KR20230156167A - 바큘로바이러스 시스템-생산된 재조합 아데노-연관 바이러스의 생물학적 효력을 증진시키는 방법 - Google Patents

바큘로바이러스 시스템-생산된 재조합 아데노-연관 바이러스의 생물학적 효력을 증진시키는 방법 Download PDF

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Abstract

곤충 세포에서의 재조합 AAV (rAAV)의 생산에 유용한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법 및 조성물은 감염성 rAAV 입자를 생산하는데 유용한 양으로 AAV VP1 단백질을 발현하기 위한 변형된 코작 서열의 사용을 포함한다.

Description

바큘로바이러스 시스템-생산된 재조합 아데노-연관 바이러스의 생물학적 효력을 증진시키는 방법{METHODS OF ENHANCING BIOLOGICAL POTENCY OF BACULOVIRUS SYSTEM-PRODUCED RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS}
관련 출원
본 출원은 2016년 4월 16일자로 출원된, "바큘로바이러스 시스템-생산된 재조합 아데노-연관 바이러스의 생물학적 효력을 증진시키는 방법(METHOD OF ENHANCING BIOLOGICAL POTENCY OF BACULOVIRUS SYSTEM-PRODUCED RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS)"이라는 명칭의 미국 가출원 번호 62/323,684의 35 U.S.C. §119(e) 하의 이익을 청구하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 국립 보건원에 의해 부여된 HL097088 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 인간 유전자 요법을 위한 가장 유망한 바이러스 벡터 중 하나로 부각되어 있다. 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)는 B형 혈우병, 악성 흑색종, 낭성 섬유증, 및 다른 질환에 대한 유전자 요법 임상 시험에서 평가받고 있다. 포유동물 세포 배양 시스템을 사용하는 rAAV의 대규모 생산이 역사적으로 문제가 있어왔던 반면, 곤충 세포를 사용하는 AAV 생산 시스템은 실행가능한 대안인 것으로 제시된 바 있다. 그러나, 상이한 세포 환경은 일부 AAV 혈청형의 바이러스 입자 어셈블리와 관련하여 도전과제를 제공한 바 있다.
숙주 생산자 세포에서의 (예를 들어, 곤충 세포에서의) rAAV의 생산과 관련된 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. rAAV 입자의 생물학적 효력 (예를 들어, 감염성)은 부분적으로 비리온 캡시드 조성, 예를 들어, 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3의 화학량론적 비에 의존한다. 곤충 세포 (예를 들어, Sf9 세포)와 같은 이종 시스템에서 제조된 일부 rAAV 혈청형 (예를 들어, AAV5, AAV8, 및 AAV9)은 비정상적 VP1 발현 수준을 특징으로 한다. 바이러스 어셈블리 시, 비정상적 VP1 발현은 부적절한 캡시드 단백질 비로 구성된 바이러스 입자의 생산을 유발하며, 이는 세포를 효율적으로 형질도입하는 입자의 능력을 방해한다. 캡시드 단백질의 유용한 화학량론적 비를 수득하는 방법은, 과잉의 VP1이 바이러스 입자를 효율적으로 패키징하는 곤충 세포의 능력을 손상시킬 수 있는 반면 낮은 수준의 VP1이 비효율적인 형질도입을 갖는 입자를 유발할 수 있다는 것을 나타내는 결과에 의해 복잡하게 될 수 있다. 따라서, 곤충 세포 rAAV 생산 시스템과 관련하여, 입자 어셈블리에 부정적으로 영향을 주지 않으면서 감염성 입자의 증가된 양을 생산하기 위해 현행 기술을 사용하는 것이 도전과제로 남아있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 VP1 번역 개시 부위와 연관된 변형된 코작 서열을 포함하는 재조합 VP1 유전자를 제공한다. 본 출원에 기재된 재조합 VP1 유전자는 관심 유전자를 포함하는 감염성 rAAV 입자를 생산하는데 유용하다 (예를 들어, 후속 연구 및/또는 치료 용도를 위함). 일부 실시양태에서, 본 출원에 기재된 재조합 VP1 유전자를 사용하여 곤충 세포에서 하나 이상의 혈청형의 rAAV 입자를 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 곤충 세포에서 및/또는 다른 관심 생산자 세포에서 (예를 들어, 포유동물 세포에서) 하나 이상의 혈청형의 rAAV 입자를 생산하는데 유용한 하나 이상의 혈청형의 재조합 VP1 유전자를 스크리닝 및 식별할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재조합 VP1 유전자는 미스-패키징된 핵산의 비교적 높은 빈도에서 및/또는 비교적 낮은 비율로 관심 재조합 게놈을 함유하는 안정한 및/또는 감염성 rAAV 입자를 생산하는데 유용할 수 있다.
일부 측면에서, 개시내용은 AAV5 혈청형으로부터 유래된 rAAV의 생산에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 개시내용은 AAV8 혈청형으로부터 유래된 rAAV의 생산에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 개시내용은 AAV9 혈청형으로부터 유래된 rAAV의 생산에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 개시내용은 변형된 코작 서열 및 AAV VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 변형된 코작 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 2-11 (표 1)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 변형된 코작 서열은 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9이다. 일부 실시양태에서, VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질은 AAV5 혈청형으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질은 변이체 AAV5 캡시드 단백질이다 (예를 들어, 이들은 하나 이상의 돌연변이를 함유하고 상응하는 야생형 캡시드 단백질에 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 캡시드 단백질을 코딩하는 서열에 의해 코딩됨).
일부 실시양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 폴리헤드린 (polh) 프로모터 서열이다. 일부 실시양태에서, 변형된 코작 서열은 VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈을 함유한다. 일부 실시양태에서, VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈은 AUG이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스 입자 (예를 들어, 바큘로바이러스 입자)에 패키징된다. 일부 실시양태에서, 개시내용은 핵산을 포함하는 곤충 세포를 제공한다.
일부 측면에서, 개시내용은 곤충 세포에서 rAAV를 생산하는 방법에 관한 것이며, 여기서 rAAV는 AAV5 혈청형으로부터 유래되며, 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 곤충 세포를 (i) 변형된 코작 서열 및 AAV5 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하며, 여기서 변형된 코작 서열은 서열식별번호: 2-11로부터 선택되는 것인 바큘로바이러스, (ii) AAV Rep 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바큘로바이러스, (iii) 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 관심 유전자를 플랭킹하는 2개의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바큘로바이러스로 형질감염시키는 단계; (b) rAAV를 생산하기에 적합한 조건 하에 곤충 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 곤충 세포로부터 rAAV를 회수하는 단계. 일부 실시양태에서, 곤충 세포는 Sf9 세포이다.
일부 측면에서, 개시내용은 변형된 코작 서열 및 AAV VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 변형된 코작 서열은 서열식별번호: 13-32 (표 2)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 변형된 코작 서열은 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 또는 서열식별번호: 32이다. 일부 실시양태에서, VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질은 AAV8 혈청형으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질은 변이체 AAV8 캡시드 단백질이다 (예를 들어, 이들은 하나 이상의 돌연변이를 함유하고 상응하는 야생형 캡시드 단백질에 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 캡시드 단백질을 코딩하는 서열에 의해 코딩됨).
일부 실시양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 폴리헤드린 (polh) 프로모터 서열이다. 일부 실시양태에서, 변형된 코작 서열은 VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈을 함유한다. 일부 실시양태에서, VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈은 AUG이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스 입자 (예를 들어, 바큘로바이러스 입자)에 패키징된다. 일부 실시양태에서, 개시내용은 핵산을 포함하는 곤충 세포를 제공한다.
일부 측면에서, 개시내용은 곤충 세포에서 rAAV를 생산하는 방법에 관한 것이며, 여기서 rAAV는 AAV8 혈청형으로부터 유래되며, 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 곤충 세포를 (i) 변형된 코작 서열 및 AAV8 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하며, 여기서 변형된 코작 서열은 서열식별번호: 13-32로부터 선택되는 것인 바큘로바이러스, (ii) AAV Rep 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바큘로바이러스, (iii) 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 관심 유전자를 플랭킹하는 2개의 AAV ITR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바큘로바이러스로 형질감염시키는 단계; (b) rAAV를 생산하기에 적합한 조건 하에 곤충 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 곤충 세포로부터 rAAV를 회수하는 단계. 일부 실시양태에서, 곤충 세포는 Sf9 세포이다.
일부 측면에서, 개시내용은 변형된 코작 서열 및 AAV VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 변형된 코작 서열은 서열식별번호: 34-45 (표 3)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 변형된 코작 서열은 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 38, 또는 서열식별번호: 42이다. 일부 실시양태에서, VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질은 AAV9 혈청형으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, VP1, VP2, 및/또는 VP3 캡시드 단백질은 변이체 AAV9 캡시드 단백질이다 (예를 들어, 이들은 하나 이상의 돌연변이를 함유하고 상응하는 야생형 캡시드 단백질에 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 캡시드 단백질을 코딩하는 서열에 의해 코딩됨).
일부 실시양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 폴리헤드린 (polh) 프로모터 서열이다. 일부 실시양태에서, 변형된 코작 서열은 VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈을 함유한다. 일부 실시양태에서, VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈은 AUG이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스 입자 (예를 들어, 바큘로바이러스 입자)에 패키징된다. 일부 실시양태에서, 개시내용은 핵산을 포함하는 곤충 세포를 제공한다.
일부 측면에서, 개시내용은 곤충 세포에서 rAAV를 생산하는 방법에 관한 것이며, 여기서 rAAV는 AAV9 혈청형으로부터 유래되며, 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 곤충 세포를 (i) 변형된 코작 서열 및 AAV9 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하며, 여기서 변형된 코작 서열은 서열식별번호: 34-45로부터 선택되는 것인 바큘로바이러스, (ii) AAV Rep 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바큘로바이러스, (iii) 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 관심 유전자를 플랭킹하는 2개의 AAV ITR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바큘로바이러스로 형질감염시키는 단계; (b) rAAV를 생산하기에 적합한 조건 하에 곤충 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 곤충 세포로부터 rAAV를 회수하는 단계. 일부 실시양태에서, 곤충 세포는 Sf9 세포이다.
일부 측면에서, 본 출원은 AAV VP1 캡시드 단백질을 번역을 위한 개시 코돈을 포함하는 변형된 코작 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 VP1 번역 개시 코돈의 바로 상류의 1-6개 뉴클레오티드에서의 뉴클레오티드 서열 변이 및/또는 VP1 번역 개시 코돈의 바로 하류의 1-2개 뉴클레오티드에서의 뉴클레오티드 서열 변이를 포함하는 핵산의 라이브러리를 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 XXXXXX(ATG)를 포함하며, 여기서 (ATG)는 VP1 개시 코돈이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 XXXXXX(AUG)를 포함하며, 여기서 (AUG)는 VP1 개시 코돈이다. 일부 실시양태에서, X는 임의의 뉴클레오티드, 예를 들어, 관심 AAV 혈청형에 대한 야생형 VP1 유전자에서의 해당 위치에서 자연 발생 뉴클레오티드와 상이한 임의의 뉴클레오티드를 나타낸다.
이들 및 다른 측면은 하기 설명 및 첨부 실시예 및 도면에서 보다 상세히 기재된다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이는 이들 도면 중 하나 이상을 본원에 제시된 구체적 실시양태의 상세한 설명과 조합하여 참조함으로써 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1은 VP1, VP2, 및 VP3을 코딩하는 캡시드 헬퍼 뉴클레오티드, 및 코딩된 캡시드 단백질의 비제한적 디자인을 예시한다.
도 2a는 Sf9 세포에 패키징된 rAAV5의 웨스턴 블롯팅 분석의 예를 도시한다.
도 2b는 Sf9 세포에 패키징된 rAAV8의 웨스턴 블롯팅 분석의 예를 도시한다.
도 2c는 Sf9 세포에 패키징된 rAAV9의 웨스턴 블롯팅 분석의 예를 도시한다.
도 3은 곤충 세포에서의 발현을 위해 디자인된 VP1 캡시드 유전자의 상류의 컨센서스 감쇠된 코작 요소의 비제한적 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 4a-4d는 Sf9 세포에서 생산된 rAAV 입자의 캡시드 단백질 조성의 비제한적 예를 도시한다. 도 4a는 rep 및 cap 유전자 발현 카세트의 디자인의 비제한적 예를 예시한다. 도 4b는 rAAV5 VP1 단백질 발현 및 그의 관련 VP1 코작 번역 개시 부위 (TIS) 효율의 직접 상관관계의 예를 제시한다: 안정하게 통합된 cap 발현 카세트를 혼입하는 10개의 개별 세포주로부터 단리된 캡시드 단백질의 웨스턴 블롯팅 분석. 각각의 캡시드 VP1 유전자 구축물에 대한 상대 TIS 효율 (%)은 각각의 레인 아래에 제시된다. 도 4c는 HEK 293 및 Sf9 세포로부터 정제된 rAAV5의 캡시드 단백질 조성의 예를 제시한다: 단파 UV 광활성화 (무염색 기술, 바이오-라드(Bio-Rad))로 직접적으로 가시화된, 이중 아이오딕사놀-정제된 rAAV5-GFP의 SDS-단백질 겔 분석. (*)는 HEK 293 세포로부터 정제된 rAAV5 샘플에서 종종 관찰된 보다 느린 이동 밴드를 나타내고, 이는 VP2 정량화 분석으로부터 배제되었다. 도 4d는 HEK 293 및 Sf9 세포로부터 정제된 rAAV9의 캡시드 단백질 조성의 예를 제시한다. 분석은 패널 도 4c에서와 동일하다.
도 5a-5d는 AAV5 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질 화학량론의 MALDI-TOF 분석을 도시한다. 도 5a는 파선에 의해 표시된 VP1 고유한 N-말단, 쇄선에 의해 표시된 고유한 VP2, 흑색 선에 의해 표시된 공통의 VP3 C-말단을 갖는 AAV5 캡시드의 아미노산 서열 (서열식별번호: 55)을 제시한다. 하향 화살표는 각각의 단백질을 나타낸다. MS 분석을 위해 선택된 트립신 펩티드는 밑줄표시되고 아래에 그의 각각의 관찰된 질량 옆에 제시된다. 트립신 펩티드는 상단에서 하단으로, 서열식별번호: 56, 48, 및 57에 상응한다. 도 5b는 H2 18O에서 소화된 rAAV5의 모든 트립신 펩티드의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼을 제시한다. 원으로 표시된 펩티드는 분석된 3개 중 1개의 대표물이다. 도 5c는 16O 물에서 제조된 트립신으로 소화된 VP1 겔 밴드로부터, 또는 18O 물에서 제조된 트립신으로 소화된 VP3 겔 밴드로부터 기원하는 동일한 트립신 펩티드 TWVLPSYNNHQYR (서열식별번호: 48)의 2개의 오버레이된 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 제시한다. 18O 물은 펩티드의 C-말단 상에 2개의 18O 원자를 혼입하며 따라서 4 원자 질량 단위 (amu)만큼 질량을 이동시킨다. 이들 소화 산물은 별개로 스폿팅/분석되었고, 스펙트럼은 2개의 18O의 VP3 펩티드 내로의 완전 혼입을 제시하기 위해 오버레이되었다. 도 5d는 상대 함량을 계산하기 위해 소화 산물이 1:1 비로 혼합된 후의 VP1 또는 VP3으로부터 유래된 동일한 샘플의 동위원소 "핑거"를 제시한다.
도 6a-6f는 HEK 293 세포 (도 6a, 6d), 또는 Sf9 세포 (도 6b, 6e)에서 제조된 rAAV9 (도 6a-c), 또는 rAAV5 (도 6d-f)의 크기 및 역가의 나노입자 트래킹 분석을 도시한다. 도 6a, 6b, 6c, 및 6d는 각각의 샘플에 대해 30초 동안 각각 기록된, rAAV/나노-금 입자 복합체의 3개의 독립적 비디오 캡쳐의 평균인, 유한 트랙 길이 조정 (FTLA) 알고리즘의 그래픽 표현을 제시한다. 도 6c 및 6f는 각각의 제제에 대해 채워진/총 입자의 계산된 비를 제시한다. 피크 옆의 숫자는 계산된 rAAV/나노-금 입자 복합체 크기를 제시한다. 더 큰 직경의 더 작은 피크는 응집된 이량체, 및 rAAV 입자의 삼량체를 나타낸다. 도 6c 및 6f는 각각의 바이러스 스톡 중 AAV 입자의 총 수에 대한 DNA-함유의 계산된 비를 나타낸다.
