CN109311932B - 提高杆状病毒系统产生的重组腺相关病毒的生物学效力的方法 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了可用于在昆虫细胞中产生重组AAV(rAAV)的方法和组合物。在一些实施方案中，方法和组合物包括使用经修饰的Kozak序列以可用于产生感染性rAAV颗粒的量来表达AAV VP1蛋白。

Description

提高杆状病毒系统产生的重组腺相关病毒的生物学效力的 方法
相关申请
本申请根据35U.S.C§119(e)要求2016年4月16日提交的题为“METHOD OFENHANCING BIOLOGICAL POTENCY OF BACULOVIRUS SYSTEM-PRODUCED RECOMBINANTADENO-ASSOCIATED VIRUS”的美国临时申请号62/323,684的权益，其全部内容通过引用并入本文。
政府支持
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的HL097088的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)已成为用于人类基因治疗最有希望的病毒载体之一。重组腺相关病毒(rAAV)正在用于血友病B、恶性黑素瘤、囊性纤维化和其他疾病的基因治疗临床试验中进行评估。尽管使用哺乳动物细胞培养系统大规模生产rAAV在历史上存在问题，但是使用昆虫细胞的AAV生产系统已被证明是可行的替代方案。然而，不同的细胞环境对一些AAV血清型的病毒颗粒组装提出了挑战。
发明内容
本文中提供了与在宿主生产者细胞中(例如，在昆虫细胞中)rAAV的产生有关的组合物和方法。rAAV颗粒的生物学效力(例如，感染性)部分地取决于病毒体(virion)衣壳组成，例如衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的化学计量比。在异源系统例如昆虫细胞(例如Sf9细胞)中制造的一些rAAV血清型(例如，AAV5、AAV8和AAV9)的特征在于异常的VP1表达水平。在病毒组装后，异常的VP1表达导致产生包含不适当的衣壳蛋白比的病毒颗粒，这阻碍了颗粒有效转导细胞的能力。获得有用的衣壳蛋白的化学计量比的方法是复杂的，因为结果表明过多的VP1可损害昆虫细胞有效包装病毒颗粒的能力，而低水平的VP1可导致颗粒转导效率低下。因此，对于昆虫细胞rAAV生产系统，使用现有技术来产生提高量的感染性颗粒而不对颗粒组装产生负面影响仍然是一个挑战。
本文中所述的方法和组合物提供了重组VP1基因，其包含与VP1翻译起始位点结合的经修饰的Kozak序列。本申请中描述的重组VP1基因可用于产生包含目的基因的感染性rAAV颗粒(例如，用于随后的研究和/或治疗用途)。在一些实施方案中，本申请中描述的重组VP1基因可用于在昆虫细胞中产生一种或更多种血清型的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本申请中描述的方法和组合物可用于筛选和鉴定一种或更多种血清型的重组VP1基因，其可用于在昆虫细胞和/或在其他目的生产者细胞中(例如，在哺乳动物细胞中)产生一种或更多种血清型的rAAV颗粒。在一些实施方案中，一种或更多种重组VP1基因可用于产生稳定的和/或感染性的rAAV颗粒，其以相对高频率和/或以相对低的错误包装核酸的比例含有目的重组基因组。
在一些方面，本公开内容提供了可用于产生来自AAV5血清型的rAAV的组合物和方法。在一些方面，本公开内容提供了用于产生来自AAV8血清型的rAAV的组合物和方法。在其他方面，本公开内容提供了用于产生来自AAV9血清型的rAAV的组合物和方法。
在一些方面，本公开内容提供了包含编码经修饰的Kozak序列以及AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸，其中经修饰的Kozak序列选自SEQ ID NO：2至11(表1)。在一些实施方案中，经修饰的Kozak序列是SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9。在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3衣壳蛋白来自AAV5血清型。在一些实施方案中，VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白是变体AAV5衣壳蛋白(例如，它们由含有一个或更多个突变的序列编码，并且其编码相对于相应的野生型衣壳蛋白具有一个或更多个氨基酸替换的衣壳蛋白)。
在一些实施方案中，核酸还包含启动子序列。在一些实施方案中，启动子序列是多角体蛋白(polh)启动子序列。在一些实施方案中，经修饰的Kozak序列含有用于翻译VP1衣壳蛋白的起始密码子。在一些实施方案中，用于翻译VP1衣壳蛋白的起始密码子是AUG。在一些实施方案中，核酸包装在病毒颗粒(例如杆状病毒颗粒)中。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含核酸的昆虫细胞。
在一些方面，本公开内容涉及在昆虫细胞中产生rAAV的方法，其中所述rAAV来自AAV5血清型，所述方法包括(a)用以下转染昆虫细胞：(i)包含含有编码经修饰的Kozak序列以及AAV5VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列之核酸的杆状病毒，其中经修饰的Kozak序列选自SEQ ID NO：2至11，(ii)包含编码AAV Rep蛋白的核苷酸序列的杆状病毒，(iii)包含与启动子序列可操作连接之目的基因侧翼的两个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列的杆状病毒；(b)在适于产生rAAV的条件下培养昆虫细胞；(c)从昆虫细胞中回收rAAV。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞。
在一些方面，本公开内容提供了包含编码经修饰的Kozak序列以及AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸，其中经修饰的Kozak序列选自SEQ ID NO：13至32(表2)。在一些实施方案中，经修饰的Kozak序列是SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32。在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3衣壳蛋白来自AAV8血清型。在一些实施方案中，VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白是变体AAV8衣壳蛋白(例如，它们由含有一个或更多个突变的序列编码，并且其编码相对于相应的野生型衣壳蛋白具有一个或更多个氨基酸替换的衣壳蛋白)。
在一些实施方案中，核酸还包含启动子序列。在一些实施方案中，启动子序列是多角体蛋白(polh)启动子序列。在一些实施方案中，经修饰的Kozak序列含有用于翻译VP1衣壳蛋白的起始密码子。在一些实施方案中，用于翻译VP1衣壳蛋白的起始密码子是AUG。在一些实施方案中，核酸包装在病毒颗粒(例如杆状病毒颗粒)中。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含核酸的昆虫细胞。
在一些方面，本公开内容涉及在昆虫细胞中产生rAAV的方法，其中rAAV来自AAV8血清型，所述方法包括(a)用以下转染昆虫细胞：(i)包含编码经修饰的Kozak序列以及AAV8VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列之核酸的杆状病毒，其中经修饰的Kozak序列选自SEQ ID NO：13至32，(ii)包含编码AAV Rep蛋白的核苷酸序列的杆状病毒，(iii)包含与启动子序列可操作地连接之目的基因侧翼的两个AAV ITR核苷酸序列的杆状病毒；(b)在适于产生rAAV的条件下培养昆虫细胞；以及(c)从昆虫细胞中回收rAAV。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞。
在一些方面，本公开内容提供了包含编码经修饰的Kozak序列以及AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸，其中经修饰的Kozak序列选自SEQ ID NO：34至45(表3)。在一些实施方案中，经修饰的Kozak序列是SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：42。在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3衣壳蛋白来自AAV9血清型。在一些实施方案中，VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白是变体AAV9衣壳蛋白(例如，它们由含有一个或更多个突变的序列编码，并且其编码相对于相应的野生型衣壳蛋白具有一个或更多个氨基酸替换的衣壳蛋白)。
在一些实施方案中，核酸还包含启动子序列。在一些实施方案中，启动子序列是多角体蛋白(polh)启动子序列。在一些实施方案中，经修饰的Kozak序列含有用于翻译VP1衣壳蛋白的起始密码子。在一些实施方案中，用于翻译VP1衣壳蛋白的起始密码子是AUG。在一些实施方案中，核酸包装在病毒颗粒(例如杆状病毒颗粒)中。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含核酸的昆虫细胞。
在一些方面，本公开内容涉及在昆虫细胞中产生rAAV的方法，其中rAAV来自AAV9血清型，所述方法包括(a)用以下转染昆虫细胞：(i)包含含有编码经修饰的Kozak序列以及AAV9VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列之核酸的杆状病毒，其中经修饰的Kozak序列选自SEQ ID NO：34至45，(ii)包含编码AAV Rep蛋白的核苷酸序列的杆状病毒，(iii)包含与启动子序列可操作地连接之目的基因侧翼的两个AAV ITR核苷酸序列的杆状病毒；(b)在适于产生rAAV的条件下培养昆虫细胞；以及(c)从昆虫细胞中回收rAAV。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞。
在一些方面，本申请提供了包含编码经修饰的Kozak序列的核苷酸序列之核酸的文库，所述经修饰的Kozak序列包含用于翻译AAV VP1衣壳蛋白的起始密码子和紧邻VP1翻译起始密码子上游1至6个核苷酸的核苷酸序列改变和/或紧邻VP1翻译起始密码子下游1至2个核苷酸的核苷酸序列改变。在一些实施方案中，核酸包含XXXXXX(ATG)，其中(ATG)是VP1起始密码子。在一些实施方案中，核酸包含XXXXXX(AUG)，其中(AUG)是VP1起始密码子。在一些实施方案中，X代表任何核苷酸，例如，与目的AAV血清型的野生型VP1基因中该位置处天然存在的核苷酸不同的任何核苷酸。
在以下描述和所附实施例和附图中更详细地描述了这些和其他方面。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面，通过参考这些附图中的一幅或更多幅结合本文中给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开内容的某些方面。
图1说明了编码VP1、VP2和VP3的衣壳辅助核苷酸和所编码的衣壳蛋白的非限制性设计。
图2A描绘了包装在Sf9细胞中的rAAV5的蛋白质印迹分析的实例。
图2B描绘了包装在Sf9细胞中的rAAV8的蛋白质印迹分析的实例。
图2C描绘了包装在Sf9细胞中的rAAV9的蛋白质印迹分析的实例。
图3描绘了设计成用于在昆虫细胞中表达的VP1衣壳基因上游的共有减弱的Kozak元件的非限制性核苷酸序列。
图4A-4D描绘了在Sf9细胞中产生的rAAV颗粒的衣壳蛋白组分的非限制性实例。图4A说明了rep和cap基因表达盒的设计的非限制性实例。图4B示出了rAAV5VP1蛋白表达与其相关的VP1 Kozak翻译起始位点(translation initiation site，TIS)效率的直接相关性的实例：从稳定并入了整合的cap表达盒的10个单独细胞系分离的衣壳蛋白的蛋白质印迹分析。每个衣壳VP1基因构建体的相关TIS效率(％)在各自泳道下方示出。图4C示出了从HEK293和Sf9细胞纯化的rAAV5的衣壳蛋白组分的实例：用短波UV光活化(免染技术，Bio-Rad)直接观察的双碘克沙醇纯化的rAAV5-GFP之SDS-蛋白质凝胶分析。(*)表示在从HEK 293细胞纯化的rAAV5样品中经常观察到的较慢的迁移带，并且其被从VP2定量分析中排除。图4D示出了从HEK 293和Sf9细胞纯化的rAAV9的衣壳蛋白组分的实例。分析与图4C中的图相同。
图5A-5D描绘了AAV5VP1、VP2和VP3衣壳蛋白化学计量的MALDI-TOF分析。图5A示出了AAV5衣壳的氨基酸序列(SEQ ID NO：55)，其中VP1独特的N-端用虚线标记，独特的VP2用点划线标记，共同的VP3C-端用黑线标记。向下箭头指出各自的蛋白质。选择用于MS分析的胰蛋白酶肽加了下划线，并在它们各自观测的质谱旁边示出。胰蛋白酶肽从上到下对应于SEQ ID NO：56、48和57。图5B示出了在H2 18O中消化的rAAV5的所有胰蛋白酶肽的MALDI-TOF-MS谱。圈出的肽是所分析的三个中的一个代表。图5C示出了相同的胰蛋白酶肽TWVLPSYNNHQYR(SEQ ID NO：48)的两个重叠的MALDI-TOF MS谱，其来自用在16O水中制备的胰蛋白酶消化的VP1凝胶条带，或来自用在18O水中制备的胰蛋白酶消化的VP3凝胶条带。18O水在肽的C-端并入两个18O原子，因此将质量偏移4个原子质量单位(amu)。将这些消化产物分别点样/分析并且光谱重叠以显示两个18O完全并入VP3肽中。图5D示出了在消化产物以1∶1比例混合后来自VP1或VP3的相同肽的同位素“指”以计算相对含量。
图6A-6F描绘了在HEK 293细胞(图6A，6D)或Sf9细胞(图6B，6E))中制造的rAAV9(图6A-C)或rAAV5(图6D-F)的尺寸和滴度的纳米颗粒追踪分析。图6A、6B、6C和6D示出了有限轨道长度调整(Finite Track Length Adjustment，FTLA)算法的图形表示，rAAV/纳米金颗粒复合物之三个独立视频捕获的平均值，对于每个样本各记录30秒。图6C和6F示出了每种制剂的完整颗粒/总颗粒的计算比例。峰旁边的数字示出了计算的rAAV/纳米金颗粒复合物尺寸。较大直径的较小峰代表rAAV颗粒之聚集的二聚体和三聚体。图6C和6F示出了各病毒原液中含DNA的AAV颗粒与AAV颗粒总数的计算比例。
图7A-7C描绘了在纹状体注射HEK 293或Sf9 B8来源的rAAV5后的萤光素酶和mApple表达。图7A提供了示出在AAV注射后3周检测到的生物发光(bioluminescence，BLI)信号的热图图像。伪彩色标度(pseudo-color scale)表示以计数形式的发出的光的强度。Max和Min分别是最大计数和最小计数。图7B提供了示出了表示为总计数，为平均值±SEM(每组n＝4)的BLI强度的图。Mann-Whitney检验分析示出了组间的显著差异(p＝0.0286，单尾检验)。图7C示出了如通过可变模式激光扫描仪(黑白，B/W图像)或荧光显微镜(彩色图像)所检测的冠状脑切片中的mApple荧光。
