CN107365765A - 草莓叶绿体基因组dna的高效提取方法 - Google Patents

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陶建敏
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Abstract

本发明公开了一种草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，先从草莓叶片的叶肉中分离出完整的无核污染的高纯度叶绿体；对所述的叶绿体进行裂解，得到叶绿体DNA粗品，对该叶绿体DNA粗品进行纯化，得到叶绿体DNA纯品。本发明所述的方法对部分耗材、试剂、离心力等进行改良，不需超高速离心机，也不需Mirocloth、匀浆机等昂贵耗材，首次利用高盐‑低pH缓冲液结合Percoll密度梯度法成功分离出草莓大量完整的叶绿体，实现了草莓物种完整叶绿体的分离及高质量叶绿体DNA的提取，为草莓叶绿体基因组研究奠定基础，提取的叶绿体DNA具有高质量和高纯度等显著优点，满足基因组测序要求。

Description

草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法。
背景技术
叶绿体是绿色植物细胞中进行光合作用的重要细胞器，自身拥有相对独立的遗传物质，即叶绿体DNA(cpDNA)。叶绿体DNA序列高度保守，且多为母系遗传，近年来在揭示物种起源、进化及不同物种间亲缘关系等方面发挥重要价值(张韵洁和李德铢，2011)。同时，叶绿体转基因技术因具有定点整合、高效表达及无花粉逃逸等优势，成为植物基因工程研究的新热点(Daniell H，2005)，因而获得完整的叶绿体全基因组序列显得尤为重要。而获得高纯度、高产量的cpDNA是开展叶绿体基因组研究的重要前提。
草莓(Fragaria×ananassa Duch.)属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生草本果树，以其色、香、味俱佳，营养价值高的特点被人们誉为“水果皇后”，现世界各地广为栽培，在小浆果生产中位居首位(Potter等，2007)。但草莓叶绿体DNA的提取至今没有十分有效的方法，制约了草莓叶绿体基因组及叶绿体转基因等研究进展。
传统的植物叶绿体DNA的提取方法主要有DNase I法(Kolodner and Tewari，1979)、高盐-低pH法(Bookjans等，1984)、蔗糖密度梯度离心法(Hirai等，1985)和Percoll密度梯度离心法(Heinhorst等，1988)。DNase I法虽能有效地去除吸附于叶绿体表面的核DNA，但在多次匀浆离心后，叶绿体膜很难保持完整，会将无完整叶绿体膜保护的cpDNA一同降解，造成产率很低(Shi等，2012)。蔗糖密度梯度离心法虽能获得完整叶绿体，但需要超速离心机，对仪器要求较高，且离心时间长，耗时(陈春梅和陈亮，2014)。Vieira等(2014)提取针叶树叶绿体DNA，但存在几点不足：⑴提取的cpDNA质量低，无法满足高通量测序要求。⑵叶片置于4℃冰箱黑暗饥饿处理10天，时间较长，会造成叶片的腐烂、褐化。⑶匀浆机匀浆过程中持续发热使叶绿体提前破碎。⑷匀浆液先用双层纱布过滤，再用双层Miracloth过滤，Miracloth价格昂贵，成本高。⑸进行Percoll密度梯度离心时，分成6管，每管中含有20mLPercoll细胞分离液，Percoll细胞分离液价格昂贵，成本高。
主要参考文献：
[1]张韵洁，李德铢.叶绿体系统发育基因组学的研究进展.植物分类与资源学报，2011，33(4)：365-375.
[2]Daniell H.2005.Chloroplast genetic engineering:Recent advances andfuture perspectives.Critical Reviews in Plant Sciences,24:83-107.
[3]Potter D,Eriksson T,Evans R C,Oh S,Smedmark J E E,Morgan D R,KerrM,Robertson K R,Arsenault M,Dickinson T A,Campbell C S.2007.Phylogeny andclassification of Rosaceae.Plant Syst Evol,266:5-43.
[4]Kolodner R,Tewari K K.1979.Inverted repeats in chloroplast DNAfrom higher plants.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited Statesof America,76:41-45.
[5]Hirai A,Ishibashi T,Morikami A,Iwatsuki N,Shinozaki K,SugiuraM.1985.Rice chloroplast DNA:a physical map and the location of the genes forthe large subunit of ribulose1,5-bisphosphate carboxylase and the 32KDphotosystem II reaction center protein.Theoretical and Applied Genetics,70:117-122.
