CN1657632A - 表达人类cyp2j2反义基因的重组腺相关病毒及其制备方法 - Google Patents

表达人类cyp2j2反义基因的重组腺相关病毒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒及其制备方法，本发明所提供的该重组腺相关病毒，是从人类CYP2J2 cDNA长1509bp，编码含503个氨基酸的蛋白质，利用PCR法从人类白细胞DNA中克隆人类CYP2J2 cDNA，通过三种质粒磷酸钙共转染法包装制备含反义目的基因的重组腺相关病毒并纯化，制备的重组腺相关病毒转染不同种类的人肿瘤细胞系，它能明显抑制各种肿瘤细胞的增殖和迁移、促进肿瘤细胞的凋亡，抑制在体肿瘤瘤体的生长和转移。因此，确定，CYP2J2的选择性抑制剂和表达反义CYP2J2基因的重组腺相关病毒是肿瘤治疗的潜在药物。

Description

表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒及其制备方法
                     发明领域
本发明涉及能表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒重组体(rAAV-anti2J2)的构建和制备方法，更具体地说涉及人类CYP2J2基因的克隆及含反义CYP2J2基因的重组腺相关病毒重组体的包装制备方法，和该重组腺相关病毒重组体以及CYP2J2选择性抑制剂治疗肿瘤的药学用途。
                     背景技术
随着人们对细胞色素P450(CYP)氧化酶系广泛研究和认识，其在机体生理和病理生理方面所起的作用日益受到重视，尤其是20年前发现的花生四烯酸(AA)的CYP代谢途径，在人体中的生物学及病理生理学作用成为目前研究的热点。AA-CYP表氧化酶代谢途径能将花生四烯酸代谢成4种不同的环氧化二十碳三烯甘油酸(Epoxyeicosatrienoic Acids，EETs)(5，6-，8，9-，11，12-，14，15-EETs)。CYP表氧化酶包括2C和2J两类，已有研究显示，2C在生物体内广泛分布，尤其在肝脏中表达最丰富，在血管中亦存在表达；目前已发现2J的6个克隆，其中在人类仅发现了2J2，其在心脏和血管内皮细胞表达最丰富。我们和国外学者已有研究发现EETs在调节心血管系统稳态中发挥着重要作用，包括调节血压、对心脏和血管内皮细胞的保护及抗凋亡作用。然而我们的研究发现表氧化酶基因在人类肿瘤组织中选择高表达，并能促进肿瘤细胞的增殖转移和抗肿瘤细胞的凋亡。这一发现对肿瘤的治疗具有极其积极的意义。肿瘤是现代人群的多发病及常见病，预后差、死亡率高，在我国乃至世界一直是主要的致死原因，它是一种多基因、多步骤、多阶段调控的慢性疾病。目前该疾病用一般药物不能取得良好的治疗效果，而随着分子生物学理论和技术的发展，基因治疗的出现，让我们看到肿瘤治疗新的曙光。基因治疗已成为21世纪重要的医药产业，尚有很多有待克服的缺点，尤其是关于基因治疗载体的选择。
为了能使肿瘤的基因治疗真正实现，我们将反义人类CYP2J2cDNA与重组腺相关病毒载体重组构建，并经检测已获得了可以满足治疗要求的高滴度病毒，在动物实验中也已证实了其可以有抑制肿瘤生长作用，从而有希望真正满足临床治疗的需要。此外研究了AA-CYP表氧化酶的抑制剂抑制恶性肿瘤增殖的作用及其机制。阐述了AA-CYP表氧化酶在人类肿瘤中选择性高表达及其抑制剂抑制恶性肿瘤增殖的药学用途。
                     发明内容
本发明人已经成功将CYP2J2 cDNA反向插入真核表达载体pXXUF1中构成重组质粒pXXUF1-anti2J2。之后，将pXX2、pXX6、pXXUF1-anti2J2用钙磷共转染法转入293细胞包装制备能表达人反义CYP2J2基因的重组腺相关病毒(rAAV-anti2J2)，采用肝素柱纯化，斑点杂交法测定滴度。另外，将包装制备的重组腺相关病毒转染不同种类的人肿瘤细胞系，经实践证明含反义CYP2J2的重组腺相关病毒转染能非常显著地抑制肿瘤细胞增殖和迁移，促进肿瘤细胞的凋亡，而将转染了rAAV-anti2J2的细胞系导入裸鼠皮下发现rAAV-anti2J2能显著抑制体内瘤体的生长，此外CYP2J2的选择性抑制剂亦起到了同样的作用。这为开发肿瘤治疗新药提供了全新的思路和方向。