도 7a-7c는 HEK 293-, 또는 Sf9 B8-유래된 rAAV5의 선조체 주사 후의 루시페라제 및 mApple 발현을 도시한다. 도 7a는 AAV 주사로부터 3주 후에 검출된 생물발광 (BLI) 신호를 제시하는 열 지도 영상을 제공한다. 슈도-컬러 스케일은 카운트의 수로 방출된 광의 강도를 나타낸다. Max 및 Min은 각각 카운트의 최대 및 최소 수이다. 도 7b는 카운트의 총 수로서 표현된 BLI 강도를 평균 ± SEM (군당 n = 4)으로서 제시하는 그래프를 제공한다. 만-휘트니 검정 분석은 군 사이의 유의차를 제시한다 (p = 0.0286, 단측 검정). 도 7c는 가변 모드 레이저 스캐너 (흑색-및-백색, B/W 영상), 또는 형광 현미경 (컬러 영상)에 의해 검출된 바와 같은 관상 뇌 단면에서의 mApple 형광을 제시한다.
도 8a-8d는 rAAV-Bac-UF26 카세트 및 그의 바로 가까이의 접합부의 NGS 판독물의 분포를 도시한다. 도 8a는 각각의 뉴클레오티드 위치에서의 판독물의 수를 참조 서열의 판독물의 총 수로 나눔으로써 수치적으로 정규화된 HEK 293 세포에 패키징된 rAAV5-Bac-UF26 카세트의 일루미나 판독물 커버리지를 제시한다. 중복 샘플에 대한 서열 커버리지 그래프는 PCR-프리 (PCR-프리 1 및 PCR-프리 2) 및 PCR-기반 (PCR 1 및 PCR 2)에 대해 화살표로 나타내어진다. rAAV 카세트 및 인접한 서열 사이의 커버리지의 하락은 서열 커버리지에서의 실제 감소보다 오히려 생물정보학 분석 제한의 그래픽 표현을 반영한다. 패널 (도 8a) 및 (도 8b)에서의 서열의 스케일에 따라 작성된 참조 rAAV-Bac-UF26 카세트의 주석달린 지도가 그래프 아래에 제시된다. 박테리아 플라스미드 DNA에서의 rAAV 카세트에 바로 인접한 서열은 더 밝은 회색 색조로 음영표시된다. 도 8b는 Sf9 B8 세포에 패키징된 rAAV5-Bac-UF26 카세트의 일루미나 판독물 커버리지를 제시한다. rAAV 카세트 내의 GC-풍부화된 서열은 더 어두운 회색 색조로 음영표시된다. 도 8c는 HEK 293 및 Sf9 B8 세포 둘 다에서의 좌측 rAAV ITR에 바로 인접한 서열의 도 8a 및 도 8b에서의 패널로부터의 줌을 예시한다. 도 8d는 HEK 293 및 Sf9 B8 세포 둘 다에서의 우측 rAAV ITR에 바로 인접한 서열의 도 8a 및 도 8b에서의 패널로부터의 줌을 예시한다.
도 9a-9b는 HEK 293 대 Sf9 B8 세포에 의해 캡시드화된 rAAV5-Bac-UF26 카세트에서 식별된 SNP의 분포를 제시한다. 도 9a는 4개의 잔기 A, G, C, 및 T의 치환이 참조 pTR-Bac-UF26 데이터베이스 서열에 대비하여 주어진 위치에서 판독된 경우에 점증적으로 플롯팅된 것을 제시한다. 상대 SNP 비 (Y 축)는 동일한 위치에서의 서열분석의 총 깊이에 대한 치환을 갖는 주어진 위치에서의 판독물의 총 수의 비로서 정의된다. 서열분석의 깊이는 삽입/결실 (indel)을 배제한 주어진 위치에서의 참조 및 대안적 뉴클레오티드의 서열 판독물의 합계이다. SNP 변이체의 분석은 양성 대조군, 플라스미드 pTR-Bac-UF26 샘플이 포함된다. 결과적으로, SNP의 제로 비율은 데이터베이스 참조와 동일한 잔기를 나타내고, 양성 값은 모 플라스미드 데이터베이스 서열과 관련하여 새롭게 획득된 SNP를 의미한다. 높은 GC-함량의 영역은 음영표시된다. 도 9b는 도 9a에서의 서열의 스케일에 따라 작성된 참조 rAAV-Bac-UF26 카세트의 주석달린 맵을 제시한다.
도 10a-10b는 rAAV5 및 rAAV9 캡시드 내로 패키징된 rAAV 카세트의 주석달린 그래픽 지도를 도시한다.
도 11은 SDS-PAGE 전기영동에 의해 분리된 rAAV5 제제의 스캐닝 프로파일을 도시한다 (도 4c). 음영표시된 면적은 정량화를 위해 작성된 곡선하 면적 (AUC)을 나타낸다. (*)는 분석으로부터 배제된 피크를 나타낸다.
도 12a-12b는 rAAV5 또는 rAAV9 캡시드 내로 패키징된 rAAV-UF50-BC의 시험관내 형질도입 검정을 도시한다. 도 12a는 rAAV5-UF50-BC의 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 및 그의 그래픽 정량화를 제시한다. 도 12b는 rAAV9-UF50-BC의 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 및 그의 그래픽 정량화를 제시한다.
도 13은 NGS를 위한 rAAV5 벡터 DNA 제조의 개략적인 흐름도의 비제한적 예를 도시한다.
도 14a-14c는 DNA 단편 크기의 NGS 라이브러리의 분포를 도시한다. NGS 라이브러리의 분석은 하이 센시티브 D5000 스크린테이프에 의해 수행되었다. 도 14a는 NGS에 의해 직접 서열분석된 PCR-프리 라이브러리를 제시한다: 1,2 - rAAV5/Sf9; 3,4 - rAAV5/HEK 293. 도 14b는 낮은 사이클 PCR 풍부화를 위해 사용된 PCR-프리 라이브러리를 제시한다: 5,6 - rAAV5/Sf9, 7,8 - rAAV5/HEK293. 도 14c는 PCR 풍부화된 라이브러리를 제시한다: 9, 10 - rAAV5/Sf9; 11, 12 - rAAV5/HEK 293. 라이브러리 9-12는 NGS에 의해 직접 서열분석된다.
도 15는 NGS 데이터 프로세싱의 개략적인 흐름도의 비제한적 예를 도시한다.
본 출원의 측면은 숙주 생산자 세포에서 (예를 들어, 곤충 생산자 세포에서) rAAV 입자를 생산하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 변형된 번역 개시 서열 (TIS, 또한 코작 서열로도 지칭됨)은 VP1 개시 코돈 (예를 들어, VP1 캡시드 단백질을 코딩하는 재조합 유전자의 경우에 ATG/AUG 개시 코돈)과 연관되고, 관심 AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 내로 혼입된다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 숙주 생산자 세포에서 효과적인 rAAV 입자 (예를 들어, 고수율로 생산되거나, 감염성, DNA 함유, 안정한 등인 rAAV 입자, 또는 그의 임의의 조합)를 생산하는데 유용한 VP1 코작 서열을 식별할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 생산된 rAAV 입자는 관심 유전자 (예를 들어, 치료 유전자)를 함유할 수 있고 치료 목적을 위해 사용될 수 있다.
rAAV는 유전자 요법/DNA 백신 전달을 위한 벡터로서 광범위하게 사용되지만, 임상 적용을 위한 감염성 rAAV의 대규모 생산은 현행 기술을 기반으로 하는 것이 도전과제로 남아있다. AAV 캡시드는 AAV 게놈 내 단일 캡시드 유전자의 대안적 스플라이싱 및 차등 코돈 용법을 통해 유래된, 3개의 캡시드 단백질, VP1, VP2, 및 VP3으로 이루어진다. VP3 서열은 모든 3개의 스플라이싱 변이체 사이에 공통이고, VP2 및 VP1은 더 긴 N-말단 서열을 가지며, VP1은 가장 긴 캡시드 단백질이다 (예를 들어 도 1에 예시된 바와 같음). 전형적인 캡시드 입자 내 VP1/VP2/VP3의 비는 1/1/10인 것으로 추정된다. 더욱이, 이는 정의된 VP1/VP2/VP3 화학량론이 없고 어셈블리는 캡시드에 혼입되어 있는 VP1/VP2/VP3의 상대 양이 주로 숙주 생산자 세포 내 (또는 시험관내 생산 시스템 내) 그의 상대 발현 수준에 의존하도록 확률적인 것으로 보인다. 본 출원에 기재된 조성물 및 방법은 생산자 세포 내 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질 내로 번역되어 있는 (예를 들어, ATG/AUG 번역 개시 코돈 주위의) 변형된 VP1 코작 서열을 갖는 재조합 캡시드 유전자를 관심 재조합 유전자를 함유하는 감염성 rAAV 입자를 생산하는데 유용한 상대 양으로 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 캡시드 유전자는 캡시드 유전자의 자연 스플라이싱을 가능하도록 하는 적절한 스플라이스 공여자 및/또는 수용자 부위를 갖지 않는다 (예를 들어, 일부 실시양태에서 재조합 캡시드 유전자로부터의 전사체는 생산자 세포에서 적절하게 또는 전혀 스플라이싱되지 않음). 일부 실시양태에서, 누출 리보솜 스캐닝을 증가시키고 캡시드 유전자로부터 VP1/VP2/VP3의 목적하는 비를 생산하기 위해, 감쇠된 코작 서열과 연관된 정규 AUG 코돈은 VP1 번역 개시 부위에 사용되었다. 변형된 캡시드 유전자로부터 생산되고 관심 유전자를 캡시드화하는 rAAV 입자는 연구, 임상 시험, 및 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 기재된 변형된 캡시드 유전자는 rAAV 입자의 대규모 제조를 위해 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 본 출원은 또한 감염성 rAAV 입자를 생산하는데 유용한 서열을 식별하기 위해 AAV 캡시드 유전자 발현 구축물을 스크리닝 및 평가하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 복수의 상이한 rAAV 캡시드 유전자 발현 구축물은 관심 숙주 세포 내 rAAV 입자 어셈블리에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 상이한 rAAV 캡시드 유전자 발현 구축물은 동일한 프로모터, 동일한 AAV 캡시드 코딩 서열 (예를 들어, 임의적으로 하나 이상의 캡시드 돌연변이를 포함한 임의의 관심 혈청형의 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩함)을 포함하지만 VP1에 대한 번역 개시 코돈 (예를 들어, ATG/AUG)과 연관된 상이한 코작 서열을 갖는다. 일반적으로, VP2 및 VP3에 대한 번역 코돈 및 주위 개시 서열은 변하지 않는다 (예를 들어, 이들은 그의 자연 야생형 서열로서 유지됨). 그러나, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 변화는 이들 서열에서 만들어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 코작 서열은 VP1에 대한 번역 개시 코돈의 바로 상류의 6개 뉴클레오티드 내의 서열 변이를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상이한 코작 서열은 VP1에 대한 번역 개시 코돈으로부터 바로 하류의 2개 뉴클레오티드 내의 서열 변이를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상이한 코작 서열은 VP1에 대한 번역 개시 코돈의 바로 상류의 6개 뉴클레오티드 내의 1개 이상의 위치 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 위치) 및/또는 VP1에 대한 번역 개시 코돈으로부터 바로 하류의 2개 뉴클레오티드 내의 1개 이상의 위치 (예를 들어, 1 또는 2개 위치)에서 뉴클레오티드 서열 변이를 나타내는 상이한 코작 서열의 라이브러리로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상이한 코작 서열은 VP1에 대한 코작 서열의 모든 가능한 변이의 전부 또는 하위세트를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이는 변형되어 있는 AAV 캡시드 혈청형 (예를 들어, 혈청형 1, 2, 3, 3B, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 등) 유전자에 대한 자연 VP1 코작 서열에 대비한 것이다. 일부 실시양태에서, 선택된 백분율 번역 효율 (예를 들어, 참조 번역 효율에 대비하여, 예를 들어 자연 또는 컨센서스 코작 서열과 연관된 번역 효율에 대비하여)을 갖는 상이한 코작 서열이 평가된다. 일부 실시양태에서, 상이한 코작 서열은 25% 내지 50%, 예를 들어 25% 내지 45%, 예를 들어 30% 내지 40%, 대략 25%, 대략 30%, 대략 35%, 대략 40%, 대략 45%, 대략 50%, 또는 다른 값 (예를 들어, 임의의 상기 값 사이의 중간 값)의 범위의 번역 효율을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 목적하는 번역 효율 및 번역 효율의 범위를 갖는 모든 코작 서열이 평가된다. 일부 실시양태에서, 목적하는 퍼센트 범위 내의 번역 효율을 갖는 코작 서열의 하위세트가 평가된다. 일부 실시양태에서, 번역 효율의 표적 범위 내의 백분율 증분 (예를 들어, 1-5% 증분, 예를 들어 대략 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5% 증분)을 나타내는 코작 서열이 평가된다. 일부 실시양태에서, 상이한 코작 서열은 상이한 코작 서열 (예를 들어, VP1 개시 코돈과 연관됨)을 갖는 재조합 캡시드 유전자를 각각 함유하는 재조합 핵산을 다른 헬퍼 유전자 (예를 들어, Rep, 및 다른 헬퍼 유전자)를 또한 발현하고 ITR 서열에 의해 플랭킹된 관심 표적 유전자 (예를 들어, 검출가능한 마커를 코딩하는 대조군 유전자 또는 관심 치료 유전자)를 갖는 관심 재조합 AAV 게놈을 또한 함유하는 숙주 세포 내로 도입함으로써 (ITR 서열에 의해 플랭킹된 관심 유전자가 재조합 캡시드 유전자로부터 발현된 캡시드 단백질을 함유하는 rAAV 입자 내로 패키징될 수 있도록 함) 평가된다. 숙주 세포는 임의의 유형의 세포 (예를 들어, 포유동물, 곤충, 또는 다른 유형의 숙주 세포)일 수 있다. 숙주 세포는 플라스미드 형질감염 (예를 들어, 다른 헬퍼 유전자를 발현하고/거나 관심 rAAV 게놈을 함유하는 하나 이상의 플라스미드를 사용함), 바이러스 형질도입 (예를 들어, 하나 이상의 재조합 바이러스, 예를 들어 재조합 바큘로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 다른 헬퍼 유전자를 발현하고/거나 관심 rAAV 게놈을 함유하는 재조합 바이러스 게놈을 갖는 다른 재조합 바이러스를 사용함), 또는 게놈 통합 (예를 들어, 하나 이상의 헬퍼 유전자 및/또는 관심 rAAV 게놈을 가짐)의 결과로서 다른 헬퍼 유전자를 발현하고/거나 관심 rAAV 게놈을 함유할 수 있다. 상이한 캡시드 유전자 구축물이 숙주 세포 내로 도입된 후에, 세포는 rAAV 입자를 생산하기 위한 조건 하에 인큐베이션되고, rAAV 입자는 단리 및/또는 정제되고, 평가된다. 단리 및/또는 정제된 rAAV 입자는 하기 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 인자를 기반으로 하여 평가될 수 있다:
a) rAAV 입자의 수율. 일부 실시양태에서, 예를 들어 동일한 혈청형 (예를 들어 HEK 293 세포 또는 Sf9 세포에서, 참조 방법론을 사용하여 생산됨)의 참조 rAAV에 대해 유사하거나 또는 그보다 더 우수한 수율이 선택된다.
b) rAAV 입자 내 VP1/VP2/VP3 단백질의 비. 일부 실시양태에서, >0.5/>0.5/10의 VP1/VP2/VP3의 비가 선택된다. 따라서, 일부 실시양태에서, VP1/VP3의 비는 대략 또는 >0.5/10, 예를 들어 대략 또는 >0.75/10, 예를 들어 대략 또는 >1/10, 예를 들어 대략 또는 >1.25/10, 예를 들어 대략 또는 >1.5/10, 예를 들어 대략 또는 > 1.75/10, 또는 대략 2/10, 또는 임의의 중간 비이다. 유사하게, 일부 실시양태에서, VP2/VP3의 비는 독립적으로 대략 또는 >0.5/10, 예를 들어 대략 또는 >0.75/10, 예를 들어 대략 또는 >1/10, 예를 들어 대략 또는 >1.25/10, 예를 들어 대략 또는 >1.5/10, 예를 들어 대략 또는 > 1.75/10, 또는 대략 2/10, 또는 임의의 중간 비이다.
c) 채워진/비워진 rAAV 입자의 비. 일부 실시양태에서, 참조 비 (예를 들어 HEK 293 세포 또는 Sf9 세포에서, 참조 방법론을 사용하여 생산된, 예를 들어 동일한 혈청형의, rAAV 입자에 대한 채워진/비워진 비)와 유사하거나 또는 그보다 더 큰 채워진/비워진 입자의 비가 선택된다.
d) rAAV 입자의 형질도입 효율. 일부 실시양태에서, 예를 들어 동일한 혈청형 (예를 들어 HEK 293 세포, 또는 Sf9 세포에서, 참조 방법론을 사용하여 생산됨)의 참조 rAAV에 대해 유사하거나 또는 그보다 더 우수한 형질도입 효율이 선택된다. 일부 실시양태에서, 형질도입 효율은 시험관내에서 (예를 들어, 배양물에서 성장시킨 세포, 예를 들어 HeLa 세포에서) 평가된다. 일부 실시양태에서, 형질도입 효율은 생체내에서 (예를 들어, 동물 모델, 예를 들어 설치류 모델, 예컨대 마우스 모델에서) 평가된다.
e) rAAV 입자에의 DNA 패키징의 정밀도. 일부 실시양태에서, 참조 rAAV에 대한 것보다 (예를 들어, 다른 DNA, 예를 들어 숙주 DNA, 또는 숙주 세포에서 플라스미드 또는 바이러스 벡터 상의 rAAV 게놈을 플랭킹하는 DNA에 대비한 rAAV 게놈 DNA의) DNA 패키징의 유사한 또는 더 높은 정밀도가 선택된다. 일부 실시양태에서, 참조 rAAV는, 예를 들어 HEK 293 세포, 또는 Sf9 세포에서, 참조 방법론을 사용하여 생산된, 예를 들어 동일한 혈청형의, rAAV일 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 패키징의 정밀도는 패키징되어 있는 비-rAAV 게놈의 백분율을 결정함으로써 평가될 수 있다. 이는, 예를 들어 rAAV 입자에 패키징된 DNA를 서열분석함으로써 임의의 적합한 방법을 사용하여 (예를 들어, NGS 또는 다른 기술을 사용하여) 결정될 수 있다.
