CN104232585B - 一种携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞的制备方法，其包括如下步骤：构建携带金属硫蛋白基因的重组腺相关病毒载体质粒pAAV‑MCS‑hMT；制备携带人金属硫蛋白基因的重组腺相关病毒rAAV‑hMT，测定滴度；将重组腺相关病毒rAAV‑hMT感染脐带间充质干细胞，得到携带人金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞。本发明得到的携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞用于衰老模型小鼠，能有效延缓小鼠衰老进程；将其用于高血铅模型小鼠，可明显降低小鼠血铅含量。
Description
技术领域
本发明属于干细胞再生医学技术领域。更具体地，本发明涉及一种携带人金属硫蛋白（Human Metallothionein，hMT）基因的脐带间充质干细胞的制备方法，及其在氧自由基、重金属导致疾病或衰老治疗中的应用。
背景技术
金属硫蛋白（Metallothionein，MT）是指一类低分子量、高巯基含量（20%-30%），能大量结合金属离子的性能独特的蛋白质或活性肽。在人体、动物、植物以及微生物体内均广泛存在。MT具有非常保守的一级结构和相似的空间结构，在许多物种中MT以多种亚型存在。
MT具有较强的清除自由基的作用。自由基过剩或任何引起自由基过程剩的因素均会引起细胞病变，影响细胞正常功能的发挥，甚者引起衰老及疾病。天然形式下MT中的巯基均以还原状态存在，巯基具亲核性，从而使MT易与亲电性物质特别是某些自由基相互作用。MT对自由基如羟自由基(OH) ，氧自由基(O2)或一氧化氮(NO)等有较强的清除作用。MT是讫今为止发现的清除自由基最强的活性蛋白蛋（或多肽），其清除羟自由基（OH）的能力约为SOD的10,000倍，而清除氧自由基（O）的能力约是谷胱甘肽（GSH）的25倍。
MT富含巯基及其重金属结合能力决定了它在重金属解毒方面起着重要的作用。MT的巯基基团（-SH）能强烈螯合有毒重金属Hg、Pb、Cd、As等，其中螯合Pb的强度比Zn大200倍，而螯合Cd的强度又比Pb大10倍[13]，从而使它们无法毒害人体，同时对体内Zn等微量元素无影响。这对保护大脑、肝、肾等人体重要器官具有极其重要意义。
目前，MT的来源主要有三类，一类是在培养基中添加金属离子，直接诱导微生物生产MT；另一类是对动物喂养含金属离子的饲料或者注射相关溶液，然后从动物内脏中提取MT；还有的就是利用基因工程技术生产MT。这几类生产方法都存在着产量极低，成本高、提纯步骤复杂的缺陷，更值得一提的是直接诱导法、动物提取法产生的MT为非人源性MT，且常结合有重金属，失去了清除氧自由基和结合重金属的能力。因此，针对MT的转基因治疗将逐渐成为研究的热点方向。
脐带间充质干细胞（umbilical-derived mesenchymal stem cells，UMSCs）是存在于脐带华通氏胶和血管周围组织中的一种干细胞，具有多向分化和自我更新的潜能。UMSCs具有以下优点：脐带是分娩后的废弃物，取材方便；UMSCs可在体外分离、培养，扩增迅速，且生物学特性稳定；UMSCs免疫原性低，异体移植不引起免疫排斥反应；UMSCs具有分泌SCF、LIF、M-CSF、Flt-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、SDF-1、VEGF等因子的特性，具有免疫调节功能，可用于自身免疫性疾病、神经系统疾病的治疗。当前，针对MSC抗衰老、MSC基因修饰等研究才刚刚兴起，国内外尚无携带hMT基因UMSCs构建的报道，亦无其用于氧自由基、重金属导致的疾病治疗、抗衰老的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有较强实用价值的携带人金属硫蛋白（HumanMetallothionein，hMT）基因的脐带间充质干细胞方法。得到的携带hMT基因的脐带间充质干细胞具有分泌hMT 、SCF、LIF、M-CSF、Flt-3、IL-6等因子，去除氧自由基或重金属，调节体内微环境的特性。将其用于衰老模型小鼠，能有效延缓小鼠衰老进程；将其用于高血铅小鼠，可明显降低血铅含量。
本发明的携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞制备方法，包含如下步骤：