所以，本发明的第一个目的是提供含有反义人CYP2J2基因的重组腺相关病毒。
本发明的第二个目的是提供含有反义人CYP2J2基因的重组腺相关病毒的包装和制备过程。
本发明的第三个目的是提供利用CYP2J2选择性抑制剂抑制肿瘤细胞增殖及其治疗肿瘤的实验方法和结果。
本发明的第四个目的是提供利用含反义人CYP2J2基因的重组腺相关病毒治疗肿瘤的实验方法和结果。
为了实现本发明的目的，发明人设计的一种表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒及其制备方法，本发明所提供的该重组腺相关病毒，是从人类CYP2J2 cDNA长1509bp，编码含503个氨基酸的蛋白质，利用PCR法从人类白细胞DNA中克隆人类CYP2J2 cDNA，通过三种质粒磷酸钙共转染法包装制备含反义目的基因的重组腺相关病毒并纯化，制备的重组腺相关病毒转染不同种类的人肿瘤细胞系，它能明显抑制各种肿瘤细胞的增殖和迁移、促进肿瘤细胞的凋亡，抑制在体肿瘤瘤体的生长和转移。因此，确定，CYP2J2的选择性抑制剂和表达反义CYP2J2基因的重组腺相关病毒是肿瘤治疗的潜在药物。
本发明重组腺相关病毒包括的三种质粒：
(1)pXX2：为包装质粒，含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列。并在上游和下游各插入一个p5启动子，使表达效率可以提高15倍，提供rAAV复制所必须的Rep蛋白；
(2)pXXUF1：真核表达载体，含CMV启动子，有较强的表达效率，其含有一多克隆NotI位点，可以连接不同的目的基因，pXXUF1反向连接人CYP表氧化酶基因，该载体含有rAAV转基因表达所必须的末端重复序列(ITRs)，负责病毒的复制和病毒外壳的包被并携带目的基因；
(3)pXX6：为辅助质粒，删除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1 RNA基因，所表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激rAAV基因的转录和翻译，保证rAAV产量；
(4)以上三种质粒经磷酸钙沉淀法共转染293细胞，即可在293细胞内形成高滴度的含目的基因的rAAV颗粒。
本发明重组腺相关病毒的制备，其步骤：
(1)XX2质粒——提供腺相关病毒包装所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列，和pXX6质粒——提供刺激腺相关病毒复制和转录所必需的腺病毒E1A、E2A和VAI RNA基因；
(2)含腺相关病毒基因组的真核表达载体pXXUF1，在该真核载体中腺相关病毒缺失cap蛋白和rep蛋白编码区，并插入人类CYP2J2反义基因，形成重组质粒pXXUF1-anti2J2；
(3)步骤1)中的pXX2、pXX6和步骤2)中的pXXUF1-anti2J2通过磷酸钙沉淀法共转染293细胞，适时回收，纯化、斑点杂交法检测其病毒滴度；
(4)步骤3)中回收纯化的病毒转染肿瘤细胞，检测其表达及生物学活性。
该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工，再经分子生物学方法包装复制，并经纯化而成。
它包括有表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒和药学上所接受的载体或赋形剂。
本发明所述的一种表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒，其选用CYP表氧化酶选择性抑制剂和CYP表氧化酶代谢花生四烯酸所形成的表氧化产生表氧化二十烷烯酸的拮抗剂，该化学制剂是人工化合而成并具有选择性抑制CYP表氧化酶系活性或阻断表氧化二十烷烯酸的作用，能够控制肿瘤增殖，而对细胞并无毒性作用。