이러한 평가의 결과로서, 하나 이상의 코작 서열 (및/또는 VP1 번역 개시 코돈의 코작 서열 상류를 포함한 Cap 발현 구축물)은 특정한 세포 유형에서 관심의 rAAV를 생산하는데 선택 및 사용될 수 있다.
따라서, 본 출원의 측면은 곤충 세포에서의 rAAV의 생산에 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 측면에서, 개시내용은 i) 변형된 코작 서열 및 ii) AAV VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV5 혈청형 캡시드 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV8 혈청형 캡시드 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV9 혈청형 캡시드 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 변형된 코작 서열 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된다.
본원에 제공된 핵산을 포함하는 일반적 구조의 비제한적 예는 도 1에 도시된다. 핵산(100)은 변형된 코작 서열(120) 및 AAV VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질(110)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. wt AAV에서, 포유동물 세포에서, 캡시드 단백질은 2개의 mRNA 이소형을 생성하도록 스플라이싱될 수 있는 단일 mRNA로서 전사된다. 이러한 전사-후 프로세싱 및 누출 리보솜 스캐닝은 3개의 별개의 캡시드 단백질의 생산을 가능하게 한다: AAV VP1 캡시드 단백질(111), 대안적 개시 코돈 ACG로부터 개시된 AAV VP2 캡시드 단백질(112), 및 AAV VP3 캡시드 단백질(113). 추가적으로, 일부 실시양태에서, 동일한 뉴클레오티드 서열 내의 별개의 오픈 리딩 프레임은 어셈블리-활성화 단백질(114)을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열(130)은 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 인핸서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 초과의 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 캡시드 내로 패키징된 rAAV 카세트는 도 10a 및 10b에서 발견된 것들과 유사하다.
프로모터는 프로모터 서열이 뉴클레오티드 서열의 전사를 제어 및/또는 조절할 때 뉴클레오티드 서열에 "작동가능하게 연결된"다. 일부 실시양태에서, 곤충 세포에서 활성인 프로모터를 활용하는 것이 유리하다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 폴리헤드린 (polh) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 p10, p35, 및 IE-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 곤충 숙주 세포에서 외래 유전자를 발현하는 방법 및 기술은 관련 기술분야에 알려져 있다. 곤충 세포에서의 폴리펩티드의 분자 조작 및 발현에 대한 방법론은, 예를 들어, 문헌 [Summers and Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. In Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A. and R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W.H. Freeman and Richardson, C. D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; 미국 특허 번호 4,745,051; US2003148506; 및 WO 03/074714]에 기재되어 있다. 그러나, 임의의 적합한 프로모터는 생산자 세포로서 사용되는 세포 유형 (예를 들어, 곤충, 포유동물, 또는 기타)에 의존하여 사용될 수 있다 (예를 들어, 임의의 자연, 변이체, 합성, 키메라, 말단절단된, 구성적, 유도성, 조직-특이적, 종-특이적 등의 프로모터 또는 상기 중 2종 이상의 조합).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 코작 서열은 VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈을 함유한다. 일부 실시양태에서, 개시 코돈은 AUG이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산은 바이러스 입자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스 입자 내에 함유된다 (예를 들어, 바이러스 입자에 의해 캡시드화됨). 일부 실시양태에서, 바이러스 입자는 AAV 입자이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 입자는 바큘로바이러스 입자이다.
일부 측면에서, 개시내용은 (a) 곤충 세포를 (i) 변형된 코작 서열 및 AAV VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하며, 여기서 변형된 코작 서열은 서열식별번호: 2-11, 13-32, 또는 33-45로부터 선택되는 것인 바큘로바이러스, (ii) AAV Rep 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바큘로바이러스, (iii) 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 관심 유전자를 플랭킹하는 2개의 AAV ITR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바큘로바이러스로 형질감염시키는 단계; (b) rAAV를 생산하기에 적합한 조건 하에 곤충 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 곤충 세포로부터 rAAV를 회수하는 단계를 포함하는, 곤충 세포에서 rAAV를 생산하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 개시내용은 곤충 세포를 제공하며, 여기서 곤충 세포는 변형된 코작 서열 및 AAV VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하며, 여기서 변형된 코작 서열은 서열식별번호: 2-11, 13-32, 또는 33-45로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 곤충 세포 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, Rep 단백질을 코딩하는 유전자는 곤충 세포 게놈 내로 통합된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 개시내용은 (a) 곤충 세포를, 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 관심 유전자를 플랭킹하는 2개의 AAV ITR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바큘로바이러스로 형질감염시키며, 여기서 곤충 세포의 게놈은 본원에 기재된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계; (b) rAAV를 생산하기에 적합한 조건 하에 곤충 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 곤충 세포로부터 rAAV를 회수하는 단계를 포함하는, 곤충 세포에서 rAAV를 생산하는 방법을 제공한다.
곤충 세포에서의 rAAV의 생산은 이전에 기재된 바 있다 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 번호 US20120100606 참조). 본 개시내용에 제공된 방법 및 조성물은 AAV의 복제를 가능하게 하고 배양물에 유지될 수 있는 임의의 곤충 세포에서 활용될 수 있다. 예를 들어, 사용된 세포주는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 드로소필라(drosophila) 세포주, 또는 모기 세포주 (예를 들어, 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) 유래된 세포주)로부터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 곤충 세포는 바큘로바이러스 감염에 감수성이다 (예를 들어, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, Ha2302, 및 Hz2E5). 따라서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 바큘로바이러스 발현 벡터 (BEV)를 사용하여 rAAV를 생산하는데 유용하다.
BEV는 단백질 생산을 위한 가장 범용적인 시스템 중 하나로 부각되어 있다. 기초적 단백질 생산 이외에도, BEV는 더 복잡한 과제 예컨대 이종 다중단백질 복합체의 합성을 위해 및 유전자 요법 비히클 예컨대 rAAV의 어셈블리를 위해 활용되어 왔다. 일부 실시양태에서, 후자 전력은, 각각 헬퍼 기능성을 제공하는, 3종의 BEV로 공동-감염된 곤충 세포를 활용한다. 예를 들어, 곤충 세포는 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열에 의해 플랭킹된 관심 유전자를 포함하는 제1 바큘로바이러스, AAV rep를 포함하는 제2 바큘로바이러스, 및 AAV cap를 포함하는 제3 바큘로바이러스로 공동-감염된다. AAV cap는 어셈블리-활성화 단백질 (AAP) 및 바이러스 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 코딩한다. 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3은 동일한 mRNA 전사체로부터 번역되며, 이는 2개의 상이한 크기의 mRNA 이소형 중 어느 하나 내로 전사-후 스플라이싱될 수 있다. 포유동물 세포에서의 전사-후 스플라이싱은 VP1:VP2:VP3 캡시드 단백질의 적절한 화학량론적 비의 발현을 유발할 mRNA 형태의 분포를 생성하기에 적절한 비율에서 발생한다. 또한, 곤충 세포에서 일부 혈청형 (예를 들어, AAV5, AAV8, 및 AAV9)의 생산은 세포를 형질도입하는데 비효율적인 입자를 유발한다. 따라서, 조성물 및 방법은 곤충 세포에서 또는 임의의 다른 관심 숙주 세포 유형 (예를 들어, 포유동물 숙주 생산자 세포 또는 다른 유형의 세포)에서 rAAV 생산을 개선시키기 위해 VP1 발현 수준을 변형시키는데 유용하다.
일부 측면에서, 개시내용은 변형된 코작 서열 및 AAV VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 조성물을 제공하며, 여기서 캡시드 단백질은 AAV5 혈청형으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 코작 서열은 AAV5 VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈 및 개시 코돈의 상류의 추가적인 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코작 서열은 개시 코돈의 하류의 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 코작 서열은 서열 RNXTXT(ATG)NY (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 (ATG)는 VP1 개시 코돈이고; R은 C 또는 T 뉴클레오티드이고; N은 A, T, G, 또는 C로부터 선택된 뉴클레오티드이고; X는 G 또는 T 뉴클레오티드이고; Y는 A, T, 또는 C로부터 선택된 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 코작 서열은 표 1에 열거된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
표 1. AAV5 VP1 코작 서열
Figure pat00001
일부 측면에서, 개시내용은 변형된 코작 서열 및 AAV VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 조성물을 제공하며, 여기서 캡시드 단백질은 AAV8 혈청형으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 코작 서열은 AAV8 VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈 및 개시 코돈의 상류의 추가적인 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코작 서열은 개시 코돈의 하류의 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 코작 서열은 서열 YNXRNR(ATG)XZ (서열식별번호: 12)의 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 (ATG)는 VP1 개시 코돈이고; Y는 A, T, 또는 C로부터 선택된 뉴클레오티드이고; N은 A, T, G, 또는 C로부터 선택된 뉴클레오티드이고; X는 G 또는 T 뉴클레오티드이고; R은 C 또는 T 뉴클레오티드이고; Z는 G 또는 C 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 코작 서열은 표 2에 열거된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
표 2. AAV8 VP1 코작 서열
Figure pat00002
일부 측면에서, 개시내용은 변형된 코작 서열 및 AAV VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 조성물을 제공하며, 여기서 캡시드 단백질은 AAV9 혈청형으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 코작 서열은 AAV9 VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈 및 개시 코돈의 상류의 추가적인 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코작 서열은 개시 코돈의 하류의 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 코작 서열은 서열 TNXTXT(ATG)XZ (서열식별번호: 33)의 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 (ATG)는 VP1 개시 코돈이고; N은 A, T, C, 또는 G로부터 선택된 뉴클레오티드이고; X는 G 또는 T 뉴클레오티드이고; Z는 G 또는 C 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 코작 서열은 표 3에 열거된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
표 3. AAV9 VP1 코작 서열
Figure pat00003
지칭되고 있는 핵산이 RNA 또는 DNA 분자인지 여부에 따라 U 또는 T 뉴클레오티드가 지칭될 수 있는 것으로 인지되어야 한다.
야생형 AAV 게놈은 양성- 또는 음성-센스 단일-가닥 데옥시리보핵산 (ssDNA)이다. 게놈은 2개의 역전된 말단 반복부 (ITR), DNA 가닥의 각각의 단부에서 1개, 및 2개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함한다: ITR 사이의 rep 및 cap. rep ORF는 AAV 생활 주기에 요구된 Rep 단백질을 코딩하는 4개의 중첩 유전자를 포함한다. cap ORF는 캡시드 단백질: VP1, VP2, 및 VP3을 코딩하는 중첩 유전자를 포함하며, 이는 함께 상호작용하여 바이러스 캡시드를 형성한다. VP1, VP2, 및 VP3은 하나의 mRNA 전사체로부터 번역되며, 이는 2가지 상이한 방식으로 스플라이싱될 수 있다: 더 길거나 또는 더 짧은 인트론은 절제되어 mRNA의 2개의 이소형의 형성을 유발할 수 있다: ~2.3 kb- 및 ~2.6 kb-길이 mRNA 이소형. 캡시드는 AAV 게놈을 보호할 수 있는 비-외피보유, T-1 이십면체 격자 내로 대략 60개의 개별 캡시드 단백질 서브유닛의 초분자 어셈블리를 형성한다. 성숙 캡시드는 약 1:1:10의 근사치 비에서 VP1, VP2, 및 VP3으로 구성된다 (각각 대략 87, 73 및 62 kDa의 분자 질량). VP2 및 VP3에 대비한 VP1의 수준은 곤충 세포에서 감염성 입자의 효율적 생산을 수득하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, VP1:VP2:VP3 비는 (0.5-2):(0.5-2):10의 범위 내이다. 일부 실시양태에서, VP1:VP2:VP3 비는 (0.5-1.5):(0.5-1.5):10의 범위 내이다.
재조합 AAV (rAAV) 입자는 핵산 벡터를 포함할 수 있으며, 이는 최소로 하기를 포함할 수 있다: (a) 관심 단백질 또는 폴리펩티드 또는 관심 RNA (예를 들어, siRNA 또는 마이크로RNA)를 코딩하는 관심 유전자를 포함하는 하나 이상의 이종 핵산 영역; 및 (b) 하나 이상의 핵산 영역 (예를 들어, 이종 핵산 영역)을 플랭킹하는 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열 (예를 들어, 야생형 ITR 서열 또는 조작된 ITR 서열)을 포함하는 하나 이상의 영역. 일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 2 kb - 7 kb 사이의 크기이다. 일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 4 kb 및 5 kb 사이의 크기이다 (예를 들어, 4.2 내지 4.7 kb 크기). 일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 원형이다. 일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 단일-가닥이다. 일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 이중-가닥이다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 핵산 벡터는, 예를 들어, 핵산 벡터의 이중-가닥의 형성을 개시하는 핵산 벡터의 또 다른 영역에 상보적인 핵산 벡터의 영역을 함유하는 자기-상보적 벡터일 수 있다.
ITR 서열은 임의의 AAV 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 1개 초과의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. ITR 서열 및 ITR 서열을 함유하는 플라스미드는 관련 기술분야에 알려져 있고 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, 펜실베니아주 필라델피아 소재의 벡터 바이오랩스(Vector Biolabs); 캘리포니아주 샌디에고 소재의 셀바이오랩스(Cellbiolabs); 캘리포니아주 산타 클라라 소재의 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies); 및 매사추세츠주 캠브리지 소재의 애드진(Addgene)으로부터 입수가능한 제품 및 서비스; 및 문헌 [Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):14082-7; and Curtis A. Machida. Methods in Molecular Medicine™. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6:201 ⓒ Humana Press Inc. 2003. Chapter 10. Targeted Integration by Adeno-Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni Cathomen and Richard Jude Samulski; 미국 특허 번호 5,139,941 및 5,962,313] 참조, 이들 모두는 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, rAAV 입자 또는 rAAV 제제 내의 입자는 임의의 유도체 또는 유사형을 포함한 임의의 AAV 혈청형일 수 있다 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 2/1, 2/5, 2/8, 2/9, 3/1, 3/5, 3/8, 또는 3/9). 본원에 사용된 바와 같은 rAAV 바이러스 벡터 (예를 들어, rAAV 입자)의 혈청형은 재조합 바이러스의 캡시드 단백질의 혈청형을 지칭한다. 유도체 및 유사형의 비제한적 예는 rAAV2/1, rAAV2/5, rAAV2/8, rAAV2/9, AAV2-AAV3 하이브리드, AAVrh.10, AAVhu.14, AAV3a/3b, AAVrh32.33, AAV-HSC15, AAV-HSC17, AAVhu.37, AAVrh.8, CHt-P6, AAV2.5, AAV6.2, AAV2i8, AAV-HSC15/17, AAVM41, AAV9.45, AAV6(Y445F/Y731F), AAV2.5T, AAV-HAE1/2, AAV 클론 32/83, AAVShH10, AAV2 (Y->F), AAV8 (Y733F), AAV2.15, AAV2.4, AAVM41, 및 AAVr3.45를 포함한다. 이러한 AAV 혈청형 및 유도체/유사형, 및 이러한 유도체/유사형을 생산하는 방법은 관련 기술분야에 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ] 참조). 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 유사형화된 rAAV 입자이며, 이는 (a) 하나의 혈청형 (예를 들어, AAV2, AAV3)으로부터의 ITR를 포함하는 핵산 벡터 및 (b) 또 다른 혈청형 (예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAV10)으로부터 유래된 캡시드 단백질로 구성된 캡시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 곤충 세포에서 임의의 혈청형, 또는 유도체/유사형 (예를 들어, AAV5, AAV8, AAV9, 또는 다른 혈청형 또는 그를 기반으로 하는 유도체/유사형)의 AAV를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 유사형화된 rAAV 벡터를 생산 및 사용하는 다른 방법은 관련 기술분야에 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001; Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000; Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002; 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001] 참조). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 캡시드 치환 (예를 들어, 상응하는 야생형 서열에 대비하여)은 재조합 캡시드 유전자 (예를 들어, 본 출원에 기재된 재조합 VP1 유전자)에서 코딩될 수 있다.
rAAV 입자 및 핵산 벡터를 생산하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 방법이 또한 관련 기술분야에 알려져 있고 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함된, 문헌 [Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167; 및 미국 특허 공개 번호 US20070015238 및 US20120322861]; 및 ATCC 및 셀 바이오랩스, 인크.(Cell Biolabs, Inc.)로부터 입수가능한 플라스미드 및 키트 참조). 예를 들어, 핵산 벡터를 함유하는 플라스미드는, 예를 들어, rep 유전자 (예를 들어, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 코딩함) 및 cap 유전자 (본원에 기재된 바와 같은 변형된 VP3 영역을 포함한 VP1, VP2, 및 VP3을 코딩함)를 함유하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드와 조합될 수 있고, rAAV 입자가 패키징되고 후속적으로 정제될 수 있도록 생산자 세포주 내로 형질감염될 수 있다.