图8A-8D描绘了rAAV-Bac-UF26盒及其最接近接头(junction)的NGS读取的分布。图8A示出了包装在HEK 293细胞中的rAAV5-Bac-UF26盒的Illumina读取覆盖范围，其通过将每个核苷酸位置的读取数目除以所参考序列的读取总数进行数字归一化。对于无PCR(无PCR 1和无PCR 2)和基于PCR(PCR 1和PCR 2)，用箭头表示重复样品的序列覆盖范围图。rAAV盒与相邻序列之间的覆盖范围的下降反映了生物信息学分析限制的图形表示，而不是序列覆盖范围的实际降低。在图下方示出的是参考的rAAV-Bac-UF26盒的注释图，其按图中序列的比例绘制(图8A)和(图8B)。细菌质粒DNA中紧邻rAAV盒的序列以浅灰色阴影表示。图8B示出了包装在Sf9B8细胞中的rAAV5-Bac-UF26盒的Illumina读取覆盖范围。rAAV盒内的富含GC的序列以深灰色阴影表示。图8C说明了图8A和图8B中在HEK 293和Sf9B8两种细胞中与左侧rAAV ITR紧邻的序列的图的放大。图8D示出了图8A和图8B中在HEK 293和Sf9B8细胞中与右侧rAAV ITR紧邻的序列的图的放大。
图9A-9B示出了在由HEK 293与Sf9B8细胞衣壳包封(encapsidated)的rAAV5-Bac-UF26盒中鉴定的SNP的分布。图9A示出了如果相对于参考pTR-Bac-UF26数据库序列在给定位置处读取，则累积绘制四个残基A、G、C和T的替换。相关SNP比(Y轴)定义为在给定位置处具有一个替换的读取总数相对于相同位置处的测序总深度的比例。测序的深度是在给定位置处参考和替代核苷酸的序列读取的总和，不包括插入/缺失(插失(indel))。SNP变体的分析包括阳性对照、质粒pTR-Bac-UF26样品。因此，零比率的SNP表示与数据库参考相同的残基，正值表示相对于亲本质粒数据库序列新获得的SNP。高GC含量的区域用阴影表示。图9B示出了相对于图9A中序列的标度绘制的参考rAAV-Bac-UF26盒的注释图。
图10A-10B描绘了包装到rAAV5和rAAV9衣壳中的rAAV盒的注释图形图。
图11描绘了通过SDS-PAGE电泳分离的rAAV5制备物的扫描图谱(图4C)。阴影区域表示用于量化的曲线下面积(AUC)。(*)表示从分析中排除的峰。
图12A-12B描绘了包装到rAAV5或rAAV9衣壳中的rAAV-UF50-BC的体外转导测定。图12A示出了荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)及其对rAAV5-UF50-BC的图形定量。图12B示出了荧光激活细胞分选(FACS)及其对rAAV9-UF50-BC的图形定量。
图13描绘了用于NGS的rAAV5载体DNA制备物的示意性流程图的非限制性实例。
图14A-14C描绘了DNA片段大小的NGS文库的分布。NGS文库的分析由高灵敏度D5000ScreenTape完成。图14A示出了由NGS直接测序的无PCR文库：1，2-rAAV5/Sf9；3，4-rAAV5/HEK 293。图14B示出了用于低循环PCR富集的无PCR文库：5，6-rAAV5/Sf9、7，8-rAAV5/HEK293。图14C示出了富含PCR的文库：9，10-rAAV5/Sf9；11，12-rAAV5/HEK 293。文库9至12由NGS直接测序。
图15描绘了NGS数据处理的示意性流程图的非限制性实例。
发明详述
本申请的一些方面提供了用于在宿主生产者细胞中(例如，在昆虫生产者细胞中)产生rAAV颗粒的方法和组合物。在一些实施方案中，经修饰的翻译起始序列(TIS，也称为Kozak序列)与VP1起始密码子(例如，对于编码VP1衣壳蛋白的重组基因为ATG/AUG起始密码子)结合并且并入编码目的AAV血清型的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的重组核酸中。在一些实施方案中，本申请中描述的方法和组合物可用于鉴定可用于在宿主生产者细胞中产生有效rAAV颗粒的VP1 Kozak序列(例如，以高产率产生的rAAV颗粒，其是感染性的、含有DNA的、稳定的等，或其任何组合)。在一些实施方案中，使用本申请中描述的方法和组合物产生的rAAV颗粒可含有目的基因(例如治疗基因)并且可用于治疗目的。
rAAV被广泛用作基因治疗/DNA疫苗递送的载体，但是基于目前的技术，大规模生产用于临床应用的感染性rAAV仍然具有挑战性。AAV衣壳由三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3组成，其通过AAV基因组中单个衣壳基因的可变剪接和差异密码子使用而得到。VP3序列在所有三种剪接变体之间是共同的，并且VP2和VP1具有较长的N-端序列，其中VP1是最长的衣壳蛋白(如例如图1中所阐明的)。通常衣壳颗粒中VP1/VP2/VP3的比例估计为1/1/10。此外，看起来没有确定的VP1/VP2/VP3化学计量，并且组装是随机的，使得并入衣壳中的VP1/VP2/VP3的相对量主要取决于其在宿主生产者细胞中(或在体外生产系统中)的相对表达水平。本申请中描述的组合物和方法提供了具有经修饰的VP1 Kozak序列(例如，围绕着ATG/AUG翻译起始密码子)的重组衣壳基因，其在生产者细胞中被翻译成VP1、VP2和VP3衣壳蛋白，其相对量可用于产生含有感染性rAAV颗粒的目的重组基因。在一些实施方案中，重组衣壳基因不具有合适的剪接供体和/或受体位点以允许衣壳基因进行天然剪接(例如，在一些实施方案中，来自重组衣壳基因的转录物在生产者细胞中未被适当地剪接或根本不剪接)。在一些实施方案中，为了提高渗漏核糖体扫描(leaky ribosome scanning)并从衣壳基因产生所期望比例的VP1、VP2、VP3，将结合减弱的Kozak序列的经典AUG密码子用于VP1翻译起始位点。由经修饰的衣壳基因产生的rAAV颗粒以及衣壳包封目的基因可用于研究、临床测试和治疗目的。在一些实施方案中，本申请中描述的经修饰的衣壳基因可用于大规模制造rAAV颗粒。
在一些方面，本申请还提供了用于筛选和评估AAV衣壳基因表达构建体以鉴定可用于产生感染性rAAV颗粒之序列的方法和组合物。在一些实施方案中，评估多个不同的rAAV衣壳基因表达构建体在目的宿主细胞中的rAAV颗粒组装。在一些实施方案中，不同的rAAV衣壳基因表达构建体包含相同的启动子、相同的AAV衣壳编码序列(例如，编码任何目的血清型的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白，任选地包括一个或更多个衣壳突变)但具有与VP1的翻译起始密码子(例如，ATG/AUG)结合的不同Kozak序列。通常，VP2和VP3的翻译密码子及周围起始序列没有改变(例如，它们保持为其天然野生型序列)。然而，在一些实施方案中，可以在这些序列中进行一个或更多个改变。在一些实施方案中，不同的Kozak序列表现出在紧邻VP1的翻译起始密码子上游的六个核苷酸内的序列改变。在一些实施方案中，不同的Kozak序列包括紧邻VP1的翻译起始密码子下游的两个核苷酸内的序列改变。因此，在一些实施方案中，不同Kozak序列选自不同Kozak序列的文库，所述Kozak序列变现出在紧邻VP1的翻译起始密码子上游的六个核苷酸内的一个或更多个位置(例如，1、2、3、4、5或6个位置)和/或在紧邻VP1翻译起始密码子下游的两个核苷酸内的一个或更多个位置(例如，1或2个位置)处的核苷酸序列改变。在一些实施方案中，不同的Kozak序列可以表现出VP1的Kozak序列的所有可能变体的全部或子集。在一些实施方案中，改变是相对于经修饰的AAV衣壳血清型(例如，血清型1、2、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12等)基因的天然VP1 Kozak序列。在一些实施方案中，评估具有选定百分比翻译效率的不同Kozak序列(例如，相对于参考翻译效率，例如相对于与天然或共有Kozak序列相关的翻译效率)。在一些实施方案中，不同的Kozak序列表现出翻译效率范围在25％至50％之间，例如在25％至45％之间，例如在30％至40％之间，约25％、约30％、约35％、约35％、40％、约45％、约50％或其他值(例如，任意前述之间的中间值)。在一些实施方案中，评估具有所期望的翻译效率或翻译效率范围的所有Kozak序列。在一些实施方案中，评估具有在期望百分比范围内的翻译效率的Kozak序列的子集。在一些实施方案中，评估表现出翻译效率的目标范围内的百分比增量(例如，1至5％增量，例如约1％、2％、3％、4％或5％增量)的Kozak序列。在一些实施方案中，通过将各自含有具有不同Kozak序列(例如，与VP1起始密码子结合的)的重组核酸引入到宿主细胞中来评估不同的Kozak序列，所述宿主细胞还表达其他辅助基因(例如，Rep和其他辅助基因)并且还含有具有侧翼为ITR序列的目的靶基因的目的重组AAV基因组(例如，如编码可检测标志物或目的治疗基因的对照基因)(使得侧翼为ITR序列的目的基因为可以被包装到含有由重组衣壳基因表达的衣壳蛋白的rAAV颗粒中)。宿主细胞可以是任何类型的细胞(例如，哺乳动物、昆虫或其他类型的宿主细胞)。作为质粒转染(例如，使用一种或更多种表达其他辅助基因和/或含有目的rAAV基因组的质粒)、病毒转导(例如，使用一种或更多种重组病毒，例如重组杆状病毒、腺病毒、疱疹病毒或具有表达其他辅助基因和/或含有目的rAAV基因组的重组病毒基因组的其他重组病毒)或基因组整合(例如，与一种或更多种辅助基因和/或目的rAAV基因组)的结果，宿主细胞可以表达其他辅助基因和/或含有目的rAAV基因组。在将不同的衣壳基因构建体引入宿主细胞后，将细胞在一定条件下孵育以产生rAAV颗粒，分离和/或纯化rAAV颗粒，并进行评估。可以基于一种或更多种因素评估分离的和/或纯化的rAAV颗粒，包括但不限于以下的一种或更多种：
a)rAAV颗粒的产率。在一些实施方案中，选择与例如相同血清型的参考rAAV(例如，使用参考方法例如在HEK 293细胞或Sf9细胞中产生的)相似或更好的产率
b)rAAV颗粒中VP1/VP2/VP3蛋白的比例。在一些实施方案中，选择VP1/VP2/VP3的比例＞0.5/＞0.5/10。因此，在一些实施例中，VP1/VP3的比例是约或＞0.5/10，例如约或大于＞0.75/10，例如约或大于＞1/10，例如约或大于＞1.25/10，例如约或＞1.5/10，例如约或＞1.75/10，或约2/10，或任意中间比例。同样，在一些实施方案中，VP2/VP3的比例独立地约或＞0.5/10，例如约或＞0.75/10，例如约或＞1/10，例如约或＞1.25/10，例如约或＞1.5/10，例如约或＞1.75/10，或约2/10，或任意中间比例。
c)完整/空的rAAV颗粒的比例。在一些实施方案中，选择与参考比例相似或大于参考比例的完整/空的颗粒的比例(例如，使用参考方法例如在HEK 293细胞或Sf9细胞中产生的，例如相同血清型的rAAV颗粒的完整/空的比例)。
d)rAAV颗粒的转导效率。在一些实施方案中，选择与例如相同血清型的参考rAAV(例如，使用参考方法例如在HEK 293细胞或Sf9细胞中产生的)相似或更好的转导效率。在一些实施方案中，在体外评估转导效率(例如，在细胞中，例如在培养物中培养的HeLa细胞中)。在一些实施方案中，在体内评估转导效率(例如，在动物模型，例如啮齿动物模型，例如小鼠模型中)。
e)rAAV颗粒中DNA包装的精确度。在一些实施方案中，选择与参考rAAV相似或更高的DNA包装精确度(例如，相对于其他DNA(例如宿主DNA)的rAAV基因组DNA，或在宿主细胞中的质粒或病毒载体上rAAV基因组侧翼的DNA)。在一些实施方案中，参考rAAV可以是例如相同血清型的rAAV，其是使用参考方法例如在HEK 293细胞或Sf9细胞中产生的。在一些实施方案中，可以通过确定包装的非rAAV基因组的百分比来评估DNA包装的精确度。这可以使用任何合适的方法确定，例如通过对rAAV颗粒中的包装DNA进行测序(例如，使用NGS或其他技术)。
作为该评估的结果，可以选择一个或更多个Kozak序列(和/或包括VP1翻译起始密码子上游的Kozak序列的Cap表达构建体)并用于在特定的细胞类型中产生目的rAAV。
因此，本申请的一些方面涉及可用于在昆虫细胞中产生rAAV的方法和组合物。在一些方面，本公开内容提供了包含编码以下核苷酸序列的核酸组合物，i)经修饰的Kozak序列和ii)AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白来自AAV5血清型衣壳蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白来自AAV8血清型衣壳蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白来自AAV9血清型衣壳蛋白。在一些实施方案中，核苷酸序列还包含启动子序列。在一些实施方案中，启动子与编码经修饰的Kozak序列和AAV衣壳蛋白的序列可操作地连接。
包含本文中提供的核酸的通用结构的非限制性实例描绘于图1中。核酸100包含编码经修饰的Kozak序列120以及AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白110的核苷酸序列。在wt AAV中，在哺乳动物细胞中，衣壳蛋白被转录为可以被剪接以产生两种mRNA同种型的单个mRNA。这种转录后加工和渗漏核糖体扫描允许产生三种单独的衣壳蛋白：AAV VP1衣壳蛋白111、从替代起始密码子ACG处起始的AAV VP2衣壳蛋白112和AAV VP3衣壳蛋白113。另外，在一些实施方案中，在相同核苷酸序列内的单独的开放阅读框编码组装活化蛋白114。在一些实施方案中，启动子序列130与核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，核酸包含增强子。在一些实施方案中，核苷酸序列包括多于一个的启动子。在一些实施方案中，包装到rAAV衣壳中的rAAV盒类似于图10A和10B中存在的那些。
当启动子序列控制和/或调节核苷酸序列的转录时，启动子与核苷酸序列“可操作地连接”。在一些实施方案中，利用在昆虫细胞中有活性的启动子是有利的。在一些实施方案中，启动子是多角体蛋白(polh)启动子。在一些实施方案中，启动子选自p10、p35和IE-1。用于在昆虫宿主细胞中表达外源基因的方法和技术是本领域已知的。用于在昆虫细胞中分子工程改造和表达多肽的方法学描述于例如Summers和Smith.1986.A Manual of Methodsfor Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures(用于杆状病毒载体和昆虫培养程序的方法手册)，Texas Agricultural Experimental Station Bull.No.7555，College Station，Tex.；Luckow.1991。在Prokop等，Cloning and Expression ofHeterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors′Recombinant DNATechnology and Applications，97-152；King，L.A.和R.D.Possee，1992；The baculovirusexpression system，Chapman和Hall，United Kingdom；O′Reilly，D.R.，L.K.Miller，V.A.Luckow，1992，Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual，New York；W.H.Freeman和Richardson，C.D.，1995，Baculovirus Expression Protocols，Methods inMolecular Biology，第39卷；美国专利号4,745,051；US2003148506；和WO 03/074714中。然而，根据用作生产者细胞(例如，昆虫，哺乳动物或其他)的细胞类型，可以使用任何合适的启动子(例如，任何天然的、变体型的、合成的、嵌合的、截短的、组成型的、诱导型的、组织特异性的、物种特异性的等启动子或前述两种或更多种的组合)。