（1）将人金属硫蛋白基因连接到腺相关病毒载体pAAV-MCS上，得到携带人金属硫蛋白基因的重组腺相关病毒载体pAAV-MCS-hMT，鉴定人金属硫蛋白基因已连接到腺相关病毒载体上；
（2）利用磷酸钙共沉淀法将重组腺相关病毒载体pAAV- MCS-hMT、pHelper和pAAV-RC共转染到AAV-293细胞中，培养直至AAV-293细胞出现表型变化和毒性反应；
（3）收集细胞悬液，反复冻融后，收集含有重组腺相关病毒株rAAV-hMT的上清液，纯化并测定毒株的滴度；
（4）将重组腺相关病毒rAAV-hMT按20MOI加入第2代对数生长期脐带间充质干细胞培养液中，培养箱培养，得到携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞。
步骤（1）所述的人金属硫蛋白基因经RcoR I和Xba I双酶切后插入pAAV- MCS，构建重组质粒pAAV- MCS-hMT；合成鉴定引物5’-ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3’， 5’-CAGCTGCACTTGTCTGACGT -3’；测序鉴定hMT基因正确连接到pAAV- MCS质粒上；
步骤（2）培养AAV-293 细胞，待细胞生长密度为80%，制备1mg/mL浓度的pAAV-MCS-hMT、pAAV-RC、pHelper，共转染AAV-293细胞进行重组病毒包装。于37℃、5%CO2条件下转染孵育6 h后，更换培养液，继续培养直至AAV-293细胞出现表型变化和毒性反应，完成病毒包装；
步骤（3）收集细胞悬液轮流放置于干燥的冰乙醇浴箱中冰冻和37℃水浴箱中融化，反复冻融4次，每次10分钟，室温下10000g转速离心10分钟，收集含有重组腺相关病毒株rAAV-hMT的上清液，纯化并测定毒株的滴度；
步骤（4）将重组腺相关病毒rAAV-hMT按20MOI加入第2代对数生长期脐带间充质干细胞培养液中，5%CO2，37℃细胞培养箱培养24小时，得到携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞。
采用上述技术方案，本发明方法可获得一种携带有人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞，以2×105/ml细胞浓度结种至细胞培养瓶，置于5%CO2，37℃细胞培养箱培养24小时，培养液中人金属硫蛋白含量明显升高。该携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞或分泌液可用来制备成用于氧自由基、重金属导致疾病或衰老治疗的制品。
附图说明
图1．重组腺相关病毒rAAV-hMT的构建示意图；
图2．MTS法测定20MOI腺相关病毒rAAV-hMT感染UMSCs细胞存活率结果图；
图3．流式细胞术测定携带人金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞表面标记结果图；
图4．携带人金属硫蛋白基因UMSCs的成骨、成脂分化结果图
图5．qRT-PCR法检测携带人金属硫蛋白UMSCs hMT mRAN水平结果图；
图6．携带人金属硫蛋白基因UMSCs对重金属Cd2+、Pb2+耐受性鉴定结果图；
图7．携带人金属硫蛋白基因UMSCs对衰老小鼠血清MT、脑组织端粒酶影响结果图；
图8．携带人金属硫蛋白基因UMSCs对高铅小鼠的促排铅作用结果图。
具体实施方式
以下结合附图详细说明本发明的具体实施方式：
实施例一 携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞的制备
本发明将两端含有RcoR I和Xba I酶切位点的hMT基因片段和pAAV- MCS质粒用RcoR I和Xba I双酶切，用T4连接酶将hMT基因连接到pAAV- MCS质粒上，构建重组质粒pAAV- MCS-hMT；合成鉴定引物5’-ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3’，5’- CAGCTGCACTTGTCTGACGT-3’；进行测序鉴定hMT基因正确连接到pAAV- MCS质粒上（见图1）。将1mg/mL浓度的pAAV-MCS-hMT、pAAV-RC、pHelper，共转染生长密度约80%的AAV-293细胞进行重组病毒包装，37℃、5%CO2条件下孵育6 h后，更换培养液，继续培养直至AAV-293细胞出现表型变化和毒性反应，完成重组腺相关病毒株rAAV-hMT的包装。