JP2023538925A - アデノ随伴ウイルスの収量を増加させるための核酸構築物及びその構築方法 - Google Patents

アデノ随伴ウイルスの収量を増加させるための核酸構築物及びその構築方法 Download PDF

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Abstract

アデノ随伴ウイルスの収量を増加させるための核酸構築物及びその構築方法に関し、核酸構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）エレメント、及びＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ＡＡＶエレメントは、Ｃａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＡＡＶシスエレメントを含む。構築方法は、外来標的遺伝子を運ぶＡＡＶエレメント及びＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドをバキュロウイルスベクター骨格に組み込むことを含む。得られた本発明の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、空カプシド率が低く、同時に単一細胞及び培養物の単位体積あたりのｒＡＡＶ収量を増加させ、生産コストを削減し、スケールアップが容易である。

Description

本発明は、遺伝子導入ベクターの技術分野に関し、特にアデノ随伴ウイルスの収量を増加させるための核酸構築物及びその構築方法に関する。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、基礎研究や臨床遺伝子治療で広く使用されている遺伝子導入ベクターである。その安全性が高く、宿主細胞範囲が広く、免疫原性が低く、生体内で外来遺伝子を発現させる時間が長いなどの特徴から、ｒＡＡＶは最も有望な遺伝子導入ベクターの１つと見なされており、世界中の遺伝子治療及びワクチン研究で広く使用されている。近年、ますます多くの研究者が大規模な動物研究及びヒト臨床試験にｒＡＡＶを使用している。ＡＡＶゲノムは、ＩＴＲ配列、非構造タンパク質Ｒｅｐ、及び構造タンパク質Ｃａｐの３つのコアエレメントを含む。
昆虫バキュロウイルス系は、組換えタンパク質を産生するための一般的な手段であり、従来のトリプルプラスミド一過性トランスフェクション法と比較して、昆虫細胞は、培養密度が高く、無血清浮遊培養が可能であり、スケールアップが容易であるという利点を有し、また、バキュロウイルス感染細胞の産生方法はバッチ安定性がより高い。研究者は２００２年からｒＡＡＶの産生にそれを使用し始めたが、昆虫細胞では、Ｃａｐ、Ｒｅｐ、及びＡＡＶベクターゲノムＤＮＡの比率が理想的な比率に達するのが容易ではなく、ＡＡＶのパッケージング効率が高くないなどの様々な理由により、従来の方法でパッケージングされた組換えＡＡＶベクターは、空カプシド率が高い（１１％～３４％）（非特許文献１）。空カプシドＡＡＶと標的遺伝子を運ぶＡＡＶの物理的及び化学的特性が非常に類似しており、精製が非常に難しいため、空カプシドＡＡＶは臨床グレードのＡＡＶベクターの製造において除去しなければならない不純物である。
Ｂｅｎｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｓｍｉｔｈ ＲＨ，Ｌｅｖｙ ＪＲ，Ｋｏｔｉｎ ＲＭ：Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ－ＡＡＶ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄｓ ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ ｒＡＡＶ ｓｔｏｃｋｓ ｆｒｏｍ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００９，１７（１１）：１８８８－１８９６．
上記の従来技術の欠点に鑑みて、本発明の目的は、従来技術の問題を解決するために、組換えアデノ随伴ウイルスの収量及び品質を向上させるための核酸構築物及びその構築方法を提供することである。
上記の目的及び他の関連する目的を達成するために、本発明の第１態様によって提供される核酸構築物は、ＡＡＶエレメント、ＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びバキュロウイルス組換え相同領域をコードするポリヌクレオチドを含み、ＡＡＶエレメントはＣａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＡＡＶシスエレメントを含む。
いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質は、Ａｃｉｅ０、Ａｃｉｅ０１、Ａｃｉｅ０２のうちの１つ以上の遺伝子によってコードされ、及び／又は、バキュロウイルス組換え相同領域は、ｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４又はｈｒ５のうちの１つ以上から選択される。
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターは、Ｇｐ６４、ｐＨ、ｐ６．９又はｐ１０のうちの１つ以上から選択される。
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、バキュロウイルスプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルス組換え相同領域に結合される。いくつかの実施形態では、バキュロウイルスプロモーターは、好ましくは、ｐＨ、Ｇｐ６４、ｐ６．９又はｐ１０のうちの１つ以上である。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶシスエレメントは、ＩＴＲ配列から選択される。
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、外来標的遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態では、外来標的遺伝子はＡＡＶエレメントに埋め込まれている。
いくつかの実施形態では、核酸構築物の構造は、ＩＥ遺伝子発現カセット－Ｃａｐ遺伝子発現カセット－ＩＴＲ－外来標的遺伝子発現カセット－ＩＴＲ－Ｒｅｐ遺伝子発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、核酸構築物の構造は、ＩＥ遺伝子発現カセット－Ｃａｐ遺伝子発現カセット－ＩＴＲ－外来標的遺伝子発現カセット－ＩＴＲ－Ｒｅｐ遺伝子発現カセットである。
いくつかの実施形態では、核酸構築物のヌクレオチド配列は、配列番号１を含み、又は配列番号１と比較して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸構築物のヌクレオチド配列は、配列番号１に示される通りである。
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、アデノ随伴ウイルスベクター又は組換えバキュロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、アデノ随伴ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、組換えバキュロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えバキュロウイルスベクターは、好ましくは組換えバキュロウイルスシャトルベクターである。
本発明の第２態様は組換えバキュロウイルスを提供し、この組換えバキュロウイルスは、上記のいずれかの核酸構築物をバキュロウイルス系によって構築することによって得られるか、又は上記のいずれかの核酸構築物中の任意のエレメントを含む核酸構築物をバキュロウイルス系によって共同構築することによって得られる。
本発明の第３態様はアデノ随伴ウイルスを提供し、このアデノ随伴ウイルスは、上記のいずれかの組換えバキュロウイルスを細胞に感染させた後にパッケージングすることによって得られる。
本発明の第４態様は細胞株を提供し、この細胞株は、上記のいずれかの組換えバキュロウイルスに感染した細胞株である。
本発明の第５態様はアデノ随伴ウイルスベクター系を提供し、このアデノ随伴ウイルスベクター系は、バキュロウイルス系及び上記の核酸構築物を含む。
本発明の第６態様は上記の核酸構築物の構築方法を提供し、この構築方法は、外来標的遺伝子を運ぶＡＡＶエレメント、ＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びバキュロウイルス組換え相同領域をコードするポリヌクレオチドをバキュロウイルスベクター骨格に組み込むことを含む。
上記方法は、以下の特徴のうちの１つ以上（例えば、２つ又は３つ）を含む。
１）ＡＡＶエレメントは、Ｃａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＡＡＶシスエレメントを含み、例えば、ＡＡＶシスエレメントは、好ましくはＩＴＲ配列である。
２）ＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ａｃｉｅ０、Ａｃｉｅ０１又はＡｃｉｅ０２のうちの１つ以上から選択される。
３）バキュロウイルスベクター骨格は、ｐＦａｓｔＢａｃｄｕａｌ、ｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＡ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＢ又はｐＦａｓｔＢａｃＨＴＣのうちの１つから選択される。
４）バキュロウイルス組換え相同領域は、ｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４又はｈｒ５のうちの１つ以上から選択される。
本発明の第７態様はアデノ随伴ウイルスの収量を増加させるための産生方法を提供し、この産生方法は、組換えバキュロウイルスを昆虫細胞株に感染させる工程を含む。
上述のように、本発明のアデノ随伴ウイルスの収量を増加させるための核酸構築物及びその構築方法は、少なくとも以下の有益な効果を有する：
１）本発明は、バキュロウイルスベクターに挿入された標的遺伝子の昆虫細胞での発現を明らかに減少させ、昆虫細胞に対する標的遺伝子発現の影響を低減し、産生細胞の増殖指標を改善し、ｒＡＡＶのパッケージングにより有利である。
２）従来の接着２９３及び２９３Ｔ細胞の産生、並びに従来のバキュロウイルス産生方法と比較して、この最適化されたベクター構築方法は、単一細胞及び培養物の単位体積あたりのｒＡＡＶ収量を明らかに増加させ、生産コストを削減し、またスケールアップすることができる。
３）様々な規模、種類のアデノ随伴ウイルス遺伝子治療ベクターの製造など、幅広い応用が可能である。
本発明のｐＦＢｄ－Ｃａｐ－ＩＴＲ－Ｒｅｐベクターの構造を示す概略図である。 本発明のｐＦＢｄ－Ｃａｐ－ＩＴＲ－Ｒｅｐベクターのマップを示す概略図である。 本発明のｐＦＢｄ－ＩＥ－ｈｒ１Ｃａｐ－ＩＴＲ－Ｒｅｐベクターの構造を示す概略図である。 本発明のｐＦＢｄ－ＩＥ－ｈｒ１Ｃａｐ－ＩＴＲ－Ｒｅｐベクターのマップを示す概略図である。 本発明のＢＶ－Ｃａｐ－ＩＴＲ－Ｒｅｐ及びＢＶ－ＩＥ－ｈｒ１Ｃａｐ－ＩＴＲ－ＲｅｐがＳＦ９細胞に感染してから２～４日後のＥＧＦＰ発現量の比較を示す図である。 ２つのＢＶ感染細胞溶解液に対する本発明のＡＡＶ Ｃａｐモノクローナル抗体のＷＢ検出を示す図である。 本発明のｒＡＡＶ２の電子顕微鏡検出（力価２．０Ｅ＋１３ＶＧ／ｍＬ）を示す図である。 本発明のＢＶ－Ｃａｐ－ＩＴＲ－Ｒｅｐ及びＢＶ－ＩＥ－ｈｒ１Ｃａｐ－ＩＴＲ－ＲｅｐでパッケージングされたｒＡＡＶ２が２９３Ｔ細胞に感染してから２日後の蛍光観察を示す図である。
本発明は、少なくとも部分的には、ＡＡＶエレメント、ＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びバキュロウイルス組換え相同領域をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物が、バキュロウイルスの宿主である昆虫細胞における挿入された標的遺伝子の発現を明らかに制御することができ、細胞状態を改善し、アデノ随伴ウイルスのパッケージング効率を高め、それによってアデノ随伴ウイルスの収量を大幅に増加させるという発見に基づいている。本発明は、ｒＡＡＶの空カプシド率を予想外に低下させ（例えば、Ｃａｐの発現量が増加しても、空カプシドの増加にはつながらない）、より優れた感染性を有するｒＡＡＶを産生し、単一細胞及び培養物の単位体積あたりのｒＡＡＶ収量を明らかに増加させることができ、したがって、様々なアデノ随伴ウイルス遺伝子治療ベクターの大規模産生に適している。
以下に別段の定義がない限り、本明細書で言及されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
「核酸構築物」という用語は、標的細胞又は組織に導入することができる人工的に構築された核酸セグメントを指し、核酸構築物はレンチウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターであってもよく、レンチウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターは、ベクター骨格、即ち空のベクター、及び発現カセットを含む。
「ベクター」という用語は、１つ以上の核酸又は１つ以上のポリヌクレオチドを標的細胞又は組織に導入又は移入するために使用される核酸断片又はポリヌクレオチド断片を指す。通常、ベクターは外来ＤＮＡを別の細胞又は組織に導入するために使用される。ベクターは、細菌中で増殖するための細菌耐性遺伝子及び生物体内で標的タンパク質を発現させるためのプロモーターを含むことができる。ＤＮＡは、ＰＣＲ又は当業者に知られている任意の他の１種以上の適切な技術によってインビトロで生成することができる。
本発明の第１態様は核酸構築物を提供し、この核酸構築物は、ＡＡＶエレメント及びＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ＡＡＶエレメントはＣａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＡＡＶシスエレメントを含む。
一実施形態では、核酸構築物は、バキュロウイルス組換え相同領域をコードするポリヌクレオチドを更に含む。
いくつかの実施形態では、核酸構築物のヌクレオチド配列は、配列番号１を含み、又は配列番号１と比較して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸構築物のヌクレオチド配列は、配列番号１に示される通りである。
配列番号１
TTCTCTGTCACAGAATGAAAATTTTTCTGTCATCTCTTCGTTATTAATGTTTGTAATTGACTGAATATCAACGCTTATTTGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTC
GGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCAGACCAGCCGCGTAACCTGGCAAAATCGGTTACGGTTGAGTAATAAATGGATGCCCTGCGTAAGCGGGTGTGGGCGGACAATAAAGTCTTAAACTGAACAAAATAGATCTAAACTATGACAATAAAGTCTTAAACTAGACAGAATAGTTGTAAACTGAAATCAGTCCAGTTATGCTGTGAAAAAGCATACTGGACTTTTGTTATGGCTAAAGCAAACTCTTCATTTTCTGAAGTGCAAATTGCCCGTCGTATTAAAGAGGGGCGTGGCCAAGGGCATGGTAAAGACTATATTCGCGGCGTTGTGACAATTTACCGAACAACTCCGCGGCCGGGAAGCCGATCTCGGCTTGAACGAATTGTTAGGTGGCGGTACTTGGGTCGATATCAAAGTGCATCACTTCTTCCCGTATGCCCAACTTTGTATAGAGAGCCACTGCGGGATCGTCACCGTAATCTGCTTGCACGTAGATCACATAAGCACCAAGCGCGTTGGCCTCATGCTTGAGGAGATTGATGAGCGCGGTGGCAATGCCCTGCCTCCGGTGCTCGCCGGAGACTGCGAGATCATAGATATAGATCTCACTACGCGGCTGCTCAAACCTGGGCAGAACGTAAGCCGCGAGAGCGCCAACAACCGCTTCTTGGTCGAAGGCAGCAAGCGCGATGAATGTCTTACTACGGAGCAAGTTCCCGAGGTAATCGGAGTCCGGCTGATGTTGGGAGTAGGTGGCTACGTCTCCGAACTCACGACCGAAAAGATCAAGAGCAGCCCGCATGGATTTGACTTGGTCAGGGCCGAGCCTACATGTGCGAATGATGCCCATACTTGAGCCACCTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACATCAAACATCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATAGACTGTACAAAAAAACAGTCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCACCGCTGCGTTCGGTCAAGGTTCTGGACCAGTTGCGTGAGCGCATACGCTACTTGCATTACAGTTTACGAACCGAACAGGCTTATGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCGTTTCCACGGTGTGCGTCACCCGGCAACCTTGGGCAGCAGCGAAGTCGAGGCATTTCTGTCCTGGCTGGCGAACGAGCGCAAGGTTTCGGTCTCCACGCATCGTCAGGCATTGGCGGCCTTGCTGTTCTTCTACGGCAAGGTGCTGTGCACGGATCTGCCCTGGCTTCAGGAGATCGGTAGACCTCGGCCGTCGCGGCGCTTGCCGGTGGTGCTGACCCCGGATGAAGTGGTTCGCATCCTCGGTTTTCTGGAAGGCGAGCATCGTTTGTTCGCCCAGGACTCTAGCTATAGTTCTAGTGGTTGGCCTACGTACCCGTAGTGGCTATGGCAGGGCTTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGTTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTATTGGTCCCAATGGGGTCTCGGTGGGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAACACCCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCGGTACCGCATGCCTTAGTTGAACTCGAACTTCTTGTACTTGCAGTTGAGCTTTTGCTCGGCGAATGTGATGGCGTCGGAGAGTGGCACCAGTCCCTGCAGGATCAAGGCCAAGAGCTTCAGCAAGTTGTTGTGCAGTGTAGTTGACTCGCGACGGTTGACCTTGCCGATCACGAACATGTGGTGCTTGAATCTGTTGTACTTTTGGA
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TGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTGGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCATCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAATCTAGAGCCTGCAGTCTCGACAAGCTTGTCGAGAAGTACTAGAGGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTGATCACTGCTTGAGCCTAGGAGATCCGAACCAGATAAGTGAAATCTAGTTCCAAACTATTTTGTCATTTTTAATTTTCGTATTAGCTTACGACGCTACACCCAGTTCCCATCTATTTTGTCACTCTTCCCTAAATAATCCTTAAAAACTCCATTTCCACCCCTCCCAGTTCCCAACTATTTTGTCCGCCCACAGCGGGGCATTTTTCTTCCTGTTATGTTTTTAATCAAACATCCTGCCAACTCCATGTGACAAACCGTCATCTTCGGCTACTTT
いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ ＤＪ／８、ＡＡＶ ｒｈ１０、ＡＡＶ Ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ又はＡＡＶ ＰＨＰ．Ｓなどの異なる血清型のＡＡＶに由来する。異なる血清型のＡＡＶのカプシドタンパク質は、細胞表面の異なる受容体を認識するため、異なる組織細胞への感染効率は大きく異なる可能性があり、特定の臓器標的特異性を示す。特定の実験目的に応じて適切な血清型のＡＡＶを選択して、特定のタイプの細胞組織への特定の血清型のＡＡＶの特異的な高効率形質導入を実現することができる。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ１に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ３に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ４に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ５に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ６に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ７に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ８に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ９に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ ＤＪに由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ ＤＪ／８に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ ｒｈ１０に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ Ｒｅｔｒｏに由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントはＡＡＶ ＰＨＰ．ｅＢ／ＰＨＰ．Ｂ／ＰＨＰ．Ｓに由来する。
Ｃａｐタンパク質は構造タンパク質であり、通常、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３構造タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、３つの構造タンパク質をＡＡＶのカプシドタンパク質に組み立てることができると考えられる。
Ｒｅｐタンパク質は非構造タンパク質であり、通常、Ｒｅｐ７８及び５２タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐタンパク質はＤＮＡの複製及びパッケージングを調節することができると考えられる。
一実施形態では、ＡＡＶシスエレメントは、末端逆位配列（ＩＴＲ配列）から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列はヘアピン構造に折り畳むことができ、ＡＡＶ
ＤＮＡ複製開始及び組換えＡＡＶビリオンのパッケージングに必要な唯一の既知のシスエレメントであると考えられる。
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、外来標的遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態では、外来標的遺伝子はＡＡＶエレメントによって運ばれ、即ち、外来標的遺伝子は、ＡＡＶエレメントに埋め込まれている。
具体的には、いくつかの実施形態では、外来標的遺伝子は両端のＩＴＲ配列の間に埋め込まれている。
好ましくは、いくつかの実施形態では、外来標的遺伝子のサイズは≦３．５ｋｂである。いくつかの実施形態では、両端のＩＴＲ配列の間のサイズ制限により、外来標的遺伝子のサイズは一般に大きすぎてはならず、さもなければパッケージング効果が低下する可能性があると考えられる。
外来遺伝子の種類は、実験の目的によって異なる。外来遺伝子は、ＡＡＤＣ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸなどの様々な疾患の治療に関連する遺伝子であってもよく、また、ＥＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子などの実験室で一般的に使用されるツール遺伝子であってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターを更に含むと考えられる。いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターは、Ｇｐ６４、ｐＨ、ｐ６．９又はｐ１０のうちの１つ以上から選択されると考えられる。いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターはＧｐ６４を含む。いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターはｐＨを含む。いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターはｐ６．９を含む。いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターはｐ１０を含む。
好ましくは、いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターはｐＨ強力プロモーターから選択される。いくつかの実施形態では、核酸構築物にｉｅの追加のコピーを加え、強力プロモーターｐＨの制御下で発現させると、ウイルスの内因性レベルを上回り、バキュロウイルス感染後の後期細胞の生存が増加すると考えられる。
いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質は、Ａｃｉｅ０、Ａｃｉｅ０１又はＡｃｉｅ０２のうちの１つ以上（例えば、２つ又は３つ）の遺伝子によってコードされるタンパク質から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質は、Ａｃｉｅ０によってコードされるタンパク質、即ちＩＥ０から選択される。Ａｃｉｅ０のヌクレオチド配列は配列番号１０に示されるとおりであり、ＩＥ０タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１１に示されるとおりである。いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質は、Ａｃｉｅ０１によってコードされるタンパク質、即ちＩＥ１から選択される。Ａｃｉｅ０１のヌクレオチド配列は配列番号１２に示されるとおりであり、ＩＥ１タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１３に示されるとおりである。いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質は、Ａｃｉｅ０２によってコードされるタンパク質、即ちＩＥ２タンパク質から選択される。Ａｃｉｅ０２のヌクレオチド配列は配列番号１４に示されるとおりであり、ＩＥ２タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１５に示されるとおりである。
配列番号１０～１５の配列は以下の通りである：
配列番号１０
ATGATAAGAACCAGCAGTCACGTGCTGAACGTCCAGGAAAATATAATGACGTCAAACTGTGCGTCATCGCCATATTCGTGCGAGGCAACGTCCGCTTGCGCAGAAGCTCAGCAGGTAATGATCGATAACTTTGTTTTCTTTCACATGTACAACGCCGACATACAAATTGACGCAAAGCTGCAATGCGGCGTGCGCTCGGCCGCGTTTGCAATGATCGACGATAAACATTTGGAAATGTACAAGCATAGAATAGAGAATAAATTTTTTTATTACTATGATCAATGTGCCGACATTGCCAAACCCGACCGTCTGCCCGATGACGACGGCGCGTGCTGTCACCATTTTATTTTTGATGCCCAACGTATTATTCAATGTATTAAAGAGATTGAAAGCGCGTACGGCGTGCGTGATCGCGGCAATGTAATAGTGTTTTATCCGTACTTGAAACAGTTGCGAGACGCGTTGAAGCTAATTAAAAACTCTTTTGCGTGTTGTTTTAAAATTATAAATTCTATGCAAATGTACGTGAACGAGTTAATATCAAATTGCCTGTTGTTTATTGAAAAGCTGGAAACTATTAATAAAACTGTTAAAGTTATGAATTTGTTTGTAGACAATTTGGTTTTGTACGAATGCAATGTTTGTAAAGAAATATCTACGGATGAAAGATTTTTAAAGCCAAAAGAATGTTGCGAATACGCTATATGCAACGCGTGCTGCGTTAACATGTGGAAGACGGCCACCACGCACGCAAAATGTCCAGCGTGCAGGACATCGTATAAATAA
配列番号１１
MIRTSSHVLNVQENIMTSNCASSPYSCEATSACAEAQQVMIDNFVFFHMYNADIQIDAKLQCGVRSAAFAMIDDKHLEMYKHRIENKFFYYYDQCADIAKPDRLPDDDGACCHHFIFDAQRIIQCIKEIESAYGVRDRGNVIVFYPYLKQLRDALKLIKNSFACCFKIINSMQMYVNELISNCLLFIEKLETINKTVKVMNLFVDNLVLYECNVCKEISTDERFLKPKECCEYAICNACCVNMWKTATTHAKCPACRTSYK