일부 실시양태에서, 생산자 세포주는 곤충 세포로부터 유래된다. 곤충 세포의 예는 Sf9 세포 (예를 들어, ATCC® CRL-1711™ 참조)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 생산자 세포는 본원에 기재된 방법에 사용하기 위해 Rep 단백질 및/또는 Cap 단백질을 코딩하는 rep 및/또는 cap 유전자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 AAV VP1, VP2, 및 VP3을 코딩하는 핵산)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 패키징은 시험관내에서 수행된다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 핵산 벡터를 함유하는 플라스미드는, 예를 들어, 제1 혈청형의 rep 유전자 및 동일한 혈청형의 cap 유전자 또는 상이한 혈청형을 함유하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드와 조합되고, rAAV 입자가 패키징되도록 헬퍼 세포주 내로 형질감염된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 헬퍼 플라스미드는 rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하는 제1 헬퍼 플라스미드 및 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자, 및 VA 유전자를 포함하는 제2 헬퍼 플라스미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, rep 유전자는 AAV2로부터 유래된 rep 유전자이다. 헬퍼 플라스미드, 및 이러한 플라스미드를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 알려져 있고 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, 독일 빌레펠트 소재의 플라스미드팩토리(PlasmidFactory)로부터의 pDM, pDG, pDP1rs, pDP2rs, pDP3rs, pDP4rs, pDP5rs, pDP6rs, pDG(R484E/R585E), 및 pDP8.ape 플라스미드; 펜실베니아주 필라델피아 소재의 벡터 바이오랩스; 캘리포니아주 샌디에고 소재의 셀바이오랩스; 캘리포니아주 산타 클라라 소재의 애질런트 테크놀로지스; 및 매사추세츠주 캠브리지 소재의 애드진으로부터 입수가능한 다른 제품 및 서비스; pxx6; 문헌 [Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760; Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.; Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy, Vol. 7, 839-850; Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303; 및 Moullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188] 참조).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 숙주 세포 (예를 들어, 생산자 세포)는 하나 이상의 헬퍼 기능 (예를 들어, 숙주 세포 게놈 내로 통합된 재조합 핵산에 의해 코딩되거나, 또는 숙주 세포에서 플라스미드 또는 바이러스 핵산 벡터에 의해 코딩됨)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 기재된 바와 같은 변형된 코작 서열을 포함하는 재조합 캡시드 유전자 (예를 들어, VP1 유전자)는 플라스미드, 바이러스 게놈 (예를 들어, 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 또는 다른 바이러스 게놈) 상에 제공되거나, 또는 숙주 세포 (예를 들어, 포유동물 또는 곤충 세포, 예를 들어 Sf9 세포)의 게놈 내로 통합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자 (예를 들어, rAAV 입자에 패키징되어 있는 유전자)는 효소, 호르몬, 항체, 수용체, 리간드, 또는 다른 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 치료상 유용한 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 참조 또는 마커 단백질 (예를 들어, 검출가능한 마커, 예를 들어 GFP)을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 RNA, 예를 들어 조절 RNA 예컨대 siRNA 또는 다른 조절 RNA (예를 들어, 치료 RNA)를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 폴리펩티드, 펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 리보자임, 펩티드-핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 치료 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 치료 유전자는 항체, 펩티바디, 성장 인자, 응고 인자, 호르몬, 막 단백질, 시토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체 또는 이온 채널 상에 작용하는 활성화 또는 억제 펩티드, 세포내 프로세스를 표적화하는 세포-투과 단백질, 혈전용해제, 효소, 골 형태발생 단백질, 유전자 편집을 위해 사용된 뉴클레아제 또는 다른 단백질, Fc-융합 단백질, 항응고제, 뉴클레아제, 가이드 RNA 또는 유전자 편집을 위한 다른 핵산 또는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 리소솜 축적 질환을 위한 치료제이다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 신경계 불능, 신경운동 결핍, 신경골격 장애 또는 신경근육 질환을 위한 치료제이다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 근육 불능 또는 이영양증, 근병증 또는 심근병증을 위한 치료제이다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 백신 (예를 들어, 핵산 또는 펩티드 백신)를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자 (예를 들어, 치료제를 코딩함)는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 천연 프로모터, 합성 또는 재조합 프로모터, 키메라 프로모터, 말단절단된 프로모터, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 종-특이적 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 상기 중 2종 이상의 조합일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 조절가능할 수 있다 (예를 들어, 프로모터로부터의 발현의 수준은 외부 조건을 변화시킴으로써 또는 조절 분자를 첨가 또는 제거함으로써 증가 또는 감소될 수 있음). 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 그의 천연 프로모터에, 또는 대안적으로 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 rAAV를 포함하는 조성물은 포유동물 대상체 (예를 들어, 인간)를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암, 당뇨병, 자가면역 질환, 신장 질환, 심혈관 질환, 췌장 질환, 장 질환, 간 질환, 신경계 질환, 신경근육 질환, 배튼병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병, 폐 질환, α-1. 알파.-1 항트립신 결핍, 신경계 불능, 신경운동 결핍, 신경골격 장애, 허혈, 졸중, 리소솜 축적 질환, 폼페병, 뒤시엔느 근육 이영양증, 프리드라이히 운동실조, 카나반병, 방향족 L-아미노산 데카르복실라제 결핍, 혈우병 A/B, 또는 다른 질환, 또는 그의 임의의 조합을 갖는다.
추가의 상세설명 없이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명을 기반으로 하여 본 개시내용을 최대한 활용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 구체적 실시양태는 단지 예시적이며, 어떠한 방식으로도 개시내용의 나머지를 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 인용된 모든 공개는 본원에 지칭된 목적 또는 주제를 위해 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 감쇠된 코작 서열을 사용한 안정한 세포주 내 VP1:VP2:VP3 비의 조정
rAAV 입자의 생물학적 효력 (예를 들어, 감염성)은 부분적으로 비리온 캡시드 조성, 예를 들어, 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3의 화학량론적 비에 의존한다. 이종 시스템 예컨대 곤충 세포 (예를 들어, Sf9 세포)에서 제조된 일부 rAAV 혈청형 (예를 들어, AAV5, AAV8, 및 AAV9)은 비정상적 VP1 발현 수준을 특징으로 한다. 바이러스 어셈블리 시, 비정상적 VP1 발현은 부적절한 캡시드 단백질 비로 구성된 바이러스 입자의 생산을 유발하며, 이는 세포를 효율적으로 형질도입하는 입자의 능력을 방해한다. 캡시드 단백질의 유용한 화학량론적 비를 수득하는 방법은, 과잉의 VP1이 바이러스 입자를 효율적으로 패키징하는 곤충 세포의 능력을 손상시킬 수 있는 반면 낮은 수준의 VP1이 비효율적인 형질도입을 갖는 입자를 유발할 수 있다는 것을 나타내는 결과에 의해 복잡하게 될 수 있다. 따라서, 현행 시스템을 사용하는 곤충 세포 rAAV 생산 시스템과 관련하여, 입자 어셈블리에 불리하게 영향을 주지 않으면서 감염성 입자의 수율을 증가시키는 방법을 찾는 것이 도전과제로 남아있다.
현행 조사는 Sf9 곤충 세포에서 발현된 rAAV에서의 VP1의 번역 속도의 개시를 조정함으로써 캡시드 단백질 비를 개선시키는 것을 추구한다. 구체적으로, AAV5, AAV8, 및 AAV9에서의 VP1의 코작 서열은 감쇠되었던 반면 정규 ATG 개시 코돈은 일정하게 유지되었고, 형질도입 효율을 측정하여 어셈블리된 입자를 평가하였다.
감쇠된 코작 요소의 세트를 AAV5에 대해 디자인하고, 이들 요소를 코딩하는 핵산을 생성하였다. 코딩된 코작 서열은 표 4에 제시된다. 4개의 코작 요소의 하위세트는, 도 2a에 도시된 웨스턴 블롯팅 분석에 의해 예시된 바와 같이, 1:1:10의 야생형 AAV5 VP1:VP2:VP3 비에 근접한 비로 캡시드 단백질을 코딩하는 것으로 밝혀졌다. 이들 요소 (AAV5 코작 서열 7-10)의 경우에, (VP1):(VP2):(VP3)의 각각의 비는 (0.5-2):(0.5-1):10의 범위 내에 있었다. 번역 개시 서열 (TIS, 또한 코작 서열로도 지칭됨)의 시험관내 상대 효율을 각각의 어셈블리된 입자에 대해 측정되어 있다 (표 4). 이들 수는 도 4b에서의 웨스턴 블롯팅 패널 아래의 수에 상응한다. AAV5 코작 서열 7 (서열식별번호: 8) 및 8 (서열식별변호: 9)은 가장 큰 효율을 나타내는 rAAV를 생산하였고 추가의 분석을 위해 선택되었다.
표 4. AAV5 VP1 코작 서열
Figure pat00004
AAV5 코작 서열 7은 2:1:(8-9)의 각각의 VP1:VP2:VP3 비를 생성하였다. HEK 293 세포로부터 단리된 AAV5와 비교하여, 곤충 세포에서 생성된 서열 7 입자는 2배 더 큰 형질도입 효율을 나타내었다. AAV5 코작 서열 8은 (1-1.5):1:10의 각각의 VP1:VP2:VP3 비를 생성하였다. HEK 293 세포로부터 단리된 AAV5와 비교하여, 서열 8 입자는 3배 내지 5배 더 큰 형질도입 효율을 나타내었다. 서열 8의 패키징된 rAAV5 변이체의 수율이 서열 7의 것보다 대략 10배 더 높은 것에 주목하였다.
감쇠된 코작 요소의 세트를 AAV8에 대해 디자인하고, 이들 요소를 코딩하는 핵산을 생성하였다. 코딩된 코작 서열은 표 5에 제시된다.
표 5. AAV8 VP1 코작 서열
Figure pat00005
AAV8 코작 서열 1-12는, 도 2b에 도시된 웨스턴 블롯팅 분석에 예시된 바와 같이, VP1의 과다-발현 및 VP2 및 VP3의 낮은 발현을 입증하였다. 이들 서열은 후속 시험으로부터 배제되었다. 잔류 요소 (서열 13-20)는 HEK293 세포로부터 단리된 AAV8과 유사한 비로 VP1:VP2:VP3의 발현을 지시하였다.
감쇠된 코작 요소의 세트를 AAV9에 대해 디자인하고, 이들 요소를 코딩하는 핵산을 생성하였다. 코딩된 코작 서열은 표 6에 제시된다.
표 6. AAV9 VP1 코작 서열
Figure pat00006
AAV9 코작 서열 2 (서열식별번호: 35), 3 (서열식별번호: 36), 5 (서열식별번호: 38), 및 9 (서열식별번호: 42)는, 도 2c에 도시된 웨스턴 블롯팅 분석에 의해 예시된 바와 같이, 만족스러운 VP1:VP2:VP3 비로 AAV9 캡시드를 지시하였다. 각각의 AAV 혈청형으로 수행된 실험을 고려하여, "컨센서스" 감쇠된 코작 요소가 유래되었다. 도 3에 제시된 바와 같이, -5 (개시 코돈으로부터 상류의 5개 뉴클레오티드)인 위치가 AAV 혈청형 5, 8, 및 9로부터 선택된 주어진 캡시드에 대한 VP1:VP2:VP3 발현 비의 정확한 조절을 위해 가장 유연하다.
실시예 2: rAAV 평가
rAAV 제조를 위한 바큘로바이러스/Sf9 시스템의 주요 결점은 Bac-유래된 rAAV 벡터 혈청형의 대부분이, 거의 예외없이, 변경된 캡시드 조성 및 더 낮은 생물학적 효력을 입증한다는 것이다. AAV 캡시드 단백질 화학량론의 혈청형-특이적 조정을 달성하기 위해 감쇠된 코작 서열 및 누출 리보솜 스캐닝을 활용하는 새로운 곤충 세포-기반 생산 플랫폼이 기재되어 있다. 예로서, rAAV5 및 rAAV9를 생성하고 포괄적으로 HEK 293 유래된 벡터와 병렬로 특징화하였다. 질량 분광측정법 분석은 인간 세포-유래 벡터와 비교하여 VP1 및 VP2 캡시드 단백질 함량 둘 다에서 3배 증가를 문서화하였다. 게다가, 캡시드화된 단일-가닥 바이러스 DNA의 광범위한 분석을 차세대 서열분석을 사용하여 수행하고, 곤충 세포에서 생산된 rAAV5에 대해 부수적으로 패키징된 오염 DNA에서 6배 감소를 제시하였다. 결과적으로, 재디자인된 rAAV는, rAAV5의 경우에, 심지어 마우스에서 뇌 조직의 4배 더 높은 형질도입을 매개하는 HEK 293-제조된 rAAV와 비교하여도, 상당히 더 높은 생물학적 효력을 입증하였다. 따라서, 기재된 시스템은 GMP 등급 벡터 생산을 위한 확장가능한 플랫폼을 제공하는 우월한 감염성 및 예외적인 순도의 rAAV 벡터를 산출한다.
rAAV는 유전자 요법/DNA 백신 전달을 위한 벡터로서 광범위하게 사용되지만, 임상 시험을 위한 고도로 감염성 rAAV의 스케일-업 생산은 도전적인 제안으로 남아있다. AAV 캡시드는 AAV 게놈에서의 단일 캡시드 유전자의 대안적 스플라이싱 및 차등 코돈 용법을 통해 유래된, 3개의 캡시드 단백질, VP1, VP2, 및 VP3으로 이루어진다. VP3 서열은 모든 3개의 스플라이싱 변이체 사이에 공통이고, VP2 및 VP1은 바이러스 감염에 결정적인 포스포리파제 도메인 A2를 함유하는 VP1의 고유한 영역과 함께 N-말단 더 긴 서열을 갖는다 1. 캡시드 내 VP1/VP2/VP3의 정확한 양은 알려지지 않았지만, SDS-PAGE 상에서 분해된 캡시드 단백질의 밀도측정법 분석을 기반으로, 1/1/10인 것으로 추정된다 2-4. 더욱이, 정의된 VP1/VP2/VP3 화학량론이 없고 어셈블리는 캡시드에 혼입된 VP1/VP2/VP3의 상대 양이 주로 그의 상대 발현 수준에 의존하도록 화학량론인 것으로 보인다 5. 따라서, 주어진 rAAV 생산 시스템에서의 캡시드 단백질 발현 유닛의 디자인은 생물학적으로 강력한 유전자 요법 벡터의 어셈블리에 필수적이다.
이러한 목표를 향하여, 원래 확장가능한 시스템 중 하나는, 각각, rAAV 트랜스진 카세트, AAV rep, 및 cap 헬퍼 유전자를 코딩하는 에이. 칼리포르니카(A. californica) 멀티캡시드 뉴클레오폴리헤드로바이러스 (AcMNPV)로부터 유래된 3종의 재조합 바큘로바이러스로 공동-감염된 Sf9 곤충 세포의 현탁 배양을 활용하였다 6. 그러나, 이러한 시스템에서 생산된 AAV 혈청형의 대부분은 VP1 캡시드 단백질의 부적절한 함량 및 그의 포스포리파제 A2 활성으로 인해 HEK 293-유래된 벡터와 비교하여 낮은 형질도입 효율을 특징으로 하였다 7-10. 이러한 결점은 누출 리보솜 스캐닝을 유도하기 위한 VP1에 대한 비-정규 ACG 개시 코돈을 활용하는 캡시드 유전자 헬퍼 벡터 디자인으로부터 생성되었다 6. 심지어 다른 그룹이 상이한 개시 코돈 CUG 11 또는 인공 인트론 12을 활용하여 문제를 어느 정도까지 해결했을지라도, 해결책은 혈청형-특이적 서열 조정에 필요한 유연성이 결여된 것으로 보였다. 조정가능한 누출 리보솜 스캐닝을 통한 상대 VP1/VP2/VP3 조성의 조절의 신규 시스템이 도입된다.
