酶切后的pAAV-P5-RC载体10μL、加入酶切后的CMV+mir342基因1μL、T4连接酶1μL、10×缓冲液2.5μL、双蒸水10.5μL，连接条件为16℃过夜。pAAV-P5-RC-mir342即构建成功，具体鉴定结果请参见图3和图4，图谱见图5。

实施例4：三质粒包装AAV病毒

以pAAV-MCS质粒（购自Addgene）、pAAV-P5-RC-mir342质粒（本发明实施例3构建）、pAAV-Ad质粒（购自Addgene）为例。

以HEK293细胞作为包装细胞，用含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基进行细胞培养。

细胞生成融合度到80%-85%时，用Lipo3000转染法将上述三个质粒pAAV-MCS、pAAV-P5-RC-mir342、pAAV-Ad共转染HEK293细胞（购自ATCC），三质粒用量分别为5μg、5μg、5μg，转染试剂Lipo3000的加入量为20μL，将两种溶液混合到DMEM中，补足总体积为1mL，静置15分钟；即开始转染。

向10cm培养皿加入静置后的转染混合液1mL，放入二氧化碳培养箱中培养，其中条件为5%CO₂、37℃，培养24小时后，更换新鲜的培养基，继续培养48小时后收集细胞。

将细胞放入-80℃冰箱反复冻融三次，然后加入Dnase I和Rnase A，终浓度为0.1mg/mL，37℃水浴30分钟，3000g离心30分钟，收集上清到50mL离心管中，再用0.45μm的过滤器进行过滤，重新收集上清，获得病毒粗提液。

参照文献（Hum Gene Ther.2001 Jan 1,12(1):71-6），进行纯化。层析柱加入2ml肝素-琼脂糖后，用50mL的1XPBS平衡，将病毒粗提液过柱，用25m℃的0.15M的NaCl溶液洗涤柱子2次，再用15mL的0.4M的NaCl溶液洗脱病毒，将病毒液用浓缩柱进行浓缩后置与-80℃下备用。

对所获得的病毒液进行滴度测定，对比滴度不同。

参照上述步骤依次构建血清型为1型、2型、3型、4型、5型、6.2型、7型、9型、rh10型的rAVV。

不同血清型的区别在于cap基因不同：

1型cap序列（SEQ ID No.6）：

atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgcgagtggtgggacttgaaacctggagccccgaagcccaaagccaaccagcaaaagcaggacgacggccggggtctggtgcttcctggctacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaagcgggtgacaatccgtacctgcggtataaccacgccgacgccgagtttcaggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaagaagcgggttctcgaacctctcggtctggttgaggaaggcgctaagacggctcctggaaagaaacgtccggtagagcagtcgccacaagagccagactcctcctcgggcatcggcaagacaggccagcagcccgctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtccccgatccacaacctctcggagaacctccagcaacccccgctgctgtgggacctactacaatggcttcaggcggtggcgcaccaatggcagacaataacgaaggcgccgacggagtgggtaatgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgcacctgggccttgcccacctacaataaccacctctacaagcaaatctccagtgcttcaacgggggccagcaacgacaaccactacttcggctacagcaccccctgggggtattttgatttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaattggggattccggcccaagagactcaacttcaaactcttcaacatccaagtcaaggaggtcacgacgaatgatggcgtcacaaccatcgctaataaccttaccagcacggttcaagtcttctcggactcggagtaccagcttccgtacgtcctcggctctgcgcaccagggctgcctccctccgttcccggcggacgtgttcatgattccgcaatacggctacctgacgctcaacaatggcagccaagccgtgggacgttcatccttttactgcctggaatatttcccttctcagatgctgagaacgggcaacaactttaccttcagctacacctttgaggaagtgcctttccacagcagctacgcgcacagccagagcctggaccggctgatgaatcctctcatcgaccaatacctgtattacctgaacagaactcaaaatcagtccggaagtgcccaaaacaaggacttgctgtttagccgtgggtctccagctggcatgtctgttcagcccaaaaactggctacctggaccctgttatcggcagcagcgcgtttctaaaacaaaaacagacaacaacaacagcaattttacctggactggtgcttcaaaatataacctcaatgggcgtgaatccatcatcaaccctggcactgctatggcctcacacaaagacgacgaagacaagttctttcccatgagcggtgtcatgatttttggaaaagagagcgccggagcttcaaacactgcattggacaatgtcatgattacagacgaagaggaaattaaagccactaaccctgtggccaccgaaagatttgggaccgtggcagtcaatttccagagcagcagcacagaccctgcgaccggagatgtgcatgctatgggagcattacctggcatggtgtggcaagatagagacgtgtacctgcagggtcccatttgggccaaaattcctcacacagatggacactttcacccgtctcctcttatgggcggctttggactcaagaacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacgcctgttcctgcgaatcctccggcggagttttcagctacaaagtttgcttcattcatcacccaatactccacaggacaagtgagtgtggaaattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaagcgctggaatcccgaagtgcagtacacatccaattatgcaaaatctgccaacgttgattttactgtggacaacaatggactttatactgagcctcgccccattggcacccgttaccttacccgtcccctgtaa

2型Cap序列（SEQ ID No.7）：

atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa

3型Cap序列（SEQ ID No.8）：

atggctgctgacggttatcttccagattggctcgaggacaacctttctgaaggcattcgtgagtggtgggctctgaaacctggagtccctcaacccaaagcgaaccaacaacaccaggacaaccgtcggggtcttgtgcttccgggttacaaatacctcggacccggtaacggactcgacaaaggagagccggtcaacgaggcggacgcggcagccctcgaacacgacaaagcttacgaccagcagctcaaggccggtgacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgccgagtttcaggagcgtcttcaagaagatacgtcttttgggggcaaccttggcagagcagtcttccaggccaaaaagaggatccttgagcctcttggtctggttgaggaagcagctaaaacggctcctggaaagaagggggctgtagatcagtctcctcaggaaccggactcatcatctggtgttggcaaatcgggcaaacagcctgccagaaaaagactaaatttcggtcagactggagactcagagtcagtcccagaccctcaacctctcggagaaccaccagcagcccccacaagtttgggatctaatacaatggcttcaggcggtggcgcaccaatggcagacaataacgagggtgccgatggagtgggtaattcctcaggaaattggcattgcgattcccaatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcaccagaacctgggccctgcccacttacaacaaccatctctacaagcaaatctccagccaatcaggagcttcaaacgacaaccactactttggctacagcaccccttgggggtattttgactttaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcattaacaacaactggggattccggcccaagaaactcagcttcaagctcttcaacatccaagttagaggggtcacgcagaacgatggcacgacgactattgccaataaccttaccagcacggttcaagtgtttacggactcggagtatcagctcccgtacgtgctcgggtcggcgcaccaaggctgtctcccgccgtttccagcggacgtcttcatggtccctcagtatggatacctcaccctgaacaacggaagtcaagcggtgggacgctcatccttttactgcctggagtacttcccttcgcagatgctaaggactggaaataacttccaattcagctataccttcgaggatgtaccttttcacagcagctacgctcacagccagagtttggatcgcttgatgaatcctcttattgatcagtatctgtactacctgaacagaacgcaaggaacaacctctggaacaaccaaccaatcacggctgctttttagccaggctgggcctcagtctatgtctttgcaggccagaaattggctacctgggccctgctaccggcaacagagactttcaaagactgctaacgacaacaacaacagtaactttccttggacagcggccagcaaatatcatctcaatggccgcgactcgctggtgaatccaggaccagctatggccagtcacaaggacgatgaagaaaaatttttccctatgcacggcaatctaatatttggcaaagaagggacaacggcaagtaacgcagaattagataatgtaatgattacggatgaagaagagattcgtaccaccaatcctgtggcaacagagcagtatggaactgtggcaaataacttgcagagctcaaatacagctcccacgactggaactgtcaatcatcagggggccttacctggcatggtgtggcaagatcgtgacgtgtaccttcaaggacctatctgggcaaagattcctcacacggatggacactttcatccttctcctctgatgggaggctttggactgaaacatccgcctcctcaaatcatgatcaaaaatactccggtaccggcaaatcctccgacgactttcagcccggccaagtttgcttcatttatcactcagtactccactggacaggtcagcgtggaaattgagtgggagctacagaaagaaaacagcaaacgttggaatccagagattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtagacactaatggtgtttatagtgaacctcgccctattggaacccggtatctcacacgaaacttgtga