本发明所述的一种表达人类CYP212反义基因的重组腺相关病毒，已保藏于武汉大学内中国典型物保护中心，保藏日期：2004年6月30日，保藏编号：CCTCCNO：V200411分类命名：表达人类细胞色素P4502J2反义基因的重组腺相关病毒。
本发明进一步详细描述：
为了获得人CYP2J2基因，本发明人首先根据GeneBank报道的CYP2J2基因序列设计了扩增CYP2J2 cDNA片段的特异性引物，用酚-氯仿抽提的方法从人白细胞中提取基因组DNA并以其为模板进行PCR(试剂盒购自日本TaKaRa公司)。PCR仪购自英国TECONE公司。并将产物与pXXUF1反向相连构成重组质粒pXXUF1-anti2J2，导入寄主细胞即大肠杆菌，获得阳性克隆。
重组腺相关病毒包装需要三种质粒，即(1)pXX2：为包装质粒，含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列。并在上游和下游各插入一个p5启动子，使表达效率可以提高15倍；(2)pXX6：为辅助质粒，删除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1 RNA基因，它们表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激AAV基因的转录和翻译，保证AAV的产量；(3)pXXUF1-anti2J2：反向连接人CYP2J2基因的真核表达载体，所用的是CMV启动子，有较强的表达效率。该载体含有rAAV转基因表达所必须的末端重复序列(ITRs)，负责病毒的复制和病毒外壳的包被并携带目的基因。我们按摩尔比1∶1∶1将pXX2、pXX6、pXXUF1-anti2J2用钙磷转染法转入293细胞。转染后48-72小时后，收获293细胞，反复冻溶细胞3次，病毒即释放入上清液中，采用肝素柱纯化，斑点杂交法测定滴度，即获得含反义人2J2基因的重组腺相关病毒。
然后为了证实CYP表氧化酶在肿瘤发生发展中的作用及其选择性抑制剂和含反义2J2基因的重组腺相关病毒对肿瘤的治疗作用。首先研究开发CYP表氧化酶在人类肿瘤组织中选择性高表达，并证明rAAV-anti2J2能显著降低肿瘤细胞2J2的表达。而转染反义CYP表氧化酶基因(rAAV-anti2J2)和加用CYP表氧化酶抑制剂17-ODYA可显著抑制肿瘤细胞增殖，为基础状态下的50％以下(P＜0.01)；而转染rAAV-CYP2J2能明显促进肿瘤细胞的增殖，细胞增殖数是基础状态即转染rAAV-GFP和未转染细胞的2～3倍(P＜0.01)。同样将rAAV-anti2J2转染人舌鳞癌细胞株Tca-8113，然后移植到裸鼠皮下，部分模拟肿瘤细胞在体内的生长过程，测量肿瘤大小，绘制肿瘤体积生长曲线。证明rAAV-anti2J2转染能明显抑制肿瘤的生长。
此外，对肿瘤组织微血管密度测定发现，rAAV-anti2J2转染能显著降低瘤体内微血管密度。
同样rAAV-anti2J2转染还能显著降低肿瘤细胞的迁移能力。促进肿瘤细胞的凋亡。
上述结果显示rAAV-anti2J2及CYP表氧化酶抑制剂(17-ODYA)具有抑制肿瘤增殖转移、促进肿瘤细胞凋亡的作用，可用于肿瘤治疗。表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒(rAAV-anti2J2)的构建成功，在生物体内可长期高效表达，从基因水平上阻断CYP2J2基因的转录与翻译，使CYP2J2表达减少，其作用更强，更为彻底。将其与表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒(rAAV-anti2J2)和CYP表氧化酶抑制剂用于临床后，必将在肿瘤等严重危害人类健康的疾病治疗中发挥极其主要的作用。
本发明的优越性在于，其研究开发的重组腺相关病毒载体克服了其他基因表达载体所难以克服的缺点，它可以携带目的基因转染分裂期和非分裂期细胞(即具有广泛的转基因范围)、无副作用(无免疫源性)、感染效率高、能驱动目的基因在体内长期表达，而且成功地解决了无腺病毒污染的体外大量复制问题。