[6]Heinhorst S,Gannon G C,Galun E,Kenschaft L,Weissbach A.1988.Clonebank and physical and genetic map of potato chloroplast DNA.Theoretical andApplied Genetics,75:244-251.
[7]Shi C,Hu N,Huang H,Gao J,Zhao Y J,Gao L Z.2012.An improvedchloroplast DNA extraction procedure for whole plastid genome sequencing.PlosOne,7:e31468.
[8]陈春梅，陈亮.茶树叶绿体DNA提取方法研究.分子植物育种，2014，12(3)：562-566.
[9]Vieira LDN,Faoro H,Fraga HPDF,Rogalski M,Souza EMD,Pedrosa FDO,Nodari RO,Guerra MP.2014.An Improved Protocol for Intact Chloroplasts andcpDNA Isolation in Conifers.Plos One,9:e84792.
[10]Taberlet P,Gielly L,Pautou G,Bouvet J.1991.Universal primers foramplification of three non-coding regions of chloroplast DNA.Plant molecularbiology,17:1105-1109.
[11]White TJ,Bruns T,Lee S,Taylor J.1990.Amplification and directsequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.In“PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications”(M.Innis,D.Gelfand,J.Sninsky,and T.White,Eds.),pp.315–322.Academic Press,San Diego.
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，对部分耗材、试剂、离心力等进行改良，实现了草莓物种完整叶绿体的分离及高质量叶绿体DNA的提取，为草莓叶绿体基因组研究奠定基础。本发明所述的草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，不需超高速离心机，也不需Mirocloth、匀浆机等昂贵耗材，首次利用高盐-低pH缓冲液结合Percoll密度梯度法成功分离出草莓大量完整的叶绿体，提取的叶绿体DNA具有高质量和高纯度等显著优点，满足基因组测序要求。
本发明所述的草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，包括如下步骤：
1)以新鲜草莓叶片为材料，脱脂棉包裹叶柄，蒸馏水浸润，3-5℃黑暗饥饿处理2-4天；
2)十二烷基肌氨酸钠溶液浸泡4-6min，冲洗，去中脉，剪成1-3cm2大小，加入匀浆缓冲液A进行匀浆，匀浆过程先10000-12000rpm匀浆4-6s，再21000-23000rpm匀浆9-11s，重复2-4次，第一次过滤，滤渣回收加入匀浆缓冲液A再次按上述方法匀浆，第二次过滤；
3)将步骤2)得到的两次滤液500-700g离心9-11min，上清液过滤，2500-3500g离心，弃上清得粗提叶绿体沉淀；
4)将步骤3)得到的粗提叶绿体加入悬浮缓冲液B，轻悬，将悬浮液铺在Percoll密度梯度分离液上，在水平转子离心机上3-5℃，4500-5500g离心25-35min，逐一吸取30％与70％浓度界面上的叶绿体；
5)将步骤4)的叶绿体用悬浮缓冲液B悬浮稀释，3-5℃，2500-3500g离心15-25min，去除Percoll分离液，获得纯净的叶绿体；
6)向步骤5)获得的叶绿体中加入缓冲液C，充分悬浮，再加入蛋白酶K，室温静置1-3min后，缓慢加入(18-22)％十二烷基硫酸钠和β-巯基乙醇，充分摇匀后在50-60℃条件下水浴3-5h，期间每半小时轻微振荡一次，得到含有cpDNA的消化液；