在一些实施方案中，本文中所述的经修饰的Kozak序列含有用于翻译VP1衣壳蛋白的起始密码子。在一些实施方案中，起始密码子是AUG。在一些实施方案中，本文中所述的核酸还包含病毒颗粒。在一些实施方案中，核酸包含在病毒颗粒内(例如，由病毒颗粒衣壳包封)。在一些实施方案中，病毒颗粒是AAV颗粒。在一些实施方案中，病毒颗粒是杆状病毒颗粒。
在一些方面，本公开内容提供了在昆虫细胞中产生rAAV的方法，其包括以下步骤：(a)用以下转染昆虫细胞：(i)包含含有编码经修饰的Kozak序列和AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列之核酸的杆状病毒，其中经修饰的Kozak序列选自SEQ ID NO：2至11、13至32或33至45，(ii)包含编码AAV Rep蛋白的核苷酸序列的杆状病毒，和(iii)包含与启动子序列可操作地连接之目的基因侧翼的两个AAV ITR核苷酸序列的杆状病毒；(b)在适于产生rAAV的条件下培养昆虫细胞；以及(c)从昆虫细胞中回收rAAV。
在一些实施方案中，本公开内容提供了昆虫细胞，其中昆虫细胞包含含有编码经修饰的Kozak序列和AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸，其中经修饰的Kozak序列选自SEQ ID NO：2至11、13至32或33至45。在一些实施方案中，核酸整合到昆虫细胞基因组中。在一些实施方案中，编码Rep蛋白的基因整合到昆虫细胞基因组中。因此，在一些实施方案中，本公开内容提供了在昆虫细胞中产生rAAV的方法，其包括以下步骤：(a)用包含与启动子序列可操作地连接之目的基因侧翼的两个AAV ITR核苷酸序列的杆状病毒转染昆虫细胞，其中昆虫细胞的基因组包含本文中所述的核苷酸；(b)在适于产生rAAV的条件下培养昆虫细胞；以及(c)从昆虫细胞中回收rAAV。
先前已经描述了在昆虫细胞中rAAV的产生(参见，例如，美国专利公开号US20120100606，其通过引用整体并入本文)。本公开内容中提供的方法和组合物可以用于允许AAV的复制并且可以在培养物中维持的任何昆虫细胞中。例如，所用的细胞系可以来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、果蝇(Drosophila)细胞系或蚊子细胞系(例如白纹伊蚊(Aedes albopictus)来源的细胞系)。在一些实施方案中，昆虫细胞对杆状病毒感染敏感(例如，Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、Ha2302和Hz2E5)。因此，本文中提供的方法和组合物可用于使用杆状病毒表达载体(BEV)产生rAAV。
BEV已成为最通用的蛋白质生产系统之一。除了碱性蛋白质生产之外，BEV还被用于更复杂的任务，例如异源多蛋白复合物的合成以及基因治疗载体如rAAV的组装。在一些实施方案中，后一种策略利用与三种BEV共感染的昆虫细胞，每种BEV提供辅助功能。例如，昆虫细胞与包含侧翼为AAV反向末端重复序列(ITR)序列的目的基因的第一杆状病毒、包含AAV rep的第二杆状病毒和包含AAV cap的第三杆状病毒共感染。AAV cap编码组装活化蛋白(AAP)和病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。衣壳蛋白VP1、VP2和VP3从相同的mRNA转录物翻译而来，其可以在转录后剪接成两种不同大小的mRNA同种型中的任一种。哺乳动物细胞中的转录后剪接以适于产生mRNA形式的分布的速率发生，将导致适当化学计量比的VP1：VP2：VP3衣壳蛋白的表达。此外，在昆虫细胞中，一些血清型(例如，AAV5、AAV8和AAV9)的产生导致在转导细胞方面效率低的颗粒。因此，组合物和方法可用于修饰VP1表达水平以改善昆虫细胞或任何其他目的宿主细胞类型(例如哺乳动物宿主生产者细胞或其他类型的细胞)中的rAAV产生。
在一些方面，本公开内容提供了包含编码经修饰的Kozak序列以及AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸组合物，其中衣壳蛋白来自AAV5血清型。在一些实施方案中，Kozak序列包含用于翻译AAV5VP1衣壳蛋白的起始密码子和起始密码子上游的额外核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列还包含起始密码子下游的核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含序列RNXTXT(ATG)NY(SEQ ID NO：1)的核苷酸，其中(ATG)是VP1起始密码子；R是C或T核苷酸；N是选自A、T、G或C的核苷酸；X是G或T核苷酸；并且Y是选自A、T或C的核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含表1中所列的核苷酸序列。
表1.AAV5 VP1 Kozak序列
SEQ ID NO： 序列
2 CAUUGUAUGUC
3 UCGUUUAUGGA
4 CAGUUUAUGGU
5 CAUUGUAUGGU
6 UAGUGUAUGCU
7 CAUUGUAUGCU
8 UCUUUUAUGUC
9 UGUUUUAUGUC
10 UAGUUUAUGUC
11 UAGUGUAUGUC
在一些方面，本公开内容提供了包含编码经修饰的Kozak序列以及AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸组合物，其中衣壳蛋白来自AAV8血清型。在一些实施方案中，Kozak序列包含用于翻译AAV8VP1衣壳蛋白的起始密码子和起始密码子上游的额外核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列还包含起始密码子下游的核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含序列YNXRNR(ATG)XZ(SEQ ID NO：12)的核苷酸，其中(ATG)是VP1起始密码子；Y是选自A、T或C的核苷酸；N是选自A、T、G或C的核苷酸；X是G或T核苷酸；R是C或T核苷酸；并且Z是G或C核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含表2中所列的核苷酸序列。
表2.AAV8 VP1 Kozak序列
SEQ ID NO： 序列
13 UAGCGCAUGGC
14 UGGUAUAUGGC
15 UAGUUUAUGGC
16 CAGUGUAUGGC
17 UAGUGUAUGGC
18 UAUUGUAUGGC
19 CAUUGUAUGGC
20 CCGUUUAUGGG
21 ACUUGUAUGGG
22 CAUUUUAUGGG
23 UAGUGUAUGUC
24 UAGUUUAUGUC
25 UGUUUUAUGUC
26 UCUUUUAUGUC
27 UAGUGUAUGGG
28 UAGUUUAUGGG
29 UGUUUUAUGGG
30 UCUUUUAUGGG
31 UAGUGUAUGUC
32 UAGUUUAUGUC
在一些方面，本公开内容提供了包含编码经修饰的Kozak序列以及AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸组合物，其中衣壳蛋白来自AAV9血清型。在一些实施方案中，Kozak序列包含用于翻译AAV9VP1衣壳蛋白的起始密码子和起始密码子上游的额外核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列还包含起始密码子下游的核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含序列TNXTXT(ATG)XZ(SEQ ID NO：33)的核苷酸，其中(ATG)是VP1起始密码子；N是选自A、T、C或G的核苷酸；X是G或T核苷酸；并且Z是G或C核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含表3中所列的核苷酸序列。
表3.AAV9 VP1 Kozak序列
SEQ ID NO： 序列
34 UAGUGUAUGUC
35 UAGUUUAUGUC
36 UGUUUUAUGUC
37 UCUUUUAUGUC
38 UAGUGUAUGGG
39 UAGUUUAUGGG
40 UGUUUUAUGGG
41 UCUUUUAUGGG
42 UAGUGUAUGGC
43 UAGUUUAUGGC
44 UGUUUUAUGGC
45 UCUUUUAUGGC
应理解，根据所指的核酸是RNA还是DNA分子，可以指U或T核苷酸。
野生型AAV基因组是单链脱氧核糖核酸(ssDNA)，可以是正链或负链。基因组包含两个反向末端重复序列(ITR)，DNA链的每个末端各有一个，以及在ITR之间的两个开放阅读框(ORF)：rep和cap。rep ORF包含编码AAV生命周期所需的Rep蛋白的四个重叠基因。capORF包含编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3(其一起相互作用形成病毒衣壳)的重叠基因。VP1、VP2和VP3是从一个mRNA转录物翻译而来的，可以用两种不同的方式进行剪接：可以切除较长或较短的内含子，从而形成两种mRNA同种型：～2.3kb-和～2.6kb-长mRNA同种型。衣壳形成约60个单独衣壳蛋白亚基的超分子组装体，形成能够保护AAV基因组的无包膜T-1二十面体晶格。成熟衣壳由约1∶1∶10比例的VP1、VP2和VP3(分子量分别为约87、73和62kDa)组成。可以如本文中所述调节VP1相对于VP2和VP3的水平以便在昆虫细胞中获得感染性颗粒的有效产生。在一些实施方案中，VP1∶VP2∶VP3比例为(0.5-2)∶(0.5-2)∶10。在一些实施方案中，VP1∶VP2∶VP3比例为(0.5-1.5)∶(0.5-1.5)∶10。
重组AAV(rAAV)颗粒可包含核酸载体，其可至少包含：(a)含有编码目的蛋白质或多肽或目的RNA(例如，siRNA或microRNA)的目的基因的一个或更多个异源核酸区域；和(b)在一个或更多个核酸区域(例如，异源核酸区域)侧翼含有一个或更多个反向末端重复序列(ITR)序列(例如，野生型ITR序列或工程改造的ITR序列)的一个或更多个区域。在一些实施方案中，核酸载体的大小为2kb至7kb。在一些实施方案中，核酸载体的大小为4kb至5kb(例如，大小为4.2至4.7kb)。在一些实施方案中，核酸载体是环状的。在一些实施方案中，核酸载体是单链的。在一些实施方案中，核酸载体是双链的。在一些实施方案中，双链核酸载体可以是，例如，含有与核酸载体的另一区域互补的核酸载体区域，引发核酸载体形成双链的自身互补载体。
ITR序列可以来自任何AAV血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)或者可以来自多于一种血清型。ITR序列和含有ITR序列的质粒是本领域已知的并且可商购获得(参见，例如，可获自以下的产品和服务：Vector Biolabs，Philadelphia，PA；Cellbiolabs，SanDiego，CA；Agilent Technologies，Santa Clara，Ca；和Addgene，Cambridge，MA；以及Genedelivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemicdelivery of a therapeutic protein.Kessler PD，Podsakoff GM，Chen X，McQuistonSA，Colosi PC，Matelis LA，Kurtzman GJ，Byrne BJ.Proc Natl Acad Sci U S A.1996Nov26；93(24)：14082-7；以及Curtis A.Machida.Methods in Molecular MedicineTM.ViralVectors for Gene Therapy Methods and Protocols.10.1385/1-59259-304-
Figure BDA0001905733590000171
Humana Press Inc.2003.Chapter 10.Targeted Integration by Adeno-AssociatedVirus.Matthew D.Weitzman，Samuel M.Young Jr，Toni Cathomen和Richard JudeSamulski；美国专利号5,139,941和5,962,313，所有这些通过引用并入本文中)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒或rAAV制备物中的颗粒可以是任何AAV血清型，包括任何衍生物或假型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、2/1、2/5、2/8、2/9、3/1、3/5、3/8或3/9)。如本文中使用的，rAAV病毒载体(例如，rAAV颗粒)的血清型是指重组病毒的衣壳蛋白的血清型。衍生物和假型的非限制性实例包括rAAV2/1、rAAV2/5、rAAV2/8、rAAV2/9、AAV2-AAV3杂合体、AAVrh.10、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAV-HSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAV克隆32/83、AAVShH10、AAV2(Y-＞F)、AAV8(Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41和AAVr3.45。这样的AAV血清型和衍生物/假型以及产生这样衍生物/假型的方法是本领域已知的(参见，例如，Mol Ther.2012Apr；20(4)：699-708.doi：10.1038/mt.2011.287.Epub 2012Jan 24.The AAV vector toolkit：poised at theclinical crossroads.Asokan A1，Schaffer DV，Samulski RJ.)。在一些实施方案中，rAAV颗粒是假型rAAV颗粒，其包含(a)含有来自一种血清型(例如AAV2、AAV3)的ITR的核酸载体和(b)含有来自另一种血清型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10)的衣壳蛋白的衣壳。在一些实施方案中，本文中所述的方法可用于在昆虫细胞中产生任何血清型或衍生物/假型(例如，AAV5、AAV8、AAV9或基于其的其他血清型或衍生物/假型)的AAV。用于产生和使用假型rAAV载体的其他方法是本领域已知的(参见，例如，Duan等.，J.Virol.，75：7662-7671，2001；Halbert等.，J.Virol.，74：1524-1532，2000；Zolotukhin等.，Methods，28：158-167，2002；和Auricchio等.，Hum.Molec.Genet.，10：3075-3081，2001)。在一些实施方案中，可以在重组衣壳基因(例如，本申请中描述的重组VP1基因)中编码一个或更多个衣壳替换(例如，相对于相应的野生型序列)。
本文中描述了产生rAAV颗粒和核酸载体的方法。其他方法也是本领域已知的并且可商购获得(参见，例如，Zolotukhin等.Production and purification of serotype 1，2，and 5recombinant adeno-associated viral vectors.Methods 28(2002)158-167；和美国专利公开号US20070015238和US20120322861，其通过引用并入本文；以及可从TCC andCell Biolabs，Inc.，获得的质粒和试剂盒。例如，含有核酸载体的质粒可以与一种或更多种例如含有rep基因(例如，编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和cap基因(编码VP1、VP2和VP3，包括如本文所述的经修饰的VP3区域)的辅助质粒组合，并转染到生产者细胞系中，使得rAAV颗粒可以被包装并随后纯化。