                       附图说明
从下面给出附图，结合本发明的上面和其他目的和特征将变得明了。
图1显示了2J2的序列(取自GeneBank)，浅色部分为CDNA开放阅读框序列；
图2是显示pXXUF1-anti2J2的质粒构成；
图3显示了腺相关病毒的核苷酸序列及具体分区；
图4是显示腺相关病毒的基因组构造图；
图5是显示腺相关病毒的ITR序列及二级结构图；
图6是显示腺相关病毒的转录和翻译(一)；
图7是显示腺相关病毒的转录和翻译(二)；
图8是显示pXX2、pXX6质粒图谱构成；
图9是显示pXXUF1质粒构成(注：该质粒构成图只显示质粒的主要部分，实际上这两种质粒已加工为5000-7000bp的环状结构，其余部分无重要性，故不写入)；
图10是显示CYP表氧化酶基因(rAAV-2J2)转染后的有效表达和反义基因(rAAV-anti2J2)转染后显著抑制肿瘤细胞CYP2J2表达，其中图10A.CYP表氧化酶基因(rAAV-2J2)转染后的有效表达和反义基因(rAAV-anti2J2)转染后显著抑制肿瘤细胞CYP2J2表达。A，分别用rAAV-2J2和rAAV-anti2J2转染肿瘤细胞后种植于裸鼠皮下形成移植瘤，32天后从移植瘤组织中提取的蛋白进行CYP-2J2 WesternBlot结果；B，分别用rAAV-2J2和rAAV-anti2J2转染肿瘤细胞后直接提取的蛋白进行CYP-2J2 Western Blot结果，这两个结果均显示rAAV-2J2转染能在肿瘤细胞中有效表达，而rAAV-anti2J2转染能非常显著地抑制或阻断CYP2J2表达。这与CYP2J2引起肿瘤恶性增殖和rAAV-anti2J2抑制肿瘤恶性增殖密切相关；
图11是显示CYP表氧化酶对四肿瘤细胞系增殖的影响；
图12是显示转基因后肿瘤生长曲线；
图13是显示转染基因后肿瘤组织微血管密度结果；
图14是显示CYP表氧化酶对肿瘤细胞侵袭能力的影响。
                      具体实施方式
实施例1CYP2J2 cDNA的克隆及pXXUF1·anti2J2重组质粒的制备
为了克隆人CYP2J2 cDNA根据公开的CYP2J2基因序列(图1)首先设计了可扩增CYP2J2 cDNA的PCR引物：上游引物：5’-GCCCGGAATTCAAAATGATTCTCAAC-3’；下游引物：5’-GGCGCACAAGCTTTCAAATAAGAGTATAAC-3’。由武汉生物合成公司合成。用酚-氯仿抽提的方法从人白细胞中提取基因组DNA并以其为模板进行PCR(试剂盒购自日本TAKARA公司)。PCR仪购自英国TECONE公司。并将产物与pXXUF1反向相连，构成重组质粒pXXUF1-anti2J2。质粒图如图2。
实施例2 rAAV-anti2J2重组病毒的包装、回收与纯化
一、天然腺相关病毒(AAV)及重组腺相关病毒(rAAV)载体的特点：腺相关病毒是一种动物单链DNA病毒，它属于细小病毒科，细小病毒亚科，依赖病毒属，自然缺陷、无包被和无致病原性。
1、AAV基因组是一个线性、单链(ssDNA)分子，含4680个核苷酸(序列如图3)，其特点在于：
1)其基因组由4个开放阅读框(ORF)组成，分称rep区、lip区、inf区和cap区(见图3、图4)。位于基因组DNA左端的一个大ORF由于移码突变或缺失会阻止DNA复制，因而被称为rep区，。右端的一个大ORF(cap)编码合成3种外壳蛋白。另有两个小ORF位于基因组DNA的中央区，即inf区和lip区，具体功能尚不清。
2)在分子单链每个末端含有一个145个碱基末端重复序列(ITR)(见图3)。ITR序列折叠成发卡结构作为DNA复制起始和包装重组AAV基因组为感染性的病毒颗粒所需的唯一已知顺式作用元件(见图5)。
3)腺相关病毒的复制和转录调节相当复杂，按有无辅助病毒的共转染分，有增殖性和潜伏性两种表达方式(如图6)。