收集细胞悬液轮流放置于干燥的冰乙醇浴箱中冰冻和37℃水浴箱中融化，反复冻融4次，每次10分钟，室温下10000g转速离心10分钟，收集含有重组腺相关病毒株rAAV-hMT的上清液，超滤浓缩纯化并测定毒株的滴度；将重组腺相关病毒rAAV-hMT按20MOI加入第2代对数生长期UMSCs培养液中，5%CO2，37℃细胞培养箱培养24小时，得到携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞。将携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞以3×104/ml细胞浓度结种至96孔板，置于5%CO2，37℃细胞培养箱培养24、48、72、96小时，细胞具有良好的生长状态（见图2）。流式细胞术测定携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞表面标记结果与UMSCs相比，表面标记无明显变化（见图3）。携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞的成骨、成脂分化实验结果显示其分化能力无明显变化（见图4）。
实施例二 携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞中hMT mRAN水平鉴定
合成hMT荧光定量PCR引物5’- CCAACTGCTCCTGCTCGC -3’，5’-CAGCTGCACTTGTCTGACGT -3’。将细胞株1：UMSCs；细胞株2：空载腺相关病毒感染的UMSCs；细胞株3：本发明获得的携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞共3种细胞株，传代至细胞培养瓶。待细胞长至90%密度，用PBS 洗3遍后，加1 ml TRIzol试剂提取细胞总RNA。核酸检测仪检测RNA 质量和浓度，取2μg的总RNA，利用逆转录试剂盒进行逆转录，获得cDNA。荧光实时定量PCR鉴定hMT mRNA水平。反应体系：SYBR Green mix 25μL，2.0μL cDNA 模板、引物各1μL ( 10nmol/L )、用ddH2O补足体系至50μL。反应：95℃、2 min，然后95℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，共40个循环，最后72℃、5min延伸。同时设置6个浓度梯度，制作标准曲线。根据标准曲线，计算细胞株1、细胞株2和细胞株3中hMT mRNA和内参基因β-actin mRNA的相对含量。重复检测3次。结果显示细胞株3中hMT mRNA表达水平较细胞株1、细胞株2增高约16培（图5）。
实施例四 携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞对重金属Cd2+、Pb2+的耐受性
将细胞株1：UMSCs；细胞株2：空载腺相关病毒感染的UMSCs；细胞株3：本发明获得的携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞，以3×104/ml细胞浓度结种至96孔板，每孔100ul，置于5%CO2，37℃细胞培养箱过夜，去除旧培养液，分别添加含有CdCl2（终浓度25μm/L）、醋酸铅（终浓度50μm/L）的培养液100μL，以添加新鲜培养液100μL为正常对照。置CO2孵箱中370C培养1，2，3，4天，每孔加入MTS 15μL，培养4小时，震荡5min，用酶标仪于490nm处测吸光度A值，绘制生长曲线。其结果说明，细胞株1，细胞株2的生长均受到50μm/L CdCl2、75μm/L醋酸铅的抑制；而细胞株3对50μm/LCdCl2、75μm/L醋酸铅具有显著的耐受性（图6）。
实施例五 携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞对D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用