4型Cap序列（SEQ ID No.9）：

atgactgacggttaccttccagattggctagaggacaacctctctgaaggcgttcgagagtggtgggcgctgcaacctggagcccctaaacccaaggcaaatcaacaacatcaggacaacgctcggggtcttgtgcttccgggttacaaatacctcggacccggcaacggactcgacaagggggaacccgtcaacgcagcggacgcggcagccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaggccggtgacaacccctacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttccagcagcggcttcagggcgacacatcgtttgggggcaacctcggcagagcagtcttccaggccaaaaagagggttcttgaacctcttggtctggttgagcaagcgggtgagacggctcctggaaagaagagaccgttgattgaatccccccagcagcccgactcctccacgggtatcggcaaaaaaggcaagcagccggctaaaaagaagctcgttttcgaagacgaaactggagcaggcgacggaccccctgagggatcaacttccggagccatgtctgatgacagtgagatgcgtgcagcagctggcggagctgcagtcgagggcggacaaggtgccgatggagtgggtaatgcctcgggtgattggcattgcgattccacctggtctgagggccacgtcacgaccaccagcaccagaacctgggtcttgcccacctacaacaaccacctctacaagcgactcggagagagcctgcagtccaacacctacaacggattctccaccccctggggatactttgacttcaaccgcttccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggcatgcgacccaaagccatgcgggtcaaaatcttcaacatccaggtcaaggaggtcacgacgtcgaacggcgagacaacggtggctaataaccttaccagcacggttcagatctttgcggactcgtcgtacgaactgccgtacgtgatggatgcgggtcaagagggcagcctgcctccttttcccaacgacgtctttatggtgccccagtacggctactgtggactggtgaccggcaacacttcgcagcaacagactgacagaaatgccttctactgcctggagtactttccttcgcagatgctgcggactggcaacaactttgaaattacgtacagttttgagaaggtgcctttccactcgatgtacgcgcacagccagagcctggaccggctgatgaaccctctcatcgaccagtacctgtggggactgcaatcgaccaccaccggaaccaccctgaatgccgggactgccaccaccaactttaccaagctgcggcctaccaacttttccaactttaaaaagaactggctgcccgggccttcaatcaagcagcagggcttctcaaagactgccaatcaaaactacaagatccctgccaccgggtcagacagtctcatcaaatacgagacgcacagcactctggacggaagatggagtgccctgacccccggacctccaatggccacggctggacctgcggacagcaagttcagcaacagccagctcatctttgcggggcctaaacagaacggcaacacggccaccgtacccgggactctgatcttcacctctgaggaggagctggcagccaccaacgccaccgatacggacatgtggggcaacctacctggcggtgaccagagcaacagcaacctgccgaccgtggacagactgacagccttgggagccgtgcctggaatggtctggcaaaacagagacatttactaccagggtcccatttgggccaagattcctcataccgatggacactttcacccctcaccgctgattggtgggtttgggctgaaacacccgcctcctcaaatttttatcaagaacaccccggtacctgcgaatcctgcaacgaccttcagctctactccggtaaactccttcattactcagtacagcactggccaggtgtcggtgcagattgactgggagatccagaaggagcggtccaaacgctggaaccccgaggtccagtttacctccaactacggacagcaaaactctctgttgtgggctcccgatgcggctgggaaatacactgagcctagggctatcggtacccgctacctcacccaccacctgtaa

5型Cap序列（SEQ ID No.10）：

atgtcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaaggtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatcaagcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcctgtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagacaacccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgggggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagagggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctgttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccaccagacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa

6.2型Cap序列（SEQ ID No.11）：

atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgcgagtggtgggacttgaaacctggagccccgaaacccaaagccaaccagcaaaagcaggacgacggccggggtctggtgcttcctggctacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggggagcccgtcaacgcggcggatgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaagcgggtgacaatccgtacctgcggtataaccacgccgacgccgagtttcaggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaagaagagggttctcgaacctcttggtctggttgaggaaggtgctaagacggctcctggaaagaaacgtccggtagagcagtcgccacaagagccagactcctcctcgggcattggcaagacaggccagcagcccgctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtccccgacccacaacctctcggagaacctccagcaacccccgctgctgtgggacctactacaatggcttcaggcggtggcgcaccaatggcagacaataacgaaggcgccgacggagtgggtaatgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacatgggccttgcccacctataacaaccacctctacaagcaaatctccagtgcttcaacgggggccagcaacgacaaccactacttcggctacagcaccccctgggggtattttgatttcaacagattccactgccatttctcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaattggggattccggcccaagagactcaacttcaagctcttcaacatccaagtcaaggaggtcacgacgaatgatggcgtcacgaccatcgctaataaccttaccagcacggttcaagtcttctcggactcggagtaccagttgccgtacgtcctcggctctgcgcaccagggctgcctccctccgttcccggcggacgtgttcatgattccgcagtacggctacctaacgctcaacaatggcagccaggcagtgggacggtcatccttttactgcctggaatatttcccatcgcagatgctgagaacgggcaataactttaccttcagctacaccttcgaggacgtgcctttccacagcagctacgcgcacagccagagcctggaccggctgatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacctgaacagaactcagaatcagtccggaagtgcccaaaacaaggacttgctgtttagccgggggtctccagctggcatgtctgttcagcccaaaaactggctacctggaccctgttaccggcagcagcgcgtttctaaaacaaaaacagacaacaacaacagcaactttacctggactggtgcttcaaaatataaccttaatgggcgtgaatctataatcaaccctggcactgctatggcctcacacaaagacgacaaagacaagttctttcccatgagcggtgtcatgatttttggaaaggagagcgccggagcttcaaacactgcattggacaatgtcatgatcacagacgaagaggaaatcaaagccactaaccccgtggccaccgaaagatttgggactgtggcagtcaatctccagagcagcagcacagaccctgcgaccggagatgtgcatgttatgggagccttacctggaatggtgtggcaagacagagacgtatacctgcagggtcctatttgggccaaaattcctcacacggatggacactttcacccgtctcctctcatgggcggctttggacttaagcacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacgcctgttcctgcgaatcctccggcagagttttcggctacaaagtttgcttcattcatcacccagtattccacaggacaagtgagcgtggagattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaaacgctggaatcccgaagtgcagtatacatctaactatgcaaaatctgccaacgttgatttcactgtggacaacaatggactttatactgagcctcgccccattggcacccgttacctcacccgtcccctg