포유동물 기원의 세포에서, AAV에서의 P40-구동된 전사체는 각각 VP1, 또는 VP2/VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 2개의 스플라이싱된 mRNA 변이체를 생산하기 위한 스플라이싱을 겪는다. 바큘로바이러스/Sf9 시스템에서 polh 프로모터가 P40/인트론 서열을 대체하기 때문에, 스플라이싱에 의한 조절은 이용가능하지 않고 누출 리보솜 스캐닝을 통한 VP1 발현의 대안적 조절이 사용된다. 컨센서스 서열 GCCRCCAUGGC (서열식별번호: 49) (R=A 또는 G)는, 또한 코작 서열로도 알려져 있는, 효과적인 포유동물 번역 개시 부위 (TIS)인 것으로 간주된다 13. 이러한 서열로부터의 임의의 편차는 VP1 AUG의 누출 스캐닝 및 VP2 ACG 또는 VP3 AUG 코돈 하류의 인-프레임으로부터의 번역의 개시를 증가시킬 것이며 따라서 VP1/VP2/VP3 화학량론을 변화시킬 것이다. 현행 작업에서, 심지어 HEK 293 유래된 벡터와 비교하여도 상당히 더 큰 생물학적 효력을 유발하는 더 높은 VP1/VP2 함량을 갖는 입자를 유도하기 위해 바큘로바이러스/Sf9 시스템 내 VP1/VP2/VP3 캡시드 조성의 비를 합리적으로 조정하기 위한 접근법이 기재되어 있다.
이러한 진보된 생산 플랫폼을 그 전체로 특징화하기 위해, 제조된 캡시드화된 DNA의 차세대 서열 (NGS) 분석을 2가지 방법에 의해 수행하였다: HEK 293의 통상적인 삼중 플라스미드 공동-형질감염 및 안정하게 통합된 rep/cap 헬퍼 유전자를 혼입하는 Sf9 세포주의 단일 BEV 감염. 2개의 플랫폼에 의해 제조된 rAAV 카세트의 직접 병렬 NGS 분석은 상당히 더 적은 오염 DNA를 캡시드화하는 곤충 세포에서 바이러스 DNA 패키징의 더 높은 정밀도를 밝혀내었다.
AAV5 및 rAAV9 캡시드 유전자의 디자인. 누출 리보솜 스캐닝을 증가시키기 위해 감쇠된 코작 서열에 의해 선행된 정규 AUG 코돈을 사용하였다. AUG의 상류, 또는 하류의 뉴클레오티드를 무작위로 변형시키는 것은 현실적인 접근법이 아닐 것인데, 8개의 잔기의 관련 스트레치를 스패닝하는 가능한 TIS 서열의 복잡성이 65,536개의 가능한 순열이기 때문이다. 더욱이, 컨센서스 코작 서열은 효모 14, 고등 식물 15, 무척추동물 16, 또는 척추동물 17에 대해 상이한 것으로 보인다. 따라서, 감쇠된 TIS의 스크리닝을 합리화하기 위한 한가지 방식은 문헌 [Noderer et al.] 18에 의해 유래된 모든 가능한 포유동물 TIS 순열의 경험적 열 지도를 활용하는 것이었으며, 그에 의해 TIS의 모든 가능한 조합은 컨센서스 코작 서열에 대비한 "개시 효율" 값을 할당하였다.
12-43% 개시 효율의 범위를 선택하고 2-4% 증분만큼 차이가 있는 10개의 돌연변이체에 대해 시험하였다. 모든 10개의 AAV5 VP1 시험된 TIS는 표 9에 제시되고, cap-발현 헬퍼 플라스미드의 맥락에서 사용하여 (도 4a) 이전에 기재된 바와 같은 7 BSR 풀링된 세포주를 유도하고 그의 캡시드 조성을 평가하였다. 몇 가지 주목할만한 예외를 제외하고는 (예를 들어, 도 4b, 레인 6), 상대 VP1 함량은 점차적으로 감소하였던 반면, 상대 TIS 효율의 이론적 값 감소를 근접하게 따랐다. 이러한 상관관계는 누출 스캐닝 번역 개시를 활용하여 VP1 함량을 조정할 수 있다는 원래 가설을 지지한다. 유용한 VP1/VP2/VP3 화학량론을 추가로 식별하기 위해, 각각 10개의 rAAV5 벡터의 감염성 및 전체 역가를 검정하였다. 감염성 rAAV5 벡터를 생산하기 위해, CBA-구동된 GFP를 코딩하는 BEV (도 10a, pTR-Bac-UF26)를 생성하였다. 병렬 비교는 40% TIS 상대 효율을 갖는 구축물 (도 4b, 레인 2)이 가장 높은 수율을 생산하는 모든 다른 구축물에 비해 우월하였다는 것을 밝혀내었다. 따라서, 감쇠된 TIS, UGUUUUAUGUC (표 9의 서열식별번호: 9)를 혼입하는 이러한 특정한 캡시드 유전자-함유 헬퍼 구축물을 선택하여 생산자 세포주를 유도하였다. 그러나, 다른 서열이 또한 사용될 수 있다. 유사한 방식으로, 감쇠된 코작 서열을 갖는 12개의 AAV9 VP1 플라스미드 구축물을 스크리닝하였다 (표 9). AAV9의 경우에, 특히 유용한 서열은 45%의 상대 TIS 효율을 구성하는 UAGUGUAUGGC (서열식별번호: 42)였다. 그러나, 다른 서열이 또한 사용될 수 있다.
rep2/cap5 안정한 세포주의 특징화. 개별 세포주를 Rep-결합 성분 (RBE)이 없는 Rep2-, 및 Cap5-발현 플라스미드를 사용하여 유도하였다 8. Cap5 헬퍼는 하기 감쇠된 TIS를 함유하였다: UGUUUUAUGUC (서열식별번호: 9). 5개의 개별 세포주를 앞서 기재된 바와 같이 증식시키고 시험하였다 7. rAAV5--UF26의 가장 높은 수율을 제시하는, B8로 지정된 하나의 세포주는 추가의 특징화를 위해 선택되었다. 하기 파라미터를 조사하였다.
표 9. AAV5 및 AAV9 캡시드 유전자의 발현에 대해 시험된 WT 및 감쇠된 TIS.
Figure pat00007
Figure pat00008
*추정된 상대 TIS 효율 18
각각의 혈청형에 대해 선택된 서열은 볼드체로 강조하였다. 밑줄은 VP1 개시 코돈을 나타낸다.
VP1/VP2/VP3 화학량론. 순차적 이중 아이오딕사놀 구배에 의해 HEK 293 세포로부터 정제된 rAAV5-GFP의 캡시드 조성은 그것이 더 낮은 VP1 함량을 함유하였다는 점에서 VP1/VP2/VP3에 대한 1/1/10의 이론적 값으로부터 벗어났다 (도 4c). 더욱이, 이러한 캡시드는 약간 더 높은 MW를 갖는 추가적인 VP2 캡시드 단백질을 혼입하였다. 대조적으로, Sf9 B8-유래된 벡터는 더 높은 수준의 VP1 및 VP2를 구성하였다 (도 4c). rAAV9의 경우에, Sf9-유래된 벡터의 캡시드 조성은 HEK 293 세포에서 제조된 벡터의 것과 거의 동일하였다 (도 4d). rAAV5와는 달리, 바이러스 샘플 둘 다는 VP2보다 더 많은 VP1을 혼입하고 또한 캡시드-특이적 단백질분해의 생성물일 수 있는 VP3보다 더 작은 밴드를 함유하는 것으로 보인다 19.
정확한 수치를 정량화하기 위해, rAAV5에 대한 각각의 캡시드 밴드의 밀도를 곡선하 면적 (AUC)으로서 플롯팅하였다 (도 11). 하기 값 (VP3=10의 공통 분모로 조정된 2개의 독립적 실험의 평균)이 얻어졌다: HEK 293 VP1/VP2/VP3=0.2/0.5/10; Sf9 B8 VP1/VP2/VP3=0.7/1.7/10. 계산된 화학량론을 검증하기 위해, rAAV5 캡시드 조성을 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 - 비행 시간 (MALDI-TOF)을 사용하여 질량 분광측정법에 의해 분석하였다.
MALDI-TOF. 비리온 쉘을 구성하는 AAV VP는 그의 VP3 C-말단을 공유한다 (도 5a, 흑색으로 제시됨). VP1 (파선), 및 VP2 (쇄선) 고유한 N-말단은 그의 고유한 트립신 펩티드를 분석함으로써 상대 화학량론을 해독하기 위한 도전과제를 만드는 공통 공유된 VP3 도메인과 비교하여 상대적으로 작다. 따라서, 차등 16O/18O 표지화 접근법을 사용하여 VP1, VP2 또는 VP3으로부터 유래된 것을 제외하고는 동일한 펩티드를 판별하였다. 중산소 안정한 동위원소 물 H2 18O이 트립신 소화 동안 사용될 때, 2개의 18O 원자가 4 Da만큼 질량을 이동시키는 트립신 펩티드의 C-말단 카르복실 기에서 교환된다 20, 21. 2개의 상이한 단백질 (예를 들어, VP1 또는 VP3)로부터 유래된 동일한 펩티드 사이의 이러한 이동은 단백질의 식별 및 정량화를 가능하게 한다.
파일럿 소화를 수행한 후에, VP3 영역에서의 3개의 펩티드 (도 5a)를 선택하여 각각의 단백질의 상대 존재비를 정량화하였다. 2개의 18O 원자의 완전 혼입을 VP3/VP1-, 및 VP2/VP3 샘플을 별개로 실행함으로써 확증하였다. 이어서, H2 18O 중 모든 VP3 소화 트립신 산물의 전체 MALDI 스펙트럼을 분석하였다 (도 5b). 모든 펩티드는 2개의 18O 원자가 혼입되어 있는 것을 확증하는 예측된 펩티드 분자량으로부터의 4 Da 질량 이동을 제시하였다. 관찰된 질량 이동이 단지 2 Da라면 반응은 완전하지 않거나 또는 불완전 트립신 불활성화로부터의 역 교환이 발생하고 있었다 20. 도 5c는 별개로 스폿팅되고 MALDI-TOF에 의해 분석된 VP1 (오리지널 컬러 도면에서의 적색 트레이스) 또는 VP3 (오리지널 컬러 도면에서의 청색 트레이스)으로부터의 트립신 펩티드 TWVLPSYNNHQYR (서열식별번호: 48)의 오버레이를 제시한다. VP3 샘플에 대한 4 Da의 뚜렷한 질량 이동은 역 교환의 증거 없이 완전 18O 원자 교환을 입증하였다. 도 5d는 H2 18O로 소화되고 H2 16O에서 소화된 VP1과 1:1로 혼합된 VP3의 대표적인 MALDI-TOF 스펙트럼을 제시한다. 피크 면적을 적분하고 사용하여 단백질의 존재비를 계산하였다.
각각의 단백질당 3개의 고유한 펩티드 (도 5a)를 분석하고, 각각 3회 반복하여 MALDI-TOF를 실행하였다 (표 10 및 11). 이는 그의 상대 존재비의 높은 신뢰성 정량화를 가능하게 하였다 22. 하기 값 (VP3=10의 공통 분모로 조정된 3개의 독립적 실험의 평균)이 얻어졌다: HEK 293 VP1/VP2/VP3=0.4/0.5/10; Sf9 B8 VP1/VP2/VP3=1.1/1.7/10. 이들 수는 상기 기재된 AUC 밀도와 현저하게 일치하였다.
표 10. VP1/VP3 이온, 강도 및 비.
Figure pat00009
* M/Z는 질량을 전하 수로 나눈 것을 나타낸다.
표 11. VP2/VP3 이온, 강도 및 비.
Figure pat00010
* M/Z는 질량을 전하 수로 나눈 것을 나타낸다.
채워진/비워진 입자 비. 2개의 제조 플랫폼 중 어느 하나가 더 높은 비의 비워진 입자, 불리한 면역 반응의 잠재적 공급원 및 벡터 정제 동안의 기술적 도전과제를 생성하는지 여부를 결정하기 위해 이러한 파라미터를 조사하였다. rAAV5 및 rAAV9를 단일특이적 항체 친화도 수지 상에서 1-단계 크로마토그래피, rAAV5의 경우에 AVB, 및 rAAV9의 경우에 포로스 캡처셀렉트(POROS CaptureSelect)™에 의해 정제하였다. 정제 후에, 벡터 게놈 입자 역가를 QC PCR을 사용하여 검정하였다. rAAV5, 및 rAAV9 벡터의 총 입자 역가를 금 나노입자로 장식된 rAAV 캡시드의 나노입자 트래킹 분석 (NTA)을 사용하여 검정하였다. 이러한 접근법은 고도로 산란하는 물질 예컨대 금 나노입자 및 바이러스 캡시드 사이의 정전기 인력을 활용한다. 생성된 금-표지화된 바이러스 입자는 광학 시스템에 의해 가시화되고 트래킹되기에 충분한 광을 산란시켜 (도 6a-6f), AAV의 크기 및 농도를 측정하기 위한 NTA의 사용을 가능하게 한다. 흥미롭게도, 플랫폼 둘 다에 대한 rAAV9 입자의 평균 크기는 동일하였지만 (38 nm의 주요 피크, 도 6a, 6b), HEK 293으로부터 및 Sf9 B8로부터의 rAAV5의 평균 크기는 상이하였다 (48 nm vs 42 nm, 도 6d, 6e). 중요하게는, 이들 크기가 바이러스/나노-금 입자 복합체의 근사치이며, 결과적으로, 바이러스 입자 전하의 함수이다.
총-대-채워진 입자의 비를 계산한 후에, HEK 293-유래된 rAAV9의 이들 값은 2.8이고, Sf9-유래된 rAAV9에 대한 값은 3.1이었다 (도 6c). 유사하게, rAAV5의 경우에, 비는 또한 상당히 상이하지 않았다: 14.8 vs. 15.2 (도 6f). rAAV9에 대한 전반적인 더 낮은 비는, 분명하게, 캡처셀렉트 수지 크로마토그래피에 대한 정제 바이어스로부터 생성되었으며, 이는 DNA-함유 rAAV9 입자의 우선적 결합, 및 그에 대한 풍부화를 제시하였다 (데이터는 제시되지 않음).
시험관내 형질도입 효율. 루시페라제 및 mApple 리포터 유전자를 혼입하는 rAAV 트랜스진 카세트 (도 10b, pTR-UF50-BC 23)를 사용하여 형질도입 효율을 시험하기 위한 Sf9 B8 세포주를 감염시키기 위한 각각의 BEV를 생성하였다. 동일한 플라스미드를 또한 사용하여 HEK 293 세포의 삼중 플라스미드 공동-형질감염에 의해 rAAV를 생성하였다. 병렬로 정제되고 적정된 rAAV5-Luc-mApple 벡터 둘 다를 사용하여 HeLa-유래된 C12 세포주를 감염시켰다 24. FACS 분석 (도 12a)은 Sf9-생산된 rAAV5 벡터에 대하여 상당히 더 높은 (~5배) 형질도입 효율을 밝혀내었다. rAAV9의 경우에, rAAV9의 2개 샘플 사이의 유의차가 없었다 (도 12b). 실험 둘 다로부터의 데이터는 단백질 함량과 일치한다.
생체내 형질도입 효율 (도 7). HEK 293 및 Sf9 B8 세포에서 생산된 rAAV5-Luc-mApple을 마우스의 뇌 (선조체)에서 생체내 검정하였다. 주사후 3주 째에, 형질도입 효율을 생물발광 (BLI)에 의해 결정하였다 (도 7a). Sf9 B8-유래된 AAV5로 주사된 동물은 HEK 293-유래된 AAV5보다 4배 더 높은 BLI 신호 강도를 제시하였다 (도 7b, 각각 4.3x105±1.8x105, 및 1.1x105±3.5x104). 유사하게, 뇌 단면의 형광 분석은 HEK 293과 비교하여 Sf9 B8-유래된 샘플에서 더 강한 mApple 신호를 밝혀내었다 (도 7c).
HEK 293 및 Sf9 세포에서 생산된 rAAV5 벡터의 차세대 서열분석 (NGS) 분석. 더 높은 효력 rAAV5-기반 벡터의 생산을 위한 개선된 OneBac 시스템을 확립하면, HEK 293 세포에서 표준 삼중 공동-형질감염 프로토콜에 의해, 또는 안정한 rep2cap5 Sf9 세포주 B8의 단일 BEV-UF26 감염에 의해 제조된 캡시드화된 ssDNA (pTR-Bac-UF26, 도 10a)의 비교 NGS 분석을 수행하였다. NGS 분석의 목적은 rAAV 카세트-특이적, 뿐만 아니라 부수적으로 패키징된 오염된 DNA 종을 특징화하며, 따라서 GMP-등급 rAAV 벡터 생산의 요구를 충족시키는 바람직한 플랫폼을 확립하는 것이었다. 모든 NGS 라이브러리를 이중으로 제조하고, 서열분석하고, 분석하였다. 일반적인 작업흐름은 흐름도에 도시된다 (도 13). 하기 파라미터를 분석하였다.