在一些实施方案中，生产者细胞系来自昆虫细胞。昆虫细胞的实例包括但不限于Sf9细胞(参见，例如，
Figure BDA0001905733590000181
CRL-1711TM)。生产者细胞可包含编码用于本文中所述的方法的Rep蛋白和/或Cap蛋白的rep和/或cap基因(例如，如本文中所述的编码AAV VP1、VP2和VP3的核酸)。在一些实施方案中，包装在体外进行。
在本文中提供的方法的一些实施方案中，将含有核酸载体的质粒与一种或更多种辅助质粒(例如，其含有第一血清型的rep基因和相同血清型或不同血清型的cap基因)结合，并转染到辅助细胞系中，以便包装rAAV颗粒。
在一些实施方案中，所述一种或更多种辅助质粒包括含有rep基因和cap基因的第一辅助质粒和含有E1a基因、E1b基因、E4基因，E2a基因和VA基因的第二辅助质粒。在一些实施方案中，rep基因是来自AAV2的rep基因。辅助质粒和制备这样质粒的方法是本领域已知的并且可商购获得(参见，例如来自PlasmidFactory，Bielefeld，Germany的pDM、pDG、pDP1rs、pDP2rs、pDP3rs、pDP4rs、pDP5rs、pDP6rs、pDG(R484E/R585E)和Pdp8.ape；可从以下获得的其他产品和服务；Vector Biolabs，Philadelphia，PA；Cellbiolabs，San Diego，CA；Agilent Technologies，Santa Clara，Ca；和Addgene，Cambridge，MA；pxx6；Grimm等.(1998)，Novel Tools for Production and Purification of RecombinantAdenoassociated Virus Vectors，Human Gene Therapy，第9卷，2745-2760；Kern，A.等.(2003)，Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated VirusType 2Capsids，Journal of Virology，第77卷，11072-11081.；Grimm等.(2003)，HelperVirus-Free，Optically Controllable，and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1to 6，Molecular Therapy，第7卷，839-850；Kronenberg等.(2005)，A Conformational Change in the Adeno-Associated VirusType 2Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1N Termini，Journal ofVirology，第79卷，5296-5303；以及Moullier，P.和Snyder，R.O.(2008)，Internationalefforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards，Molecular Therapy，第16卷，1185-1188)。
在一些实施方案中，一种或更多种宿主细胞(例如，生产者细胞)可以具有一种或更多种辅助功能(例如，由整合到宿主细胞基因组中的重组核酸编码，或由宿主细胞中的质粒或病毒核酸载体编码)。在一些实施方案中，可以向质粒、病毒基因组(例如，杆状病毒、疱疹病毒、腺病毒或其他病毒基因组)或整合到宿主细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞，例如Sf9细胞)的基因组提供包含本申请中描述的经修饰的Kozak序列的重组衣壳基因(例如，VP1基因)。
在一些实施方案中，目的基因(例如，包装在rAAV颗粒中的基因)编码酶、激素、抗体、受体、配体或其他蛋白质。在一些实施方案中，目的基因编码治疗上有用的蛋白质。在一些实施方案中，目的基因编码参考或标志物蛋白(例如，可检测标志物，例如GFP)。在一些实施方案中，目的基因编码RNA，例如调节RNA，例如siRNA或其他调节RNA(例如治疗性RNA)。在一些实施方案中，治疗剂是多肽、肽、抗体或其抗原结合片段、核酶、肽-核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸或反义多核苷酸。在一些实施方案中，目的基因编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，治疗基因编码抗体、肽体(peptibody)、生长因子、凝血因子、激素、膜蛋白、细胞因子、趋化因子、作用于细胞表面受体或离子通道的活化或抑制肽、靶向细胞内过程的细胞渗透肽、溶解血栓剂、酶，骨形态发生蛋白、用于基因编辑的核酸酶或其他蛋白质、Fc融合蛋白、抗凝血剂、核酸酶、用于基因编辑的指导RNA或其他核酸或蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质对于溶酶体贮积病是治疗性的。在一些实施方案中，治疗性蛋白质对于神经障碍、神经运动缺陷、神经骨骼损伤或神经肌肉疾病是治疗性的。在一些实施方案中，治疗性蛋白质对于肌肉障碍(muscular disability)或营养不良、肌病或心肌病是治疗性的。在一些实施方案中，目的基因编码疫苗(例如，核酸或肽疫苗)。
在一些实施方案中，目的基因(例如，编码治疗剂)与启动子可操作地连接。启动子可以是但不限于天然启动子、合成或重组启动子、嵌合启动子、截短启动子、组成型启动子、诱导型启动子、物种特异性启动子、组织特异性启动子或前述两种或更多种的组合。在一些实施方案中，启动子可以是可调节的(例如，可以通过改变外部条件或通过添加或去除调节分子来提高或降低来自启动子的表达水平)。在一些实施方案中，目的基因可以与其天然启动子可操作地连接，或者可选地与不同的启动子连接。
在一些实施方案中，包含本文中所述的rAAV的组合物可用于治疗哺乳动物对象(例如人)。在一些实施方案中，所述对象患有癌症、糖尿病、自身免疫疾病、肾病、心血管疾病、胰腺病、肠疾病、肝病、神经疾病、神经肌肉疾病、布拉顿病(Bratten′s disease)、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、肺病、α-1α-1抗胰蛋白酶缺乏症、神经性障碍、神经运动缺陷、神经骨骼损伤、缺血、中风、溶酶体贮积病、庞贝病(Pompe disease)、杜谢内肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy)、弗里德赖希氏共济失调、卡纳万氏病(Canavandisease)、芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症、血友病A/B或其他疾病，或其任何组合。
无需进一步详细阐述，认为本领域技术人员基于以上描述可以最大程度地利用本公开内容。因此，以下具体实施方案应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开内容的其余部分。出于本文中引用的目的或主题，本文中引用的所有出版物均通过引用并入。
实施例
实施例1：使用减弱的Kozak序列调节稳定细胞系中的VP1∶VP2∶VP3比例
rAAV颗粒的生物学效力(例如，感染性)部分取决于病毒体衣壳组成，例如衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的化学计量比。在异源系统如昆虫细胞(例如，Sf9细胞)中产生的一些rAAV血清型(例如，AAV5、AAV8和AAV9)的特征在于异常的VP1表达水平。在病毒组装后，异常的VP1表达导致产生右由不适当的衣壳蛋白比例组成的病毒颗粒，这妨碍了颗粒有效转导细胞的能力。获得有用的化学计量比的衣壳蛋白的方法是复杂的，结果表明过多的VP1可损害昆虫细胞有效包装病毒颗粒的能力，而低水平的VP1可导致颗粒低效转导。因此，对于使用现有系统的昆虫细胞rAAV生产，找到提高感染性颗粒产率而不会不利地影响颗粒组装的方法仍然是一个挑战。
目前的研究旨在通过调节Sf9昆虫细胞中表达的rAAV中VP1的翻译起始速率来提高衣壳蛋白比率。具体地，AAV5、AAV8和AAV9中VP1的Kozak序列减弱，而经典ATG起始密码子保持恒定，并测量转导效率以评估组装的颗粒。
为AAV5设计了一组减弱的Kozak元件，并产生了编码这些元件的核酸。编码的Kozak序列显示在表4中。发现四个Kozak元件的小组以接近于1∶1∶10的野生型AAV5 VP1∶VP2∶VP3比例的比例编码衣壳蛋白，如图2A中描绘的Western印迹所示。对于这些元件(AAV5Kozak序列7-10)，(VP1)∶(VP2)∶(VP3)的各自比例在(0.5-2)∶(0.5-1)∶10的范围内。已经针对每个组装的颗粒测量了翻译起始序列(TIS，也称为Kozak序列)的体外相对效率(表4)。这些数字对应于图4B中Western印迹板下面的数字。AAV5Kozak序列7(SEQ ID NO：8)和8(SEQ ID NO：9)产生表现出最高效率的rAAV，并选择用于进一步分析。
表4.AAV5 VP1 Kozak序列
序列 Kozak序列 效率(％)
1 CAUUGUAUGUC(SEQ ID NO：2) 32
2 UCGUUUAUGGA(SEQ ID NO：3) 30
3 CAGUUUAUGGU(SEQ ID NO：4) 20
4 CAUUGUAUGGU(SEQ ID NO：5) 16
5 UAGUGUAUGCU(SEQ ID NO：6) 14
6 CAUUGUAUGCU(SEQ ID NO：7) 12
7 UCUUUUAUGUC(SEQ ID NO：8) 43
8 UGUUUUAUGUC(SEQ ID NO：9) 40
9 UAGUUUAUGUC(SEQ ID NO：10) 37
10 UAGUGUAUGUC(SEQ ID NO：11) 33
AAV5Kozak序列7产生的相应VP1∶VP2∶VP3比例为2∶1∶(8-9)。与从HEK 293细胞分离的AAV5相比，在昆虫细胞中产生的序列7颗粒显示出2倍高的转导效率。AAV5 Kozak序列8产生相应的VP1∶VP2∶VP3比例(1-1.5)∶1∶10。与从HEK 293细胞分离的AAV5相比，序列8颗粒显示出3至5倍高的转导效率。注意到序列8的包装的rAAV5变体的产率为序列7的产率约10倍高。
为AAV8设计了一组减弱的Kozak元件，并产生了编码这些元件的核酸。编码的Kozak序列显示在表5中。
表5.AAV8 VP1 Kozak序列
序列 Kozak序列 效率(％)
1 UAGCGCAUGGC(SEQ ID NO：13) 70
2 UGGUAUAUGGC(SEQ ID NO：14) 60
3 UAGUUUAUGGC(SEQ ID NO：15) 50
4 CAGUGUAUGGC(SEQ ID NO：16) 46-47
5 UAGUGUAUGGC(SEQ ID NO：17) 45
6 UAUUGUAUGGC(SEQ ID NO：18) 44
7 CAUUGUAUGGC(SEQ ID NO：19) 43
8 CCGUUUAUGGG(SEQ ID NO：20) 41-42
9 ACUUGUAUGGG(SEQ ID NO：21) 40
10 CAUUUUAUGGG(SEQ ID NO：22) 37
11 UAGUGUAUGUC(SEQ ID NO：23) 34
12 UAGUUUAUGUC(SEQ ID NO：24) 31
13 UGUUUUAUGUC(SEQ ID NO：25) 33
14 UCUUUUAUGUC(SEQ ID NO：26) 37
15 UAGUGUAUGGG(SEQ ID NO：27) 40
16 UAGUUUAUGGG(SEQ ID NO：28) 43
17 UGUUUUAUGGG(SEQ ID NO：29) 33
18 UCUUUUAUGGG(SEQ ID NO：30) 38
19 UAGUGUAUGUC(SEQ ID NO：31) 42
20 UAGUUUAUGUC(SEQ ID NO：32) 43
AAV8 Kozak序列1-12表现出VP1的过表达和VP2和VP3的低表达，如图2B中描绘的Western印迹分析所示。将这些序列排除在后续测试之外。剩余的元件(序列13-20)以与从HEK293细胞分离的AAV8相似的比例指导VP1∶VP2∶VP3的表达。
为AAV9设计了一组减弱的Kozak元件，并产生了编码这些元件的核酸。编码的Kozak序列显示在表6中。
表6.AAV9 VP1 Kozak序列
序列 Kozak序列 效率(％)
1 UAGUGUAUGUC(SEQ ID NO：34) 33
2 UAGUUUAUGUC(SEQ ID NO：35) 37
3 UGUUUUAUGUC(SEQ ID NO：36) 40
4 UCUUUUAUGUC(SEQ ID NO：37) 43
5 UAGUGUAUGGG(SEQ ID NO：38) 33
6 UAGUUUAUGGG(SEQ ID NO：39) 38
7 UGUUUUAUGGG(SEQ ID NO：40) 42
8 UCUUUUAUGGG(SEQ ID NO：41) 43
9 UAGUGUAUGGC(SEQ ID NO：42) 45
10 UAGUUUAUGGC(SEQ ID NO：43) 50
11 UGUUUUAUGGC(SEQ ID NO：44) 54
12 UCUUUUAUGGC(SEQ ID NO：45) 57
AAV9 Kozak序列2(SEQ ID NO：35)、3(SEQ ID NO：36)、5(SEQ ID NO：38)和9(SEQID NO：42)以令人满意的VP1∶VP2∶VP3比例指导AAV9衣壳，如通过图2C中描绘的Western印迹分析所示。考虑到用每种AAV血清型进行的实验，得到了“共有序列”减弱的Kozak元件。如图3所示，对于选自AAV血清型5、8和9的给定衣壳，-5(起始密码子上游5个核苷酸)的位置对于精确调节VP1∶VP2∶VP3表达比例是最灵活的。
实施例2：评估rAAV
用于rAAV生产的杆状病毒/Sf9系统的主要缺点是大多数Bac衍生的rAAV载体血清型(除少数例外)表现出改变的衣壳组成和较低的生物学效力。描述了一种新的基于昆虫细胞的生产平台，其利用减弱的Kozak序列和漏核糖体扫描来实现AAV衣壳蛋白化学计量的血清型特异性调节。举例来说，将rAAV5和rAAV9与HEK 293衍生的载体并列产生并全面表征。质谱分析表明，与人细胞衍生的载体相比，VP1和VP2衣壳蛋白两者含量提高了三倍。此外，使用新一代测序进行衣壳封装单链病毒DNA的广泛分析，并显示对于在昆虫细胞中产生的rAAV5，并行包装(collateral package)的污染DNA降低六倍。因此，重新设计的rAAV显示出显著更高的生物学效力，甚至与HEK 293产生的rAAV相比，在rAAV5的情况下，在小鼠脑组织中介导的转导高四倍。因此，所描述的系统产生具有优异感染性和优异纯度的rAAV载体，为GMP级载体生产提供了可扩展的平台。
rAAV被广泛用作基因治疗/DNA疫苗递送的载体，但是用于临床试验的高度感染性rAAV的放大生产仍然是具有挑战性的命题。AAV衣壳由通过AAV基因组中单个衣壳基因的可变剪接和差异密码子使用得到的三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3组成。VP3序列在所有三种剪接变体之间是共同的，VP2和VP1具有N端较长的序列，VP1的独特区域含有对病毒感染至关重要的磷脂酶结构域1。衣壳中VP1/VP2/VP3的确切量是未知的，但根据在SDS-PAGE2-4上分辨的衣壳蛋白的光密度测定分析，估计为1/1/10。此外，似乎没有确定的VP1/VP2/VP3化学计量，并且组装是随机的，使得包含在衣壳中的VP1/VP2/VP3的相对量主要取决于它们的相对表达水平5。因此，给定的rAAV生产系统中衣壳蛋白表达单元的设计对于生物学有效的基因治疗载体的组装是必不可少的。