7型Cap序列（SEQ ID No.12）：

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9型Cap序列（SEQ ID No.13）：

atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaaccttagtgaaggaattcgcgagtggtgggctttgaaacctggagcccctcaacccaaggcaaatcaacaacatcaagacaacgctcgaggtcttgtgcttccgggttacaaataccttggacccggcaacggactcgacaagggggagccggtcaacgcagcagacgcggcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaggccggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgccgagttccaggagcggctcaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaaaaagaggcttcttgaacctcttggtctggttgaggaagcggctaagacggctcctggaaagaagaggcctgtagagcagtctcctcaggaaccggactcctccgcgggtattggcaaatcgggtgcacagcccgctaaaaagagactcaatttcggtcagactggcgacacagagtcagtcccagaccctcaaccaatcggagaacctcccgcagccccctcaggtgtgggatctcttacaatggcttcaggtggtggcgcaccagtggcagacaataacgaaggtgccgatggagtgggtagttcctcgggaaattggcattgcgattcccaatggctgggggacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaatcacctctacaagcaaatctccaacagcacatctggaggatcttcaaatgacaacgcctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggattccggcctaagcgactcaacttcaagctcttcaacattcaggtcaaagaggttacggacaacaatggagtcaagaccatcgccaataaccttaccagcacggtccaggtcttcacggactcagactatcagctcccgtacgtgctcgggtcggctcacgagggctgcctcccgccgttcccagcggacgttttcatgattcctcagtacgggtatctgacgcttaatgatggaagccaggccgtgggtcgttcgtccttttactgcctggaatatttcccgtcgcaaatgctaagaacgggtaacaacttccagttcagctacgagtttgagaacgtacctttccatagcagctacgctcacagccaaagcctggaccgactaatgaatccactcatcgaccaatacttgtactatctctcaaagactattaacggttctggacagaatcaacaaacgctaaaattcagtgtggccggacccagcaacatggctgtccagggaagaaactacatacctggacccagctaccgacaacaacgtgtctcaaccactgtgactcaaaacaacaacagcgaatttgcttggcctggagcttcttcttgggctctcaatggacgtaatagcttgatgaatcctggacctgctatggccagccacaaagaaggagaggaccgtttctttcctttgtctggatctttaatttttggcaaacaaggaactggaagagacaacgtggatgcggacaaagtcatgataaccaacgaagaagaaattaaaactactaacccggtagcaacggagtcctatggacaagtggccacaaaccaccagagtgcccaagcacaggcgcagaccggctgggttcaaaaccaaggaatacttccgggtatggtttggcaggacagagatgtgtacctgcaaggacccatttgggccaaaattcctcacacggacggcaactttcacccttctccgctgatgggagggtttggaatgaagcacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacacctgtacctgcggatcctccaacggccttcaacaaggacaagctgaactctttcatcacccagtattctactggccaagtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaagcgctggaacccggagatccagtacacttccaactattacaagtctaataatgttgaatttgctgttaatactgaaggtgtatatagtgaaccccgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa

Rh10型Cap序列（SEQ ID No.14）：

atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgcgagtggtgggacttgaaacctggagccccgaaacccaaagccaaccagcaaaagcaggacgacggccggggtctggtgcttcctggctacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaagcgggtgacaatccgtacctgcggtataaccacgccgacgccgagtttcaggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaagaagcgggttctcgaacctctcggtctggttgaggaaggcgctaagacggctcctggaaagaagagaccggtagagccatcaccccagcgttctccagactcctctacgggcatcggcaagaaaggccagcagcccgcgaaaaagagactcaactttgggcagactggcgactcagagtcagtgcccgaccctcaaccaatcggagaaccccccgcaggcccctctggtctgggatctggtacaatggctgcaggcggtggcgctccaatggcagacaataacgaaggcgccgacggagtgggtagttcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctccccacctacaacaaccacctctacaagcaaatctccaacgggacttcgggaggaagcaccaacgacaacacctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgactttaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggattccggcccaagagactcaacttcaagctcttcaacatccaggtcaaggaggtcacgcagaatgaaggcaccaagaccatcgccaataaccttaccagcacgattcaggtctttacggactcggaataccagctcccgtacgtcctcggctctgcgcaccagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtcttcatgattcctcagtacgggtacctgactctgaacaatggcagtcaggccgtgggccgttcctccttctactgcctggagtactttccttctcaaatgctgagaacgggcaacaactttgagttcagctaccagtttgaggacgtgccttttcacagcagctacgcgcacagccaaagcctggaccggctgatgaaccccctcatcgaccagtacctgtactacctgtctcggactcagtccacgggaggtaccgcaggaactcagcagttgctattttctcaggccgggcctaataacatgtcggctcaggccaaaaactggctacccgggccctgctaccggcagcaacgcgtctccacgacactgtcgcaaaataacaacagcaactttgcctggaccggtgccaccaagtatcatctgaatggcagagactctctggtaaatcccggtgtcgctatggcaacccacaaggacgacgaagagcgattttttccgtccagcggagtcttaatgtttgggaaacagggagctggaaaagacaacgtggactatagcagcgttatgctaaccagtgaggaagaaattaaaaccaccaacccagtggccacagaacagtacggcgtggtggccgataacctgcaacagcaaaacgccgctcctattgtaggggccgtcaacagtcaaggagccttacctggcatggtctggcagaaccgggacgtgtacctgcagggtcctatctgggccaagattcctcacacggacggaaactttcatccctcgccgctgatgggaggctttggactgaaacacccgcctcctcagatcctgattaagaatacacctgttcccgcggatcctccaactaccttcagtcaagctaagctggcgtcgttcatcacgcagtacagcaccggacaggtcagcgtggaaattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaaacgctggaacccagagattcaatacacttccaactactacaaatctacaaatgtggactttgctgttaacacagatggcacttattctgagcctcgccccatcggcacccgttacctcacccgtaatctgtaa