7)步骤6)获得的消化液冰浴4-6min，加醋酸钾继续冰浴25-35min，3-5℃，9500-10500g离心10-20min，上清液加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液抽提，3-5℃，9500-10500g离心10-20min，再加入与上清等体积的氯仿/异戊醇混合液抽提，3-5℃，9500-10500g离心5-15min；
8)步骤7)获得的上层透明液相加入2-4mol醋酸钠和异丙醇，轻摇混匀后，-18-22℃静置过夜，3-5℃，9500-10500g离心15-25min，收集DNA沉淀，乙醇漂洗去盐，风干，3-5℃ddH2O溶解50-70min，得到cpDNA原液；
9)步骤8)获得的cpDNA原液加入RNaseA35-38℃温育25-35min，再加入等体积氯仿抽提，上清液加入2-4mol醋酸钠和异丙醇，挑出叶绿体DNA，乙醇漂洗，风干，ddH2O溶解得到纯化的cpDNA。
步骤1)所述的草莓叶片可以为任意品种的草莓叶片，优选展开不久的健康无病虫害的绿色幼嫩叶片为分离叶绿体的材料；采取后可先用脱脂纱布包裹置于冰盒内冷藏保鲜，带回实验室，再用脱脂棉包裹叶柄，蒸馏水浸润，3-5℃黑暗饥饿处理2-4天。
本发明步骤1)黑暗饥饿处理可以消耗叶绿体中的淀粉含量，避免在匀浆过程中因淀粉的存在而使叶绿体膜提前破碎；饥饿处理2-4天还可以避免叶片腐烂、褐化。
优选的，步骤2)所述十二烷基肌氨酸钠溶液的浓度为4-6％，通过十二烷基肌氨酸钠溶液浸泡，可以减少叶片表面的污染。
本发明步骤2)中匀浆所用的设备可以为普通食物料理机，料理机提前置于预冷的环境；优选的，加入匀浆缓冲液A的量为每克叶片加入3-5ml匀浆缓冲液A。
本发明所述的匀浆缓冲液A的配比为：
本发明步骤2)中匀浆过程中通过10000-12000rpm的低速匀浆与21000-23000rpm的高速匀浆交替进行，可以避免发热，优选的，可以每次匀浆后静置5-10s待液面平稳后再进行下一次匀浆，来进一步避免发热，保持叶绿体的稳定，避免叶绿体破碎。
本发明步骤2)中第一次过滤选用的是双层脱脂纱布过滤，第二次过滤选用的是双层400目尼龙布过滤；步骤3)中过滤选用的是双层300目尼龙布过滤。
本发明步骤4)中加入悬浮缓冲液B后，可以用无菌软毛笔轻悬。
本发明步骤4)中所述Percoll密度梯度分离液的配置方法优选为：以悬浮缓冲液B为溶剂，将Percoll细胞分离液加入其中，分别配置成30％(v/v)和70％(v/v)的密度梯度分离液，在每支离心管中依次缓慢添加等量的30％和70％的密度梯度分离液。
本发明步骤5)用悬浮缓冲液B悬浮稀释，可以稀释两次，每次悬浮缓冲液B用量为步骤4)的叶绿体的三倍。
本发明所述悬浮缓冲液B的配比为：
本发明步骤6)中所述的蛋白酶K的浓度优选为8-12mg/ml，加入体积量优选为叶绿体悬浮液的(0.3-0.4)％；通过加入蛋白酶K使膜蛋白降解，使与DNA结合的蛋白质降解，从而使叶绿体DNA充分游离。
本发明步骤6)中加入(18-22)％的十二烷基硫酸钠和β-巯基乙醇，其中(18-22)％的十二烷基硫酸钠的加入体积优选为叶绿体悬浮液的(18-20)％，β-巯基乙醇的加入体积优选为叶绿体悬浮液的(0.2-0.3)％。本发明通过加入十二烷基硫酸钠为离子型表面活性剂，与蛋白质结合成复合物，使蛋白质变性而沉淀下来，从而使DNA与蛋白质分离；加入β-巯基乙醇可以有效防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。
本发明所述的缓冲液C的优选配比为：
按重量体积计：
本发明步骤7)中醋酸钾的作用在于K离子会使之前的蛋白复合物从溶液中有效地沉淀下来。
优选的，本发明步骤7)中苯酚/氯仿/异戊醇混合液的各成分体积比为苯酚：氯仿：异戊醇为(24-26)：(23-25)：1，其中苯酚用于抽提细胞DNA，使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用，用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相；氯仿的作用是克服酚的缺点，加速有机相与液相分层；加少许异戊醇,可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
优选的，本发明步骤7)中氯仿/异戊醇混合液的各成分体积比为氯仿：异戊醇为(23-25)：1。用氯仿抽提可以去除核酸溶液中的迹量苯酚，而异戊醇同样可以减少气泡的产生。