在AAV的增殖性表达中，可转录生成6种mRNA，分别由启动子P5、P19、P40启动合成(如图7)。在腺病毒(Ad)共转染的情况下，Ad的E1A基因负责AAV基因表达的反式激活；Ad E2A基因编码单链DNA结合蛋白，可刺激AAV启动子所启动的转录，还可促进AAV转录后从胞核向胞质转运；另外Ad VA1 RNA可能也有利于AAV蛋白合成的起始。而AAV也能够正调节和负调节自身基因和辅助病毒基因的表达。AAV的rep基因能够正调节和负调节P5、P19、P40启动子所启动的转录，在有Ad的情况下，rep基因产物行使正调节功能，这是AAV基因大量合成所必须的；而在无辅助病毒共转染的情况下，rep基因产物则起负调节作用。
在无辅助病毒的情况下，AAV DNA以双链形式整合到宿主细胞基因组中，在那里以潜伏状态持续存在，形成AAV的潜伏感染。AAV整合的特异位点是在人染色体的19q13.3-19q ter上。Rep基因产物除了负调节作用外，还可识别和结合特异的整合位点，即GGTC序列，并介导了ITR与整合位点的重组。而腺病毒的感染可使其进入增殖感染状态。
2、AAV作为基因治疗的载体。
AAV是目前已知的唯一能够在宿主基因组特异染色体位点整合的真核细胞病毒。这个发现使基因治疗产生了新的希望，与非整合载体(如腺病毒为基础的载体)相比，AAV载体不仅能够更持续稳定地表达转基因，而且能够减少理论上由于转基因的随机整合导致的插入突变几率。我们使用的这一套载体系统是将天然腺相关病毒和腺病毒用分子生物学方法经一系列剪切和修饰而成，它们保留了腺相关病毒复制和转录所必需的部分，也保留了腺病毒的晚期基因辅助成份，其他多余的部分均已删除，既能实现病毒长期稳定的潜伏感染，又能避免腺病毒的致病危险，而且腺病毒晚期基因的表达可以保证被克隆基因的表达效率。这一载体系统的构成如下：
pXX2：(如图8)保留了AAV的cap基因和rep基因(此时得到pACG-2)，并在下游区域又插入了一个p5启动子(在原来区域用XbaI和PstI切下，再连接到pACG-2的适当位置)。
PXX6：(如图8)在腺病毒改造质粒pBH10(已切掉了E1、E3基因和包装信号)上用PmeI和SgfI切下一个8kb的片段(得到pXX5)，而pXX6则是由pXX5上用ClaI和SalI切下一段克隆入pBS中得到的，仅仅留下E2A、E4和VA编码区。
pXXUF1(如图9)：rAAV包装所用的质粒pXXUF1含有CMV启动子(箭头)所驱动的人gfp基因，它是将腺相关病毒的编码基因全部删除后再由NotI位点导入的。为了便于基因克隆和表达，又将其加工成环状。
二、rAAV-anti2J2重组病毒的包装与回收
pXX2、pXX6、pXXUF1-anti2J2质粒的大量提取，所用大提试剂盒购自Promega公司。方法依说明书所述。
将293细胞(人肾母胚胎肿瘤细胞系)传入数个150mm培养板中，传代培养需要0.25％胰蛋白酶、高糖DMEM培养基、新生小牛血清(购自Gibco公司)。待细胞生长到60％到70％聚集度时，按85μg DNA/150mm培养盘的总量，按摩尔比1∶1∶1(质量比为1.7∶3.8∶1)用钙磷转染法转入293细胞。首先分别将pXX2、pXX6、pXXUF1-anti2J2质粒加入一无菌的250ml培养瓶中，然后依次加入2.5MCaCl2溶液(160μl/盘)和无菌去离子水，最后加入2×BBS(pH6.95，1.6ml/盘)，逐滴加入振摇混合液，以形成较小的钙磷颗粒。之后室温下孵育30min。随即吸弃293细胞培养盘中的培养基，加入3ml DNA-钙磷混合液，于35℃、3％CO2培养16～24小时后换液，转入37℃，5％CO2继续培养36～48小时。转染后48-72小时吸弃所有培养基，加入少量PBS缓冲液，刮取盘中293细胞，-80℃冻存。
为祛除细胞中的异型蛋白，须用肝素柱纯化，方法如下：将收集的含病毒的293细胞反复冻溶三次，加入0.1mg的DNase I及0.1mg的RNase A，37℃抚育2小时；再加入0.5％的脱氧胆酸，37℃抚育30分钟；离心数分钟，上清分别经5μm和0.8μm的滤膜过滤；取8ml肝素琼脂糖混悬液加入一直径为2.5cm装有阀门的玻璃柱中；待琼脂糖混悬液流尽后，在形成的琼脂床上放置一滤膜，用25mlPBS(PH7.4)平衡琼脂床；关闭阀门，将上述经过过滤的病毒原液加入玻璃柱中，打开阀门，控制病毒以1滴/秒的速度滴下；待病毒液滴完后，用25mlPBS(PH7.4)+0.1M NaCl洗两次；用15mlPBS(PH7.4)+0.4MNaCl洗脱病毒；用Millipore Biomax-100k NMWL过滤装置(UFV2BHK40)浓缩病毒液至3～5ml。