为实现这一目标，最初的可扩展系统之一利用经来自苜蓿银纹夜蛾多核壳体核型多角体病毒(AcMNPV)的分别编码rAAV转基因盒、AAV rep和cap辅助基因的三种重组杆状病毒共转染的Sf9昆虫细胞的悬浮培养物6。然而，与HEK 293衍生的载体相比，由于VP1衣壳蛋白的不适当含量及其磷脂酶A2活性7-10，在该系统中产生的大多数AAV血清型的特征在于低转导效率。这个缺点是由于衣壳基因辅助载体设计利用VP1的非经典ACG起始密码子以诱导漏核糖体扫描6。即使其他组利用不同的起始密码子CUG11或人工内含子12在一定程度上解决该问题，但解决方案似乎缺乏血清型特异性序列调整所必需的灵活性。介绍了一种通过可调节的漏核糖体扫描来调节相对VP1/VP2/VP3组成的新系统。
在哺乳动物来源的细胞中，AAV中的P40驱动的转录物经历剪接以产生分别编码VP1或VP2/VP3衣壳蛋白的两种剪接的mRNA变体。由于在杆状病毒/Sf9系统中polh启动子代替了P40/内含子序列，所以不能通过剪接进行调节，并且使用通过漏核糖体扫描对VP1表达的替代调节。共有序列GCCRCCAUGGC(SEQ ID NO：49)(R＝A或G)被认为是有效的哺乳动物翻译起始位点(TIS)，也称为Kozak序列13。与该序列的任何偏差都会提高VP1 AUG的漏扫描以及从框内下游VP2 ACG或VP3 AUG密码子的翻译起始，从而改变VP1/VP2/VP3化学计量。在目前的工作中，描述了合理调节杆状病毒/Sf9系统中VP1/VP2/VP3衣壳组成的比例以获得具有更高VP1/VP2含量的颗粒的方法，其导致甚至与HEK 293衍生的载体相比显著更高的生物效力。
为了在其整体上表征这种先进的生产平台，通过两种方法进行了产生的衣壳封装DNA的下一代序列(NGS)分析：HEK 293的常规三质粒共转染和稳定引入整合的rep/cap辅助基因的Sf9细胞系的单一BEV感染。对由两个平台产生的rAAV盒进行的直接平行NGS分析揭示了昆虫细胞中病毒DNA包装的更高精确度，包封了显著更少的污染DNA。
AAV5和rAAV9衣壳基因的设计。为了提高漏核糖体扫描，使用前面是减弱的Kozak序列的经典AUG密码子。随机修饰AUG上游或下游的核苷酸不是一种现实的方法，因为跨越8个残基的相关延伸的可能TIS序列的复杂性为65,536种可能的排列。此外，对于酵母14，高等植物15，无脊椎动物16或脊椎动物17，共有序列Kozak序列似乎是不同的。因此，使减弱的TIS的筛选合理的一种方法是利用由Noderer等得到18的所有可能的哺乳动物TIS排列的经验热图，因此TIS的所有可能组合被指定为相对于共有序列Kozak序列的“起始效率”值。
选择12-43％的起始效率范围并测试相差2-4％的增量的10个突变体。所有10个AAV5VP1测试的TIS显示在表9中，并且用于表达cap的辅助质粒(图4A)的背景中，以如前所述7得到BSR合并的细胞系并评估它们的衣壳组成。除了几个明显例外(例如，图4B，泳道6)，相对VP1含量逐渐降低，同时紧密地遵循相对TIS效率的理论值降低。这种相关性支持最初的假设，即漏扫描翻译起始可用于调节VP1含量。为了进一步鉴定有用的VP1/VP2/VP3化学计量，测定了10种rAAV5载体各自的感染性和总体滴度。为了产生感染性rAAV5载体，产生编码CBA驱动的GFP的BEV(图10A，pTR-Bac-UF26)。并排比较显示，与所有其他构建体相比，具有40％TIS相对效率的构建体(图4B，泳道2)是优异的，产生了最高产率。因此，选择引入了减弱的TIS UGUUUUAUGUC(表9中的SEQ ID NO：9)的这种特定的含衣壳基因的辅助构建体来得到生产细胞系。但是，也可以使用其他序列。以类似的方式，筛选了12种具有减弱的Kozak序列的AAV9 VP1质粒构建体(表9)。对于AAV9，特别有用的序列是UAGUGUAUGGC(SEQ ID NO：42)，构成相对TIS效率的45％。但是，也可以使用其他序列。
rep2/cap5稳定细胞系的表征。使用缺少Rep-结合元件(RBE)的Rep2和Cap5表达质粒8得到个体细胞系。Cap5辅助包含以下减弱的TIS：UGUUUUAUGUC(SEQ ID NO：9)。如先前所述繁殖和测试五种个体细胞系7。选择一种被称为B8的显示最高的rAAV5-UF26产率的细胞系用于进一步表征。研究了以下参数。
表9.测试WT和减弱的TIS的AAV5和AAV9衣壳基因的表达。
Figure BDA0001905733590000271
Figure BDA0001905733590000281
Figure BDA0001905733590000291
*估计的相对TIS效率18
每种血清型的选择的序列以粗体突出显示。下划线表示VP1起始密码子。
VP1/VP2/VP3化学计量。通过连续双碘克沙醇梯度从HEK 293细胞纯化的rAAV5-GFP的衣壳组成偏离VP1/VP2/VP3的理论值1/1/10，因为其含有较低的VP1含量(图4C)。此外，该衣壳引入了额外的具有稍高MW的VP2衣壳蛋白。相反，Sf9 B8衍生的载体包含有更高水平的VP1和VP2(图4C)。对于rAAV9，Sf9衍生载体的衣壳组成与HEK 293细胞中制备的载体几乎相同(图4D)。与rAAV5不同，两种病毒样品似乎都含有比VP2更多的VP1，并且还含有小于VP3的带，这可能是衣壳特异性蛋白水解的产物19。
为了量化精确的数值，将rAAV5的各个衣壳带的密度绘制为曲线下面积(AUC)(图11)。得到以下值(两个独立实验的平均值，调整到VP3公分母＝10)∶HEK 293VP1/VP2/VP3＝0.2/0.5/10；Sf9B8VP1/VP2/VP3＝0.7/1.7/10。为了验证计算的化学计量，使用基质辅助激光解吸/电离-飞行时间(MALDI-TOF)通过质谱法分析rAAV5衣壳组合物。
MALDI-TOF。构成病毒体壳的AAV VP共享其VP3C-末端(图5A，以黑色显示)。与共享的VP3结构域相比，VP1(虚线)和VP2(点划线)独特的N-末端相对较小，对通过分析其独特的胰蛋白酶肽来破译相对化学计量产生了挑战。因此，差异16O/18O标记方法用于区分相同的肽但衍生自VP1、VP2或VP3。当在胰蛋白酶消化期间使用重氧稳定同位素水H2 18O时，在胰蛋白酶肽的C末端羧基上交换两个18O原子，质量偏移4Da20，21。来自两种不同蛋白质(例如VP1或VP3)的相同肽之间的这种偏移允许鉴定和定量蛋白质。
在进行中试消化后，选择VP3区域中的三种肽(图5A)来定量每种蛋白质的相对丰度。通过分别运行VP3/VP1-和VP2/VP3样品确认了两个18O原子的完全引入。然后，分析H2 18O中所有VP3消化胰蛋白酶产物的完整MALDI光谱(图5B)。所有肽显示出与预测的肽分子量相比的4Da质量偏移，证实引入了两个18O原子。如果观察到的质量偏移仅为2Da，则反应不完全或者发生不完全胰蛋白酶失活的反向交换20。图5C显示来自VP1(原始颜色图中的红色迹线)或VP3(原始颜色图中的蓝色迹线)的胰蛋白酶肽TWVLPSYNNHQYR(SEQ ID NO：48)的重叠，其分别点样并通过MALDI-TOF分析。VP3样品的4Da的明显质量偏移证明了完全的18O原子交换，没有反向交换的证据。图5D显示用H2 18O消化并以1∶1与在H2 16O中消化的VP1混合的VP3的代表性MALDI-TOF光谱。将峰面积积分并用于计算每种蛋白质的丰度。
分析每种蛋白质的三种独特肽(图5A)，每种都在三次重复的MALDI-TOF运行中(表10和11)。这允许对它们的相对丰度进行高置信度量化22。得到以下值(三个独立实验的平均值，调整到VP3公分母＝10)：HEK 293 VPI/VP2/VP3＝0.4/0.5/10；Sf9B8VP1/VP2/VP3＝1.1/1.7/10。这些数字与上述AUC密度非常一致。
表10.VP1/VP3离子、强度和比率。
Figure BDA0001905733590000301
*M/Z表示质量除以电荷数。
表11.VP2/VP3离子、强度和比率。
Figure BDA0001905733590000311
*M/Z表示质量除以电荷数。
全/空颗粒比率。研究该参数以确定两个产生平台中的任一个是否产生更高的空颗粒比率，这是不利的免疫应答的潜在来源以及载体纯化期间的技术挑战。将rAAV5和rAAV9通过单特异性抗体亲和树脂上的一步色谱法纯化，rAAV5为AVB，rAAV9为POROSCaptureSelectTM纯化。纯化后，使用QC PCR测定载体基因组颗粒滴度。使用用金纳米颗粒修饰的rAAV衣壳的纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定rAAV5和rAAV9载体的总颗粒滴度。该方法利用高散射材料(例如金纳米颗粒)和病毒衣壳之间的静电吸引力。得到的金标记的病毒颗粒散射足够的光以通过光学系统可视化和跟踪(图6A-6F)，使得能够使用NTA来测量AAV的尺寸和浓度。有趣的是，虽然两个平台的rAAV9颗粒的平均尺寸相同(38nm的主峰，图6A，6B)，但来自HEK 293和Sf9 B8的rAAV5的平均尺寸不同(48nm对42nm，图.6D，6E)。值得注意的是，这些尺寸是病毒/纳米金颗粒复合物的近似值，后者又是病毒颗粒电荷的函数。
在计算总颗粒与完整颗粒的比率后，HEK 293衍生的rAAV9的这些值为2.8，并且对于Sf9衍生的rAAV9为3.1(图6C)。类似地，对于rAAV5，比率也没有显著差异：14.8对15.2(图6F)。显然，rAAV9的总体较低比率是由CaptureSelect树脂色谱的纯化偏差引起的，其显示了含DNA的rAAV9颗粒的优先结合和富集(数据未示出)。
体外转导效率。使用引入萤光素酶和mApple报告基因的rAAV转基因盒(图10B，pTR-UF50-BC23)产生相应的BEV以感染Sf9 B8细胞系以测试转导效率。相同的质粒也用于通过HEK 293细胞的三质粒共转染来产生rAAV。将并排纯化和滴定的两种rAAV5-Luc-mApple载体用于感染HeLa衍生的C12细胞系24。FACS分析(图12A)显示出Sf9产生的rAAV5载体的显著更高(～5倍)的转导效率。对于rAAV9，两种rAAV9样品之间没有显著差异(图12B)。两个实验的数据与蛋白质含量一致。
体内转导效率(图7)。在小鼠的脑(纹状体)中体内测定在HEK 293和Sf9B8细胞中产生的rAAV5-Luc-mApple。注射后三周，通过生物发光(BLI)测定转导效率(图7A)。用Sf9B8衍生的AAV5注射的动物显示出比HEK 293衍生的AAV5高4倍的BLI信号强度(图7B，分别为4.3x105±1.8x105和1.1x105±3.5x104)。类似地，脑切片的荧光分析显示与HEK 293相比，Sf9B8衍生的样品中更强的mApple信号(图7C)。
HEK293和Sf9细胞中产生的rAAV5载体的下一代测序(NGS)分析。已经建立了用于生产更高效力的基于rAAV5的载体的改进的OneBac系统，对通过HEK 293中的标准三重共转染方案或通过稳定的rep2cap5 Sf9细胞系B8的单一BEV-UF26转染产生的衣壳封装ssDNA(pTR-Bac-UF26，图10A)进行了比较NGS分析。NGS分析的目的是表征rAAV盒特异性以及并行包装的污染DNA种类，从而建立满足GMP级rAAV载体生产要求的优选平台。一式两份地对所有NGS文库进行制备、测序和分析。一般工作流程在流程图中描绘(图13)。已分析了以下参数。
污染DNA序列的并行包装。
过滤后，分配给索引的读数总数为757,433,116。在读数与参考序列比对后，rAAV盒的覆盖率达到高至2,260,074读数/nt(nt位置2,000)。对于并行包装的序列，覆盖率显著较低：10,781读数/nt(nt位置1,299，载体骨架)或6,424个读数/nt(nt位置200，AcMNPV基因组)。
对于两种生产方案，大多数读数是rAAV-Bac-UF26盒，其占所有衣壳封装DNA序列的96.5％(HEK 293)和99.4％(Sf9)(表12，图8A，8B)。HEK 293系统中的大部分污染DNA是细菌质粒骨架(2.5％)以及低水平的rep2/cap5辅助序列(0.7％)和人基因组DNA(0.17％)，而Sf9制备物中的污染物是穿梭质粒骨架(0.3％)和AcMNPV基因组(0.2％)。对于Sf9衍生的rAAV5，未发现任何读数与最近从ATCC(Sf-弹状病毒)获得的Sf9细胞系分离的偶然弹状病毒同源25。
并行包装的序列更充分地由rAAV盒及其各自的骨架的直接连接代表：HEK 293细胞的细菌质粒和Sf9细胞的杆状病毒基因组。值得注意的是，在两个系统之间的连接读数覆盖范围内存在显著差异(至少十倍)，其中HEK 293细胞似乎以更高的频率包封更远离左右AAV末端重复的细菌质粒骨架序列(图8C，8D)。因此，对污染DNA序列的分析表明，OneBac系统提供更高的精确度并提供更高质量的rAAV载体，因此只有0.6％的衣壳封装载体基因组包含外源DNA，与HEK 293细胞的3.5％相反。
表12.HEK 293和Sf9*细胞中rAAV5-UF26的特异性和并行包装的分析
Figure BDA0001905733590000331
*纯化的病毒体中DNA的相对含量显示为通过NGS分析鉴定的总序列的百分比。所有NGS分析均以两个平行行中的每个参考基因组显示的重复进行。
rAAV基因组覆盖率。使用包括仅8个循环的PCR扩增步骤的标准方案以产生NGS文库，在CBA启动子内鉴定了多个序列，并且下游内含子与rAAV盒的其余部分相比显示出至少低十倍的测序覆盖度。仔细检查发现这些序列极其富含GC(图8A，8B)。由于DNA复制过程中的截短，这种相对较低的覆盖率可能反映了这些序列在包装的病毒体中的较低代表。或者，该下降代表由PCR相关的NGS文库制备引入的伪影。为了排除第二种可能性，在没有PCR扩增的情况下直接从纯化的衣壳封装rAAV DNA制备NGS文库。这样，所讨论的序列的覆盖率恢复到与盒的其余部分相当的水平。因此，HEK 293和Sf9细胞都支持全长rAAV盒的包装，几乎没有任何截断的证据。
rAAV-Bac-UF26盒的基因组同一性。AAV盒的高测序深度允许详细分析包装的DNA序列同一性和与其各自亲本细菌质粒的相关性。为了降低错误调用的可能性并提高单核苷酸多态性(SNP)分析的置信度，仅使用无PCR样品的NGS数据。来自两种病毒样品的DNA的SNP变体以及阳性对照质粒样品显示非常相似的取代谱(相关系数为0.75-0.77)(图9A)。有趣的是，大多数SNP与上文鉴定为富含GC含量的区域的非编码序列共定位(图9B)：鸡β-肌动蛋白启动子和内含子序列。此外，与Lecomte等26一致，AAV TR显示出相对高的SNP改变性。
Urabe等10和Kohlbrenner等9先前记载了昆虫细胞产生的AAV5和AAV8血清型的rAAV载体相对较差的效力。随后，显示许多其他OneBac衍生的AAV血清型的特征在于与293衍生的AAV相比具有较低的感染性27。所有受影响的血清型的统一原因是衣壳辅助基因的修饰序列导致引入磷脂酶A2活性的VP1衣壳的较低含量。正如所料，推荐的解决方案旨在通过使用不同的起始密码子CUG11或人工内含子8，12来缓解这一问题。尽管新设计有助于提高某些载体的感染性，但解决方案似乎缺乏血清型特异性序列调整所必需的灵活性。
本文描述了一种新方法以提高衣壳的相对VP1/VP2含量。这是通过修饰VP1 AUG起始密码子前面的经典Kozak序列来实现的。作为原理证明，对于AAV5和AAV9血清型测试了一系列Kozak序列，显示最有利的翻译起始位点是血清型特异性生产性rAAV载体，其超过HEK293衍生的对应物的转导效率。然而，所描述的方法需要在相对TIS效率的窄窗口中精细调节VP1 Kozak序列，相对TIS效率对于不同血清型也是不同的。这种变化的原因之一是VP1∶VP2∶VP3比例不仅取决于VP1 TIS相对效率，还取决于VP2和VP3 TIS相对效率，而这对于所有血清型也是不同的(表13)。此外，故意提高VP1含量高于某一阈值(例如，图4B，泳道1和6)似乎适得其反，因为一旦VP1∶VP2∶VP3比例偏离1∶1∶10的理论值太远，病毒的产率就会急剧下降。人们可以得出“共有序列”VP1TIS：U(C)A(C/G)U(G)UG(U)UAUGG(SEQ ID NO：50)，其理解是可以凭经验鉴定用于特定用途的特定TIS。