优选的，本发明步骤8)和步骤9)中2-4mol醋酸钠的加入体积量为体系的8-12％，异丙醇的加入体积量为体系的0.7-0.9倍。醋酸钠中的钠离子中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于DNA聚集沉淀；异丙醇也是沉淀DNA的作用。
优选的，本发明步骤8)中乙醇漂洗优选先用70％的乙醇漂洗2次，再用无水乙醇漂洗一次去盐；步骤9)中乙醇漂洗优选先用70％的乙醇漂洗2次。
本发明一种具体的草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，先从草莓叶片的叶肉中分离出完整的无核污染的高纯度叶绿体；对所述的叶绿体进行裂解，得到叶绿体DNA粗品，对该叶绿体DNA粗品进行纯化，得到叶绿体DNA纯品，具体按照以下步骤制备：
1)取栽培草莓品种‘红颊’刚展开不久的健康无病虫害的绿色幼嫩叶片为分离叶绿体的材料，用医用脱脂纱布包裹置于冰盒内冷藏保鲜，带回实验室，再用医用脱脂棉包裹住叶柄，蒸馏水浸润，于4℃冰箱黑暗饥饿处理3天；
2)取经过步骤1)处理的叶片100g，用500mL 5％十二烷基肌氨酸钠溶液浸泡5min，蒸馏水冲洗干净，滤纸上吸干水分，去中脉，剪成1-3cm2大小，置于预冷的料理机中，每25g叶片加入100mL预冷的匀浆缓冲液A进行匀浆。匀浆过程中应尽量避免发热，先低速匀浆1次5s，再高速匀浆1次10s，重复3次，当叶片匀浆成绿豆大小即可。用双层脱脂纱布过滤匀浆液至烧杯中，滤渣回收，加入100mL匀浆缓冲液A再次匀浆过滤。再用双层400目尼龙布过滤，得到滤液；
3)将步骤2)的滤液分装在两个干净的250mL离心管中，4℃，600g，离心10min，弃沉淀，得上清；
4)将步骤3)的上清液用双层300目尼龙布过滤转移至新离心管中，于4℃，3000g，离心20min，弃上清，得到粗提叶绿体沉淀；
5)向步骤4)的沉淀中加入12mL悬浮缓冲液B，用无菌软毛笔轻悬。各取2mL沉淀悬浮液小心铺在Percoll密度梯度分离液上，共6管。在水平转子离心机上4℃，5000g，离心30min，逐一吸取30％与70％浓度界面上的绿色叶绿体，归并为1份；
6)将步骤5)的叶绿体用3倍体积的悬浮缓冲液B悬浮稀释2次，4℃，3000g，离心20min，以完全去除Percoll分离液，获得纯净的叶绿体；
7)向步骤6)得到的叶绿体沉淀中加入8mL缓冲液C，充分悬浮，得到悬浮液；
8)向步骤7)的悬浮液中加入30μL蛋白酶K(10mg/mL)，室温静置2min后，缓慢加入1.5mL 20％十二烷基硫酸钠，20μLβ-巯基乙醇，充分摇匀后在55℃条件下水浴4h，期间每半小时轻微振荡一次，得到含有cpDNA的消化液；
9)裂解结束后，冰浴5min，立刻加入1.5mL 5mol醋酸钾(pH 5.2)，轻轻混匀后继续冰浴30min。于4℃，10000g，离心15min，将上清液转移并分装至2mL离心管中。加入与上清等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，每次都需充分颠翻摇匀，10000g，4℃，离心15min。加入与上清等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提1次，10000g，4℃，离心10min；
10)小心转移上层透明液相至新的1.5mL离心管中，加入1/10体积的3mol醋酸钠(pH 5.2)和0.8倍体积的异丙醇，轻摇混匀后，-20℃静置过夜。4℃，10000g，离心20min，收集DNA沉淀，用70％的乙醇漂洗2次，无水乙醇漂洗1次去盐。室温风干沉淀，每管加30μLddH2O于4℃冰箱溶解1小时，轻缓混匀，得到cpDNA原液。加1μL RNase A(10mg/mL)，37℃温育30min；
11)再向步骤10)得到的经RNA酶消化的溶液中加入等体积氯仿，抽提2次，上清液加入1/10体积的3mol醋酸钠(pH 5.2)和0.8倍体积的异丙醇，挑出叶绿体DNA，用70％乙醇漂洗2次，风干，每管加入25μL ddH2O溶解得到纯化的cpDNA溶液，用分光光度计测定DNA浓度和纯度。
本发明的有益效果：
1.本发明的效果之一是获取的叶绿体数量多，完整，纯度高。获得的cpDNA质量高，纯度高。本发明提取的cpDNA可以用来进行PCR及基因组高通量测序，说明cpDNA的质量完全可以满足分子生物学实验要求；100g草莓叶片可以分离纯化出2-3ug的cpDNA。