不同血清型的滴度如图6和下表所示：

表1、构建的不同血清型rAVV的滴度v.g/mL

由上述结果可知，用本发明构建的质粒用来包装病毒，能有效提高病毒滴度，从而提高了产量，降低病毒生产成本。

进一步地，采用qPCR的方法对2型rAVV病毒的滴度进行检测（可参考https://www.addgene.org/protocols/aav-titration-qpcr-using-sybr-green-technology记载的方法）：

提取纯化重组腺相关病毒DNArAAV经过Dnase I于25℃孵育1小时然后，使用Proteinase K（蛋白酶K）37℃孵育1小时。等体积向每管样品中加入配制好的酚、氯仿及异戊醇混合液进行纯化分离。从每管样品中轻轻吸取离心后上层水相，加入到新的离心管中，向每管加入适量体积的3M醋酸钠（pH5.2）、糖原。涡旋热变性：90℃反应10min。qPCR使用2×SYBR Green试剂盒，标准样品使用含有全部病毒基因组的线性化质粒。反应条件如下：1、95℃，10s；2、95℃，10s；3、60℃，30s；其中步骤2和步骤3连续重复40次。

结果见图7，与标尺线交点对应的X坐标轴循环数越高，滴度越低。

综上，本发明通过在pAAV-RC质粒中插入mir342基因及其调控真核启动子，并同时在其所含rep基因的上游的引入P5启动子用于调控rep基因的表达，从而构建得到一种rAAV重组包装质粒，采用包含该rAAV重组包装质粒的三质粒产品包装病毒，能够有效提升病毒毒滴，提高产生效率，降低生产成本。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海健士拜生物科技有限公司

澳斯康生物（南通）股份有限公司

甘肃健顺生物科技有限公司

健顺生物科技（南通）有限公司

上海澳斯康生物制药有限公司

<120> rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 103

<212> DNA

<213> 腺相关病毒(adeno-associated virus)

<400> 1

agtcctgtat tagaggtcac gtgagtgttt tgcgacattt tgcgacacca tgtggtcacg 60

ctgggtattt aagcccgagt gagcacgcag ggtctccatt ttg 103

<210> 2

<211> 99

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

gaaactgggc tcaaggtgag gggtgctatc tgtgattgag ggacatggtt aatggaattg 60

tctcacacag aaatcgcacc cgtcaccttg gcctactta 99

<210> 3

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttaacagtc ctgtattaga ggtcacgtga gtgttttgcg acattttgcg acaccatgtg 60

gtcacgctgg gtatttaagc ccgagtgagc acgcagggtc tccattttgc ggccg 115

<210> 4

<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60

ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120

tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180

tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgga tcctgccatt gcatccttct 240

ctgcagacta agatggagtt cctgaaccaa gaccgcttgc tggccaacct gtgaaactgg 300

gctcaaggtg aggggtgcta tctgtgattg agggacatgg ttaatggaat tgtctcacac 360

agaaatcgca cccgtcacct tggcctactt a 391

<210> 5

<211> 403

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tacgtagtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 60

ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 120

cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt 180

gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ggtttagtga accggatcct gccattgcat 240

ccttctctgc agactaagat ggagttcctg aaccaagacc gcttgctggc caacctgtga 300

aactgggctc aaggtgaggg gtgctatctg tgattgaggg acatggttaa tggaattgtc 360

tcacacagaa atcgcacccg tcaccttggc ctacttaccc ggg 403

<210> 6

<211> 2211

<212> DNA

<213> 1型腺相关病毒(adeno-associated virus 1)

<400> 6

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60

gagtggtggg acttgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120

gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180

aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240

cagcagctca aagcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300

caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360

gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420

ggaaagaaac gtccggtaga gcagtcgcca caagagccag actcctcctc gggcatcggc 480

aagacaggcc agcagcccgc taaaaagaga ctcaattttg gtcagactgg cgactcagag 540

tcagtccccg atccacaacc tctcggagaa cctccagcaa cccccgctgc tgtgggacct 600

actacaatgg cttcaggcgg tggcgcacca atggcagaca ataacgaagg cgccgacgga 660

gtgggtaatg cctcaggaaa ttggcattgc gattccacat ggctgggcga cagagtcatc 720

accaccagca cccgcacctg ggccttgccc acctacaata accacctcta caagcaaatc 780

tccagtgctt caacgggggc cagcaacgac aaccactact tcggctacag caccccctgg 840

gggtattttg atttcaacag attccactgc cacttttcac cacgtgactg gcagcgactc 900

atcaacaaca attggggatt ccggcccaag agactcaact tcaaactctt caacatccaa 960

gtcaaggagg tcacgacgaa tgatggcgtc acaaccatcg ctaataacct taccagcacg 1020

gttcaagtct tctcggactc ggagtaccag cttccgtacg tcctcggctc tgcgcaccag 1080

ggctgcctcc ctccgttccc ggcggacgtg ttcatgattc cgcaatacgg ctacctgacg 1140

ctcaacaatg gcagccaagc cgtgggacgt tcatcctttt actgcctgga atatttccct 1200

tctcagatgc tgagaacggg caacaacttt accttcagct acacctttga ggaagtgcct 1260

ttccacagca gctacgcgca cagccagagc ctggaccggc tgatgaatcc tctcatcgac 1320

caatacctgt attacctgaa cagaactcaa aatcagtccg gaagtgccca aaacaaggac 1380

ttgctgttta gccgtgggtc tccagctggc atgtctgttc agcccaaaaa ctggctacct 1440

ggaccctgtt atcggcagca gcgcgtttct aaaacaaaaa cagacaacaa caacagcaat 1500

tttacctgga ctggtgcttc aaaatataac ctcaatgggc gtgaatccat catcaaccct 1560

ggcactgcta tggcctcaca caaagacgac gaagacaagt tctttcccat gagcggtgtc 1620

atgatttttg gaaaagagag cgccggagct tcaaacactg cattggacaa tgtcatgatt 1680

acagacgaag aggaaattaa agccactaac cctgtggcca ccgaaagatt tgggaccgtg 1740

gcagtcaatt tccagagcag cagcacagac cctgcgaccg gagatgtgca tgctatggga 1800

gcattacctg gcatggtgtg gcaagataga gacgtgtacc tgcagggtcc catttgggcc 1860

aaaattcctc acacagatgg acactttcac ccgtctcctc ttatgggcgg ctttggactc 1920

aagaacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacgcctg ttcctgcgaa tcctccggcg 1980

gagttttcag ctacaaagtt tgcttcattc atcacccaat actccacagg acaagtgagt 2040

gtggaaattg aatgggagct gcagaaagaa aacagcaagc gctggaatcc cgaagtgcag 2100

tacacatcca attatgcaaa atctgccaac gttgatttta ctgtggacaa caatggactt 2160

tatactgagc ctcgccccat tggcacccgt taccttaccc gtcccctgta a 2211

<210> 7

<211> 2208

<212> DNA

<213> 2型腺相关病毒(adeno-associated virus 2)