表13.围绕AAV血清型中VP1、VP2和VP3起始密码子的翻译起始序列
Figure BDA0001905733590000351
*表示通过AAV血清型衣壳基因的序列比对推断的AAV7中推定的替代起始密码子VP3。Kozak TIS的相对强度以起始密码子旁边的％表示18
在选择用于分析的rAAV5构建体中，相对VP1含量的数值从HEK 293衍生载体中的0.2-0.4(通过两个独立测定)提高至Sf9细胞中的0.7-1.1(即，平均提高3倍)。对于VP2，这些值从0.5提高到1.7，提高了差不多3倍。VP2的一致提高是rAAV5 VP1相对提高的不可预测的影响之一。VP1和VP2两者的N末端包含所谓的基础区域3(BR3，PKRKKART(SEQ ID NO：51))，其代表了对于AAV在细胞核内递送其基因组并然后转导细胞28-30有用的保守核定位序列(NLS)基序。因此，每个VP1和VP2提高3倍会提高更具感染性的病毒的产率，这并不奇怪。
上面提供的数据不包括在最近描述的OneBac2.08和当前系统中产生的rAAV5和rAAV9的直接比较。然而，人们可以将各自的衣壳比例联系起来并得出结论，对于这些血清型，新设计的cap辅助基因显著改善了AAV5和AAV9衣壳化学计量，其翻译成为更高效力的病毒载体。
另一个意外的发现是HEK 293和Sf9细胞显示的包装效率的相似性，其通过全空颗粒比的替代参数评估。使用先前鉴定的1∶2.5的rep/cap表达盒的比例来构建稳定的生产细胞系7，类似于HEK 293，实现了包装效率。
随着许多临床试验的进行，评估由不同方案产生的rAAV原液的遗传特性成为一个紧迫的监管问题。许多研究小组报道了来自包装宿主细胞26，31，32、细菌辅助质粒骨架26，33、辅助病毒8，32和wt AAVrep/cap序列26，34的序列的并行衣壳封装。为了评估包装的rAAV盒的遗传同一性，进行了衣壳封装的单链病毒DNA的NGS分析。试验分析显示富含GC的序列中盒的序列覆盖不均匀，这对于两个平台几乎相同。利用无PCR方案，显示覆盖率下降显然是由于文库制备期间PCR诱导的伪影，而不是截短的rAAV基因组的包装35，36。基于PCR的NGS文库制备方法的精确性被多个小组质疑为不适合AAV相关分析37，特别是在富含GC的回文序列如反向末端重复序列(ITR)中，或应用于任何富含GC的序列38。因此，应使用充分的方案进行rAAV载体制备物的NGA分析。
对来自两个平台的病毒DNA的遗传同一性的分析显示在昆虫和人细胞中的衣壳封装rAAV DNA之间没有显著差异。然而，值得注意的是，这里记录了用于转染HEK 293细胞的pTR-Bac-UF26质粒DNA库序列偏离数据库中该质粒序列的事实。质粒DNA的这种遗传漂变的事实虽然令人惊讶，但可以通过以下机制解释。含有rAAV盒的质粒在重组缺陷的大肠杆菌菌株中繁殖，以维持AAV ITR的完整性。这些菌株缺乏催化重排和使非标准二级和三级结构缺失的途径组分(endA，recB recJ)。结果，质粒DNA积累错配的碱基和点突变，其否则将由错配修复系统恢复。DNA中的错配，如果不修复，会导致高的自发突变频率。因此，在转染期间，突变的质粒DNA将其异源双链体“印迹”结构携带到宿主HEK 293细胞核中，在那里它被修复39或复制拷贝突变。因此，共转染方案中，质粒DNA库将大肠杆菌的一些诱变负荷转移到衣壳封装的AAV盒中，这对于一些富含GC的序列可能是实质性的。有趣的是，GFP报告基因cDNA似乎具有最小数量的突变(图8A)，其可以反映其合成的“人源化”起源40。在这方面，除了其免疫原性相关效应之外41，从rAAV盒中耗尽CpG基序也可能有助于提高亲本质粒DNA的遗传稳定性。
由这两个平台产生的rAAV盒的直接并排NGS分析显示，在昆虫细胞中病毒DNA包装的精确度更高，包装更少的污染DNA(0.6％对3.5％)。如果考虑到FDA指南“残留细胞-底物DNA的水平应该≤10ng/剂量”，这种6倍的降低似乎是显著的
(fda.gov/downloads/AdvisoryCommittees/CommitteesMeetingMaterials/BloodVaccinesandO therBiologics/VaccinesandRelatedBiologicalProductsAdvisoryCommittee/UCM319573.pdf).。
考虑到目前使用rAAV的临床试验中剂量达到高至6x1013vg/kg42，43，所以如果在HEK 293细胞中产生，载体将包含超过FDA指南的污染DNA。在这里，显示使用OneBac系统产生的rAAV5载体具有显著更高的感染性，同时包装更少量的外源DNA。因此，这种生产方法通过降低其有效剂量和提高安全性来改善载体施用的潜在治疗结果。
材料和方法
以下非限制性材料和方法与本申请中描述的某些实验结合使用。这些或其他材料和方法可以与本申请中描述的实施方案结合使用。
在HEK 293细胞中产生rAAV5和rAAV9
通过如先前所述44的三重共转染程序产生rAAV5和rAAV9载体。具有rAAV盒的质粒(rAAV5-Bac-UF26，或rAAV5-UF50-BC，以及rAAV9-Bac-UF26，图10A-10B)与pHelper和pRep2Cap5(或pRep2Cap9)以1∶1∶1的摩尔比组合使用。使用连续双轮碘克沙醇浮力密度离心纯化rAAV5和rAAV9。具体地，将含有全颗粒的第一轮碘克沙醇级分用1x PBS-MK缓冲液稀释2.5倍，并用在标准梯度中代替15％碘克沙醇-1M NaCl步骤44。
在Sf9细胞中产生rAAV5和rAAV9
将Bac-UF26或UF50-BC rAAV盒插入pFastBac骨架中，并按照Bac-to-Bac系统指南得到各自的BEV。将噬斑纯化的BEV繁殖至P3，通过噬斑测定滴定，并用于感染含有rep2cap5或rep2cap9诱导型辅助基因的基于Sf9的稳定细胞系，如先前所述7。收获后，用benzonase处理冻融裂解物并通过在20,000g下高速离心30分钟澄清。如上文对293HEK产生的AAV所述来纯化上清液。
rAAV5和rAAV9的一步纯化。如先前所述45，使用AVB Sepharose High Performance亲和层析树脂(GE Healthcare)从澄清的粗裂解物中纯化rAAV5。使用POROSCAPTURESELECTTMAAV9树脂(Thermo Fisher)通过一步亲和层析从粗裂解物中纯化。具体地，将澄清的粗裂解物在重力下施加到含有0.5ml树脂的柱上，然后用10倍柱体积的1xPBS洗涤柱，接着用1ml洗脱缓冲液：50mM柠檬酸盐缓冲液pH 3.0-1M NaCl洗涤。洗脱的rAAV9立即用0.1ml 1M TrisHCl pH 8.4中和。
rAAV滴定
rAAV载体的直接比较分析需要准确估计各自的病毒滴度。使用四种独立测定来滴定源自HEK 293或Sf9细胞的rAAV：1)液滴数字PCR(ddPCR)46-使用BioRad QX200数字PCR系统建立参考标准；2)使用iTaqTM Universal
Figure BDA0001905733590000381
Green Supermix试剂盒(BioRad，1725121)和qPCR BioRad CFX Connect RealTime System进行定量竞争PCR(QC-PCR)；3)基于picogreen的方案47和4)使用NanoSight 300(NS-300，Malvern Instruments，Malvern，UK)的纳米颗粒跟踪分析(NTA)——以量化rAAV颗粒的滴度和尺寸。在确定每个方案的条件并使用由ddPCR衍生的参考标准后，来自方案2)和3)的计算的滴度总是在2的因子内，并且被平均以得出工作滴度。简而言之，进行以下程序。
ddPCR。使用补充有0.05％Pluronic F-68的1x乳酸林格(LR)溶液制备一式三份稀释液，每次反应1-10-3个病毒基因组拷贝。使用以下引物进行DdPCR：
Figure BDA0001905733590000382
QC-PCR。为了得到标准曲线，在SmaI消化各质粒pTR-Bac-UF26后，凝胶纯化rAAV-UF26转基因盒。将回收的DNA稀释至约1ng/μl的浓度，通过QUBIT dsDNA测定确定精确浓度。使用相同的引物组并使用通过参考rAAV样品(ddPCR)和凝胶纯化的rAAV盒(QC-PCR)的10倍连续稀释制备的标准曲线，进行高度纯化的Sf9-或HEK29-产生的rAAV的直接QC-PCR滴定。
基于PicoGreen的测定通过Quanti-iT PicoGreen dsDNA测定试剂盒(LifeTechnology，P7589)进行，使用λDNA标准来校准标准曲线，如描述的47。通过Perkin Elmer1420Multilabel Counter Victor V测量光密度。
NTA。在NTA分析之前，通过PAAG凝胶电泳评估病毒原液的滴度。知道近似滴度，将50μl在LR缓冲液中稀释的AAV原液加入到含有标记缓冲液(20mM柠檬酸，pH 3.5，0.1％Pluronic F68，1mM NaCl)和金纳米颗粒(Sigma，Cat.#741949)的标记混合物中。在室温孵育30分钟后，使用没有AAV的标记混合物和没有金的标记缓冲液中的AAV作为阴性对照。使用具有以下设置的NS-300仪器进行测量：激光类型-Blue488，相机水平-15，帧数-749，记录时间-30秒，记录数-每个数据点3个。由NS-300产生的至少四个数据点用于计算AAV滴度。
MALDI-TOF。从SDS-PAAG切下VP1、VP2和VP3带并制备用于胰蛋白酶消化。使用来自Promega(Madison WI)的测序级胰蛋白酶，使用产生商推荐的方案在凝胶切片中消化衣壳蛋白。简单来说，尽可能地修剪条带以使背景聚丙烯酰胺材料最小化。然后将凝胶块在纳米纯水中洗涤5分钟。重复洗涤步骤两次，然后是两个脱色循环，每个循环用1∶1v/v甲醇∶50mM碳酸氢铵脱色10分钟。将凝胶块用1∶1v/v乙腈∶50mM碳酸氢铵脱水。将凝胶切片再水化并与二硫苏糖醇(DTT)溶液(25mM，在100mM碳酸氢铵中)一起孵育30分钟，然后添加在100mM碳酸氢铵溶液中的55mM碘乙酰胺。将碘乙酰胺与凝胶切片在黑暗中孵育30分钟。将凝胶切片再次用两个循环的H2O洗涤，并用1∶1v/v乙腈∶50mM碳酸氢铵脱水。通过使其在0.01％ProteaseMAX表面活性剂中的12ng/ml胰蛋白酶中再水化5分钟，将蛋白酶驱入凝胶块中。然后将凝胶片用40μL 0.01％ProteaseMAX表面活性剂：50mM碳酸氢铵覆盖，并在振荡器上轻轻混合1小时。通过添加0.5％TFA终止消化。立即进行MS分析以确保具有最小非特异性切割的高质量胰蛋白酶肽，或将样品在-80℃下冷冻直至其可以进行分析。除ProteaseMAX表面活性剂外，以相同方式进行18O标记的消化，并在H2 18O中制备胰蛋白酶。为了防止反向交换，通过在100℃孵育15分钟使胰蛋白酶失活。使用H2 18O消化VP3，而在常规H2 16O中消化VP1；将消化产物以1∶1混合并通过MALDI-TOF进行分析。对VP2/VP3也进行了类似的分析。
在用N2激光在反射、正离子模式下操作的Bruker Daltonics Microfle上进行MALDI-TOF。在产生信号所需的阈值水平下使用激光功率。该仪器用肽校准标准II(布鲁克道尔顿)校准，后者是血管紧张素II，血管紧张素I，物质P，蛙皮素，ACTH clip 1-17，ACTHclip 18-39，生长抑素28，缓激肽片段1-7、肾素底物猪十四肽(Renin SubstrateTetradecapeptide porcine)的混合物，覆盖质量范围为～700Da至3200Da。使用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质，并在50％ACN/0.1％TFA(在H2O中)中制备为饱和溶液。将1μL基质和1μL样品的分配物彻底混合在一起；将0.5μL点在靶板上并使其干燥。
体外转导测定。使用用rAAV以MOI为2,000感染或用Ad5以MOI为5共感染的C12细胞24测定rAAV5-Bac-UF26和rAAV9-Bac-UF26。感染后48小时，通过荧光激活细胞分选(FACS)对mApple荧光阳性细胞进行评分。
AAV注射
所有动物程序均由佛罗里达大学动物护理和使用委员会(University ofFlorida Institutional Animal Care and Use Committee)批准。将四至五周龄的雌性BALB/c(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME USA)小鼠用于实验。所有外科手术均使用无菌技术和异氟醚气体麻醉进行。如前所述进行脑部手术23。简单地说，一旦麻醉，将小鼠置于立体定位框架(Kopf Instruments，Tujunga，CA)中，并且通过内径为30-40μm的玻璃微量移液管以0.5μl/分钟的速率将2μl HEK-或8B-衍生的rAAV5-UF50-BC载体(4.75×1011vg/ml)注射到右侧纹状体(坐标：前-后-0.3mm，侧面-2.0mm，背腹-3.0mm)。在从脑中取出之前将针留在原位5分钟。
生物发光成像
如前所述对小鼠进行成像23。在腹膜内注射D-萤光素(PBS中15mg/mL，126mg萤光素/kg体重)后12分钟，使用Xenogen IVIS Lumia体内成像系统(PerkinElmer，Waltman，MA)从感兴趣区域分析获得生物发光测量值。以25cm的视野对三只小鼠同时成像。使用中等分档和f-stop为1的60秒的成像时间用于相机设置。将每个数据集中显示的图像相对于适当的颜色强度标度归一化。BLI数据作为原始数据报告，作为到达电荷耦合器件检测器的计数总数。
脑组织制备和荧光成像
用戊巴比妥(Beuthanasia-D)将小鼠深度麻醉，并通过升主动脉用10ml盐水溶液灌注，然后用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的10ml冰冷的4％多聚甲醛(PFA)灌注。取出脑并在4℃下在4％PFA中后固定过夜。在振动切片机台VT1000S(LLeica Microsystems，Wetzlar，Germany)上切割60微米厚的冠状切片。通过可变模式激光扫描仪(Typhoon 9200，GE Amersham，Pittsburgh，PA，USA)或使用倒置显微镜DMI4000B(Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)分析mApple荧光。
NGS分析
通过使用HiSeq 3000仪器(Illumina，San Diego，CA)的UF ICBR Core以及配对末端测序进行NGS。为了证明所选NGS方案的可重复性，所有DNA样品一式两份制备。类似地，NGS文库合成、测序和生物信息学的所有步骤平行和一式两份地进行。
基于HEK 293的生产的参考DNA包括可能污染rAAV原液的所有DNA序列：智人(H.sapiens)基因组序列(HEK 293，GRCh38.p9，ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.35或RefSeq assembly accession：GCF_000001405.35)；腺病毒辅助质粒(pHelper，GenBank：AF369965.1)；编码AAV2Rep和AAV5VP蛋白(rep2cap5)的pACGr2c5，以及各自的质粒骨架。对于基于Sf9的生产，分析以下序列：草地夜蛾(S.frugiperda)基因组(JQCY02.1.fsa_nt.gz，GenBank：JQCY00000000.2)；AcMNPV基因组(GenBank NC_001623.1)；草地夜蛾弹状病毒分离株Sf(GenBank KF947078.1)；FastBac穿梭质粒骨架，以及编码AAV2 Rep和AAV5 VP的序列。