实施例3rAAV-anti2J2病毒滴度的测定一斑点杂交
(1)CYP2J2 cDNA探针的标记和纯化：
同位素标记的核苷酸α-p32购自北京雅辉公司。用Not I切下pXXUF1-anti2J2中的CYP2J2片段做为已知序列的探针。随机引物法标记CYP2J2片段并纯化(试剂盒购自QIAGEN公司，方法如说明书)。
(2)回收物的和定量标准的准备：
回收物经适量DNase I和RNase A消化细胞基因组的DNA和RNA后再加Proteinase K，消化病毒的蛋白质外壳(以上试剂均购自日本TAKARA公司)。酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，祛除沉淀，上清中为病毒中的DNA。将上清按体积比对倍稀释。标准物采用目的基因片段，即CYP2J2片段，测定浓度后按分子数对倍稀释(具体计算方法略)。并作加热和碱变性处理。
(3)杂交与放射自显影
配好斑点杂交装置，并按装置大小安置一块0.45μm的尼龙膜，将待测病毒样品和标准样品按体积梯度和分子梯度分别上样，上样后将膜80℃干烤2小时，后42℃预杂交1小时(预杂交液购自INTERGEN公司)。再加加热处理的标记探针，45℃杂交12-16小时。洗膜后-80℃放射自显影2-3天。制备的rAAV滴度达1×1011p.f.u.，即可用于动物实验。
实施例4 CYP表氧化酶对肿瘤生长及侵蚀的影响
(1)CYP表氧化酶基因转染后在皮下移植瘤和在肿瘤细胞系中的有效表达
将control组和转染rAAV-GFP、rAAV-anti2J2、rAAV-CYP2J2组裸鼠皮下移植瘤和肿瘤细胞系组织蛋白提取后采用western blot法检测组织中表氧化酶的表达。结果显示转染rAAV-anti2J2组与对照组比较表达明显减少，转染rAAV-GFP组与对照组比较没有显著差异。见图10A和B。
(2)CYP表氧化酶及抑制剂对四种肿瘤细胞体外培养增殖的影响
将rAAV-CYP2J2和rAAV-CYPF87V转染肿瘤细胞，使其高效表达代谢花生四烯酸产生内源性EETs的表氧化酶，间接增加细胞内EETs浓度，可直接证实CYP表氧化酶促增殖作用。与对照组比较，转染rAAV-CYP2J2和rAAV-CYPF87V能明显促进肿瘤细胞的增殖，细胞增殖数是基础状态即转染rAAV-GFP和未转染细胞的2～3倍(P＜0.01)；转染反义CYP表氧化酶基因(rAAV-anti2J2)和加用CYP表氧化酶抑制剂17-ODYA后，细胞增殖明显受抑，为基础状态下的50％以下(P＜0.01)。见图11。
(3)rAAV-antiCYP表氧化酶对人舌鳞癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响
我们采用离体途径将rAAV-antiCYP转染人舌鳞癌细胞株Tca-8113，然后移植到裸鼠皮下，部分模拟肿瘤细胞在体内的生长过程，皮下接种后第7d、12d、17d、22d、27d、32d用游标卡尺精确测量瘤体最长径(a)与最短径(b)，肿瘤体积V＝πab2/6，绘制肿瘤体积生长曲线。结果如下：裸鼠接种Tca-8113后，经过4～7天的潜伏期即出现肉眼可见的皮下瘤结节，之后，瘤体生长逐渐加速。各组移植瘤生长曲线呈S形，生长高峰在12-22天之间不等。随着时间的延长，各组形成皮下移植瘤的体积出现明显差异。转染rAAV-antiCYP2J2组出现肿瘤生长延迟现象，生长曲线呈S形右移。而在转染rAAV-anti2J2第32天，肿瘤的体积的大小是基础状态的2倍左右。这说明CYP表氧化酶能明显促进在体肿瘤的生长，抑制其基因表达后能明显抑制肿瘤的生长。结果如图12：
(4).rAAV-AS-CYP表氧化酶对肿瘤组织微血管密度的影响