<400> 7

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60

cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120

gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180

aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240

cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300

caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360

gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420

ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480

aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540

tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600

aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660

gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720

accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780

tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840

tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900

aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960

aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020

caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080

tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140

aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200

cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260

cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320

tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380

cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440

ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500

tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560

ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620

atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680

gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740

accaacctcc agagaggcaa cagacaagca gctaccgcag atgtcaacac acaaggcgtt 1800

cttccaggca tggtctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860

attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920

caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980

ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040

gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100

acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160

tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208

<210> 8

<211> 2211

<212> DNA

<213> 3型腺相关病毒(adeno-associated virus 3)

<400> 8

atggctgctg acggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctttctga aggcattcgt 60

gagtggtggg ctctgaaacc tggagtccct caacccaaag cgaaccaaca acaccaggac 120

aaccgtcggg gtcttgtgct tccgggttac aaatacctcg gacccggtaa cggactcgac 180

aaaggagagc cggtcaacga ggcggacgcg gcagccctcg aacacgacaa agcttacgac 240

cagcagctca aggccggtga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttt 300

caggagcgtc ttcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc ttggcagagc agtcttccag 360

gccaaaaaga ggatccttga gcctcttggt ctggttgagg aagcagctaa aacggctcct 420

ggaaagaagg gggctgtaga tcagtctcct caggaaccgg actcatcatc tggtgttggc 480

aaatcgggca aacagcctgc cagaaaaaga ctaaatttcg gtcagactgg agactcagag 540

tcagtcccag accctcaacc tctcggagaa ccaccagcag cccccacaag tttgggatct 600

aatacaatgg cttcaggcgg tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg tgccgatgga 660

gtgggtaatt cctcaggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctgggcga cagagtcatc 720

accaccagca ccagaacctg ggccctgccc acttacaaca accatctcta caagcaaatc 780

tccagccaat caggagcttc aaacgacaac cactactttg gctacagcac cccttggggg 840

tattttgact ttaacagatt ccactgccac ttctcaccac gtgactggca gcgactcatt 900

aacaacaact ggggattccg gcccaagaaa ctcagcttca agctcttcaa catccaagtt 960

agaggggtca cgcagaacga tggcacgacg actattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020

caagtgttta cggactcgga gtatcagctc ccgtacgtgc tcgggtcggc gcaccaaggc 1080

tgtctcccgc cgtttccagc ggacgtcttc atggtccctc agtatggata cctcaccctg 1140

aacaacggaa gtcaagcggt gggacgctca tccttttact gcctggagta cttcccttcg 1200

cagatgctaa ggactggaaa taacttccaa ttcagctata ccttcgagga tgtacctttt 1260

cacagcagct acgctcacag ccagagtttg gatcgcttga tgaatcctct tattgatcag 1320

tatctgtact acctgaacag aacgcaagga acaacctctg gaacaaccaa ccaatcacgg 1380

ctgcttttta gccaggctgg gcctcagtct atgtctttgc aggccagaaa ttggctacct 1440

gggccctgct accggcaaca gagactttca aagactgcta acgacaacaa caacagtaac 1500

tttccttgga cagcggccag caaatatcat ctcaatggcc gcgactcgct ggtgaatcca 1560

ggaccagcta tggccagtca caaggacgat gaagaaaaat ttttccctat gcacggcaat 1620

ctaatatttg gcaaagaagg gacaacggca agtaacgcag aattagataa tgtaatgatt 1680

acggatgaag aagagattcg taccaccaat cctgtggcaa cagagcagta tggaactgtg 1740

gcaaataact tgcagagctc aaatacagct cccacgactg gaactgtcaa tcatcagggg 1800

gccttacctg gcatggtgtg gcaagatcgt gacgtgtacc ttcaaggacc tatctgggca 1860

aagattcctc acacggatgg acactttcat ccttctcctc tgatgggagg ctttggactg 1920

aaacatccgc ctcctcaaat catgatcaaa aatactccgg taccggcaaa tcctccgacg 1980

actttcagcc cggccaagtt tgcttcattt atcactcagt actccactgg acaggtcagc 2040

gtggaaattg agtgggagct acagaaagaa aacagcaaac gttggaatcc agagattcag 2100

tacacttcca actacaacaa gtctgttaat gtggacttta ctgtagacac taatggtgtt 2160

tatagtgaac ctcgccctat tggaacccgg tatctcacac gaaacttgtg a 2211

<210> 9

<211> 2205

<212> DNA

<213> 4型腺相关病毒(adeno-associated virus 4)