오염 DNA 서열의 부수적 패키징.
여과 후에, 인덱스에 할당된 판독물의 총 수는 757,433,116이었다. 참조 서열에 대한 판독물의 정렬 후에, rAAV 카세트에 대한 커버리지는 2,260,074 판독물/nt (nt 위치 2,000)만큼 높이 도달하였다. 부수적으로 패키징된 서열의 경우에 커버리지는 상당히 더 낮았다: 10,781 판독물/nt (nt 위치 1,299, 벡터 백본), 또는 6,424 판독물/nt (nt 위치 200, AcMNPV 게놈).
생산 프로토콜 둘 다의 경우에, 판독물의 대부분은 모든 캡시드화 DNA 서열의 96.5% (HEK 293) 및 99.4% (Sf9)를 차지하는 rAAV-Bac-UF26 카세트였다 (표 12, 도 8a, 8b). HEK 293 시스템 내의 오염된 DNA의 대부분은 더 낮은 수준의 rep2/cap5 헬퍼 서열 (0.7%), 및 인간 게놈 DNA (0.17%)와 함께, 박테리아 플라스미드 백본 (2.5%)이었던 반면, Sf9 제제 내의 오염물은 셔틀 플라스미드 백본 (0.3%), 및 AcMNPV 게놈 (0.2%)이었다. Sf9-유래된 rAAV5의 경우에, 판독물은 ATCC로부터 수득된 Sf9 세포주로부터 최근에 단리되었던 우발성 랍도바이러스 (Sf-랍도바이러스)에 상동인 것으로 밝혀지지 않았다 25.
부수적으로 패키징된 서열은 rAAV 카세트 및 그의 각각의 백본의 바로 가까이의 접합에 의해 더 풍부하게 나타내어졌다: HEK 293 세포의 경우에 박테리아 플라스미드 및 Sf9 세포의 경우에 바큘로바이러스 게놈. 특히, 2개의 시스템 사이의 접합 판독물 커버리지에서 적어도 10배의 유의차가 있었으며 그에 의해 HEK 293 세포는 좌측 및 우측 AAV 말단 반복부 둘 다로부터 더 떨어져 있는 박테리아 플라스미드 백본 서열을 훨씬 더 높은 빈도로 캡시드화하는 것으로 보인다 (도 8c, 8d). 따라서, 오염 DNA 서열의 분석은 OneBac 시스템이 더 우수한 정밀도를 전달하고 더 높은 품질의 rAAV 벡터를 제공하며, 그 결과 단지 0.6%의 캡시드화 벡터 게놈이 HEK 293 세포의 경우에 3.5%에 대조적으로 외부 DNA를 혼입한다는 것을 시사한다.
표 12. HEK 293 및 Sf9 세포 내 rAAV5-UF26의 특이적 및 부수적 패키징의 분석*
Figure pat00011
* 정제된 비리온 내 DNA의 상대 함량은 NGS 분석에 의해 식별된 총 서열의 백분율로서 제시된다. 2개의 병렬 행에서 각각의 참조 게놈에 대해 제시된 모든 NGS 분석을 이중으로 수행하였다.
rAAV 게놈 커버리지. NGS 라이브러리를 생성하기 위한 PCR 증폭 단계의 단지 8개 사이클을 포함한 표준 프로토콜을 사용하여, 여러 서열을 rAAV 카세트의 나머지와 비교하여 적어도 10배 더 낮은 서열분석 커버리지를 나타내는 CBA 프로모터 및 하류 인트론 내에서 식별하였다. 정밀 검사는 이들 서열이 극도로 GC-풍부하다는 것을 밝혀내었다 (도 8a, 8b). 이러한 비교적 낮은 커버리지는 DNA 복제 동안 말단절단 때문에 패키징된 비리온에서 이들 서열의 더 낮은 표현을 반영할 수 있다. 대안적으로, 이러한 하락은 PCR-관련 NGS 라이브러리 제조에 의해 도입된 인공물을 나타내었다. 제2 가능성을 배제하기 위해, NGS 라이브러리를 PCR 증폭 없이 정제된 캡시드화된 rAAV DNA로부터 직접 제조하였다. 이러한 방식은, 해당 서열의 커버리지를 카세트의 나머지와 필적할만한 수준으로 회복시켰다. 따라서, HEK 293 및 Sf9 세포 둘 다는 있어도 극히 적은 말단절단의 증거로 전장 rAAV 카세트의 패키징을 지원한다.
rAAV-Bac-UF26 카세트의 게놈 동일성. AAV 카세트의 높은 서열분석 깊이는 그의 각각의 모 박테리아 플라스미드에 대한 패키징된 DNA 서열 동일성 및 상관관계의 상세한 분석을 가능하게 하였다. 오류 지시의 확률을 감소시키고 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 분석의 신뢰성을 증가시키기 위해, 단지 PCR-프리 샘플 NGS 데이터를 활용하였다. 바이러스 샘플 둘 다, 뿐만 아니라 양성 대조군 플라스미드 샘플로부터의 DNA에 대한 SNP 변이체는 매우 유사한 치환 프로파일을 나타낸다 (0.75-0.77의 상관 계수) (도 9a). 흥미롭게도, SNP의 대부분은 GC 함량에서 풍부화된 영역으로서 상기 식별된 비-코딩 서열과 함께 공동-국재화되었다 (도 9b): 닭 β-액틴 프로모터 및 인트론 서열. 게다가, 그리고 문헌 [Lecomte et al. 26]과 일치하게, AAV TR은 비교적 높은 SNP 가변성을 나타낸다.
AAV5 및 AAV8 혈청형의 곤충 세포-제조된 rAAV 벡터의 비교적 열등한 효력은 문헌 [Urabe et al. 10 및 Kohlbrenner et al. 9]에 의해 이전에 문서화되었다. 후속적으로, 많은 다른 OneBac-유래된 AAV 혈청형은 293-유래된 AAV와 비교하여 더 낮은 감염성을 특징으로 하였던 것으로 제시되었다 27. 모든 영향받은 혈청형에 대한 통합 원인은 포스포리파제 A2 활성을 혼입하는 VP1 캡시드 단백질의 더 낮은 함량을 유발한 캡시드 헬퍼 유전자의 변형된 서열이었다. 예상된 바와 같이, 권장된 해결책은 상이한 개시 코돈 CUG 11 및 인공 인트론 8, 12을 사용함으로써 이러한 문제를 해소하는 것을 목표로 하였다. 비록 새로운 디자인이 일부 벡터에 대한 감염성을 증가시키는데 도움이 될지라도, 해결책은 혈청형-특이적 서열 조정에 필요한 유연성이 결여된 것으로 보였다.
캡시드의 상대 VP1/VP2 함량을 증가시키기 위한 새로운 접근법이 본원에 기재된다. 이는 VP1 AUG 개시 코돈을 선행하는 정규 코작 서열을 변형함으로써 달성된다. 원리 증명으로서, 다양한 코작 서열을 가장 유리한 번역 개시 부위가 HEK 293-유래된 대응부의 형질도입 효율을 초과한 혈청형-특이적 생산 rAAV 벡터였다는 것을 제시하는 AAV5 및 AAV9 혈청형에 대해 시험하였다. 그러나, 기재된 접근법은 또한 상이한 혈청형에 대해 달라지는 상대 TIS 효율의 좁은 창에서의 VP1 코작 서열의 미세 조정을 요구한다. 이러한 변이에 대한 이유 중 하나는 VP1:VP2:VP3 비가 VP1 TIS 상대 효율, 뿐만 아니라 또한 모든 혈청형에 대해 상이한 VP2 및 VP3 TIS 중 하나에 의존한다는 점이다 (표 13). 더욱이, 특정한 역치 초과로 의도적으로 증가하는 VP1 함량 (예를 들어, 도 4b, 레인 1 및 6)은 VP1:VP2:VP3 비가 1:1:10의 이론적 값에서 너무 멀리 이동하면 바이러스의 수율이 급격하게 하락하기 때문에 역효과를 낳는 것으로 보인다. 특정한 용도에 대한 특이적 TIS가 경험적으로 식별될 수 있다는 이해 하에 '컨센서스' VP1TIS: U(C)A(C/G)U(G)UG(U)UAUGG (서열식별번호: 50)를 유도할 수 있다.
표 13. AAV 혈청형에서의 VP1, VP2, 및 VP3 개시 코돈 주위의 번역 개시 서열
Figure pat00012
*는 AAV 혈청형 캡시드 유전자의 서열 정렬에 의해 추론된 AAV7에서의 추정 대안적 개시 코돈 VP3을 나타냄. 코작 TIS의 상대 강도는 개시 코돈 옆에 % 단위로서 표현됨 18.
분석을 위해 선택된 rAAV5 구축물에서, 상대 VP1 함량의 수치는 HEK 293-유래된 벡터에서 0.2-0.4로부터 (2개의 독립 검정에 의함) Sf9 세포에서 0.7-1.1까지 증가하였다 (즉, 평균적으로 3배만큼 증가됨). VP2의 경우에, 이들 값은 0.5로부터 1.7까지, 유사하게 3배 증가하였다. VP2의 동시 증가는 rAAV5 VP1의 상대 증가의 비예측된 효과 중 하나였다. VP1 및 VP2 둘 다의 N-말단은 AAV에 유용한 보존적 핵 국재화 서열 (NLS) 모티프를 나타내는 소위 염기성 영역 3 (BR3, PKRKKART (서열식별번호: 51))을 혼입하여 핵 내의 그의 게놈을 전달하고 후속적으로 세포를 형질도입한다28-30. 따라서 각각 VP1 및 VP2의 3배 증가가 더 많은 감염성 바이러스의 수율을 증가시킨다는 것은 놀랍지 않다.
상기에 제공된 데이터는 최근에 기재된 OneBac2.0 8 및 현행 시스템에서 제조된 rAAV5 및 rAAV9의 직접 비교를 포함하지 않는다. 그러나, 각각의 갭시드 비와 관련시키고, 이들 혈청형에 대하여, 새롭게 디자인된 cap 헬퍼 유전자가 AAV5 및 AAV9 캡시드 화학량론 둘 다를 상당히 개선시켜, 더 높은 효력 바이러스 벡터 내로 번역된다고 결론내릴 수 있다.
또 다른 예상외의 발견은 채워진-대-비워진 입자 비의 대용물 파라미터에 의해 평가되었던 HEK 293 및 Sf9 세포에 의해 나타낸 패키징 효율의 유사성이었다. 안정한 생산자 세포주를 구축하기 위해 1:2.5의 rep/cap 발현 카세트의 이전에 식별된 비를 사용하여 7, HEK 293과 유사하게 패키징 효율을 달성하였다.
진행 중인 많은 임상 시험과 함께, 상이한 프로토콜에 의해 제조된 rAAV 스톡의 유전적 동일성을 평가하는 것은 긴급한 규제 이슈가 된다. 많은 그룹은 패키징 숙주 세포 26, 31, 32, 박테리아 헬퍼 플라스미드 백본 26, 33, 헬퍼 바이러스 8, 32, 및 wt AAV rep/cap 서열 26, 34로부터 유래된 서열의 부수적 캡시드화를 보고하였다. 패키징된 rAAV 카세트의 유전적 동일성을 평가하기 위해, 캡시드화된 단일-가닥 바이러스 DNA의 NGS 분석을 수행하였다. 파일럿 분석은 플랫폼 둘 다에 대해 거의 동일하였던 GC-풍부화된 서열 내 카세트의 비균등한 서열 커버리지를 제시하였다. PCR-프리 프로토콜을 활용하여, 커버리지의 하락이 분명하게 라이브러리 제조 동안 PCR-유도된 인공물로부터 생성되고 말단절단된 rAAV 게놈의 패키징으로부터 생성되지 않았다는 것을 제시하였다 35, 36. NGS 라이브러리 제조를 위한 PCR-기반 방법의 정확도는 특히 GC-풍부한 팔린드롬 예컨대 역전된 말단 반복부 (ITR)에서 AAV-관련 분석 37에 적절하지 않거나, 또는 임의의 GC-풍부화된 서열 38에 대해 적용되었기 때문에 여러 그룹에 의해 의심받았다. 결과적으로, rAAV 벡터 제조의 NGS 분석은 충분한 프로토콜을 사용하여 수행되어야 한다.
플랫폼 둘 다로부터 유래된 바이러스 DNA의 유전적 동일성의 분석은 곤충 대 인간 세포에서 캡시드화 rAAV DNA 사이의 유의차가 없다는 것을 제시하였다. 그러나, 중요한 것은, HEK 293 세포를 형질감염시키는데 사용된 pTR-Bac-UF26 플라스미드 DNA 풀의 서열의, 데이터베이스 내의 이러한 플라스미드의 서열로부터의, 편차가 여기서 문서화된다는 사실이다. 반면에 놀랍게도, 플라스미드 DNA의 이러한 유전적 부동의 사실은 하기 메카니즘에 의해 설명될 수 있다. rAAV 카세트-함유 플라스미드는 AAV ITR의 완전성을 유지하기 위해 이. 콜라이(E. coli)의 재조합-결핍 균주에서 증식된다. 이들 균주는 비표준 2차 및 3차 구조의 재배열 및 결실을 촉매하는 경로의 구성성분 (endA, recB recJ)이 결여된다. 결과로서, 플라스미드 DNA는 달리 미스매치 복구 시스템에 의해 회복될 수 있는 미스매치된 염기 및 점 돌연변이를 축적한다. DNA에서의 미스매치는, 복구되지 않으면, 높은 자연 돌연변이 빈도를 유발한다. 따라서, 형질감염 동안, 돌연변이된 플라스미드 DNA는 그의 헤테로듀플렉스 "각인된" 구조를 숙주 HEK 293 세포 핵 내로 운반하며, 여기서 이는 복구되거나 39 또는 돌연변이 카피를 복제한다. 따라서, 공동-형질감염 프로토콜에서의 플라스미드 DNA 풀은 일부 GC-풍부한 서열에 대해 상당할 수 있는 캡시드화된 AAV 카세트 내로 이. 콜라이의 돌연변이유발 부담의 일부를 운반한다. 흥미롭게도, GFP 리포터 cDNA는 돌연변이의 최소 수를 갖는 것으로 보이며 (도 8a), 이는 그의 합성 "인간화된" 기원을 반영할 수 있다 40. 이와 관련하여, rAAV 카세트로부터 CpG 모티프를 고갈시키는 것은, 그의 면역원성-관련 효과 41 이외에도, 또한 모 플라스미드 DNA의 유전적 안정성을 증가시키는데 도움을 줄 수 있다.
2개의 플랫폼에 의해 제조된 rAAV 카세트의 직접 병렬 NGS 분석은, 예상외로, 현저히 더 적은 오염 DNA를 캡시드화하는 (0.6% vs 3.5%) 곤충 세포에서 바이러스 DNA 패키징의 더 높은 정밀도를 밝혀내었다. 이러한 6배 감소는 FDA 가이드라인에서 "잔류 세포-기질 DNA의 수준은 용량당 ≤10 ng이어야 한다"고 언급하는 것을 고려하면 유의한 것으로 보인다 (fda.gov/downloads/AdvisoryCommittees/CommitteesMeetingMaterials/BloodVaccinesandOtherBiologics/VaccinesandRelatedBiologicalProductsAdvisoryCommittee/UCM319573.pdf).
rAAV로의 현행 임상 시험을 고려하면, 그 결과 용량은 6x1013 vg/kg만큼 높이 도달했으며 42, 43, 벡터는, HEK 293 세포에서 생산되면, FDA 가이드라인을 초과할 오염 DNA의 양을 혼입할 것이다. 여기서, OneBac 시스템을 사용하여 생산된 rAAV5 벡터는 상당히 더 감염성이고, 동시에, 더 적은 양의 외부 DNA를 캡시드화하는 것으로 제시되었다. 따라서, 이러한 생산 방법은 벡터 투여의 잠재적인 치료 결과를, 그의 유효량을 감소시키고 안전성을 상승시킴으로써 개선시킨다.
물질 및 방법
하기 비제한적 물질 및 방법은 본 출원에 기재된 특정 실험과 함께 사용하였다. 이들 또는 다른 물질 및 방법은 본 출원에 기재된 실시양태와 함께 사용될 수 있다.
HEK 293 세포에서의 rAAV5 및 rAAV9 생산
rAAV5 및 rAAV9 벡터 둘 다를 이전에 기재된 바와 같은 44 삼중 공동-형질감염 절차에 의해 생산하였다. rAAV 카세트를 보유하는 플라스미드 (rAAV5-Bac-UF26, 또는 rAAV5-UF50-BC, 뿐만 아니라 rAAV9-Bac-UF26, 도 10a-10b)를 1:1:1 몰비로 pHelper 및 pRep2Cap5 (또는 pRep2Cap9)와 조합하여 사용하였다. rAAV5 및 rAAV9 둘 다를 순차적 이중 라운드 아이오딕사놀 부력 밀도 원심분리를 사용하여 정제하였다. 구체적으로, 채워진 입자를 함유하는 제1 라운드 아이오딕사놀 분획을 1x PBS-MK 완충제 2.5배로 희석하고 표준 구배 44에서 15% 아이오딕사놀-1 M NaCl 단계 대신에 사용하였다.