配列番号１２
ATGATCCGTACATCCAGCCACGTCCTGAACGTCCAAGAAAACATCATGACTTCCAACTGTGCTTCCAGCCCCTACTCCTGTGAGGCCACTTCAGCCTGCGCTGAGGCCCAGCAACTGCAGGTGGACACAGGTGGCGATAAGATCGTGAACAACCAGGTCACCATGACTCAAATCAACTTCAACGCTTCCTACACCTCTGCCAGCACTCCCTCTCGTGCTAGCTTCGACAACTCATACTCGGAGTTCTGCGACAAGCAACCTAACGATTACTTGTCTTACTACAACCACCCAACCCCGGACGGAGCTGATACTGTCATCTCCGACTCTGAAACCGCTGCCGCTAGCAACTTCCTCGCCTCAGTTAACTCGCTCACTGACAACGATTTGGTGGAGTGTCTGCTCAAGACCACTGACAACCTGGAGGAAGCTGTGTCCTCTGCCTACTACAGCGAGTCACTCGAACAGCCAGTGGTCGAACAACCCTCTCCTAGCTCAGCTTACCACGCCGAGTCCTTCGAACACTCTGCTGGTGTCAACCAGCCGTCGGCCACAGGCACCAAGAGGAAGTTGGACGAGTACCTGGATAACTCCCAGGGAGTTGTGGGTCAATTCAACAAGATCAAGTTGAGACCTAAGTACAAGAAGAGCACCATCCAGTCATGCGCTACACTGGAACAAACCATCAACCACAACACTAACATCTGTACAGTGGCTTCCACCCAGGAGATCACTCACTACTTCACAAACGACTTCGCCCCCTACCTGATGAGGTTCGACGATAACGACTACAACTCGAACAGATTCTCCGATCACATGTCTGAAACCGGTTACTACATGTTCGTCGTTAAGAAGTCCGAGGTGAAGCCTTTCGAAATCATCTTCGCCAAGTACGTCTCTAACGTGGTCTACGAGTACACAAACAACTACTACATGGTTGACAACCGTGTGTTCGTTGTGACCTTCGATAAGATCCGCTTCATGATCAGCTACAACCTGGTTAAGGAGACTGGCATCGAAATCCCACACTCACAGGACGTCTGCAACGATGAGACCGCCGCTCAAAACTGCAAGAAGTGTCACTTCGTGGACGTCCACCACACATTCAAGGCCGCTCTGACCTCCTACTTCAACCTCGATATGTACTACGCTCAGACAACCTTCGTGACCTTGCTGCAATCACTCGGCGAGCGTAAGTGTGGATTCCTCTTGTCGAAGTTGTACGAGATGTACCAGGACAAGAACCTCTTCACTTTGCCCATCATGCTGAGCCGCAAGGAATCAAACGAGATCGAAACCGCCTCTAACAACTTCTTCGTCTCGCCATACGTTTCCCAGATCCTCAAGTACTCGGAGTCCGTCCAATTCCCGGACAACCCTCCCAACAAGTACGTCGTTGATAACCTGAACCTCATCGTGAACAAGAAGAGCACTCTGACATACAAGTACTCGTCCGTCGCTAACCTGCTCTTCAACAACTACAAGTACCACGACAACATCGCTTCTAACAACAACGCCGAGAACCTCAAGAAGGTCAAGAAGGAAGACGGAAGCATGCACATCGTTGAGCAGTACTTGACTCAAAACGTCGATAACGTTAAGGGTCACAACTTCATCGTGTTGTCCTTCAAGAACGAGGAAAGGCTGACCATCGCTAAGAAGAACAAGGAGTTCTACTGGATCTCTGGCGAAATCAAGGACGTTGATGTGAGCCAGGTCATCCAAAAGTACAACAGATTCAAGCACCACATGTTCGTGATCGGCAAGGTCAACCGTCGCGAGTCAACTACACTGCACAACAACTTGCTGAAGCTCTTGGCCTTGATCCTGCAGGGACTGGTGCCACTCTCCGACGCCATCACATTCGCCGAGCAAAAGCTCAACTGCAAGTACAAGAAGTTCGAGTTCAACTAA
配列番号１３
MIRTSSHVLNVQENIMTSNCASSPYSCEATSACAEAQQLQVDTGGDKIVNNQVTMTQINFNASYTSASTPSRASFDNSYSEFCDKQPNDYLSYYNHPTPDGADTVISDSETAAASNFLASVNSLTDNDLVECLLKTTDNLEEAVSSAYYSESLEQPVVEQPSPSSAYHAESFEHSAGVNQPSATGTKRKLDEYLDNSQGVVGQFNKIKLRPKYKKSTIQSCATLEQTINHNTNICTVASTQEITHYFTNDFAPYLMRFDDNDYNSNRFSDHMSETGYYMFVVKKSEVKPFEIIFAKYVSNVVYEYTNNYYMVDNRVFVVTFDKIRFMISYNLVKETGIEIPHSQDVCNDETAAQNCKKCHFVDVHHTFKAALTSYFNLDMYYAQTTFVTLLQSLGERKCG
FLLSKLYEMYQDKNLFTLPIMLSRKESNEIETASNNFFVSPYVSQILKYSESVQFPDNPPNKYVVDNLNLIVNKKSTLTYKYSSVANLLFNNYKYHDNIASNNNAENLKKVKKEDGSMHIVEQYLTQNVDNVKGHNFIVLSFKNEERLTIAKKNKEFYWISGEIKDVDVSQVIQKYNRFKHHMFVIGKVNRRESTTLHNNLLKLLALILQGLVPLSDAITFAEQKLNCKYKKFEFN
配列番号１４
ATGAGTCGCCAAATCAACGCCGCCACTCCCAGCAGCAGCCGCCGCCACAGGCTGTCTCTCAGCCGTCGCCGCATCAACTTTACAACATCTCCCGAAGCCCAGCCGTCTTCAAGCAGTCGCAGCCAGCCGTCTTCAAGCAGTCGCAGCCATCGCCGTCAGGAGCGGCGTCAGGAGCAGCGTGTCAGCGAAGAAAACGTGCAGATTATCGGGAACGTCAACGAGCCGTTGACGCGCACCTACCATCGTCAGGGTGTCACGTATTACGTGCACGGTCAGGTTAACATTAGCAATGACGATCCGCTATTAAGTCAAGAGGATGACGTCATACTAATTAATAGTGAAAATGTGGATCGTGAACGGTTTCCCGACATCACTGCCCAGCAGTACCAGGATAACATTGCGTCGGAGACAGCTGCGCAGAGGGCTCTGCAACGAGGTTTAGATCTTGAGGCTCAGCTGATGAATGAGATTGCCCCAAGGTCTCCCACTTATAGTCCATCTTATTCGCCGAATTACGTAATACCACAGTCGCCAGATTTGTTTGCCTCGCCGCAGTCTCCGCAGCCGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAATCAGAACCCGAAGAAGAAGTAGAGGTTTCGTGTAATATTTGTTTTACTACTTTTAAAGACACTAAAAACGTAAATTCCTCGTTTGTGACTTCGATTCATTGTAACCATGCTGTGTGTTTCAAGTGTTATGTCAAGATAATTATGGACAATTCTGTGTACAAATGTTTTTGCAGCGCTACTTCATCAGATTGTCGCGTGTACAATAAGCACGGGTATGTAGAATTTATGCCCATTAACGTCACTCGTAACCAGGATTCCATCAAACAGCATTGGCGCGAGCTTTTAGAAAATAACACGGTCAACAATCACACCACGGACTTGAACTATGTGGAGCAATTGCAAAAAGAACTGTCCGAGCTGCGAGCCAAGACCAGCCAAGTTGAACATAAAATGACCATGTTAAACAGCGACTACATTATGCTTAAACACAAGCATGCTGTCGCCGAATTAGATTTACAAAAGGCAAACTATGACTTGCAAGAATCTACCAAGAAATCAGAAGAGTTGCAATCGACTGTGAATAATCTGCAAGAACAATTGCGTAAGCAGGTGGCCGAGTCTCAAGCCAAATTTTCAGAGTTTGAGCGCAGTAACTCTGATTTAGTTTCTAAGTTACAAACTGTTATGTCTAGACGTTAA
配列番号１５
MSRQINAATPSSSRRHRLSLSRRRINFTTSPEAQPSSSSRSQPSSSSRSHRRQERRQEQRVSEENVQIIGNVNEPLTRTYHRQGVTYYVHGQVNISNDDPLLSQEDDVILINSENVDRERFPDITAQQYQDNIASETAAQRALQRGLDLEAQLMNEIAPRSPTYSPSYSPNYVIPQSPDLFASPQSPQPQQQQQQQSEPEEEVEVSCNICFTTFKDTKNVNSSFVTSIHCNHAVCFKCYVKIIMDNSVYKCFCSATSSDCRVYNKHGYVEFMPINVTRNQDSIKQHWRELLENNTVNNHTTDLNYVEQLQKELSELRAKTSQVEHKMTMLNSDYIMLKHKHAVAELDLQKANYDLQESTKKSEELQSTVNNLQEQLRKQVAESQAKFSEFERSNSDLVSKLQTVMSRR
いくつかの実施形態では、ＩＥ１タンパク質はバキュロウイルス最初期遺伝子１（ｉｅ１）の産物であると考えられ、ＩＥタンパク質はバキュロウイルス転写調節因子タンパク質と呼ばれることもある。これは、初期及び後期ウイルス遺伝子を活性化し、ウイルスゲノム複製に関与する能力を備えた多機能タンパク質であり、ウイルスサイクルの調節に関与する。
いくつかの実施形態では、バキュロウイルス組換え相同領域（ｈｒ）は、ｈｒ１（ヌクレオチド配列が配列番号１６に示される）、ｈｒ２（ヌクレオチド配列が配列番号１７に示される）、ｈｒ３（ヌクレオチド配列が配列番号１８に示される）、ｈｒ４（ｈｒ４ ｌｅｆｔのヌクレオチド配列が配列番号１９に示され、ｈｒ４ ｒｉｇｈｔのヌクレオチド配列が配列番号２０に示される）、及びｈｒ５（ヌクレオチド配列が配列番号２１に示される）のうちの１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ又は５つ）から選択される。
配列番号１６～２１の配列は以下の通りである：
配列番号１６
ATCGATGTTGACCCCAACAAAAGATTTATAATTAATCATAATCACGAACAACAACAAGTCAATGAAACAAATAAACAAGTTGTCGATAAAACATTCATAAATGACACAGCAACATACAATTCTTGCATAATAAAAATTTAAATGACATCATATTTGAGAATAACAAATGACATTATCCCTCGATTGTGTTTTACAAGTAGAATTCTACCCGTAAAGCGAGTTTAGTTTTGAAAAACAAATGACATCATTTGTATAATGACATCATCCCCTGATTGTGTTTTACAAGTAGAATTCTATCCGTAAAGCGAGTTCAGTTTTGA
AAACAAATGAGTCATACCTAAACACGTTAATAATCTTCTGATATCAGCTTATGACTCAAGTTATGAGCCGTGTGCAAAACATGAGATAAGTTTATGACATCATCCACTGATCGTGCGTTACAAGTAGAATTCTACTCGTAAAGCCAGTTCGGTTATGAGCCGTGTGCAAAACATGACATCAGCTTATGACTCATACTTGATTGTGTTTTACGCGTAGAATTCTACTCGTAAAGCGAGTTCGGTTATGAGCCGTGTGCAAAACATGACATCAGCTTATGAGTCATAATTAATCGTGCGTTACAAGTAGAATTCTACTCGTAAAGCGAGTTGAAGGATCATATTTAGTTGCGTTTATGAGATAAGATTGAAAGCACGTGTAAAATGTTTCCCGCGCGTTGGCACAACTATTTACAATGCGGCCAAGTTATAAAAGATTCTAATCTGATATGTTTTAAAACACCTTTGCGGCCCGAGTTGTTTGCGTACGTGACTAGCGAAGAAGATGTGTGGACCGCAGAACAGATAGTAAAACAAAACCCTAGTATTGGAGCAATAATCGAT
配列番号１７
TGAGCAAAACACAACCGGCAAATTCTCGGCGGCCGTTTGGGAATGCGGAATAATTGCCATATGTAAATGATGTCATCGGTTCTAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTACGTGTAAAACATAATCAAGAGATGATGTCATTTGTTTTTCAAAACTGAACTCAAGAAATGATGTCATTTGTTTTTCAAAACTGAACTGGCTTTACGAGTAGAATTCTACTTGTAAAACACAATCGAGAGATGATGTCATATTTTGCACACGGCTCTAATTAAACTCGCTTTACGAGTAAAATTCTACTTGTAACGCATGATCAAGGGATGATGTCATTGGATGAGTCATTTGTTTTTCAAAACTAAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTACTTGTAAAACACAATCAAGGGATGATGTCATTATACAAATGATGTCATTTGTTTTTCAAAACTAAACTCGCTTTACGGGTAGAATTCTACTTGTAAAACAGCAACTCGAGGGATGATGTCATCCTTTACTCGATGATTATAAACGTGTTTATGTATGACTCATTTGTTTTTCAAAACTAAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTACTTGTAACGCACGATCAAGGGATGATGTCATTTATTTGTGCAAAGCTCGATGTCATCTTTTGCACACGATTATAAACACAATCCAAATAATGACTCATTTGTTTTCAAAACTGAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTACTTGTAAAACACAATCAAGGGATGATGTCATTTTCAAAATGATGTCATTTGTTTTTCAAAACTAAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTACTTGTAAAACACAATCAAGGGATGATGTCATTTTAAAAATGATCATTTGTTTTTCAAAACTAAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTACGTGTAAAACACAATCAAGGGATGATGTCATTTACTAAATAAAATAATTATTTAAATAAAACTGTTTTTTATTGTCAAATACACATTGATTCAC
配列番号１８