使用含有无PCR和PCR富集选项的ACCEL-
Figure BDA0001905733590000411
2S PCR-Free DNA Library Kit(Swift Biosciences，Ann Arbor，MI)来产生NGS文库。按照Lecomte等26描述的方案并稍作修改进行纯化的rAAV颗粒的深度DNA酶处理和双链(ds)DNA合成。简单地说，将含4x1011载体基因组(vg)的颗粒通过Baseline ZERO和Plasmid-Safe外切核酸酶广泛处理，然后进行蛋白酶K和RNA酶A处理。使用Mag-Bind RxnPure Plus试剂盒(Omega Bio-Tek，Norcross，GA)以2∶1的珠∶DNA比例纯化DNA。在用DNApolI合成第二链后，使用Covaris仪器对DNA进行超声处理。使用以下DNA剪切设置：目标大小400bp，峰值增量功率-175W，占空因数-10％，每次突发周期-200；时间-38秒，水位-15，水温-7.6-7.8℃，反应体积-47μL。剪切的输入dsDNA和合成的NGS文库的图谱显示在图14中。来自Sf9和HEK 293细胞的rAAV DNA样品在NGS文库制备期间在每个阶段显示出相似的谱和质量。在文库制备的所有阶段，通过Tape station(Agilent)和Qubit(Thermo Fisher Scientific)监测DNA质量。为了合成无PCR的NGS文库，将220ng ds DNA剪切至目标大小为200bp的选项输入。对于富含PCR的文库，在连接步骤2之后将10％的DNA按照制造商的推荐扩增8个循环。最后，用1xMag-Bind珠纯化所有文库。
生物信息学分析
生物信息学工作流程的流程图描绘在图15中。使用修改以默认配置用于超级计算群集的专用的开源软件ContaVect v2.026分析Fastq文件。ContaVect的代码适用于适当地扩展blastn和bwa工具的执行，以便在由作业调度程序管理的批处理环境中实现最高效率和吞吐量。一个变化与ContaVect的限制有关，该限制总是运行blastn和bwa，线程数等于计算节点上的CPU核心总数。尽管在某些情况下当在共享计算环境中的个人工作站上使用时，该假设可能是有效的，但是线程数通常必须等于批处理作业请求的或在虚拟机内可用的CPU核的数量。否则，所讨论的程序的效率会大大降低分析的吞吐量。当在ContaVect配置文件中将线程数设置为零时，新修改仍允许使用旧模型进行兼容，但现在ContaVect可以以指定的线程数运行blastn和bwa。默认情况下使用一个线程。此外，还添加了一个可选配置文件，可以通过MATPLOTLIBRC环境变量将其导出到环境中，以允许ContaVect在没有X11环境的群集节点上运行时使用matplotlib生成图形而不会出现故障。通过上述修改，在UFResearch Computing HiPerGator超级计算机上成功完成了分析，并且ContaVect对数据的运行时间从几天降低到几小时。所有修改都已作为GitHub代码提取请求提交给以下存储库中的ContaVect作者：github.com/a-slide/ContaVect and github.com/a-slide/pyDNA。所有描述的改编都已得到承认并纳入源代码中。通过MiniCaller软件从BAM文件中检索SNP变体，这是一种基于Java的应用程序，用于以高深度覆盖分析序列(github.com/lindenb/jvarkit/wiki/MiniCaller)。将用于HEK 293或Sf9rAAV文库以及阳性对照文库(每个重复)的MiniCaller生成的VCF文件与GenBank参考分子比对。VCF文件的解析由生成CSV文件的Python脚本执行(nbviewer.ipython.org/github/a-slide/iPython-Notebook/blob/master/Noteboo ks/VCF_analysis.ipynb)。VCF和CSV文件可从Dryad DigitalRepository获得：bio.rc.ufl.edu/secure/zolotukhin/genther/；用户名：“genther”，密码：“KrAkkegZ8F”。
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其他实施方案
本说明书中公开的所有特征可以以任意组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同、等同或类似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是同类系列的等效或类似特征的实例。
根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本公开内容的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本公开内容进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求内。
等同物
虽然本文已经描述和说明了多个发明实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文描述的功能和/或获得本文描述的结果和/或一个或更多个优点的各种其他装置和/或结构，并且这些变化和/或修改中的每一个被认为是在本文描述的发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置意图是非限制性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于具体应用或者使用本发明教导的应用。本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规的实验确定本文所述的具体发明实施方案的许多等同物。因此，应该理解，前述实施方案仅作为实例给出，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，本发明的实施方案可以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本公开内容的发明实施方案涉及本文描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法。此外，如果这些特征、系统、物品、材料、套件和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法的任何组合包含在本发明的发明范围内。
如本文定义和使用的所有定义应理解为控制字典定义、通过引用并入的文献中的定义、和/或所定义的术语的普通含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均关于每一个所引用的主题通过引用并入本文，其在一些情况下可包括整个文件。
除非明确相反指出，否则本说明书和权利要求书中使用的未用数量词限定的名词应理解为表示“至少一个”。
本说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为表示如此结合的元素中的“一个或两个”，即在某些情况下结合存在并且在其他情况下分离存在的元素。用“和/或”列出的多个元素应以相同的方式解释，即，如此结合的“一个或更多个”元素。除了用“和/或”子句具体标识的元素之外，可以可选地存在其他元素，无论其与具体标识的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当与诸如“包括”的开放式语言结合使用时，提到“A和/或B”可以在一个实施方案中指仅A(任选地包含除了B以外的元素)；在另一个实施方案中，仅B(任选地包含除了A以外的元素)；在又一个实施方案中，A和B两者(任选地包含其他元素)；等等
如本说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即，包含若干个元素或元素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选的额外的未列出的项目。仅明确表示相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”或者当在权利要求中使用时的“由...组成”是指包含若干元素或元素列表中的恰好一个元素。一般而言，当前面有排他性适于如“之一”、“...中的一个”、“...中的仅一个”、或“中的恰好一个”时，本文使用的术语“或”应理解为表示排他性选择(即，一个或另一个但不是两个)。当在权利要求中使用时，“基本上由......组成”应具有其在专利法领域中使用的普通含义。
如本说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或更多个元素的列表的短语“至少一个”应理解为表示选自元素列表中任一个或更多个元素的至少一个元素，但未必包括元素列表中列出的每个和每一个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中元素的任意组合。
该定义还允许任选地存在除了在短语“至少一个”所引用的元素列表内具体指出的元素以外的元素，无论其与具体指出的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”，或等同地“A和/或B中的至少一个”)可以是指，在一个实施方案中，至少一个(任选地包含多于一个)A，但不存在B(并且任选地包含除B之外的元素)；在另一个实施方案中，至少一个(任选地包含多于一个)B，但不存在A(并且任选地包含除A之外的元素)；在又一个实施方案中，至少一个(任选地包含多于一个)A和至少一个(任选地包含多于一个)(并且任选地包含其他元素)；等等
还应该理解，除非明确相反地指出，否则在本文要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于所描述的步骤或动作的顺序
在权利要求以及上面的说明书中，所有过渡短语，例如“包括”、“包含”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“包含有”等应理解为开放式的，即包括但不限于。只有过渡短语“由...组成”和“基本上由......组成”应分别为封闭或半封闭过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述。应当理解，在本文件中使用开放式过渡短语(例如，“包括”)描述的实施方案在替选实施方案中也别预期为由开放式过渡短语描述的特征“组成”或“基本组成”。例如，如果本公开内容描述“包含A和B的组合物”，则本公开内容还涵盖替选实施方案“由A和B组成的组合物”和“基本上由A和B组成的组合物”。
序列表
<110> University of Florida Research Foundation, Inc.
<120> 提高杆状病毒系统产生的重组腺相关病毒的生物学效力的方法
<130> U1197.70082WO00
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 62/323,684
<151> 2016-04-16
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
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<400> 1
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<220>
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<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
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<220>
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<222> (3)..(3)
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<223> n是g或t
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<400> 40
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<400> 41
ucuuuuaugg g 11
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<211> 11
<212> RNA
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<220>
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uaguguaugg c 11
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<212> RNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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uaguuuaugg c 11
<210> 44
<211> 11
<212> RNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 44
uguuuuaugg c 11
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 45
ucuuuuaugg c 11
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<212> RNA
<213> 腺相关病毒5
<400> 46
guagucaugu c 11
<210> 47
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<212> RNA
<213> 腺相关病毒9
<400> 47
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<210> 48
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 48
Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg
1 5 10
<210> 49
<211> 11
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n是a或g
<400> 49
gccnccaugg c 11
<210> 50
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n是c或g
<400> 50
ucanuguguu augg 14
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 51
Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr
1 5
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 52
atagggactt tccattgacg tc 22
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 53