Sf9 세포에서의 rAAV5 및 rAAV9 생산
Bac-UF26, 또는 UF50-BC rAAV 카세트를 pFastBac 백본 내로 삽입하고 각각의 BEV를 Bac-투-Bac 시스템 가이드라인에 따라 유도하였다. 플라크-정제된 BEV를 P3으로 확산시키고, 플라크 검정에 의해 적정하고, 이전에 기재된 바와 같은 7, rep2cap5, 또는 rep2cap9 유도성 헬퍼 유전자를 보유하는 Sf9-기반 안정한 세포주를 감염시키기 위해 사용하였다. 수확 시, 동결-해동 용해물을 벤조나제로 처리하고, 30분 동안 20,000 g에서 고속 원심분리에 의해 청정화하였다. 상청액을 293 HEK-제조된 AAV를 위해 상기 기재된 바와 같이 정제하였다.
rAAV5 및 rAAV9의 1 단계 정제. rAAV5를, 이전에 기재된 바와 같은 45, AVB 세파로스 고성능 친화성 크로마토그래피 수지 (지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용하여 청정화된 조 용해물로부터 정제하였다. rAAV9를 조 용해물로부터 포로스 캡처셀렉트™ AAV9 수지 (써모 피셔(Thermo Fisher))를 사용하여 1 단계 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 구체적으로, 청정화된 조 용매물을 0.5 ml 수지를 함유하는 칼럼에 중력 하에 적용하고, 이어서 칼럼을 10 칼럼 부피의 1xPBS, 이어서 1 ml 용리 완충제: 50 mM 시트레이트 완충제 pH 3.0-1 M NaCl로 세척하였다. 용리된 rAAV9를 0.1 ml 1 M 트리스HCl pH 8.4에 의해 즉시 중화시켰다.
rAAV 적정
rAAV 벡터의 직접 비교 분석은 각각의 바이러스 역가의 정확한 추정치를 필요로 한다. 4가지 독립적 검정을 사용하여 HEK 293 또는 Sf9 세포로부터 유래된 rAAV를 적정하였다: 1) 액적 디지털 PCR (ddPCR) 46 - 바이오라드 QX200 디지털 PCR 시스템을 사용한 참조 표준을 확립하기 위함; 2) iTaq™ 유니버셜 SYBR® 그린 슈퍼믹스 키트 (바이오라드(BioRad), 1725121) 및 qPCR 바이오라드 CFX 코네트 리얼타임 시스템을 사용하는 정량적 경쟁 PCR (QC-PCR); 3) 피코그린-기반 프로토콜 47, 및 4) 나노사이트 300 (NS-300, 말번 인스트루먼츠(Malvern Instruments), 영국 말번)을 사용한 나노입자 트래킹 분석 (NTA) - rAAV 입자의 역가 및 크기를 정량화하기 위함. 각각의 프로토콜의 조건을 확립하고, ddPCR에 의해 유래된 참조 표준을 사용한 후에, 프로토콜 2) 및 3)으로부터 계산된 역가는 항상 2배 이내이고, 작업 역가를 얻기 위해 평균내었다. 간략하게, 하기 절차를 따랐다.
ddPCR. 일련의 희석물을, 삼중으로, 반응당 1-103개 바이러스 게놈 카피의 범위에서 0.05% 플루로닉 F-68로 보충된 1x 락테이트 링거 (LR) 용액을 사용하여 제조하였다. DdPCR을 하기 프라이머를 사용하여 수행하였다: TM_CMV_F 5'-ATAGGGACTTTCCATTGACGTC-3' (서열식별번호: 52), TM_CMV_R 5'-TGATACACTTGATGTACTGCCAAG-3' (서열식별번호: 53), TM_CMV_프로브 FAM 5'- TGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCC-3' BHQ (서열식별번호: 54).
QC-PCR. 표준 곡선을 얻기 위해, rAAV-UF26 트랜스진 카세트를 각각의 플라스미드 pTR-Bac-UF26의 SmaI 소화 후에 겔-정제하였다. 회수된 DNA를 1 ng/μl의 근사치 농도로 희석하고, 정확한 농도를 큐비트(QUBIT) dsDNA 검정에 의해 결정하였다. 고도로 정제된 Sf9-, 또는 HEK 29-생산된 rAAV의 직접 QC-PCR 적정을 동일한 프라이머 세트로 및 참조 rAAV 샘플 (ddPCR)의 10배 연속 희석물 및 겔-정제된 rAAV 카세트 (QC-PCR)에 의해 제조된 표준 곡선을 사용하여 수행하였다.
피코그린-기반 검정을 기재된 바와 같이 47 표준 곡선을 보정하기 위한 람다 DNA 표준을 사용하는 Quanti-iT 피코그린 dsDNA 검정 키트 (라이프 테크놀로지(Life Technology), P7589)에 의해 수행하였다. 광학 밀도를 퍼킨 엘머 1420 멀티라벨 카운터 빅터 V에 의해 측정하였다.
NTA. NTA 분석 전에, 바이러스 스톡의 역가를 PAAG 겔 전기영동에 의해 평가하였다. 근사치 역가를 알고 있다면, LR 완충제 중에 희석된 AAV 스톡 50 μl를 표지화 완충제 (20 mM 시트르산, pH 3.5, 0.1% 플루로닉 F68, 1 mM NaCl) 및 금 나노-입자 (시그마(Sigma), Cat. # 741949)를 함유하는 표지화 믹스에 첨가하였다. RT에서 30분 인큐베이션 후에, 금-표지화된 AAV를 5x108-3x109 입자/mL의 최종 농도로 표지화 완충제에 의해 희석하였다. AAV 비함유 표지화 믹스 및 금 비함유 표지화 완충제 중 AAV를 음성 대조군으로서 사용하였다. 측정을 하기 셋팅으로 NS-300 기기를 사용하여 수행하였다: 레이저 유형 - 블루488, 카메라 수준 - 15, 프레임의 수 - 749, 기록 시간 - 30초, 기록 수 - 각각 데이터 포인트당 3. NS-300에 의해 생성된 적어도 4개의 데이터 포인트를 사용하여 AAV 역가를 계산하였다.
MALDI-TOF. VP1, VP2, 및 VP3 밴드를 SDS-PAAG로부터 절단해 내고 트립신 소화를 위해 제조하였다. 캡시드 단백질을 겔 슬라이스에서 제조업체 권장된 프로토콜을 사용하여 프로메가(Promega) (위스콘신주 매디슨)로부터의 서열분석 등급 트립신으로 소화시켰다. 간략하게, 밴드를 배경 폴리아크릴아미드 물질을 최소화하기 위해 가능한 한 근접하게 트리밍하였다. 이어서 겔 조각을 나노순수 H2O에서 5분 동안 세척하였다. 세척 단계를 2회, 이어서 각 사이클당 10분 동안 1:1 v/v 메탄올:50 mM 중탄산암모늄으로의 탈-염색 2 사이클을 반복하였다. 겔 조각을 1:1 v/v 아세토니트릴:50 mM 중탄산암모늄으로 탈수하였다. 겔 슬라이스를 재수화하고 100 mM 중탄산암모늄 용액 중 55 mM 아이오도아세트아미드의 첨가 전에 30분 동안 디티오트레이톨 (DTT) 용액 (100 mM 중탄산암모늄 중 25 mM)과 함께 인큐베이션하였다. 아이오도아세트아미드를 30분 동안 암실에서 겔 슬라이스와 함께 인큐베이션하였다. 겔 슬라이스를 H2O의 2개 사이클로 다시 세척하고, 1:1 v/v 아세토니트릴:50 mM 중탄산암모늄으로 탈수하였다. 프로테아제를 5분 동안 0.01% 프로테아제맥스 계면활성제 중 12 ng/ml 트립신으로 그들을 재수화함으로써 겔 조각 내로 구동시켰다. 이어서, 겔 조각을 0.01% 프로테아제맥스 계면활성제:50 mM 중탄산암모늄 40 μL로 오버레이하고, 1시간 동안 진탕기에서 완만하게 혼합하였다. 소화를 0.5% TFA의 첨가에 의해 정지시켰다. MS 분석을 즉시 수행하여 최소 비-특이적 절단으로 고품질 트립신 펩티드를 보장하거나 또는 샘플을 이들이 분석될 때까지 -80℃에서 동결시켰다. 18O-표지화된 소화를 프로테아제맥스 계면활성제를 제외하고는 동일한 방식으로 수행하고, 트립신을 H2 18O 중에서 제조하였다. 역 교환을 방지하기 위해, 트립신을 100℃에서 15분 동안 인큐베이션에 의해 불활성화시켰다. VP3을 H2 18O을 사용하여 소화시킨 반면 VP1을 정규 H2 16O에서 소화시켰으며; 소화 산물을 1:1 혼합하고 MALDI-TOF에 의해 분석하였다. 유사한 분석을 또한 VP2/VP3에 대해서도 수행하였다.
MALDI-TOF를 N2 레이저를 사용하여 리플렉트론, 양이온 방식으로 작동된 브루커 달토닉스 마이크로플렉스 LRF 질량 분광계 (브루커 달토닉스(Bruker Daltonics), 독일 브레만) 상에서 수행하였다. 레이저 파워를 신호를 생성하는데 필요로 하는 역치 수준으로 사용하였다. 기기를 안지오텐신 II, 안지오텐신 I, 물질 P, 봄베신, ACTH 클립 1-17, ACTH 클립 18-39, 소마토스타틴 28, 브라디키닌 단편 1-7, 레닌 기질 테트라데카펩티드 돼지의 혼합물인 커버된 질량 범위 ~700 Da - 3200 Da를 갖는 펩티드 보정 스탠다드 II (브루커 달토닉스)로 보정하였다. α-시아노-4-히드록시신남산을 매트릭스로서 사용하고, (H2O 중) 50% ACN/0.1% TFA 중 포화 용액으로서 제조하였다. 매트릭스 1 μL 및 샘플 1 μL의 할당량을 함께 완전히 혼합하고; 이의 0.5 μL를 표적 플레이트 상에 스폿팅하고 건조하도록 하였다.
시험관내 형질도입 검정. rAAV5-Bac-UF26 및 rAAV9-Bac-UF26을 2,000의 MOI로 rAAV로 감염된 C12 세포 24를 사용하여 검정하고, 5의 MOI로 Ad5로 공동-감염시켰다. 감염으로부터 48시간 후에, mApple 형광에 대해 양성인 세포를 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 점수화하였다.
AAV 주사
모든 동물 절차를 플로리다 대학교 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인받았다. 4-5주령 암컷 BALB/c (더 잭슨 래보러토리(The Jackson Laboratory), 미국 메인주 바 하버) 마우스를 실험에 사용하였다. 모든 외과적 절차를 무균 기술 및 이소플루란 가스 마취를 사용하여 수행하였다. 뇌 수술을 이전에 기재된 바와 같이 23 수행하였다. 간략하게, 마취되면, 마우스를 정위 프레임 (코프 인스트루먼츠(Kopf Instruments), 캘리포니아주 터헝가)에 배치하고, HEK-, 또는 8B-유래된 rAAV5-UF50-BC 벡터 (4.75x1011 vg/ml) 2 μl를, 0.5 μl/분의 속도로 30-40 μm의 내부 직경을 갖는 유리 마이크로피펫을 통해, 우측 선조체 (좌표: 전방-후방 -0.3 mm, 측방 -2.0 mm, 등배측-3.0 mm) 내로 주사하였다. 바늘을 뇌로부터의 인출 전에 5분 동안 제자리에 두었다.
생물발광 영상화
마우스를 이전에 기재된 바와 같이 23 영상화하였다. D-루시페린 (PBS 중 15 mg/ml, 126 mg 루시페린/kg 체중)의 복강내 주사로부터 12분 후에, 생물발광 측정을 제노겐 이비스 루미아(Xenogen IVIS Lumia) 생체내 영상화 시스템 (퍼킨엘머(PerkinElmer), 매사추세츠주 월트맨)을 사용하여 관심 영역 분석으로부터 수득하였다. 3마리의 마우스를 동시에 25 cm의 시야로 영상화하였다. 중간 비닝을 갖는 60초의 영상화 시간 및 1의 f-스톱을 카메라 셋팅에 사용하였다. 각각의 데이터 세트에 나타내어진 영상을 적절한 컬러 강도 스케일로 정규화하였다. BLI 데이터는, 카운트의 총 수가 전하-커플링된 장치 검출기에 도달할 때, 원시 데이터로서 보고하였다.
뇌 조직 제조 및 형광 영상화
마우스를 펜토바르비탈 (부타나시아-D)로 심부 마취하고, 염수 용액 10 ml, 이어서 0.1 M 포스페이트 완충제, pH 7.4 중 빙냉 4% 파라포름알데히드 (PFA) 10 ml로 상행대동맥을 통해 관류하였다. 뇌를 제거하고, 4% PFA 중에서 4℃에서 밤새 후-고정시켰다. 60 마이크로미터-두께 관상 단면을 비브라톰 스테이지 VT1000 S (레이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems), 독일 베츨라르) 상에서 절단하였다. mApple 형광을 가변 모드 레이저 스캐너 (타이푼 9200, 지이 아머샴(GE Amersham), 미국 펜실베니아주 피츠버그)에 의해 또는 도립 현미경 DMI4000 B (레이카 마이크로시스템즈, 독일 베츨라르)를 사용하여 분석하였다.
NGS 분석
NGS를 HiSeq 3000 기기 (일루미나(Illumina), 캘리포니아주 샌디에고) 및 쌍형성-단부 서열분석을 사용하여 UF ICBR 코어에 의해 수행하였다. 선택된 NGS 프로토콜의 재현성을 입증하기 위해, 모든 DNA 샘플을 이중으로 제조하였다. 유사하게, NGS 라이브러리 합성, 서열분석, 및 생물정보학의 모든 단계를 병행으로 및 이중으로 수행하였다.
HEK 293-기반 생산을 위한 참조 DNA는 rAAV 스톡을 잠재적으로 오염시킬 수 있는 모든 DNA 서열을 포함하였다: 에이치. 사피엔스(H. sapiens) 게놈 서열 (HEK 293, GRCh38.p9, ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.35 또는 RefSeq 어셈블리 수탁: GCF_000001405.35); 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 (pHelper, 진뱅크: AF369965.1); AAV2 Rep 및 AAV5 VP 단백질을 코딩하는 pACGr2c5 (rep2cap5), 및 각각의 플라스미드 백본. Sf9-기반 생산을 위해, 하기 서열을 분석하였다: 에스. 프루기페르다(S. frugiperda) 게놈 (JQCY02.1.fsa_nt.gz, 진뱅크: JQCY00000000.2); AcMNPV 게놈 (진뱅크 NC_001623.1); 에스. 프루기페르다 랍도바이러스 단리물 Sf (진뱅크 KF947078.1); FastBac 셔틀 플라스미드 백본, 및 AAV2 Rep 및 AAV5 VP를 코딩하는 서열.
PCR-프리 및 PCR-풍부화 옵션 둘 다를 함유하는 ACCEL-NGS® 2S PCR-프리 DNA 라이브러리 키트 (스위프트 바이오사이언시스(Swift Biosciences), 미시간주 앤 아버)를 활용하여 NGS 라이브러리를 생산하였다. 정제된 rAAV 입자의 심부 DNAse 처리 및 이중-가닥 (ds) DNA 합성을 사소한 변형과 함께 문헌 [Lecomte et al. 26]에 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게, 4x1011개의 벡터 게놈 (vg)-함유 입자를 베이스라인 제로(Baseline ZERO) 및 플라스미드-세이프(Plasmid-Safe) 엑소뉴클레아제에 의해 광범위하게 처리하고, 이어서 프로테이나제 K 및 RNAseA 처리하였다. DNA를 2:1의 비드:DNA 비를 사용한 매그-바인드 알엑스엔퓨어 플러스 키트(Mag-Bind RxnPure Plus Kit) (오메가 바이오-텍(Omega Bio-Tek), 조지아주 노크로스)를 사용하여 정제하였다. DNApolI로의 제2 가닥 합성 후에, DNA를 코바리스 기기를 사용하여 초음파처리하였다. DNA 전단을 위한 하기 셋팅을 사용하였다: 표적 크기 400 bp, 피크 증분 파워 - 175 W, - 듀티 팩터 - 10%, 버스트당 사이클 - 200; 시간 - 38초, 물 수준 - 15, 물 온도 - 7.6-7.8℃, 및 반응 부피 - 47 μL. 전단된 입력 dsDNA 및 합성된 NGS 라이브러리의 프로파일은 도 14에 제시된다. Sf9 및 HEK의 293 세포로부터 유래된 rAAV DNA의 샘플은 NGS 라이브러리 제조 동안 각각의 스테이지에 대한 유사한 프로파일 및 품질을 입증하였다. 라이브러리 제조의 모든 스테이지에서, DNA 품질을 테이프 스테이션 (애질런트) 및 큐비트 (써모 피셔 사이언티픽)에 의해 모니터링하였다. PCR-프리 NGS 라이브러리의 합성을 위해, ds DNA 220 ng을 200 bp 옵션 입력의 표적 크기로 전단하였다. PCR-풍부화된 라이브러리를 위해, 라이게이션 단계 2 후의 10%의 DNA를 제조업체의 권장에 따라 8 사이클 동안 증폭시켰다. 최종적으로, 모든 라이브러리를 1x매그-바인드 비드로 정제하였다.