本发明采用D-半乳糖致小鼠衰老模型评价UMSCs-hMT的抗衰老作用。将50只小鼠随机分为5组，每组10只，分别为正常组、模型组、治疗组1、治疗组2、治疗组3。治疗组1在衰老模型制备成功后，经尾静脉给予UMSCs 5×105，间隔3天，给予第二次注射；治疗组2在衰老模型制备成功后，经尾静脉给予空载腺相关病毒感染UMSCs 5×105，间隔3天，给予第二次注射；治疗组3在衰老模型制备成功后，经尾静脉给予携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞5×105，间隔3天，给予第二次注射；正常组、模型组均同时经尾静脉注射给予等量生理盐水。采用Gd-血红素饱和法检测血清中MT变化、端粒重复扩增-微孔板杂交法检测脑组织端粒酶活性，可见治疗组1、治疗组2和治疗组3小鼠的两项指标均具有一定程度的升高，治疗组3升高尤为显著（图7）。其结果说明，D-半乳糖致衰老模型小鼠经尾静脉输入携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞能有效地延缓小鼠衰老进程。
实施例六 携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞对高铅小鼠的促进排铅作用
本发明采用预防性高铅小鼠模型评价携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞的排铅作用。将40只小鼠随机分为4组，每组10只，分别为正常组、模型组、治疗组1、治疗组2、治疗组3。正常组给予饮用水；模型组给予饮用1g/L醋酸铅水溶液；治疗组在给予饮用1g/L醋酸铅水溶液的同时，治疗组1经尾静脉给予UMSCs 5×105，治疗组2经尾静脉给予空载腺相关病毒感染UMSCs 5×105，治疗组3经尾静脉给予携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞5×105，正常组和模型组均经尾静脉注射等量生理盐水。经24小时，取适量血，原子吸收广谱测定铅含量。正常组小鼠血铅含量平均约为0.04μg/g，模型组小鼠血铅含量平均约为0.53μg/g，治疗组1小鼠血铅含量平均约为0.45μg/g，治疗组2小鼠血铅含量平均约为0.48μg/g，治疗组3小鼠血铅含量平均约为0.15μg/g，其结果说明，UMSCs-hMT对高铅小鼠具有显著的促进排铅作用（图8）。
Claims (3)
1.一种携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将人金属硫蛋白基因连接到腺相关病毒载体pAAV-MCS上，得到携带金属硫蛋白基因的重组腺相关病毒载体pAAV-MCS-hMT，鉴定金属硫蛋白基因已连接到腺相关病毒载体上；
(2)利用磷酸钙共沉淀法将重组腺相关病毒载体pAAV-MCS-hMT、包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper共转染到AAV-293细胞中，培养至AAV-293细胞出现表型变化和毒性反应,完成重组腺相关病毒株rAAV-hMT的包装；
(3)收集细胞悬液，采用反复冻融方法，收集含有重组腺相关病毒株rAAV-hMT的上清液，纯化并测定rAAV-hMT毒株的滴度；
(4)重组腺相关病毒rAAV-hMT感染脐带间充质干细胞，得到携带有金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞；
所述人金属硫蛋白基因经EcoR I和Xho I双酶切后插入pAAV-MCS,构成重组腺相关病毒载体pAAV-MCS-hMT；
所述步骤(4)重组腺相关病毒rAAV-hMT感染脐带间充质干细胞的步骤为：将重组腺相关病毒rAAV-hMT按20MOI加入第2代对数生长期脐带间充质干细胞培养液中，5％CO2，37℃细胞培养箱培养24小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)获得重组腺相关病毒株rAAV-hMT的步骤为：收集细胞悬液轮流放置于干燥的冰乙醇浴箱中冰冻和37℃水浴箱中融化，反复冻融4次，每次10分钟，室温下10000g转速离心10分钟，收集上清液，纯化并测定毒株滴度。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法得到的携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞在制备治疗衰老或由氧自由基、重金属Cd2+和铅导致的疾病的制品中的应用。
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