<400> 9

atgactgacg gttaccttcc agattggcta gaggacaacc tctctgaagg cgttcgagag 60

tggtgggcgc tgcaacctgg agcccctaaa cccaaggcaa atcaacaaca tcaggacaac 120

gctcggggtc ttgtgcttcc gggttacaaa tacctcggac ccggcaacgg actcgacaag 180

ggggaacccg tcaacgcagc ggacgcggca gccctcgagc acgacaaggc ctacgaccag 240

cagctcaagg ccggtgacaa cccctacctc aagtacaacc acgccgacgc ggagttccag 300

cagcggcttc agggcgacac atcgtttggg ggcaacctcg gcagagcagt cttccaggcc 360

aaaaagaggg ttcttgaacc tcttggtctg gttgagcaag cgggtgagac ggctcctgga 420

aagaagagac cgttgattga atccccccag cagcccgact cctccacggg tatcggcaaa 480

aaaggcaagc agccggctaa aaagaagctc gttttcgaag acgaaactgg agcaggcgac 540

ggaccccctg agggatcaac ttccggagcc atgtctgatg acagtgagat gcgtgcagca 600

gctggcggag ctgcagtcga gggcggacaa ggtgccgatg gagtgggtaa tgcctcgggt 660

gattggcatt gcgattccac ctggtctgag ggccacgtca cgaccaccag caccagaacc 720

tgggtcttgc ccacctacaa caaccacctc tacaagcgac tcggagagag cctgcagtcc 780

aacacctaca acggattctc caccccctgg ggatactttg acttcaaccg cttccactgc 840

cacttctcac cacgtgactg gcagcgactc atcaacaaca actggggcat gcgacccaaa 900

gccatgcggg tcaaaatctt caacatccag gtcaaggagg tcacgacgtc gaacggcgag 960

acaacggtgg ctaataacct taccagcacg gttcagatct ttgcggactc gtcgtacgaa 1020

ctgccgtacg tgatggatgc gggtcaagag ggcagcctgc ctccttttcc caacgacgtc 1080

tttatggtgc cccagtacgg ctactgtgga ctggtgaccg gcaacacttc gcagcaacag 1140

actgacagaa atgccttcta ctgcctggag tactttcctt cgcagatgct gcggactggc 1200

aacaactttg aaattacgta cagttttgag aaggtgcctt tccactcgat gtacgcgcac 1260

agccagagcc tggaccggct gatgaaccct ctcatcgacc agtacctgtg gggactgcaa 1320

tcgaccacca ccggaaccac cctgaatgcc gggactgcca ccaccaactt taccaagctg 1380

cggcctacca acttttccaa ctttaaaaag aactggctgc ccgggccttc aatcaagcag 1440

cagggcttct caaagactgc caatcaaaac tacaagatcc ctgccaccgg gtcagacagt 1500

ctcatcaaat acgagacgca cagcactctg gacggaagat ggagtgccct gacccccgga 1560

cctccaatgg ccacggctgg acctgcggac agcaagttca gcaacagcca gctcatcttt 1620

gcggggccta aacagaacgg caacacggcc accgtacccg ggactctgat cttcacctct 1680

gaggaggagc tggcagccac caacgccacc gatacggaca tgtggggcaa cctacctggc 1740

ggtgaccaga gcaacagcaa cctgccgacc gtggacagac tgacagcctt gggagccgtg 1800

cctggaatgg tctggcaaaa cagagacatt tactaccagg gtcccatttg ggccaagatt 1860

cctcataccg atggacactt tcacccctca ccgctgattg gtgggtttgg gctgaaacac 1920

ccgcctcctc aaatttttat caagaacacc ccggtacctg cgaatcctgc aacgaccttc 1980

agctctactc cggtaaactc cttcattact cagtacagca ctggccaggt gtcggtgcag 2040

attgactggg agatccagaa ggagcggtcc aaacgctgga accccgaggt ccagtttacc 2100

tccaactacg gacagcaaaa ctctctgttg tgggctcccg atgcggctgg gaaatacact 2160

gagcctaggg ctatcggtac ccgctacctc acccaccacc tgtaa 2205

<210> 10

<211> 2175

<212> DNA

<213> 5型腺相关病毒(adeno-associated virus 5)

<400> 10

atgtcttttg ttgatcaccc tccagattgg ttggaagaag ttggtgaagg tcttcgcgag 60

tttttgggcc ttgaagcggg cccaccgaaa ccaaaaccca atcagcagca tcaagatcaa 120

gcccgtggtc ttgtgctgcc tggttataac tatctcggac ccggaaacgg tctcgatcga 180

ggagagcctg tcaacagggc agacgaggtc gcgcgagagc acgacatctc gtacaacgag 240

cagcttgagg cgggagacaa cccctacctc aagtacaacc acgcggacgc cgagtttcag 300

gagaagctcg ccgacgacac atccttcggg ggaaacctcg gaaaggcagt ctttcaggcc 360

aagaaaaggg ttctcgaacc ttttggcctg gttgaagagg gtgctaagac ggcccctacc 420

ggaaagcgga tagacgacca ctttccaaaa agaaagaagg ctcggaccga agaggactcc 480

aagccttcca cctcgtcaga cgccgaagct ggacccagcg gatcccagca gctgcaaatc 540

ccagcccaac cagcctcaag tttgggagct gatacaatgt ctgcgggagg tggcggccca 600

ttgggcgaca ataaccaagg tgccgatgga gtgggcaatg cctcgggaga ttggcattgc 660

gattccacgt ggatggggga cagagtcgtc accaagtcca cccgaacctg ggtgctgccc 720

agctacaaca accaccagta ccgagagatc aaaagcggct ccgtcgacgg aagcaacgcc 780

aacgcctact ttggatacag caccccctgg gggtactttg actttaaccg cttccacagc 840

cactggagcc cccgagactg gcaaagactc atcaacaact actggggctt cagaccccgg 900

tccctcagag tcaaaatctt caacattcaa gtcaaagagg tcacggtgca ggactccacc 960

accaccatcg ccaacaacct cacctccacc gtccaagtgt ttacggacga cgactaccag 1020

ctgccctacg tcgtcggcaa cgggaccgag ggatgcctgc cggccttccc tccgcaggtc 1080

tttacgctgc cgcagtacgg ttacgcgacg ctgaaccgcg acaacacaga aaatcccacc 1140

gagaggagca gcttcttctg cctagagtac tttcccagca agatgctgag aacgggcaac 1200

aactttgagt ttacctacaa ctttgaggag gtgcccttcc actccagctt cgctcccagt 1260

cagaacctgt tcaagctggc caacccgctg gtggaccagt acttgtaccg cttcgtgagc 1320

acaaataaca ctggcggagt ccagttcaac aagaacctgg ccgggagata cgccaacacc 1380

tacaaaaact ggttcccggg gcccatgggc cgaacccagg gctggaacct gggctccggg 1440

gtcaaccgcg ccagtgtcag cgccttcgcc acgaccaata ggatggagct cgagggcgcg 1500

agttaccagg tgcccccgca gccgaacggc atgaccaaca acctccaggg cagcaacacc 1560

tatgccctgg agaacactat gatcttcaac agccagccgg cgaacccggg caccaccgcc 1620

acgtacctcg agggcaacat gctcatcacc agcgagagcg agacgcagcc ggtgaaccgc 1680

gtggcgtaca acgtcggcgg gcagatggcc accaacaacc agagctccac cactgccccc 1740

gcgaccggca cgtacaacct ccaggaaatc gtgcccggca gcgtgtggat ggagagggac 1800

gtgtacctcc aaggacccat ctgggccaag atcccagaga cgggggcgca ctttcacccc 1860

tctccggcca tgggcggatt cggactcaaa cacccaccgc ccatgatgct catcaagaac 1920

acgcctgtgc ccggaaatat caccagcttc tcggacgtgc ccgtcagcag cttcatcacc 1980

cagtacagca ccgggcaggt caccgtggag atggagtggg agctcaagaa ggaaaactcc 2040

aagaggtgga acccagagat ccagtacaca aacaactaca acgaccccca gtttgtggac 2100

tttgccccgg acagcaccgg ggaatacaga accaccagac ctatcggaac ccgatacctt 2160

acccgacccc tttaa 2175

<210> 11

<211> 2208

<212> DNA

<213> 6.2型腺相关病毒(adeno-associated virus 6.2)

<400> 11

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60

gagtggtggg acttgaaacc tggagccccg aaacccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120

gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180

aagggggagc ccgtcaacgc ggcggatgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240