생물정보학 분석
생물정보학 작업흐름의 흐름도는 도 15에 도시된다. Fastq 파일을 그의 디폴트 구성에서 슈퍼컴퓨팅 클러스터 상에서 사용되도록 변형된 전용 오픈 소스 소프트웨어 콘타벡트(ContaVect) v2.0으로 분석하였다 26. 콘타벡트의 코드를 작업 스케줄러에 의해 승인된 배치 환경에서 최대 효율 및 처리량을 위한 blastn 및 bwa 툴의 실시에 적절하게 규모화하도록 적합화하였다. 변화 중 하나는 컴퓨팅 노드에 대한 CPU 코어의 총 수와 동등한 스레드의 수로 항상 blastn 및 bwa를 실행할 수 있는 콘다벡트의 제한과 관련되었다. 이러한 가정이 공유된 컴퓨팅 환경에서 개인 워크스테이션에 대해 사용될 때 일부 경우에 유효할 수 있을지라도 스레드의 수는 일반적으로 배치 작업에 대해 요구된 CPU 코어의 수와 동등하거나 또는 가상 기계 내에서 이용가능할 수 있어야 한다. 달리, 해당 프로그램의 효율은 분석의 처리량을 크게 감소시키는 것을 겪는다. 새로운 변형은 스레드 수가 콘타벡트 구성 파일에서 0으로 설정될 때 호환성을 위해 구 모델의 사용을 여전히 가능하게 하지만, 현재 콘타벡트는 스레드의 명시된 수로 blastn 및 bwa를 실행할 수 있다. 하나의 스레드는 디폴트에 의해 사용된다. 게다가, X11 환경 없이 클러스터 노드 상에서 실행될 때 콘타벡트가 실패 없이 매트플롯립을 사용하여 그래프를 생성하도록 하는 MATPLOTLIBRC 환경 변수를 통해 환경으로 보내어질 수 있는 임의의 구성 파일이 추가되어 있다. 상기 변형과 함께, 분석을 UF 리서치 컴큐핑 하이퍼게이터 슈퍼컴퓨터 상에서 성공적으로 완료하였고 데이터에 대한 콘타벡트의 실행 시간을 수일에서 수시간으로 감소시켰다. 모든 변형을 하기 저장소에서 콘타벡트 저작자에게 GitHub 코드 풀 요청으로서 제출되어 있다: github.com/a-slide/ContaVect 및 github.com/a-slide/pyDNA. 모든 기재된 적합화는 소스 코드 내로 인정되고 통합되어 있다. SNP 변이체를 미니콜러 소프트웨어, 높은 깊이 커버리지로의 서열의 분석을 위해 활용된 자바-기반 애플리케이션 (github.com/lindenb/jvarkit/wiki/MiniCaller)에 의해 BAM 파일로부터 검색하였다. HEK 293, 또는 Sf9 rAAV 라이브러리, 뿐만 아니라 양성 대조군 라이브러리에 대한 미니콜러-생성된 VCF 파일 (각각 이중으로)을 진뱅크 참조 분자에 대해 정렬하였다. VCF 파일의 파싱을 CSV 파일을 생성하는 피톤 스크립트에 의해 수행하였다 (nbviewer.ipython.org/github/a-slide/iPython-Notebook/blob/master/Notebooks/VCF_analysis.ipynb). VCF 파일 및 CSV 파일은 드리아드 디지털 저장소: bio.rc.ufl.edu/secure/zolotukhin/genther/; username: "genther", password: "KrAkkegZ8F"로부터 이용가능하다.
참고문헌
Figure pat00013
Figure pat00014
Figure pat00015
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다른 실시양태
본 명세서에 개시된 모든 특색은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특색은 동일한, 등가의, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적 특색에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특색은 단지 등가 또는 유사한 특색의 일반적 시리즈의 예이다.
상기 기재로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있으며, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서, 다양한 용법 및 조건에 적응시키기 위해 개시내용의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 다른 실시양태가 또한 청구범위 내에 있다.
등가물
여러 본 발명의 실시양태가 본원에 기재되고 예시되어 있지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 기능을 수행하고/거나 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 고려할 것이고, 각각의 이러한 변경 및/또는 변형은 본원에 기재된 본 발명의 실시양태의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질, 및 구성이 비제한적인 것을 의도하고, 실제 파라미터, 치수, 물질, 및/또는 구성이 본 발명의 교시가 사용되는 구체적인 적용 또는 적용들에 따라 좌우될 것임을 용이하게 인지할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 통상적인 실험을 사용하여, 본원에 기재된 구체적인 본 발명의 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시양태는 단지 예로서 제시된 것이고, 첨부된 청구범위 및 이에 대한 등가물의 범주 내에서, 본 발명의 실시양태가 구체적으로 기재되고 청구된 바와 달리 실시될 수 있음을 이해하여야 한다. 본 개시내용의 본 발명의 실시양태는 본원에 기재된 각각의 개별적인 특색, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법에 관한 것이다. 게다가, 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법이 상호 불일치하지 않는 경우에, 둘 이상의 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법의 임의의 조합은 본 개시내용의 발명의 범주 내에 포함된다.
본원에 정의되고 사용된 바와 같은 모든 정의는 사전적인 정의, 참조로 포함된 참고문헌의 정의, 및/또는 정의된 용어의 통상적인 의미에 대해 제어하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 대상과 관련하여 참조로 포함되고, 일부 경우에 그 문헌의 전문이 포함될 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같은 단수 용어는, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같은 어구 "및/또는"은, 결합된 요소, 즉, 일부 경우에는 결합하여 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소 중 "어느 하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 열거된 복수의 요소는 동일한 방식으로, 즉 결합된 요소의 "하나 이상의"로 이해되어야 한다. 다른 요소는 구체적으로 식별되는 요소와의 관련 또는 비관련에 불문하고 "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별되는 요소 외에 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 지칭은, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때, 한 실시양태에서, A 단독 (임의적으로 B 이외의 요소를 포함함); 다른 실시양태에서, B 단독 (임의적으로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서, A 및 B 둘 다 (임의적으로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같은 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포함의 의미로, 즉 요소의 수 또는 목록 중, 적어도 하나의 포함, 뿐만 아니라 하나 초과, 및 임의적으로, 추가의 열거되지 않은 항목을 포함하는 것으로 해석될 것이다. "중 단지 하나" 또는 "중 정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용될 때, "로 이루어진"과 같이 달리 명백하게 나타낸 용어만이 요소들의 수 또는 목록 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "또는"은, 단지 "어느 하나", "중 하나", "중 단지 하나", 또는 "중 정확히 하나"와 같은 배제적 용어가 사용될 때만 배제적 대안 (즉, "하나 또는 나머지 하나, 그러나 둘 다는 제외")을 나타내는 것으로 해석될 것이다. "로 본질적으로 이루어진"은, 청구범위에 사용될 때, 특허법 영역에서 사용되는 바와 같은 통상의 의미를 가질 것이다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 어구 "적어도 하나"는 요소의 목록에 있는 요소들 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 요소를 의미하나, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하는 것은 아니며, 요소의 목록에서 요소의 임의의 조합을 배제하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한 어구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 식별된 요소 이외의 요소가 구체적으로 식별된 그러한 요소와 관련되든 관련되지 않든 임의적으로 존재할 수 있다는 것을 가능하게 한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는, 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는, 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 한 실시양태에서, B가 존재하지 않는, 임의적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A (및 임의로 B 이외의 요소 포함함); 또 다른 실시양태에서, A가 존재하지 않는, 임의적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의적으로 A 이외의 요소 포함함); 또 다른 실시양태에서, 임의적으로로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A, 및 임의적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의적으로 다른 요소 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
명백하게 달리 나타내지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 행위가 언급되어 있는 순서에 제한되지는 않는 것으로 또한 이해되어야 한다.
청구범위에서, 뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 연결 어구 예컨대 "포함하는", "비롯한", "보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "유지하는", "로 이루어진" 등은 개방형, 즉 포함하지만 이에 제한되지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 단지 연결 어구 "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진"은 문헌 [United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03]에 제시된 바와 같이, 각각 폐쇄형 및 반-폐쇄형 연결 어구일 것이다. 개방형 연결 어구 (예를 들어, "포함하는")를 사용하여 이러한 문헌에 기재된 실시양태가 또한 고려되며, 대안적 실시양태에서, "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진" 특색이 개방형 연결 어구에 의해 기재되는 것으로서 인지되어야 한다. 예를 들어, 개시내용이 "A 및 B를 포함하는 조성물"을 기재하는 경우에, 개시내용은 또한 대안적 실시양태 "A 및 B로 이루어진 조성물" 및 "A 및 B로 본질적으로 이루어진 조성물"을 고려한다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Florida Research Foundation, Inc. <120> METHOD OF ENHANCING BIOLOGICAL POTENCY OF BACULOVIRUS SYSTEM-PRODUCED RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS <130> U1197.70082WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/323,684 <151> 2016-04-16 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is c or t <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is g or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is g or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, or t <400> 1 nnntntatgn n 11 <210> 2 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 cauuguaugu c 11 <210> 3 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 3 ucguuuaugg a 11 <210> 4 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 4 caguuuaugg u 11 <210> 5 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 5 cauuguaugg u 11 <210> 6 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 6 uaguguaugc u 11 <210> 7 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 7 cauuguaugc u 11 <210> 8 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 8 ucuuuuaugu c 11 <210> 9 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 9 uguuuuaugu c 11 <210> 10 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 10 uaguuuaugu c 11 <210> 11 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 11 uaguguaugu c 11 <210> 12 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, or t <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is g or t <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is c or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is c or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is g or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is c or g <400> 12 nnnnnnatgn n 11 <210> 13 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 13 uagcgcaugg c 11 <210> 14 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 14 ugguauaugg c 11 <210> 15 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 15 uaguuuaugg c 11 <210> 16 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 16 caguguaugg c 11 <210> 17 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 17 uaguguaugg c 11 <210> 18 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 18 uauuguaugg c 11 <210> 19 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 19 cauuguaugg c 11 <210> 20 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 20 ccguuuaugg g 11 <210> 21 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 21 acuuguaugg g 11 <210> 22 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 22 cauuuuaugg g 11 <210> 23 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 23 uaguguaugu c 11 <210> 24 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 24 uaguuuaugu c 11 <210> 25 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 25 uguuuuaugu c 11 <210> 26 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 26 ucuuuuaugu c 11 <210> 27 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 27 uaguguaugg g 11 <210> 28 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 28 uaguuuaugg g 11 <210> 29 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 29 uguuuuaugg g 11 <210> 30 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 30 ucuuuuaugg g 11 <210> 31 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 31 uaguguaugu c 11 <210> 32 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 32 uaguuuaugu c 11 <210> 33 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is g or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is g or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is g or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is c or g <400> 33 tnntntatgn n 11 <210> 34 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 34 uaguguaugu c 11 <210> 35 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 35 uaguuuaugu c 11 <210> 36 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 36 uguuuuaugu c 11 <210> 37 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 37 ucuuuuaugu c 11 <210> 38 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 38 uaguguaugg g 11 <210> 39 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 39 uaguuuaugg g 11 <210> 40 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 40 uguuuuaugg g 11 <210> 41 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 41 ucuuuuaugg g 11 <210> 42 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 42 uaguguaugg c 11 <210> 43 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 43 uaguuuaugg c 11 <210> 44 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 44 uguuuuaugg c 11 <210> 45 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 45 ucuuuuaugg c 11 <210> 46 <211> 11 <212> RNA <213> Adeno-associated virus 5 <400> 46 guagucaugu c 11 <210> 47 <211> 11 <212> RNA <213> Adeno-associated virus 9 <400> 47 ccagguaugg c 11 <210> 48 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 48 Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His 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Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu 1 5 10 15 Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly 35 40 45 Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val 50 55 60 Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp 85 90 95 Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn 100 105 110 Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe 115 120 125 Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile 130 135 140 Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser 145 150 155 160 Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln 165 170 175 Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr 180 185 190 Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala 195 200 205 Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp 210 215 220 Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro 225 230 235 240 Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp 245 250 255 Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr 260 265 270 Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln 275 280 285 Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val 290 295 300 Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr 305 310 315 320 Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp 325 330 335 Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys 340 345 350 Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr 355 360 365 Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser 370 375 380 Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn 385 390 395 400 Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser 405 410 415 Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp 420 425 430 Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln 435 440 445 Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp 450 455 460 Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly 465 470 475 480 Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu 485 490 495 Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr 500 505 510 Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile 515 520 525 Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu 530 535 540 Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg 545 550 555 560 Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser 565 570 575 Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro 580 585 590 Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp 595 600 605 Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met 610 615 620 Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn 625 630 635 640 Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser 645 650 655 Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu 660 665 670 Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln 675 680 685 Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp 690 695 700 Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu 705 710 715 720 Thr Arg Pro Leu <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 56 Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp Gln Tyr Leu Tyr Arg 1 5 10 <210> 57 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 57 Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met Gly Gly 1 5 10 15 Phe Gly Leu Lys 20

Claims (21)

  1. 변형된 코작 서열 및 아데노-연관 바이러스 (AAV) VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이며, 여기서 변형된 코작 서열은 서열식별번호: 2-11, 서열식별번호: 13-32, 및 서열식별번호: 34-45로부터 선택되는 것인 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 변형된 코작 서열이 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9인 핵산.
  3. 제1항에 있어서, VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질이 AAV5 혈청형으로부터 유래되는 것인 핵산.
  4. 제1항에 있어서, 프로모터 서열을 추가로 포함하는 핵산.
  5. 제4항에 있어서, 프로모터 서열이 폴리헤드린 (polh) 프로모터 서열인 핵산.
  6. 제1항에 있어서, 변형된 코작 서열이 VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈을 함유하는 것인 핵산.
  7. 제6항에 있어서, VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈이 AUG인 핵산.
  8. 제1항에 있어서, 핵산이 바이러스 입자에 패키징되는 것인 핵산.
  9. 제8항에 있어서, 바이러스 입자가 바큘로바이러스 입자인 핵산.
  10. 제1항에 있어서, 변형된 코작 서열이 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 또는 서열식별번호: 32인 핵산.
  11. 제1항에 있어서, VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질이 AAV8 혈청형으로부터 유래되는 것인 핵산.
  12. 제1항에 있어서, 변형된 코작 서열이 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 38, 또는 서열식별번호: 42인 핵산.
  13. 제1항에 있어서, VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질이 AAV9 혈청형으로부터 유래되는 것인 핵산.
  14. 제1항에 있어서, 변형된 코작 서열이 서열식별번호: 9인 핵산.
  15. 제1항에 있어서, 변형된 코작 서열이 서열식별번호: 42인 핵산.
  16. 제1항의 핵산을 포함하는 곤충 세포.
  17. 제16항에 있어서, 핵산이 곤충 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 곤충 세포.
  18. 하기 단계를 포함하는, 곤충 세포에서 재조합 AAV (rAAV)를 생산하는 방법이며, 여기서 rAAV는 AAV5 혈청형, AAV8 혈청형, 또는 AAV9 혈청형으로부터 유래되는 것인 방법:
    a) 곤충 세포를 하기로 형질감염시키는 단계:
    i) 제1항의 핵산을 포함하는 바큘로바이러스;
    ii) AAV Rep 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 바큘로바이러스;
    iii) 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 관심 유전자를 플랭킹하는 2개의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 바큘로바이러스;
    b) rAAV를 생산하기에 적합한 조건 하에 곤충 세포를 배양하는 단계; 및
    c) 곤충 세포로부터 rAAV를 회수하는 단계.
  19. 제18항에 있어서, 곤충 세포가 Sf9 세포인 방법.
  20. 하기 단계를 포함하는, 곤충 세포에서 재조합 AAV (rAAV)를 생산하는 방법이며, 여기서 rAAV는 AAV5 혈청형, AAV8 혈청형, 또는 AAV9 혈청형으로부터 유래되는 것인 방법:
    a) 제16항의 곤충 세포를, 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 관심 유전자를 플랭킹하는 2개의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 형질감염시키는 단계;
    b) rAAV를 생산하기에 적합한 조건 하에 곤충 세포를 배양하는 단계; 및
    c) 곤충 세포로부터 rAAV를 회수하는 단계.
  21. 제20항에 있어서, 곤충 세포가 Sf9 세포인 방법.
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