接种32d后处死动物，剥离瘤体制备石蜡切片行微血管密度(microvessel density，MVD)计数分析。显微镜下可见微血管主要分布在瘤组织的间质和周边区域，而在肿瘤组织内很少有微血管分布。转染rAAV-CYP2J2和rAAV-CYPF87V组微血管增多，微血管密度较大，在高倍视野下的MVD分别为76.8±9.1、70.2±7.8，与对照组(42.8±6.4)比较有显著性差异(P＜0.01)，而转染rAAV-anti2J2组(23.6±7.3)与对照组和转染rAAV-CYP2J2组比较，微血管密度显著降低(P＜0.05和P＜0.01)。见图13。
(5).rAAV-anti2J2表氧化酶对肿瘤细胞迁移浸润生长的影响
我们采用了目前常用的测定上皮细胞迁移运动的方法，即在改良的Boyden趋化小室中进行。μm微孔多聚碳酸酯滤膜预先经IV型胶原(collagen IV，10μg/ml)和Matrigel(11μg/filter)于4℃中包被24h。Tca-8113、A549、Ncl-H446和HepG2细胞系用DMEM培养液洗涤后调整为2×106/ml。在趋化小室的下层加入200μl含5％FBS的DMEM培养基作为趋化因子，然后盖上多聚碳酸酯滤膜，在趋化小室的上层加入细胞悬液800μl，5％CO2，37℃培养5h后拆卸装置，收取滤膜。擦净滤膜上层面的细胞，将膜用甲醇固定，苏木素染色。在200倍显微镜下随机观察5个视野/张膜，计数迁移细胞数。经多次重复实验结果证实，转染rAAV-antiCYP2J2和加用CYP表氧化酶抑制剂17-ODYA后，细胞迁移侵袭能力明显下降，约为基础状态下的60％(P＜0.01)。见图14A、B。
此结果说明rAAV-anti2J2病毒及CYP表氧化酶抑制剂(17-ODYA)具有抑制肿瘤生增殖转移的作用，可用于肿瘤治疗。表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒(rAAV-anti2J2)的构建成功，在生物体内可长期高效表达，从基因水平上阻断CYP2J2基因的转录与翻译，使CYP2J2表达减少，其作用更强，更为彻底。将其与相信表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒(rAAV-anti2J2)和CYP表氧化酶抑制剂用于临床后，必将在肿瘤等严重危害人类健康的疾病的治疗中，发挥极其主要的作用。
实施例5 rAAV-anti2J2表氧化酶对肿瘤细胞凋亡的影响
按照上述方法分别用rAAV-GFP，rAAV-anti2J2，rAAV-F87V和rAAV-CYP2J2转染四种不同的肿瘤细胞系，一周后用TNFα诱导细胞凋亡，然后分别用不同的方法检测细胞凋亡情况。通过DNA ladder、丫啶橙染色和流式细胞术方法分析发现：①直接加入EETs或转染rAAV-CYP2J2，rAAV-CYPF87V均能明显减少DNA ladder形成，而使用表氧化酶抑制剂17-ODYA或转染反义CYP2J2则明显促进TNF-α诱导的肿瘤细胞凋亡；②细胞用丫啶橙/溴化乙啶染色后，在荧光显微镜下可见转染表氧化酶基因和直接用EETs干预的细胞脱落少，细胞密度高，细胞凋亡数明显较对照组少，而用17-ODYA和转染反义表氧化酶基因的肿瘤细胞脱落明显，密度明显降低，大多细胞核染色质浓缩、断裂呈颗粒状，细胞凋亡明显增多。这从形态学改变初步说明EETs和表氧化酶基因具有抗TNF-α诱导肿瘤细胞凋亡的作用；③分别用PI单染法和Annexin V-FITC/PI双染色后通过流式细胞仪分析TNF-α诱导的细胞总凋亡率和早期凋亡率。结果显示：用3种EETs预处理过的肿瘤细胞总凋亡率分别为14.94％±3.5、11.72％±4.2、12.89％±2.7，显著低于对照组(28.15％±4.7)和溶媒组(27.86％±6.1，P均＜0.01)，更低于17-ODYA组(52.65％±3.6)；转染CYP2J2和CYPF87V的肿瘤细胞总凋亡率分别为7.24％±4.2和7.79％±2.7，明显较对照组的20.15％±3.5和17-ODYA组的33.51％±6.1及转染反义CYP表氧化酶基因组的40.74％±3.5低(P＜0.01)；④对表氧化酶和EETs抗凋亡机制的研究显示：EETs和转染表氧化酶基因均能非常显著地增加Akt磷酸化，上调细胞抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表达，同时下调凋亡蛋白Bax的表达；而使用CYP表氧化酶抑制剂或转染rAVV-anti2J2则产生完全相反的作用。这些结果表明，表氧化酶和EETs不仅显著促进肿瘤生长，而且还可通过抑制TNF-α诱导的细胞凋亡来保护肿瘤细胞。因此根据这些结果，可以使用CYP表氧化酶抑制剂或转染rAVV-anti2J2促进肿瘤凋亡从而达到治疗肿瘤的目的。