cagcagctca aagcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300

caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360

gccaagaaga gggttctcga acctcttggt ctggttgagg aaggtgctaa gacggctcct 420

ggaaagaaac gtccggtaga gcagtcgcca caagagccag actcctcctc gggcattggc 480

aagacaggcc agcagcccgc taaaaagaga ctcaattttg gtcagactgg cgactcagag 540

tcagtccccg acccacaacc tctcggagaa cctccagcaa cccccgctgc tgtgggacct 600

actacaatgg cttcaggcgg tggcgcacca atggcagaca ataacgaagg cgccgacgga 660

gtgggtaatg cctcaggaaa ttggcattgc gattccacat ggctgggcga cagagtcatc 720

accaccagca cccgaacatg ggccttgccc acctataaca accacctcta caagcaaatc 780

tccagtgctt caacgggggc cagcaacgac aaccactact tcggctacag caccccctgg 840

gggtattttg atttcaacag attccactgc catttctcac cacgtgactg gcagcgactc 900

atcaacaaca attggggatt ccggcccaag agactcaact tcaagctctt caacatccaa 960

gtcaaggagg tcacgacgaa tgatggcgtc acgaccatcg ctaataacct taccagcacg 1020

gttcaagtct tctcggactc ggagtaccag ttgccgtacg tcctcggctc tgcgcaccag 1080

ggctgcctcc ctccgttccc ggcggacgtg ttcatgattc cgcagtacgg ctacctaacg 1140

ctcaacaatg gcagccaggc agtgggacgg tcatcctttt actgcctgga atatttccca 1200

tcgcagatgc tgagaacggg caataacttt accttcagct acaccttcga ggacgtgcct 1260

ttccacagca gctacgcgca cagccagagc ctggaccggc tgatgaatcc tctcatcgac 1320

cagtacctgt attacctgaa cagaactcag aatcagtccg gaagtgccca aaacaaggac 1380

ttgctgttta gccgggggtc tccagctggc atgtctgttc agcccaaaaa ctggctacct 1440

ggaccctgtt accggcagca gcgcgtttct aaaacaaaaa cagacaacaa caacagcaac 1500

tttacctgga ctggtgcttc aaaatataac cttaatgggc gtgaatctat aatcaaccct 1560

ggcactgcta tggcctcaca caaagacgac aaagacaagt tctttcccat gagcggtgtc 1620

atgatttttg gaaaggagag cgccggagct tcaaacactg cattggacaa tgtcatgatc 1680

acagacgaag aggaaatcaa agccactaac cccgtggcca ccgaaagatt tgggactgtg 1740

gcagtcaatc tccagagcag cagcacagac cctgcgaccg gagatgtgca tgttatggga 1800

gccttacctg gaatggtgtg gcaagacaga gacgtatacc tgcagggtcc tatttgggcc 1860

aaaattcctc acacggatgg acactttcac ccgtctcctc tcatgggcgg ctttggactt 1920

aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacgcctg ttcctgcgaa tcctccggca 1980

gagttttcgg ctacaaagtt tgcttcattc atcacccagt attccacagg acaagtgagc 2040

gtggagattg aatgggagct gcagaaagaa aacagcaaac gctggaatcc cgaagtgcag 2100

tatacatcta actatgcaaa atctgccaac gttgatttca ctgtggacaa caatggactt 2160

tatactgagc ctcgccccat tggcacccgt tacctcaccc gtcccctg 2208

<210> 12

<211> 2214

<212> DNA

<213> 7型腺相关病毒(adeno-associated virus 7)

<400> 12

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60

gagtggtggg acctgaaacc tggagccccg aaacccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120

aacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180

aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240

cagcagctca aagcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300

caggagcgtc tgcaagaaga tacgtcattt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360

gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420

gcaaagaaga gaccggtaga gccgtcacct cagcgttccc ccgactcctc cacgggcatc 480

ggcaagaaag gccagcagcc cgccagaaag agactcaatt tcggtcagac tggcgactca 540

gagtcagtcc ccgaccctca acctctcgga gaacctccag cagcgccctc tagtgtggga 600

tctggtacag tggctgcagg cggtggcgca ccaatggcag acaataacga aggtgccgac 660

ggagtgggta atgcctcagg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720

attaccacca gcacccgaac ctgggccctg cccacctaca acaaccacct ctacaagcaa 780

atctccagtg aaactgcagg tagtaccaac gacaacacct acttcggcta cagcaccccc 840

tgggggtatt ttgactttaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900

ctcatcaaca acaactgggg attccggccc aagaagctgc ggttcaagct cttcaacatc 960

caggtcaagg aggtcacgac gaatgacggc gttacgacca tcgctaataa ccttaccagc 1020

acgattcagg tattctcgga ctcggaatac cagctgccgt acgtcctcgg ctctgcgcac 1080

cagggctgcc tgcctccgtt cccggcggac gtcttcatga ttcctcagta cggctacctg 1140

actctcaaca atggcagtca gtctgtggga cgttcctcct tctactgcct ggagtacttc 1200

ccctctcaga tgctgagaac gggcaacaac tttgagttca gctacagctt cgaggacgtg 1260

cctttccaca gcagctacgc acacagccag agcctggacc ggctgatgaa tcccctcatc 1320

gaccagtact tgtactacct ggccagaaca cagagtaacc caggaggcac agctggcaat 1380

cgggaactgc agttttacca gggcgggcct tcaactatgg ccgaacaagc caagaattgg 1440

ttacctggac cttgcttccg gcaacaaaga gtctccaaaa cgctggatca aaacaacaac 1500

agcaactttg cttggactgg tgccaccaaa tatcacctga acggcagaaa ctcgttggtt 1560

aatcccggcg tcgccatggc aactcacaag gacgacgagg accgcttttt cccatccagc 1620

ggagtcctga tttttggaaa aactggagca actaacaaaa ctacattgga aaatgtgtta 1680

atgacaaatg aagaagaaat tcgtcctact aatcctgtag ccacggaaga atacgggata 1740

gtcagcagca acttacaagc ggctaatact gcagcccaga cacaagttgt caacaaccag 1800

ggagccttac ctggcatggt ctggcagaac cgggacgtgt acctgcaggg tcccatctgg 1860

gccaagattc ctcacacgga tggcaacttt cacccgtctc ctttgatggg cggctttgga 1920

cttaaacatc cgcctcctca gatcctgatc aagaacactc ccgttcccgc taatcctccg 1980

gaggtgttta ctcctgccaa gtttgcttcg ttcatcacac agtacagcac cggacaagtc 2040

agcgtggaaa tcgagtggga gctgcagaag gaaaacagca agcgctggaa cccggagatt 2100

cagtacacct ccaactttga aaagcagact ggtgtggact ttgccgttga cagccagggt 2160

gtttactctg agcctcgccc tattggcact cgttacctca cccgtaatct gtaa 2214

<210> 13

<211> 2211

<212> DNA

<213> 9型腺相关病毒(adeno-associated virus 9)

<400> 13

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca accttagtga aggaattcgc 60

gagtggtggg ctttgaaacc tggagcccct caacccaagg caaatcaaca acatcaagac 120

aacgctcgag gtcttgtgct tccgggttac aaataccttg gacccggcaa cggactcgac 180

aagggggagc cggtcaacgc agcagacgcg gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240

cagcagctca aggccggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttc 300

caggagcggc tcaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360

gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420

ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctccgc gggtattggc 480

aaatcgggtg cacagcccgc taaaaagaga ctcaatttcg gtcagactgg cgacacagag 540

tcagtcccag accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600

cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660

gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720

accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780

tccaacagca catctggagg atcttcaaat gacaacgcct acttcggcta cagcaccccc 840

tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900

ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960

caggtcaaag aggttacgga caacaatgga gtcaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020

acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080

gagggctgcc tcccgccgtt cccagcggac gttttcatga ttcctcagta cgggtatctg 1140

acgcttaatg atggaagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200

ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260

cctttccata gcagctacgc tcacagccaa agcctggacc gactaatgaa tccactcatc 1320

gaccaatact tgtactatct ctcaaagact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380

ctaaaattca gtgtggccgg acccagcaac atggctgtcc agggaagaaa ctacatacct 1440

ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500

tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560

ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620

ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680

accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740

gccacaaacc accagagtgc ccaagcacag gcgcagaccg gctgggttca aaaccaagga 1800

atacttccgg gtatggtttg gcaggacaga gatgtgtacc tgcaaggacc catttgggcc 1860

aaaattcctc acacggacgg caactttcac ccttctccgc tgatgggagg gtttggaatg 1920

aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980

gccttcaaca aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040

gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100

tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160

tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta a 2211

<210> 14

<211> 2217

<212> DNA

<213> 14型腺相关病毒(adeno-associated virus 14)