ACGCGTAGAATTCTACTTGTAAAGCAAGTTAAAATAAGCCGTGTGCAAAAATGACATCAGACAAATGACATCATCTACCTATCATGATCATGTTAATAATCATGTTTTAAAATGACATCAGCTTATGACTAATAATTGATCGTGCGTTACAAGTAGAATTCTACTCGTAAAGCGAGTTTAGTTTTGAAAACAAATGAGTCATCATTAAACATGTTAATAATCGTGTATAAAGGATGACATCATCCACTAATCGTGCGTTACAAGTAGAATTCTACTCGTAAAGCGAGTTCGGTTTTGAAAAACAAATGACATCATTTCTTGATTGTGTTTTACACGTAGAATTCTACTCGTAAAGTATGTTCAGTTTAAAAAACAAATGACATCATTTTACAGATGACATCATTTCTTGATTATGTTTTACAAGTAGAATTCTACTCGTAAAGCGAGTTTAGTTTTAAAAAACAAATGACATCATCTCTTGATTATGTTTTACAAGTAGAATTCTACTCGTAAAGCGAGTTTAGTTTTGAAAAACAAATGACATCATCTCTTGATTATGTTTTACAAGTAGAATTCTACTCGTAAAGCGAGTTTAGTTTTGAAAAACAAATGACATCATCCCTTGATCATGCGTTACAAGTAGAATTCTACTCGTAAAGCGAGTTGAATTTTGATTACAATATT
配列番号１９
ATGCATATAATTGTGTACAAAATATGACTCATTAATCGATCGTGCGTTACAAGTAGAATTCTACTGGTAAAGCAAGTTCGGTTGTGAGCCGTGTGCAAAACATGACATCATAACTAATCATGTTTATAATCATGTGCAAAATATGACATCATCCGACGATTGTGTTTTACAAGTAGAATTCTACTCGTAAAGCGAGTTTAAAAATTTTGTGACGTCAATGAAACAACGTGTAATATTTTTTACAATATTTAAGTGAAACATTATGACTTCCAATAATTTTGTGGATGTGGATACGTTTGCAAGACAATTGATTACAGATAAATGTAGTGCTCTAATCGAAAGATGCGGATCTGTTGCCGGCAAACATTTTAGAGATTAGTAGAGAAAGGCCAGAGACAAGTATTTTGAGGTGCCAACTCAAAAAAACTATGAATACATTAAAAAATTATTTTTACGAACAAAATATATGGACGATTCGATAGATTATAAAGATTTTAACAGACGCATCCTATTGATAGTTTTTAAATTCGCTTTAAACAAGAGCACCAACTACTTTCCATCGTACTAAAGAGATCATCGAGGTGGCCATTAAACGTTTAAACAAAATTAACCCCGATTTAAAGAGTTCTCCGCGCAATGCTTCAGCATTACAAATGAATGTTTGGAAAATCTAGA
配列番号２０
AACTGGCTTTACGAGTAGAATTCTACTTGTAAAACACAATCAAGAAATGATGTCATTTTTGTACGTGATTATAAACATGTTTAAACATGGTACATTGAACTTAATTTTTGCAAGTTGATAAACTAGATTAATGTATGACTCATTTGTTTGTGCAAGTTGATAAACGTGATTAATATATGACTCATATGTTTGTGCAAAAATGGTGTCATCGTACAAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTA
CTTGTAAAACACAATCGAGGGATGATGTCATTTGTAGAATGATGTCATTTGTTTTTTCAAAACCGAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTACTTGTAAAACACAATCGAGGGATGATGTCATTTGTAGAATGATGTCATCGTACAAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTAGTAAAACAC
配列番号２１
TTGAAAATTTATTGCCTAATATTATTTTTGTCAGTTCGTTGTCATTTATTAATTTGGATGATGTCCATTTGTTTTTAAAATTGAACTGGCTTTACGAGTAGAATTCTACGCGTAAAACACAATCAAGTATGAGTCATAAGCTGATGTCATGTTTTGCACACGGCTCATAACCGAACTGGCTTTACGAGTAGAATTCTACTTGTAACGCACGATCGAGTGGATGATGGTCATTTGTTTTTCAAATCGAGATGATGTCATGTTTTGCACACGGGCTCATAAACTGCTTTACGAGTAGAATTCTACGTGTAACGCACGATCGATTGATGAGTCATTTGTTTTGCAATATGATATCATACAATATGACTCATTTGTTTTTCAAAACCGAACTTGATTTACGGGTAGAATTCTACTCGTAAAGCACAATCAAAAAGATGATGTCATTTGTTTTTCAAAACTGAACTCTCGGCTTTACGAGTAGAATTCTACGTGTAAAACACAATCAAGAAATGATGTCATTTGTTATAAAAATAAAAGCTGATGTCATGTTTTGCACATGGCTCATAACTAAACTCGCTTTACGGGTAGAATTCTACGCGTAAAACATGATTGATAATTAAATAATTCATTTGCAAAGCTATACGTTAAATCAAACGGACGTTATGGAATTGTATAATATTAAATATGCAATTGATCCAACAAATAAAATTATAATAGAGCAAGTCGAC
好ましくは、いくつかの実施形態では、バキュロウイルス組換え相同領域はｈｒ１から選択される。いくつかの実施形態では、ｈｒ１はバキュロウイルスゲノムに散在する反復配列であり、ｈｒ１はバキュロウイルスの複製起点であるだけでなく、エンハンサーとしての機能も有すると考えられる。その増強効果は感染初期では明らかではないが、感染後期ではより顕著になる。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス組換え相同領域（ｈｒ）はｈｒ２を含む。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス組換え相同領域（ｈｒ）はｈｒ３を含む。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス組換え相同領域（ｈｒ）はｈｒ４を含む。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス組換え相同領域（ｈｒ）はｈｒ５を含む。
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、バキュロウイルスプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、バキュロウイルスプロモーターは、ポリヘドロンプロモーター（ｐＨ）、Ｇｐ６４、ｐ６．９又はｐ１０のうちの１つ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）から選択される。いくつかの実施形態では、ｈｒはバキュロウイルスプロモーターにシスで結合して、ＩＥ媒介トランス活性化を促進することができ、同時に、ＩＥは二量体形態でｈｒ１に結合して、下流タンパク質の発現量を増加させると考えられる。
いくつかの実施形態では、核酸構築物の構造は、ＩＥ遺伝子発現カセット－Ｃａｐ遺伝子発現カセット－ｈｒ１－ＩＴＲ－外来標的遺伝子発現カセット－ＩＴＲ－Ｒｅｐ遺伝子発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、核酸構築物の構造は、ＩＥ遺伝子発現カセット－Ｃａｐ遺伝子発現カセット－ＩＴＲ－外来標的遺伝子発現カセット－ＩＴＲ－Ｒｅｐ遺伝子発現カセットである。
遺伝子発現カセットは、遺伝子及びそのプロモーターを含む。
好ましい実施形態では、核酸構築物の構造は、ｐＡ－ＩＥ１－ｐＨ－ｐＡ－Ｃａｐ－ｐ６．９ｐ１０－ｈｒ１－ＩＴＲ－外来標的遺伝子及びそのプロモーター－ｐＡ－ＩＴＲ－ｐＨ－Ｒｅｐ－ｐＡを含む。好ましい実施形態では、核酸構築物の構造は、ｐＡ－ＩＥ１－ｐＨ－ｐＡ－Ｃａｐ－ｐ６．９ｐ１０－ｈｒ１－ＩＴＲ－外来標的遺伝子及びそのプロモーター－ｐＡ－ＩＴＲ－ｐＨ－Ｒｅｐ－ｐＡである。
具体的には、いくつかの実施形態では、核酸構築物は、アデノ随伴ウイルスベクター又は組換えバキュロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、アデノ随伴ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、組換えバキ
ュロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えバキュロウイルスベクターは、組換えバキュロウイルスシャトルベクターである。
いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクター又は組換えバキュロウイルスベクターは、ベクター骨格を更に含む。
いくつかの実施形態では、ベクター骨格は、ｐＦａｓｔＢａｃｄｕａｌ、ｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＡ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＢ又はｐＦａｓｔＢａｃＨＴＣなどの市場で販売されている適切なベクター骨格から選択することができる。
一実施形態では、ベクター骨格はｐＦａｓｔＢａｃｄｕａｌである。
いくつかの実施形態では、核酸構築物をパッケージングすることによって得られるｒＡＡＶの力価は、少なくとも１ｘ１０１２ＶＧ／ｍＬ（例えば、少なくとも１．５ｘ１０１２、２ｘ１０１２、２．５ｘ１０１２、３ｘ１０１２、３．５ｘ１０１２、４ｘ１０１２、４．５ｘ１０１２、５ｘ１０１２、５．５ｘ１０１２、６ｘ１０１２、７ｘ１０１２、７．５ｘ１０１２、８ｘ１０１２、８．５ｘ１０１２、９ｘ１０１２、９．５ｘ１０１２、１ｘ１０１３、５ｘ１０１３、又は１ｘ１０１４ＶＧ／ｍＬ）であり、即ち、ウイルス培養液１ｍｌあたりに含まれるＡＡＶゲノムのコピー数は、少なくとも１ｘ１０１２（例えば、少なくとも１．５ｘ１０１２、２ｘ１０１２、２．５ｘ１０１２、３ｘ１０１２、３．５ｘ１０１２、４ｘ１０１２、４．５ｘ１０１２、５ｘ１０１２、５．５ｘ１０１２、６ｘ１０１２、７ｘ１０１２、７．５ｘ１０１２、８ｘ１０１２、８．５ｘ１０１２、９ｘ１０１２、９．５ｘ１０１２、１ｘ１０１３、５ｘ１０１３、又は１ｘ１０１４）である。
いくつかの実施形態では、核酸構築物をパッケージングすることによって得られるｒＡＡＶの力価は、少なくとも２．６０Ｅ＋１２ＶＧ／ｍＬであり、即ち、ウイルス培養液１ｍｌあたりに含まれるＡＡＶゲノムのコピー数は、少なくとも２．６０Ｅ＋１２である。
ｒＡＡＶの収量はｑＰＣＲ方法によって検出され、検出手順は以下のとおりである。
定量ＰＣＲで使用される標準品は、ＰｖｕＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）単一制限酵素消化によって線形化されたｐＡＡＶ－ＭＣＳプラスミドである。
定量ＰＣＲで使用されるプライマー配列は以下のとおりである。
ＩＴＲ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’（配列番号２）
ＩＴＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’（配列番号３）
定量ＰＣＲ操作プログラム：９５℃で６０秒間（９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、４０サイクル）。定量ＰＣＲで得られたＣＴ値及び標準品の濃度から標準曲線を描いた後、サンプルの力価を換算する。
本発明の第２態様は組換えバキュロウイルスを提供し、この組換えバキュロウイルスは、上記のいずれかの核酸構築物をバキュロウイルス系によって構築することによって得られるか、又は上記のいずれかの核酸構築物中の任意のエレメントを含む核酸構築物をバキュロウイルス系によって共同構築することによって得られる。
上記のいずれかの核酸構築物中の任意のエレメントを含む核酸構築物は主に、ＡＡＶエ
レメントを含む核酸構築物、ＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物、バキュロウイルス組換え相同領域をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物を指す。ＡＡＶエレメントを含む核酸構築物はまた、Ｃａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ＡＡＶシスエレメントをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物から選択することができる。組換えバキュロウイルスは、上記の核酸構築物をバキュロウイルス系によって共同構築することによって得ることができる。
バキュロウイルス系は、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ由来）、ｆｌａｓｈＢａｃ／ＢａｃＭａｇｉｃシステム（Ｍｉｒｕｓ／ＥＭＤ／ＯＥＴ／Ｎｅｘｔｇｅｎ由来）、ＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ由来）又はＢａｃＰＡＫ６／Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ由来）から選択される。
具体的には、組換えバキュロウイルスは、コンピテント細胞を上記核酸構築物で形質転換し、Ｂａｃｍｉｄを抽出し、ＳＦ９昆虫細胞をトランスフェクトすることによって得られる。
コンピテント細胞は、本発明の発明目的を限定しない限り、当技術分野で適用可能な任意のコンピテント細胞から選択することができる。例えば、コンピテント細胞はＤＨ１０Ｂａｃであり得る。
本発明の第３態様はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供し、このアデノ随伴ウイルスは、上記のいずれかの組換えバキュロウイルスをパッケージングすることによって得られる。アデノ随伴ウイルスは、血友病、脊髄性筋萎縮症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、パーキンソン病、加齢黄斑変性症などの様々な疾患を治療するために使用することができる。
本発明の第４態様は細胞株を提供し、この細胞株は、上記のいずれかの組換えバキュロウイルスに感染した細胞株である。
いくつかの実施形態では、細胞株は、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、Ｈｉｇｈ５細胞などの昆虫細胞株である。
本発明の第５態様はアデノ随伴ウイルスベクター系を提供し、このアデノ随伴ウイルスベクター系は、バキュロウイルス系及び上記の核酸構築物を含む。
本発明の第６態様は上記の核酸構築物の構築方法を提供し、この構築方法は、外来標的遺伝子を運ぶＡＡＶエレメント及びＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドをバキュロウイルスベクター骨格に組み込むことを含む。
構築方法は、バキュロウイルス組換え相同領域をコードするポリヌクレオチドをバキュロウイルスベクター骨格に組み込むことを更に含む。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶエレメントは、Ｃａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＡＡＶシスエレメントを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶシスエレメントは、末端逆位配列（ＩＴＲ配列）から