Claims (6)

1、一种表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒，其中该重组腺相关病毒包括的三种质粒：
1)pXX2：为包装质粒，含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列。并在上游和下游各插入一个p5启动子，使表达效率可以提高15倍，提供rAAV复制所必须的Rep蛋白；
2)pXXUF1：真核表达载体，含CMV启动子，有较强的表达效率，其含有一多克隆Not I位点，可以连接不同的目的基因，pXXUF1反向连接人CYP表氧化酶基因，该载体含有rAAV转基因表达所必须的末端重复序列(ITRs)，负责病毒的复制和病毒外壳的包被并携带目的基因；
3)pXX6：为辅助质粒，删除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1 RNA基因，所表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激rAAV基因的转录和翻译，保证rAAV产量；
4)以上三种质粒经磷酸钙沉淀法共转染293细胞，即可在293细胞内形成高滴度的含目的基因的rAAV颗粒。
2、一种表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒的制备，其步骤：
1)XX2质粒——提供腺相关病毒包装所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列，和pXX6质粒——提供刺激腺相关病毒复制和转录所必需的腺病毒E1A、E2A和VAI RNA基因；
2)含腺相关病毒基因组的真核表达载体pXXUF1，在该真核载体中腺相关病毒缺失cap蛋白和rep蛋白编码区，并插入人类CYP2J2反义基因，形成重组质粒pXXUF1-anti2J2；
3)步骤1)中的pXX2、pXX6和步骤2)中的pXXUF1-anti2J2通过磷酸钙沉淀法共转染293细胞，适时回收，纯化、斑点杂交法检测其病毒滴度；
4)步骤3)中回收纯化的病毒转染肿瘤细胞，检测其表达及生物学活性。
3、权利要求1所述的表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒，该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工，再经分子生物学方法包装复制，并经纯化而成。
4、一种药物组合物，其特征在于，它包括有效量的权利要求1所述的表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒和药学上所接受的载体或赋形剂。
5、如权利要求1所述的一种表达人类CYP2J2反义基因的重组腺相关病毒，其选用CYP表氧化酶选择性抑制剂和CYP表氧化酶代谢花生四烯酸所形成的表氧化产生表氧化二十烷烯酸的拮抗剂，该化学制剂是人工化合而成并具有选择性抑制CYP表氧化酶系活性或阻断表氧化二十烷烯酸的作用，能够控制肿瘤增殖，而对细胞并无毒性作用。
6、如权利要求1所述的一种表达人类CYP212反义基因的重组腺相关病毒，已保藏于武汉大学内中国典型物保护中心，保藏日期：2004年6月30日，保藏编号：CCTCCNO：V200411分类命名：表达人类细胞色素P4502J2反义基因的重组腺相关病毒。
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