2.本发明的效果之二是经济，高效。本发明使用的药品大都为普通的生化试剂，Percoll细胞分离液为国产品牌索莱宝，价格低廉，且1次实验所用量仅为30mL。整个实验没有使用试剂盒。使用家用的料理机代替昂贵的匀浆器，利用普通离心机代替超高速离心机，所使用的仪器为普通分子生物学实验常用的仪器，大大节约了实验成本。从时间上来看，5天即可完成全部实验。因此本方法在推广和应用上有较大优势。
附图说明
图1是实施例1的高盐-低pH缓冲液结合Percoll密度梯度离心对草莓叶绿体的分离效果；
图2是实施例1分离所得的叶绿体在激光扫描共聚焦荧光显微镜下自发火红色荧光的照片；
图3是实施例1的草莓cpDNA电泳检测结果；
图4是三对叶绿体通用特异性引物在cpDNA和总DNA中的扩增图谱；
图5是三对核基因组通用特异性引物在cpDNA和总DNA中的扩增图谱。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明，下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例中仪器来源：
料理机：美的(midea)BL25C43榨汁机料理机离心机：Eppendorf/Centrifuge5810R，日立高速冷冻离心机CR22N21N
电泳仪：北京市六一仪器厂DYY-10C型电泳仪
分光光度计：美国Thermo公司，NanoDrop 2000
激光扫描共聚焦荧光显微镜：德国Zeiss LSM710
试剂来源：
所有试剂均购于南京寿德试验器材公司。
实施例1
本实施例的实验材料为栽培草莓品种‘红颊’，于2016年10月中旬在江苏省句容市镇江农科院，采集刚展开不久的健康无病虫害的绿色幼嫩叶片，用医用脱脂纱布包裹置于冰盒内冷藏保鲜，带回实验室，用医用脱脂棉包裹叶柄，蒸馏水浸润，于4℃冰箱黑暗饥饿处理3天。
1.完整叶绿体的分离
(1)取田间‘红颊’草莓刚展开不久的幼嫩叶片作为分离草莓叶绿体的材料，将叶片置于4℃冰箱黑暗饥饿处理3天。
(2)称取叶片100g，用500mL 5％十二烷基肌氨酸钠溶液浸泡5min，蒸馏水冲洗干净，滤纸上吸干水分，去中脉，剪成1-3cm2大小，置于预冷的料理机中，每25g叶片加入100mL匀浆缓冲液A进行匀浆。匀浆过程中应尽量避免发热，先低速匀浆1次5s，再高速匀浆1次10s，重复3次，当叶片匀浆成绿豆大小即可。用双层脱脂纱布过滤匀浆液至烧杯中，滤渣回收，加入100mL匀浆缓冲液A再次匀浆过滤。再用双层400目尼龙布过滤，得到滤液。
(3)将滤液分装在两个干净的250mL离心管中，4℃，600g，离心10min，弃沉淀，得上清。
(4)将上清液用双层300目尼龙布过滤转移至新离心管中，于4℃，3000g，离心20min，弃上清，得到粗提叶绿体沉淀。
(5)向沉淀中加入12mL悬浮缓冲液B，用无菌软毛笔轻悬。各取2mL沉淀悬浮液小心铺在Percoll密度梯度分离液上，共6管。在水平转子离心机上4℃，5000g，离心30min，逐一吸取30％与70％浓度界面上的绿色叶绿体，归并为1份。
(6)将收集的叶绿体用3倍体积的悬浮缓冲液B悬浮稀释2次，4℃，3000g，离心20min，以完全去除Percoll分离液，获得纯净的叶绿体。在显微镜下检查叶绿体的完整性。
2.叶绿体的裂解
(1)往上述分离的叶绿体沉淀中加入8mL缓冲液C，充分悬浮，得到悬浮液。
(2)再往悬浮液中加入30μL蛋白酶K(10mg/mL)，室温静置2min后，缓慢加入1.5mL20％十二烷基硫酸钠，20μLβ-巯基乙醇，充分摇匀后在55℃条件下水浴4h，期间每半小时轻微振荡一次，在此过程中，叶绿体双层膜被消化，cpDNA被释放到消化液中。
3.叶绿体DNA(cpDNA)的提取与纯化
(1)裂解结束后，冰浴5min，立刻加入1.5mL 5mol醋酸钾(pH 5.2)，轻轻混匀后继续冰浴30min。于4℃，10000g，离心15min，将上清液转移并分装至2mL离心管中。加入与上清等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，每次都需充分颠翻摇匀，10000g，4℃，离心15min。加入与上清等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提1次，10000g，4℃，离心10min。