選択される。
具体的には、いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、強力プロモーターｐＨに結合される。
いくつかの実施形態では、バキュロウイルス組換え相同領域タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、バキュロウイルスプロモーターにシスで結合される。いくつかの実施形態では、バキュロウイルスプロモーターはｐ６．９又はｐ１０である。
いくつかの実施形態では、バキュロウイルスベクター骨格は、ｐＦａｓｔＢａｃｄｕａｌ、ｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＡ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＢ又はｐＦａｓｔＢａｃＨＴＣなどから選択される。
いくつかの実施形態では、バキュロウイルス組換え相同領域は、ｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４又はｈｒ５のうちの１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、又は５つ）から選択される。
本発明の第７態様はアデノ随伴ウイルスの産生方法を提供し、この産生方法は、組換えバキュロウイルスを昆虫細胞株に感染させる工程を含む。
このアデノ随伴ウイルスの産生方法は、アデノ随伴ウイルスの収量を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、細胞株は昆虫細胞株から選択される。一実施形態では、昆虫細胞株はＳＦ９細胞から選択される。
本発明の第８態様は、疾患を治療する方法を提供し、この方法は、有効量の上記のいずれかのアデノ随伴ウイルスを患者に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、疾患には、例えば、血友病、脊髄性筋萎縮症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、パーキンソン病、加齢黄斑変性症などが含まれる。
本発明はまた、以下の任意の番号付き段落を含む。
１．核酸構築物であって、ＡＡＶエレメント、及びＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ＡＡＶエレメントがＣａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＡＡＶシスエレメントを含むことを特徴とする、核酸構築物。
２．バキュロウイルス組換え相同領域をコードするポリヌクレオチドを更に含むことを特徴とする、段落１に記載の核酸構築物。
３．ＩＥタンパク質が、Ａｃｉｅ０、Ａｃｉｅ０１又はＡｃｉｅ０２のうちの１つ以上によってコードされるタンパク質から選択され、及び／又は、バキュロウイルス組換え相同領域がｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４又はｈｒ５のうちの１つ以上から選択されることを特徴とする、段落２に記載の核酸構築物。
４．核酸構築物がＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターを更に含み、ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターがＧｐ６４、ｐＨ、ｐ６．９又はｐ１０のうちの１つ以上から選択されることを特徴とする、段落１～３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
５．核酸構築物がバキュロウイルスプロモーターを更に含み、バキュロウイルスプロモーターがバキュロウイルス組換え相同領域に結合されており、バキュロウイルスプロモーターが好ましくはｐＨ、Ｇｐ６４、ｐ６．９又はｐ１０の１つ以上であることを特徴とする、段落１～４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
６．ＡＡＶシスエレメントがＩＴＲ配列から選択されることを特徴とする、段落１～５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
７．核酸構築物が外来標的遺伝子を更に含み、外来標的遺伝子がＡＡＶエレメントに埋め込まれていることを特徴とする、段落１～６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
８．核酸構築物の構造が、ＩＥ遺伝子発現カセット－Ｃａｐ遺伝子発現カセット－ＩＴＲ－外来標的遺伝子発現カセット－ＩＴＲ－Ｒｅｐ遺伝子発現カセットであることを特徴とする、段落１～７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
９．核酸構築物のヌクレオチド配列が配列番号１であることを特徴とする、段落１～８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
１０．核酸構築物がアデノ随伴ウイルスベクター又は組換えバキュロウイルスベクターであり、組換えバキュロウイルスベクターが好ましくは組換えバキュロウイルスシャトルベクターであることを特徴とする、段落１～９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
１１．段落１～１０のいずれか一項に記載の核酸構築物をバキュロウイルス系によって構築することによって得られるか、又は段落１～１０のいずれか一項に記載の核酸構築物中の任意のエレメントを含む核酸構築物をバキュロウイルス系によって共同構築することによって得られることを特徴とする、組換えバキュロウイルス。
１２．段落１１に記載の組換えバキュロウイルスを細胞に感染させた後にパッケージングすることによって得られることを特徴とする、アデノ随伴ウイルス。
１３．段落１１に記載の組換えバキュロウイルスに感染した細胞株であることを特徴とする、細胞株。
１４．バキュロウイルス系及び段落１～１０のいずれか一項に記載の核酸構築物を含むことを特徴とする、アデノ随伴ウイルスベクター系。
１５．外来標的遺伝子を運ぶＡＡＶエレメント及びＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドをバキュロウイルスベクター骨格に組み込むことを含むことを特徴とする、段落１～１０のいずれか一項に記載の核酸構築物を構築する方法。
１６．構築方法が以下の特徴のうちの１つ以上を含むことを特徴とする、段落１５に記載の構築方法。
１）ＡＡＶエレメントは、Ｃａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＡＡＶシスエレメントを含み、ＡＡＶシスエレメントは、好ましくはＩＴＲ配列である。
２）ＩＥタンパク質は、Ａｃｉｅ０、Ａｃｉｅ０１又はＡｃｉｅ０２遺伝子のうちの１つ以上によってコードされる。
３）バキュロウイルスベクター骨格は、ｐＦａｓｔＢａｃｄｕａｌ、ｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＡ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＢ又はｐＦａｓｔＢａｃＨＴＣのうちの１つから選択される。
４）バキュロウイルス組換え相同領域は、ｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４又はｈｒ５のうちの１つ以上から選択される。
５）バキュロウイルス組換え相同領域をコードするポリヌクレオチドをバキュロウイルスベクター骨格に組み込む。
１７．段落１１に記載の組換えバキュロウイルスを昆虫細胞株に感染させる工程を含むことを特徴とする、アデノ随伴ウイルスの産生方法。
以下、特定の具体例を通じて本発明の実施形態を説明するが、当業者は、本明細書に開示された内容から本発明の他の利点及び効果を容易に理解することができる。本発明はまた、他の異なる特定の実施形態によって実施又は適用することでき、本発明の精神から逸脱することなく、異なる観点及び用途に基づいて、本明細書の細部に様々な修正又は変更を加えることができる。
本発明の具体的な実施形態を更に説明する前に、本発明の保護範囲は、以下の特定の具体的な実施形態に限定されないことを理解されたい。また、本発明の実施例で使用される用語は、特定の具体的な実施形態を説明するためのものであり、本発明の保護範囲を限定するものではないことも理解されたい。本発明の明細書及び特許請求の範囲において、単数形「１つ」、「一」及び「この」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形を含む。
実施例が数値範囲を与える場合、本発明において別段の記載がない限り、各数値範囲の２つの終点及び２つの終点間の任意の値を選択できることを理解すべきである。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。実施例で使用される特定の方法、装置、及び材料に加えて、当業者はまた、従来技術の把握及び本発明の記載に従って、本発明の実施例に記載される方法、装置、及び材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、装置及び材料を使用して本発明を実現することができる。
以下の実施例では、ＥＧＦＰを外来標的遺伝子として例に挙げる。
実施例１ 組換えバキュロウイルスシャトルベクターの構築及び組換えバキュロウイルスの取得
関連遺伝子の決定：Ｃａｐタンパク質及びＲｅｐタンパク質の遺伝子はいずれもＡＡＶ２ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０４３３０３．１）に由来し、リボソームリーキースキャニングメカニズムに基づいて、文献（非特許文献２）を参照して塩基の点突然変異を行った。Ａｃｉｅ０１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００１６２３．１）、バキュロウイルス組換え相同領域ｈｒ１（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ１４３１３．１）。
それぞれ対応する配列の合成を遺伝子会社に委託した：Ｃａｐ遺伝子配列（配列番号４のヌクレオチド配列）、Ｒｅｐ遺伝子配列（配列番号５のヌクレオチド配列）、ｈｒ１とｐ６．９、ｐ１０プロモーターの組み合わせ（ｈｒ１ｐ６．９ｐ１０、配列番号６のヌクレオチド配列）、ｐＨプロモーターとＡｃｉｅ０１の組み合わせ（ｐＨ－Ａｃｉｅ０１、配列番号７のヌクレオチド配列）。当技術分野で周知の相同組換え法を使用して上記の配列及びｐＡＡＶ－ＥＧＦＰベクター（康霖生物科技（杭州）有限公司によって形質転換された）中のＩＴＲ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ配列をｐＦａｓｔＢａｃｄｕａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定及び同定後に２つの組換えバキュロウイルスシャトルベクター、ｐＦＢｄ－Ｃａｐ－ＩＴＲ－Ｒｅｐ（図１及び図２、配列番号８のヌクレオチド配列）及びｐＦＢｄ－ＩＥ－ｈｒ１Ｃａｐ－ＩＴＲ－Ｒｅｐ（図３及び図４、配列番
号９のヌクレオチド配列）をそれぞれ得た。
配列番号４～９の配列は以下の通りである：
配列番号４
ACGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCCGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGCCTTGTGCTTCCCGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTGGACAAGGGAGAGCCGGTGAACGAGGCAGACGCCGCTGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCTTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTCCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGATGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGTACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGACGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAACTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAGAACAAACACTCCAAGTGGAACCACCACGCAGTCAAGGCTTCAGTTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAGTATCAAAGACATCTGCGGATAACAACAACAGTGAATACTCGTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCGATGGCAAGCCACAAGGACGATGAAGAAAAGTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAGGCTCAGAGAAAACAAATGTGGACATTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGACAACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGAGAGGCAACAGACAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAAAGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCTCATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATTCTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCACCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA
配列番号５
CTGGCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAGTGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACTTGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAGTGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACTTACACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCTTAGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAACGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGACGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATTTAGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGACGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATACAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTGGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGC
GTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCATCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAA
配列番号６
ATCGATGTTGACCCCAACAAAAGATTTATAATTAATCATAATCACGAACAACAACAAGTCAATGAAACAAATAAACAAGTTGTCGATAAAACATTCATAAATGACACAGCAACATACAATTCTTGCATAATAAAAATTTAAATGACATCATATTTGAGAATAACAAATGACATTATCCCTCGATTGTGTTTTACAAGTAGAATTCTACCCGTAAAGCGAGTTTAGTTTTGAAAAACAAATGACATCATTTGTATAATGACATCATCCCCTGATTGTGTTTTACAAGTAGAATTCTATCCGTAAAGCGAGTTCAGTTTTGAAAACAAATGAGTCATACCTAAACACGTTAATAATCTTCTGATATCAGCTTATGACTCAAGTTATGAGCCGTGTGCAAAACATGAGATAAGTTTATGACATCATCCACTGATCGTGCGTTACAAGTAGAATTCTACTCGTAAAGCCAGTTCGGTTATGAGCCGTGTGCAAAACATGACATCAGCTTATGACTCATACTTGATTGTGTTTTACGCGTAGAATTCTACTCGTAAAGCGAGTTCGGTTATGAGCCGTGTGCAAAACATGACATCAGCTTATGAGTCATAATTAATCGTGCGTTACAAGTAGAATTCTACTCGTAAAGCGAGTTGAAGGATCATATTTAGTTGCGTTTATGAGATAAGATTGAAAGCACGTGTAAAATGTTTCCCGCGCGTTGGCACAACTATTTACAATGCGGCCAAGTTATAAAAGATTCTAATCTGATATGTTTTAAAACACCTTTGCGGCCCGAGTTGTTTGCGTACGTGACTAGCGAAGAAGATGTGTGGACCGCAGAACAGATAGTAAAACAAAACCCTAGTATTGGAGCAATAATCGATGACGTCGCTGACGTAGCGCTTTGAATTCCGCGCGCTTCGGACCGGGATCGTGACCAAATTCCGTTTTGCGACGATGCAGAGTTTTTGAACAGGCTGCTCAAACACATAGATCCGTACCCGCTCAGTCGGATGTATTACAATGCAGCCAATACCATGTTTTACACGACTATGGAAAACTATGCCGTGTCCAATTGCAAGTTCAACATTGAGGATTACAATAACATATTTAAGGTGATGGAAAATATTAGGAAACACAGCAACAAAAATTCAAACGACCAAGACGAGTTAAACATATATTTGGGAGTTCAGTCGTCGAATGCAAAGCGTAAAAAATATTAATAAGGTAAAAATTACAGCTACATAAATTACACAATTTAAACTGCAGTCTGGAGATACGGACCTTTAATTCAACCCAACACAATATATTATAGTTAAATAAGAATTATTATCAAATCATTTGTATATTAATTAAAATACTATACTGTAAATTACATTTTATTTACAATC
配列番号７
AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTGATCACTGCTTGAGCCTAGGAGATCCGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCATGATCCGTACATCCAGCCACGTCCTGAACGTCCAAGAAAACATCATGACTTCCAACTGTGCTTCCAGCCCCTACTCCTGTGAGGCCACTTCAGCCTGCGCTGAGGCCCAGCAACTGCAGGTGGACACAGGTGGCGATAAGATCGTGAACAACCAGGTCACCATGACTCAAATCAACTTCAACGCTTCCTACACCTCTGCCAGCACTCCCTCTCGTGCTAGCTTCGACAACTCATACTCGGAGTTCTGCGACAAGCAACCTAACGATTACTTGTCTTACTACAACCACCCAACCCCGGACGGAGCTGATACTGTCATCTCCGACTCTGAAACCGCTGCCGCTAGCAACTTCCTCGCCTCAGTTAACTCGCTCACTGACAACGATTTGGTGGAGTGTCTGCTCAAGACCACTGACAACCTGGAGGAAGCTGTGTCCTCTGCCTACTACAGCGAGTCACTCGAACAGCCAGTGGTCGAACAACCCTCTCCTAGCTCAGCTTACCACGCCGAGTCCTTCGAACACTCTGCTGGTGTCAACCAGCCGTCGGCCACAGGCACCAAGAGGAAGTTGGACGAGTACCTGGATAACTCCCAGGGAGTTGTGGGTCAATTCAACAAGATCAAGTTGAGACCTAAGTACAAGAAGAGCACCATCCAGTCATGCGCTACACTGGAACAAACCATCAACCACAACACTAACATCTGTACAGTGGCTTCCACCCAGGAGATCACTCACTACTTCACAAACGACTTCGCCCCCTACCTGATGAGGTTCGACGATAACGACTACAACTCGAACAGATTCTCCGATCACATGTCTGAAACCGGTTACTACATGTTCGTCGTTAAGAAGTCCGAGGTGAAGCCTTTCGAAATCATCTTCGCCAAGTACGTCTCTAACGTGGTCTACGAGTACACAAACAACTACTACATGGTTGACAACCGTGTGTTCGTTGTGACCTTCGATAAGATCCGCTTCATGATCAGCTACAACCTGGTTAAGGAGACTGGCATCGAAATCCCACACTCACAGGACGTCTGCAACGATGAGACCGCCGCTCAAAACTGCAAGAAGTGTCACTTCGTGGACGTCCACCACACATTCAAGGCCGCTCTGACCTCCTACTTCAACCTCGATATGTACTACGCTCAGACAACCTTCGTGACCTTGCTGCAATCACTCGGCGAGCGTAAGTGTGGATTCCTCTTGTCGAAGTTGTACGAGATGTA
CCAGGACAAGAACCTCTTCACTTTGCCCATCATGCTGAGCCGCAAGGAATCAAACGAGATCGAAACCGCCTCTAACAACTTCTTCGTCTCGCCATACGTTTCCCAGATCCTCAAGTACTCGGAGTCCGTCCAATTCCCGGACAACCCTCCCAACAAGTACGTCGTTGATAACCTGAACCTCATCGTGAACAAGAAGAGCACTCTGACATACAAGTACTCGTCCGTCGCTAACCTGCTCTTCAACAACTACAAGTACCACGACAACATCGCTTCTAACAACAACGCCGAGAACCTCAAGAAGGTCAAGAAGGAAGACGGAAGCATGCACATCGTTGAGCAGTACTTGACTCAAAACGTCGATAACGTTAAGGGTCACAACTTCATCGTGTTGTCCTTCAAGAACGAGGAAAGGCTGACCATCGCTAAGAAGAACAAGGAGTTCTACTGGATCTCTGGCGAAATCAAGGACGTTGATGTGAGCCAGGTCATCCAAAAGTACAACAGATTCAAGCACCACATGTTCGTGATCGGCAAGGTCAACCGTCGCGAGTCAACTACACTGCACAACAACTTGCTGAAGCTCTTGGCCTTGATCCTGCAGGGACTGGTGCCACTCTCCGACGCCATCACATTCGCCGAGCAAAAGCTCAACTGCAAGTACAAGAAGTTCGAGTTCAACTAA
配列番号８
TTCTCTGTCACAGAATGAAAATTTTTCTGTCATCTCTTCGTTATTAATGTTTGTAATTGACTGAATATCAACGCTTATTTGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCAGACCAGCCGCGTAACCTGGCAAAATCGGTTACGGTTGAGTAATAAATGGATGCCCTGCGTAAGCGGGTGTGGGCGGACAATAAAGTCTTAAACTGAACAAAATAGATCTAAACTATGACAATAAAGTCTTAAACTAGACAGAATAGTTGTAAACTGAAATCAGTCCAGTTATGCTGTGAAAAAGCATACTGGACTTTTGTTATGGCTAAAGCAAACTCTTCATTTTCTGAAGTGCAAATTGCCCGTCGTATTAAAGAGGGGCGTGGCCAAGGGCATGGTAAAGACTATATTCGCGGCGTTGTGACAATTTACCGAACAACTCCGCGGCCGGGAAGCCGATCTCGGCTTGAACGAATTGTTAGGTGGCGGTACTTGGGTCGATATCAAAGTGCATCACTTCTTCCCGTATGCCCAACTTTGTATAGAGAGCCACTGCGGGATCGTCACCGTAATCTGCTTGCACGTAGATCACATAAGCACCAAGCGCGTTGGCCTCATGCTTGAGGAGATTGATGAGCGCGGTGGCAATGCCCTGCCTCCGGTGCTCGCCGGAGACTGCGAGATCATAGATATAGAT
CTCACTACGCGGCTGCTCAAACCTGGGCAGAACGTAAGCCGCGAGAGCGCCAACAACCGCTTCTTGGTCGAAGGCAGCAAGCGCGATGAATGTCTTACTACGGAGCAAGTTCCCGAGGTAATCGGAGTCCGGCTGATGTTGGGAGTAGGTGGCTACGTCTCCGAACTCACGACCGAAAAGATCAAGAGCAGCCCGCATGGATTTGACTTGGTCAGGGCCGAGCCTACATGTGCGAATGATGCCCATACTTGAGCCACCTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACATCAAACATCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATAGACTGTACAAAAAAACAGTCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCACCGCTGCGTTCGGTCAAGGTTCTGGACCAGTTGCGTGAGCGCATACGCTACTTGCATTACAGTTTACGAACCGAACAGGCTTATGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCGTTTCCACGGTGTGCGTCACCCGGCAACCTTGGGCAGCAGCGAAGTCGAGGCATTTCTGTCCTGGCTGGCGAACGAGCGCAAGGTTTCGGTCTCCACGCATCGTCAGGCATTGGCGGCCTTGCTGTTCTTCTACGGCAAGGTGCTGTGCACGGATCTGCCCTGGCTTCAGGAGATCGGTAGACCTCGGCCGTCGCGGCGCTTGCCGGTGGTGCTGACCCCGGATGAAGTGGTTCGCATCCTCGGTTTTCTGGAAGGCGAGCATCGTTTGTTCGCCCAGGACTCTAGCTATAGTTCTAGTGGTTGGCCTACGTACCCGTAGTGGCTATGGCAGGGCTTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGTTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTATTGGTCCCAATGGGGTCTCGGTGGGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAACACCCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCGGTACCGCATGCTTACAGATTACGAGTCAGGTATCTGGTGCCAATGGGGCGAGGCTCTGAATACACGCCATTAGTGTCCACAGTAAAGTCCACATTAACAGACTTGTTGTAGTTGGAAGTGTACTGAATTTCGGGATTCCAGCGTTTGCTGTTTTCCTTCTGCAGCTCCCACTCGATCTCCACGCTGACCTGTCCCGTGGAGTACTGTGTGATGAAGGAAGCAAACTTTGCCGCACTGAAGGTGGTCGAAGGATTCGCAGGTACCGGGGTGTTCTTGATGAGAATCTGTGGAGGAGGGTGTTTAAGTCCGAATCCACCCATGAGGGGAGAGGGGTGAAAATGTCCGTCCGTGTGTGGAATCTTTGCCCAGATGGGCCCCTGAAGGTACACATCTCTGTCCTGCCAGACCATGCCTGGAAGAACGCCTTGTGTGTTGACATCTGCGGTAGCTGCTTGTCTGTTGCCTCTCTGGAGGTTGGTAGATACAGAACCATACTGCTCCGTAGCCACGGGATTGGTTGTCCTGATTTCCTCTTCGTCTGTAATCATGACCTTTTCAATGTCCACATTTGTTTTCTCTGAGCCTTGCTTCCCAAAGATGAGAACCCCGCTCTGAGGAAAAAACTTTTCTTCATCGTCCTTGTGGCTTGCCATCGCCGGGCCCGGATTCACCAGAGAGTCTCTGCCATTGAGGTGGTACTTGGTAGCTCCAGTCCACGAGTATTCACTGTTGTTGTTATCCGCAGATGTCTTTGATACTCGCTGCTGGCGGTAACAGGGTCCAGGAAGCCAGTTCCTAGACTGGTCCCGAATGTCACTCGCTCCGGCCTGAGAAAACTGAAGCCTTGACTGCGTGGTGGTTCCACTTGGAGTGTTTGTTCTGCTCAAGTAATACAGGTACTGGTCGATGAGAGGATTCATGAGACGGTCCAGACTCTGGCTGTGAGCGTAGCTGCTGTGGAAAGGAACGTCCTCAAAAGTGTAGCTGAAGGTAAAGTTGTTTCCGGTACGCAGCATCTGAGAAGGAAAGTACTCCAGGCAGTAAAATGAAGAGCGTCCTACTGCCTGACTCCCGTTGTTCAGGGTGAGGTATCCATACTGTGGCACCATGAAGACGTCTGCTGGGAACGGCGGGAGGCATCCTTGATGCGCCGAGCCGAGGACGTACGGGAGCTGGTACTCCGAGTCAGTAAACACCTGAACCGTGCTGGTAAGGTTATTGGCAATCGTCGTCGTACCGTCATTCTGCGTGACCTCTTTGACTTGAATGTTAAAGAGCTTGAAGTTGAGTCTCTTGGGTCGGAATCCCCAGTTGTTGTTGATGAGTCTTTGCCAGTCACGTGGTGAAAAGTGGCAGTGGAATCTGTTGAAGTCAAAATACCCCCAAGGGGTGCTGTAGCCAAAGTAGTGATTGTCGTTCGAGGCTCCTGATTGGCTGGAAATTTGTTTGTAGAGGTGGTTGTTGTAGGTGGGCAGGGCCCAGGTTCGGGTGCTGGTGGTGATGACTCTGTCGCCCATCCATGTGGAATCGCAATGCCAATTTCCCGAGGAATTACCCACTCCGTCGGCGCCCTCGTTATTGTCTGCCATTGGTGCGCCACTGCCTGTAGCCATCGTATTAGTTCCCAGACCAGAGGGGGCTGCTGGTGGCTGTCCGAGAGGCTGGGGGTCAGGTACTGAGTCTGCGTCTCCAGTCTGACCAAAATTCAATCTTTTTCTTGCAGGCTGCTGGCCCGCCTTTCCGGTTCCCGAGGAGGAGTCTGGCTCCACAGGAGAGTGCTCTACCGGCCTCTTTTTTCCCGGAGCCGTCTTAACAGGTTCCTCAACCAGGCCCAGAGGTTCAAGAACCCTCTTTTTCGCCTGGAAGACTGCTCGTCCGAGGTTGCCCCCAAAAGACGTATCTTCTTTAAGGCGCTCCTGGAACTCCGCGTCGGCGTGGTTGTACTTGAGGTAAGGGTTGTCTCCGCTGTCGAGCTGCCGGTCGTAGGCTTTGTCGTGCTCGAGGGCAGCGGCGTCTGCCTCGTTCACCGGCTCTCCCTTGTCCAGTCCGTTGAAGGGTCCGAGGTACTTGTACCCGGGAAGCACAAGGCCCCTGCTGTCGTCCTTATGCCGCTCTGCGGGCTTTGGTGGTGGTGGGCCGGGTTTGAGCTTCCACCACTGTCTTATTCCTTCAGAGAGAGTGTCCTCGAGCCAATCGGGTAGATAACCGTCGGCAGCCGTGGCGGCGCTAGCACCATGGCTCGAGATCCCGGGTGATCAAGTCTTCGTCGAGTGATTGTAAATAAAATGTAATTTACAGTATAGTATTTTAATTAATATACAAATGATTTGATAATAATTCTTATTTAACTATAATATATTGTGTTGGGTTGAATTAAAGGTCCGTATACGCCGCTACAGGGCGCGTACTATGGTTGCTTTGACGTATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTACGCGTTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGT
ACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAGGTCGACGTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATCTAGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGTTTAAACAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCGCGGCCGCTCTAGAGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCCGCCGCCCTGGCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAGTGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACTTGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAGTGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACTTACACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCTTAGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAACGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGACGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATTTAGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGACGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATACAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTGGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCATCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAATCTAGAGCCTGCAGTCTCGACAAGCTTGTCGAGAAGTACTAGAGGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTGATCACTGCTTGAGCCTAGGAGATCCGAACCAGATAAGTGAAATCTAGTTCCAAACTATTTTGTCATTTTTAATTTTCGTATTAGCTTACGACGCTACACCCAGTTCCCATCTATTTTGTCACTCTTCCCTAAATAATCCTTAAAAA
CTCCATTTCCACCCCTCCCAGTTCCCAACTATTTTGTCCGCCCACAGCGGGGCATTTTTCTTCCTGTTATGTTTTTAATCAAACATCCTGCCAACTCCATGTGACAAACCGTCATCTTCGGCTACTTT
配列番号９
TTCTCTGTCACAGAATGAAAATTTTTCTGTCATCTCTTCGTTATTAATGTTTGTAATTGACTGAATATCAACGCTTATTTGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCAGACCAGCCGCGTAACCTGGCAAAATCGGTTACGGTTGAGTAATAAATGGATGCCCTGCGTAAGCGGGTGTGGGCGGACAATAAAGTCTTAAACTGAACAAAATAGATCTAAACTATGACAATAAAGTCTTAAACTAGACAGAATAGTTGTAAACTGAAATCAGTCCAGTTATGCTGTGAAAAAGCATACTGGACTTTTGTTATGGCTAAAGCAAACTCTTCATTTTCTGAAGTGCAAATTGCCCGTCGTATTAAAGAGGGGCGTGGCCAAGGGCATGGTAAAGACTATATTCGCGGCGTTGTGACAATTTACCGAACAACTCCGCGGCCGGGAAGCCGATCTCGGCTTGAACGAATTGTTAGGTGGCGGTACTTGGGTCGATATCAAAGTGCATCACTTCTTCCCGTATGCCCAACTTTGTATAGAGAGCCACTGCGGGATCGTCACCGTAATCTGCTTGCACGTAGATCACATAAGCACCAAGCGCGTTGGCCTCATGCTTGAGGAGATTGATGAGCGCGGTGGCAATGCCCTGCCTCCGGTGCTCGCCGGAGACTGCGAGATCATAGATATAGATCTCACTACGCGGCTGCTCAAACCTGGGCAGAACGTAAGCCGCGAGAGCGCCAACAACCGCTTCTTGGTCGAAGGCAGCAAGCGCGATGAATGTCTTACTACGGAGCAAGTTCCCGAGGTAATCGGAGTCCGGCTGATGTTGGGAGTAGGTGGCTACGTCTCCGAACTCACGACCGAAAAGATCAAGAGCAGCCCGCATGGATTTGACTTGGTCAGGGCCGAGCCTACATGTGCGAATGATGCCCATACTTGAGCCACCTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACATCAAACATCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATAGACTGTACAAAAAAACAGTCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCACCGCTGCGTTCGGTCAAGGTTCTGGACCAGTTGCGTGAGCGCATACGCTACTTGCATTACAGTTTACGAACCGAACAGGCTTATGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCGTTTCCAC
GGTGTGCGTCACCCGGCAACCTTGGGCAGCAGCGAAGTCGAGGCATTTCTGTCCTGGCTGGCGAACGAGCGCAAGGTTTCGGTCTCCACGCATCGTCAGGCATTGGCGGCCTTGCTGTTCTTCTACGGCAAGGTGCTGTGCACGGATCTGCCCTGGCTTCAGGAGATCGGTAGACCTCGGCCGTCGCGGCGCTTGCCGGTGGTGCTGACCCCGGATGAAGTGGTTCGCATCCTCGGTTTTCTGGAAGGCGAGCATCGTTTGTTCGCCCAGGACTCTAGCTATAGTTCTAGTGGTTGGCCTACGTACCCGTAGTGGCTATGGCAGGGCTTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGTTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTATTGGTCCCAATGGGGTCTCGGTGGGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAACACCCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCGGTACCGCATGCCTTAGTTGAACTCGAACTTCTTGTACTTGCAGTTGAGCTTTTGCTCGGCGAATGTGATGGCGTCGGAGAGTGGCACCAGTCCCTGCAGGATCAAGGCCAAGAGCTTCAGCAAGTTGTTGTGCAGTGTAGTTGACTCGCGACGGTTGACCTTGCCGATCACGAACATGTGGTGCTTGAATCTGTTGTACTTTTGGATGACCTGGCTCACATCAACGTCCTTGATTTCGCCAGAGATCCAGTAGAACTCCTTGTTCTTCTTAGCGATGGTCAGCCTTTCCTCGTTCTTGAAGGACAACACGATGAAGTTGTGACCCTTAACGTTATCGACGTTTTGAGTCAAGTACTGCTCAACGATGTGCATGCTTCCGTCTTCCTTCTTGACCTTCTTGAGGTTCTCGGCGTTGTTGTTAGAAGCGATGTTGTCGTGGTACTTGTAGTTGTTGAAGAGCAGGTTAGCGACGGACGAGTACTTGTATGTCAGAGTGCTCTTCTTGTTCACGATGAGGTTCAGGTTATCAACGACGTACTTGTTGGGAGGGTTGTCCGGGAATTGGACGGACTCCGAGTACTTGAGGATCTGGGAAACGTATGGCGAGACGAAGAAGTTGTTAGAGGCGGTTTCGATCTCGTTTGATTCCTTGCGGCTCAGCATGATGGGCAAAGTGAAGAGGTTCTTGTCCTGGTACATCTCGTACAACTTCGACAAGAGGAATCCACACTTACGCTCGCCGAGTGATTGCAGCAAGGTCACGAAGGTTGTCTGAGCGTAGTACATATCGAGGTTGAAGTAGGAGGTCAGAGCGGCCTTGAATGTGTGGTGGACGTCCACGAAGTGACACTTCTTGCAGTTTTGAGCGGCGGTCTCATCGTTGCAGACGTCCTGTGAGTGTGGGATTTCGATGCCAGTCTCCTTAACCAGGTTGTAGCTGATCATGAAGCGGATCTTATCGAAGGTCACAACGAACACACGGTTGTCAACCATGTAGTAGTTGTTTGTGTACTCGTAGACCACGTTAGAGACGTACTTGGCGAAGATGATTTCGAAAGGCTTCACCTCGGACTTCTTAACGACGAACATGTAGTAACCGGTTTCAGACATGTGATCGGAGAATCTGTTCGAGTTGTAGTCGTTATCGTCGAACCTCATCAGGTAGGGGGCGAAGTCGTTTGTGAAGTAGTGAGTGATCTCCTGGGTGGAAGCCACTGTACAGATGTTAGTGTTGTGGTTGATGGTTTGTTCCAGTGTAGCGCATGACTGGATGGTGCTCTTCTTGTACTTAGGTCTCAACTTGATCTTGTTGAATTGACCCACAACTCCCTGGGAGTTATCCAGGTACTCGTCCAACTTCCTCTTGGTGCCTGTGGCCGACGGCTGGTTGACACCAGCAGAGTGTTCGAAGGACTCGGCGTGGTAAGCTGAGCTAGGAGAGGGTTGTTCGACCACTGGCTGTTCGAGTGACTCGCTGTAGTAGGCAGAGGACACAGCTTCCTCCAGGTTGTCAGTGGTCTTGAGCAGACACTCCACCAAATCGTTGTCAGTGAGCGAGTTAACTGAGGCGAGGAAGTTGCTAGCGGCAGCGGTTTCAGAGTCGGAGATGACAGTATCAGCTCCGTCCGGGGTTGGGTGGTTGTAGTAAGACAAGTAATCGTTAGGTTGCTTGTCGCAGAACTCCGAGTATGAGTTGTCGAAGCTAGCACGAGAGGGAGTGCTGGCAGAGGTGTAGGAAGCGTTGAAGTTGATTTGAGTCATGGTGACCTGGTTGTTCACGATCTTATCGCCACCTGTGTCCACCTGCAGTTGCTGGGCCTCAGCGCAGGCTGAAGTGGCCTCACAGGAGTAGGGGCTGGAAGCACAGTTGGAAGTCATGATGTTTTCTTGGACGTTCAGGACGTGGCTGGATGTACGGATCATGCGCCCGATGGTGGGACGGTATGAATAATCCGGAATATTTATAGGTTTTTTTATTACAAAACTGTTACGAAAACAGTAAAATACTTATTTATTTGCGAGATGGTTATCATTTTAATTATCTCCATGATCGGATCTCCTAGGCTCAAGCAGTGATCAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTTGTCTAGTACTTCTCGACGGTACCGCATGCTATGCATCAGCTGCTAGCACCATGGCTCGAGTTACAGATTACGAGTCAGGTATCTGGTGCCAATGGGGCGAGGCTCTGAATACACGCCATTAGTGTCCACAGTAAAGTCCACATTAACAGACTTGTTGTAGTTGGAAGTGTACTGAATTTCGGGATTCCAGCGTTTGCTGTTTTCCTTCTGCAGCTCCCACTCGATCTCCACGCTGACCTGTCCCGTGGAGTACTGTGTGATGAAGGAAGCAAACTTTGCCGCACTGAAGGTGGTCGAAGGATTCGCAGGTACCGGGGTGTTCTTGATGAGAATCTGTGGAGGAGGGTGTTTAAGTCCGAATCCACCCATGAGGGGAGAGGGGTGAAAATGTCCGTCCGTGTGTGGAATCTTTGCCCAGATGGGCCCCTGAAGGTACACATCTCTGTCCTGCCAGACCATGCCTGGAAGAACGCCTTGTGTGTTGACATCTGCGGTAGCTGCTTGTCTGTTGCCTCTCTGGAGGTTGGTAGATACAGAACCATACTGCTCCGTAGCCACGGGATTGGTTGTCCTGATTTCCTCTTCGTCTGTAATCATGACCTTTTCAATGTCCACATTTGTTTTCTCTGAGCCTTGCTTCCCAAAGATGAGAACCCCGCTCTGAGGAAAAAACTTTTCTTCATCGTCCTTGTGGCTTGCCATCGCCGGGCCCGGATTCACCAGAGAGTCTCTGCCATTGAGGTGGTACTTGGTAGCTCCAGTCCACGAGTATTCACTGTTGTTGTTATCCGCAGATGTCTTTGATACTCGCTGCTGGCGGTAACAGGGTCCAGGAAGCCAGTTCCTAGACTGGTCCCGAATGTCACTCGCTCCGGCCTGAGAAAACTGAAGCCTTGACTGCGTGGTGGTTCCACTTGGAGTGTTTGTTCTGCTCAAGTAATACAGGTACTGGTCGATGAGAGGATTCATGAGACGGTCCAGACTCTGGCTGTGAGCGTAGCTGCTGTGGAAAGGAACGTCCTCAAAAGTGTAGCTGAAGGTAAAGTTGTTTCCGGTACGCAGCATCTGAGAAGGAAAGTACTCCAGGCAGTAAAATGAAGAGCGTCCTACTGCCTGACTCCCGTTGTTCAGGGTGAGGTATCCATACTGTGGCACCATGAAGACGTCTGCTGG