tgatacactt gatgtactgc caag 24
<210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 54
tgggtggact atttacggta aactgcc 27
<210> 55
<211> 724
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 55
Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu
1 5 10 15
Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly
35 40 45
Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val
50 55 60
Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu
65 70 75 80
Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp
85 90 95
Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn
100 105 110
Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe
115 120 125
Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile
130 135 140
Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser
145 150 155 160
Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln
165 170 175
Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr
180 185 190
Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala
195 200 205
Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp
210 215 220
Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro
225 230 235 240
Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp
245 250 255
Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr
260 265 270
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln
275 280 285
Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val
290 295 300
Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr
305 310 315 320
Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp
325 330 335
Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys
340 345 350
Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr
355 360 365
Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser
370 375 380
Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn
385 390 395 400
Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser
405 410 415
Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp
420 425 430
Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln
435 440 445
Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp
450 455 460
Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly
465 470 475 480
Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu
485 490 495
Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr
500 505 510
Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile
515 520 525
Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu
530 535 540
Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg
545 550 555 560
Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser
565 570 575
Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro
580 585 590
Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp
595 600 605
Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met
610 615 620
Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn
625 630 635 640
Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser
645 650 655
Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu
660 665 670
Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln
675 680 685
Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp
690 695 700
Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu
705 710 715 720
Thr Arg Pro Leu
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 56
Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp Gln Tyr Leu Tyr Arg
1 5 10
<210> 57
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 57
Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met Gly Gly
1 5 10 15
Phe Gly Leu Lys
20

Claims (39)

1.核酸，其包含经修饰的Kozak序列以及编码腺相关病毒(AAV)VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列，其中所述经修饰的Kozak序列选自SEQ ID NO：2至11，其中所述VP1、VP2和VP3衣壳蛋白来自AAV5血清型。
2.权利要求1所述的核酸，其中所述经修饰的Kozak序列选自SEQ ID NO：8-11。
3.权利要求1或2所述的核酸，其中所述经修饰的Kozak序列是SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：9。
4.权利要求1或2所述的核酸，其还包含启动子序列。
5.权利要求4所述的核酸，其中所述启动子序列是多角体蛋白(polh)启动子序列。
6.权利要求1或2所述的核酸，其中所述经修饰的Kozak序列含有用于翻译所述VP1衣壳蛋白的起始密码子。
7.权利要求6所述的核酸，其中所述用于翻译所述VP1衣壳蛋白的起始密码子是AUG。
8.权利要求1或2所述的核酸，其中所述核酸包装在病毒颗粒中，任选地包装在杆状病毒颗粒中。
9.昆虫细胞，其包含权利要求1或2所述的核酸。
10.权利要求9所述的昆虫细胞，其中所述核酸整合到所述昆虫细胞的基因组中。
11.在昆虫细胞中产生重组AAV(rAAV)的方法，其中所述rAAV来自AAV5血清型，所述方法包括：
a)用以下转染昆虫细胞：
i)包含权利要求1所述的核酸的杆状病毒；
ii)包含编码AAV Rep蛋白的核酸的杆状病毒；
iii)包含含有与启动子序列可操作地连接之目的基因侧翼的两个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列之核酸的杆状病毒；
b)在适于产生rAAV的条件下培养所述昆虫细胞；以及
c)从所述昆虫细胞中回收所述rAAV。
12.在昆虫细胞中产生重组AAV(rAAV)的方法，其中所述rAAV来自AAV5血清型，所述方法包括：
a)用核酸转染权利要求9或权利要求10的昆虫细胞，任选地在杆状病毒中进行转染，所述核酸包含与启动子序列可操作地连接之目的基因侧翼的两个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列；
b)在适于产生rAAV的条件下培养所述昆虫细胞；以及
c)从所述昆虫细胞中回收所述rAAV。
13.权利要求11或12所述的方法，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞。
14.核酸，其包含经修饰的Kozak序列以及编码腺相关病毒(AAV)VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列，其中所述经修饰的Kozak序列选自SEQ ID NO：13至32，其中所述VP1、VP2和VP3衣壳蛋白来自AAV8血清型。
15.权利要求14所述的核酸，其中所述经修饰的Kozak序列是SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31或SEQID NO：32。
16.权利要求14或15所述的核酸，其还包含启动子序列。
17.权利要求16所述的核酸，其中所述启动子序列是多角体蛋白(polh)启动子序列。
18.权利要求14或15所述的核酸，其中所述经修饰的Kozak序列含有用于翻译所述VP1衣壳蛋白的起始密码子。
19.权利要求18所述的核酸，其中所述用于翻译所述VP1衣壳蛋白的起始密码子是AUG。
20.权利要求14或15所述的核酸，其中所述核酸包装在病毒颗粒中，任选地包装在杆状病毒颗粒中。
21.昆虫细胞，其包含权利要求14或15所述的核酸。
22.权利要求21所述的昆虫细胞，其中所述核酸整合到所述昆虫细胞的基因组中。
23.在昆虫细胞中产生重组AAV(rAAV)的方法，其中所述rAAV来自AAV8血清型，所述方法包括：
a)用以下转染昆虫细胞：
i)包含权利要求14所述的核酸的杆状病毒；
ii)包含编码AAV Rep蛋白的核酸的杆状病毒；
iii)包含含有与启动子序列可操作地连接之目的基因侧翼的两个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列之核酸的杆状病毒；
b)在适于产生rAAV的条件下培养所述昆虫细胞；以及
c)从所述昆虫细胞中回收所述rAAV。
24.在昆虫细胞中产生重组AAV(rAAV)的方法，其中所述rAAV来自AAV8血清型，所述方法包括：
a)用核酸转染权利要求21或权利要求22的昆虫细胞，任选地在杆状病毒中进行转染，所述核酸包含与启动子序列可操作地连接之目的基因侧翼的两个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列；
b)在适于产生rAAV的条件下培养所述昆虫细胞；以及
c)从所述昆虫细胞中回收所述rAAV。
25.权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞。
26.核酸，其包含经修饰的Kozak序列以及编码腺相关病毒(AAV)VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列，其中所述经修饰的Kozak序列选自SEQ ID NO：34至45，其中所述VP1、VP2和VP3衣壳蛋白来自AAV9血清型。
27.权利要求26所述的核酸，其中所述经修饰的Kozak序列是SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：42。
28.权利要求26或权利要求27所述的核酸，其还包含启动子序列。
29.权利要求28所述的核酸，其中所述启动子序列是多角体蛋白(polh)启动子序列。
30.权利要求26或27所述的核酸，其中所述经修饰的Kozak序列含有用于翻译所述VP1衣壳蛋白的起始密码子。
31.权利要求30所述的核酸，其中所述用于翻译所述VP1衣壳蛋白的起始密码子是AUG。
32.根据权利要求26或27所述的核酸，其中所述核酸包装在病毒颗粒中，任选地包装在杆状病毒颗粒中。
33.昆虫细胞，其包含权利要求26或27所述的核酸。
34.权利要求33所述的昆虫细胞，其中所述核酸整合到所述昆虫细胞的基因组中。
35.在昆虫细胞中产生重组AAV(rAAV)的方法，其中所述rAAV来自AAV9血清型，所述方法包括：
a)用以下转染昆虫细胞：
i)包含权利要求26所述的核酸的杆状病毒；
ii)包含编码AAV Rep蛋白的核酸的杆状病毒；
iii)包含含有与启动子序列可操作地连接之目的基因侧翼的两个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列之核酸的杆状病毒；
b)在适于产生rAAV的条件下培养所述昆虫细胞；以及
c)从所述昆虫细胞中回收所述rAAV。
36.在昆虫细胞中产生重组AAV(rAAV)的方法，其中所述rAAV来自AAV9血清型，所述方法包括：
a)用核酸转染权利要求33或权利要求34的昆虫细胞，任选地在杆状病毒中进行转染，所述核酸包含与启动子序列可操作地连接之目的基因侧翼的两个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列；
b)在适于产生rAAV的条件下培养所述昆虫细胞；以及
c)从所述昆虫细胞中回收所述rAAV。
37.权利要求35或36所述的方法，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞。
38.权利要求1所述的核酸，其中所述经修饰的Kozak序列具有SEQ ID NO：9所示的序列。
39.权利要求26所述的核酸，其中所述经修饰的Kozak序列具有SEQ ID NO：42所示的序列。
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