<400> 14

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60

gagtggtggg acttgaaacc tggagccccg aaacccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120

gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180

aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240

cagcagctca aagcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300

caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360

gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420

ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc cagactcctc tacgggcatc 480

ggcaagaaag gccagcagcc cgcgaaaaag agactcaact ttgggcagac tggcgactca 540

gagtcagtgc ccgaccctca accaatcgga gaaccccccg caggcccctc tggtctggga 600

tctggtacaa tggctgcagg cggtggcgct ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660

ggagtgggta gttcctcagg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720

atcaccacca gcacccgaac ctgggccctc cccacctaca acaaccacct ctacaagcaa 780

atctccaacg ggacttcggg aggaagcacc aacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 840

ccctgggggt attttgactt taacagattc cactgccact tctcaccacg tgactggcag 900

cgactcatca acaacaactg gggattccgg cccaagagac tcaacttcaa gctcttcaac 960

atccaggtca aggaggtcac gcagaatgaa ggcaccaaga ccatcgccaa taaccttacc 1020

agcacgattc aggtctttac ggactcggaa taccagctcc cgtacgtcct cggctctgcg 1080

caccagggct gcctgcctcc gttcccggcg gacgtcttca tgattcctca gtacgggtac 1140

ctgactctga acaatggcag tcaggccgtg ggccgttcct ccttctactg cctggagtac 1200

tttccttctc aaatgctgag aacgggcaac aactttgagt tcagctacca gtttgaggac 1260

gtgccttttc acagcagcta cgcgcacagc caaagcctgg accggctgat gaaccccctc 1320

atcgaccagt acctgtacta cctgtctcgg actcagtcca cgggaggtac cgcaggaact 1380

cagcagttgc tattttctca ggccgggcct aataacatgt cggctcaggc caaaaactgg 1440

ctacccgggc cctgctaccg gcagcaacgc gtctccacga cactgtcgca aaataacaac 1500

agcaactttg cctggaccgg tgccaccaag tatcatctga atggcagaga ctctctggta 1560

aatcccggtg tcgctatggc aacccacaag gacgacgaag agcgattttt tccgtccagc 1620

ggagtcttaa tgtttgggaa acagggagct ggaaaagaca acgtggacta tagcagcgtt 1680

atgctaacca gtgaggaaga aattaaaacc accaacccag tggccacaga acagtacggc 1740

gtggtggccg ataacctgca acagcaaaac gccgctccta ttgtaggggc cgtcaacagt 1800

caaggagcct tacctggcat ggtctggcag aaccgggacg tgtacctgca gggtcctatc 1860

tgggccaaga ttcctcacac ggacggaaac tttcatccct cgccgctgat gggaggcttt 1920

ggactgaaac acccgcctcc tcagatcctg attaagaata cacctgttcc cgcggatcct 1980

ccaactacct tcagtcaagc taagctggcg tcgttcatca cgcagtacag caccggacag 2040

gtcagcgtgg aaattgaatg ggagctgcag aaagaaaaca gcaaacgctg gaacccagag 2100

attcaataca cttccaacta ctacaaatct acaaatgtgg actttgctgt taacacagat 2160

ggcacttatt ctgagcctcg ccccatcggc acccgttacc tcacccgtaa tctgtaa 2217

Claims (10)

1.一种rAAV的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：用质粒产品转染包装细胞，培养，收集rAAV；

所述质粒产品包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和rAAV重组包装质粒；

所述rAAV重组包装质粒包含pAAV-RC质粒，以及插入所述pAAV-RC质粒的P5启动子、真核启动子和mir342基因，所述P5启动子位于所述pAAV-RC质粒所含rep基因的上游，用于调控rep基因的表达，所述真核启动子位于所述mir342基因的上游，用于调控所述mir342基因的表达。

2.根据权利要求1所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述P5启动子位于所述pAAV-RC质粒第1个碱基至第481个碱基之间或者第7004个碱基至第7350碱基之间。

3.根据权利要求1所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述真核启动子为CMV、EF1a、CAG或者SV40。

4.根据权利要求1至3任一项所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述rAAV重组包装质粒的构建方法包括在pAAV-RC质粒中插入所述P5启动子、所述真核启动子和所述mir342基因的步骤。

5.根据权利要求4所述的rAAV的制备方法，其特征在于，在所述pAAV-RC质粒中插入所述P5启动子、所述真核启动子和所述mir342基因的步骤包括：

用Hpa I酶和Eag I酶酶切所述pAAV-RC质粒，制备酶切产物Ⅰ；

在所述P5启动子的两端添加Hpa I酶和Eag I酶的酶切位点片段，用Hpa I酶和Eag I酶进行双酶切，制备酶切产物Ⅱ；

用连接酶连接所述酶切产物Ⅰ和所述酶切产物Ⅱ，制备重组质粒pAAV-P5-RC；

用Xma I酶和SnaB I酶双酶切所述pAAV-P5-RC，制备酶切产物Ⅲ；

提供包含所述真核启动子和所述mir342基因的连接片段，在所述连接片段的两端添加Xma I酶和SnaB I酶的酶切位点片段，用Xma I酶和SnaB I酶进行双酶切，制备酶切产物Ⅳ；

用连接酶连接所述酶切产物Ⅲ和所述酶切产物Ⅳ，制备所述rAAV重组包装质粒。

6.根据权利要求5所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述Hpa I酶的酶切位点片段添加在所述P5启动子的5’端，所述Eag I酶的酶切位点片段添加在所述P5启动子的3’端。

7.根据权利要求5所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述Xma I酶的酶切位点片段添加在所述连接片段的3’端，所述SnaB I酶的酶切位点片段添加在所述连接片段的5’端。

8.根据权利要求1至3以及5至7任一项所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述含两个末端反向重复序列的质粒为pAAV-MCS质粒。

9.根据权利要求1至3以及5至7任一项所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述含两个末端反向重复序列的质粒还包含GOI。

10.根据权利要求1至3以及5至7任一项所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述包装细胞选自HEK293、HEK293T和HEK293F、HEK293A、Hela、Vero和CHO中的一种或者多种；或/和，培养的条件包括：CO₂含量为4.5%-5.5%（v/v）的气体环境，温度为36.5℃-37.5℃，时间为48小时-96小时。

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