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２つの組換えベクターをそれぞれＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換してブルーホワイトセレクションを行い、白色陽性クローンを採取して培養し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標） ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）を抽出した。２種類のＢａｃｍｉｄをそれぞれ接着ＳＦ９細胞（Ｇｂｉｃｏ）にトランスフェクトし、３日後に初代組換えバキュロウイルスを回収し、Ｐ２継代まで増幅した。最後に、得られたＰ２継代組換えバキュロウイルスをそれぞれＢＶ－Ｃａｐ－ＩＴＲ－Ｒｅｐ及びＢＶ－ＩＥ－ｈｒ１Ｃａｐ－ＩＴＲ－Ｒｅｐと命名し、ウイルス力価をＴＣＩＤ５０法でそれぞれ測定した。この部分の詳細については、Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ操作マニュアル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を参照された
い。
実施例２ ｒＡＡＶ２のパッケージング及び力価測定
２種類のＰ２継代組換えバキュロウイルスをＭＯＩ＝０．１で２５ｍＬの懸濁ＳＦ９細胞（密度３．０Ｅ＋０６細胞／ｍＬ）にそれぞれ感染させ、４日後に細胞を回収し、５ｍＬのＴＮＴ溶解液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２）を用いて室温で１時間インキュベートして細胞を溶解した。最終濃度５０Ｕ／ｍＬのヌクレアーゼを追加して３７℃で２時間消化し、サンプルを取り、プロテイナーゼＫ（ＴＩＡＮＧＥＮ）を用いて５６℃で外殻を１時間消化し、ｑＰＣＲで力価を測定した。検出手順は以下のとおりである。
定量ＰＣＲで使用される標準品は、ＰｖｕＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）単一制限酵素消化によって線形化されたｐＡＡＶ－ＥＧＦＰプラスミドであった（プラスミド配列は、以下の配列番号２２に示される）。
配列番号２２
ACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCAAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTACTATGGTTGCTTTGACGTATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCG
GGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTACGCGTTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAGGTCGACGTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATCTAGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGTTTAAACAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
定量ＰＣＲで使用されるプライマー配列は以下のとおりであった。
ＩＴＲ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’（配列番号２）
ＩＴＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’（配列番号３）
定量ＰＣＲ操作プログラム：９５℃で６０秒間（９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、４０サイクル）。
定量ＰＣＲで得られたＣＴ値及び標準品の濃度から標準曲線を描いた後、サンプルの力価を換算した。ＢＶ－Ｃａｐ－ＩＴＲ－Ｒｅｐ及びＢＶ－ＩＥ－ｈｒ１Ｃａｐ－ＩＴＲ－ＲｅｐでパッケージングされたｒＡＡＶ収量は、それぞれ２．３９Ｅ＋０４ＶＧ／細胞（７．１８Ｅ＋１０ＶＧ／ｍＬに相当）及び８．６７Ｅ＋０５ＶＧ／細胞（２．６０Ｅ＋１２ＶＧ／ｍＬに相当）であった。
実施例３ 細胞感染過程におけるＥＧＦＰの発現と細胞溶解液におけるＣａｐタンパク質の発現量の比較
感染４８時間後、７２時間後、９６時間後、それぞれ倒立蛍光顕微鏡下で２種類のバキュロウイルスに感染した細胞を観察したところ、最適化された組換えバキュロウイルスは標的遺伝子（本実施例の標的遺伝子はＥＧＦＰである）の発現を大幅に減少させることができた（図５）。標的遺伝子（ＥＧＦＰ）の発現量の減少は、細胞内のｒＡＡＶパッケージングへの干渉を弱めるようであり、ｒＡＡＶパッケージング関連の構造及び機能タンパク質の発現により有利である。
Ｃａｐタンパク質抗体（Ｐｒｏｇｅｎ）を使用して同量の細胞溶解液にＷＢ検出を行った（図６）。結果は、最適化された組換えバキュロウイルスが細胞に感染した後、細胞におけるＣａｐタンパク質の発現レベルが有意に増加したことを示した。
実施例４ 精製ｒＡＡＶ２の電子顕微鏡検出及び感染性測定
ＰＯＲＯＳ（商標） ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィー充填剤を用いて細胞溶解液を精製し、蛍光定量ＰＣＲ法により力価を測定し（測定方法は実施例２と同様）、精製したｒＡＡＶ２をネガティブ染色処理し、透過型電子顕微鏡下で観察した（図７）。ゲノムをパッケージングしたｒＡＡＶ２は中実粒子であり、核酸を含まない欠陥のあるｒＡＡＶ粒子の中心は暗く染色された。全体として、形状は損なわれておらず、従来方法（非特許文献１）と比較して空カプシド率が大幅に低下し（約３％）、これは、最適化されたバキュロウイルスベクター構築物を用いると、パッケージング製品中の空カプシドウイルスの割合が大幅に減少することを示し、下流の空カプシドウイルス除去などの工程の負担が大幅に軽減される。
精製したｒＡＡＶ２を段階希釈し、それぞれＭＯＩ＝１００００、２０００、４００及び８０で培養した２９３Ｔ細胞（４８ウェルプレート、５．０Ｅ＋０４細胞／ウェル）に感染させた。感染２日後、ＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で観察した。実験結果は、このシステムによって作製されたｒＡＡＶ２が高いインビトロ感染活性を有することを示した（図８）。
上記の実施例は、本発明に開示された実施形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。更に、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に記載された様々な修正及び本発明の方法の変更が当業者には明らかであろう。本発明の様々な特定の好ましい実施形態に関連して本発明を具体的に説明したが、本発明はこれらの特定の実施形態に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、本発明を得るために当業者には明らかな上記のような様々な変更は、本発明の範囲に含まれるべきである。

Claims (17)

  1. 核酸構築物であって、
    ＡＡＶエレメント、及びＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、
    前記ＡＡＶエレメントがＣａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＡＡＶシスエレメントを含むことを特徴とする、
    核酸構築物。
  2. バキュロウイルス組換え相同領域をコードするポリヌクレオチドを更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
  3. 前記ＩＥタンパク質が、Ａｃｉｅ０、Ａｃｉｅ０１又はＡｃｉｅ０２遺伝子のうちの１つ以上によってコードされ、及び／又は、前記バキュロウイルス組換え相同領域が、ｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４又はｈｒ５のうちの１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の核酸構築物。
  4. 前記核酸構築物がＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターを更に含み、前記ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターがＧｐ６４、ｐＨ、ｐ６．９又はｐ１０のうちの１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
  5. 前記核酸構築物がバキュロウイルスプロモーターを更に含み、前記バキュロウイルスプロモーターがバキュロウイルス組換え相同領域に結合されており、前記バキュロウイルスプロモーターが好ましくはｐＨ、Ｇｐ６４、ｐ６．９又はｐ１０のうちの１つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
  6. 前記ＡＡＶシスエレメントがＩＴＲ配列から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
  7. 前記核酸構築物が外来標的遺伝子を更に含み、前記外来標的遺伝子がＡＡＶエレメントに埋め込まれていることを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
  8. 前記核酸構築物の構造が、ＩＥ遺伝子発現カセット－Ｃａｐ遺伝子発現カセット－ＩＴＲ－外来標的遺伝子発現カセット－ＩＴＲ－Ｒｅｐ遺伝子発現カセットであることを特徴とする、請求項７に記載の核酸構築物。
  9. 前記核酸構築物のヌクレオチド配列が配列番号１であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
  10. 前記核酸構築物がアデノ随伴ウイルスベクター又は組換えバキュロウイルスベクターであり、前記組換えバキュロウイルスベクターが好ましくは組換えバキュロウイルスシャトルベクターであることを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸構築物をバキュロウイルス系によって構築することによって得られる、又は請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸構築物中の任意のエレメントを含む核酸構築物をバキュロウイルス系によって共同構築することによって得られることを特徴とする、組換えバキュロウイルス。
  12. 請求項１１に記載の組換えバキュロウイルスを細胞に感染させた後にパッケージングすることによって得られることを特徴とする、アデノ随伴ウイルス。
  13. 請求項１１に記載の組換えバキュロウイルスに感染した細胞株であることを特徴とする、細胞株。
  14. バキュロウイルス系及び請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸構築物を含むことを特徴とする、アデノ随伴ウイルスベクター系。
  15. 外来標的遺伝子を運ぶＡＡＶエレメント、ＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びバキュロウイルス組換え相同領域をコードするポリヌクレオチドをバキュロウイルスベクター骨格に組み込むことを含むことを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸構築物を構築する方法。
  16. 前記構築方法が以下の特徴のうちの１つ以上を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の構築方法。
    １）前記ＡＡＶエレメントは、Ｃａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＡＡＶシスエレメントを含み、前記ＡＡＶシスエレメントは、好ましくはＩＴＲ配列である。
    ２）ＩＥタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは、Ａｃｉｅ０、Ａｃｉｅ０１又はＡｃｉｅ０２のうちの１つ以上から選択される。
    ３）前記バキュロウイルスベクター骨格は、ｐＦａｓｔＢａｃｄｕａｌ、ｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＡ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＢ又はｐＦａｓｔＢａｃＨＴＣのうちの１つから選択される。
    ４）前記バキュロウイルス組換え相同領域は、ｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４又はｈｒ５のうちの１つ以上から選択される。
  17. 請求項１１に記載の組換えバキュロウイルスを昆虫細胞株に感染させる工程を含むことを特徴とする、アデノ随伴ウイルスの産生方法。
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