(2)小心转移上层透明液相至新的1.5mL离心管中，加入1/10体积的3mol醋酸钠(pH 5.2)和0.8倍体积的异丙醇，轻摇混匀后，-20℃静置过夜。4℃，10000g，离心20min，收集DNA沉淀，用70％的乙醇漂洗2次，无水乙醇漂洗1次去盐。室温风干沉淀，每管加30μLddH2O于4℃冰箱溶解1小时，轻缓混匀，得到cpDNA原液。加1μL RNase A(10mg/mL)，37℃温育30min。
(3)再按上述方法加入等体积氯仿，抽提2次，上清液加入1/10体积的3mol醋酸钠(pH 5.2)和0.8倍体积的异丙醇，用弯钩针头挑出叶绿体DNA，用70％乙醇漂洗2次，风干，每管加入25μL ddH2O溶解得到纯化的cpDNA溶液，用分光光度计测定DNA浓度和纯度。
其中，缓冲液的组分及配比如下：
匀浆缓冲液A：
悬浮缓冲液B：
按重量体积计：
Percoll密度梯度分离液：
以悬浮缓冲液B为溶剂，将Percoll细胞分离液加入其中，分别配置成30％(v/v)和70％(v/v)的密度梯度分离液。在6支12mL的离心管中依次缓慢添加30％和70％的密度梯度分离液各4.5mL，置于4℃冰箱静置3h备用。
缓冲液C：
按重量体积计：
缓冲液中的抗坏血酸，牛血清白蛋白，二硫苏糖醇均需现加现用。
实施例2 30％-70％的Percoll密度梯度对草莓叶绿体分离纯化效果
从图1可以看出，A为脂质层，呈乳白色，B为破碎的叶绿体层，呈浅绿色，C为完整的叶绿体层，呈深绿色，D为杂质层，各成分之间分层明显，液体清晰透明。
实施例3 荧光显微镜下检测分离的叶绿体完整性
从图2可以看出，分离出的叶绿体自发火红色荧光，数量多，结构完整，基本无破碎，说明在30％-70％的Percoll密度梯度下，能够将草莓完整的叶绿体分离出来，并得到较纯的叶绿体颗粒，为进一步获得cpDNA奠定了基础。
实施例4 凝胶电泳及紫外分光光度计检测cpDNA质量
设置2μL、3μL cpDNA上样量，加1μL上样缓冲液混匀，在1％(w/v)琼脂糖凝胶中电泳，指示Marker(Trans2k plus DNA Marker和Trans15k plus DNA Marker)上样量为2μL，电泳缓冲液为1×TAE，电压为100v，电泳时间40min后，琼脂糖凝胶经EB染色，在BIO-RAD凝胶成像系统下检测条带情况，并拍照。
取1μL提取的cpDNA，利用分光光度计(美国Thermo公司，NanoDrop 2000)，测定核酸含量，记录OD260/280、OD260/230及质量浓度。
从图3可以看出(图中：M-1：Trans2k plus，上样2μL；M-2：Trans15k plus，上样2μL；S：标准品上样5μL(10ng/μL)；序列1：cpDNA上样3μL；2为cpDNA上样2μL)，点样孔中无杂质，电泳条带清晰整齐，无杂带，无拖尾现象。说明所提取的cpDNA完整，纯度较高，无蛋白质和RNA等污染。
在表1的紫外分光光度计检测结果中也可以看出OD260/OD280比值为1.82，在1.8-2.0之间，OD260/OD230比值为2.06，大于2.0，说明提取的cpDNA纯度高，无蛋白质、多糖、碳水化合物等杂质污染。
表1cpDNA紫外分光光度计检测结果
实施例5 PCR检测DNA提取和纯化效果：
根据Taberlet等(1991)报导的三对叶绿体DNA通用特异性引物扩增草莓叶绿体三个非编码区片段：
PCR反应体系为25μL：20μmol/L上下游引物各0.5μL，1μL模板DNA。PCR扩增程序：95℃预变性7min；95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共计35个循环；最后72℃延伸5min。以提取的cpDNA和利用植物基因组提取试剂盒提取的总DNA为模板进行PCR反应，其扩增图谱如图4(图中：M：2000marker；1-3：分别为cpDNA扩增出的三对叶绿体引物序列；4-6：分别为总DNA扩增出的三对叶绿体引物序列)。
根据White等(1990)三对核基因组通用特异性引物扩增草莓核糖体基因转录间隔区片段：
A：正向引物：ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；反向引物：ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；
B：正向引物：ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；反向引物：ITS2:5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’；
C：正向引物：ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’；反向引物：ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，
PCR反应体系与上述相同。PCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共计30个循环；最后72℃延伸10min。以提取的cpDNA和利用植物基因组提取试剂盒提取的总DNA为模板进行PCR反应，其扩增图谱如图5(图中：M：2000marker；1-3：分别为总DNA扩增出的三对核基因组引物序列；4-6：分别为叶绿体DNA扩增出的三对核基因组引物序列)。
从图4和图5中可以看出，利用三对叶绿体通用特异性引物，通过PCR扩增，可以从提取的cpDNA和总DNA中得到单一、特异性的产物，说明该方法提取的DNA含有cpDNA，且质量能够得到保证。而利用三对核基因组通用特异性引物，可以从总DNA中扩增出目标片段，而cpDNA中却没有扩增出来，说明所提取的DNA确实为cpDNA，且不含核DNA的污染。

Claims (10)

1.一种草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)以新鲜草莓叶片为材料，脱脂棉包裹叶柄，蒸馏水浸润，3-5℃黑暗饥饿处理2-4天；
2)十二烷基肌氨酸钠溶液浸泡4-6min，冲洗，去中脉，剪成1-3cm2大小，加入匀浆缓冲液A进行匀浆，匀浆过程先10000-12000rpm匀浆4-6s，再21000-23000rpm匀浆9-11s，重复2-4次，第一次过滤，滤渣回收加入匀浆缓冲液A再次按上述方法匀浆，第二次过滤；
3)将步骤2)得到的两次滤液500-700g离心9-11min，上清液过滤，2500-3500g离心，弃上清得粗提叶绿体沉淀；
4)将步骤3)得到的粗提叶绿体加入悬浮缓冲液B，轻悬，将悬浮液铺在Percoll密度梯度分离液上，在水平转子离心机上3-5℃，4500-5500g离心25-35min，逐一吸取30％与70％浓度界面上的叶绿体；
5)将步骤4)的叶绿体用悬浮缓冲液B悬浮稀释，3-5℃，2500-3500g离心15-25min，去除Percoll分离液，获得纯净的叶绿体；
6)向步骤5)获得的叶绿体中加入缓冲液C，充分悬浮，再加入蛋白酶K，室温静置1-3min后，缓慢加入(18-22)％十二烷基硫酸钠和β-巯基乙醇，充分摇匀后在50-60℃条件下水浴3-5h，期间每半小时轻微振荡一次，得到含有cpDNA的消化液；
7)步骤6)获得的消化液冰浴4-6min，加醋酸钾继续冰浴25-35min，3-5℃，9500-10500g离心10-20min，上清液加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液抽提，3-5℃，9500-10500g离心10-20min，再加入与上清等体积的氯仿/异戊醇混合液抽提，3-5℃，9500-10500g离心5-15min；
8)步骤7)获得的上层透明液相加入2-4mol醋酸钠和异丙醇，轻摇混匀后，-18-22℃静置过夜，3-5℃，9500-10500g离心15-25min，收集DNA沉淀，乙醇漂洗去盐，风干，3-5℃ddH2O溶解50-70min，得到cpDNA原液；
9)步骤8)获得的cpDNA原液加入RNaseA35-38℃温育25-35min，再加入等体积氯仿抽提，上清液加入2-4mol醋酸钠和异丙醇，挑出叶绿体DNA，乙醇漂洗，风干，ddH2O溶解得到纯化的cpDNA。
2.根据权利要求1所述的草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，步骤1)选用展开不久的健康无病虫害的绿色幼嫩叶片为分离叶绿体的材料；步骤2)所述十二烷基肌氨酸钠溶液的浓度为4-6％；加入匀浆缓冲液A的量为每克叶片加入3-5ml匀浆缓冲液A。
3.根据权利要求1所述的草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，匀浆缓冲液A的配比为：
4.根据权利要求1所述的草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，步骤2)中每次匀浆后静置5-10s待液面平稳后再进行下一次匀浆；步骤2)中第一次过滤选用的是双层脱脂纱布过滤，第二次过滤选用的是双层400目尼龙布过滤；步骤3)中过滤选用的是双层300目尼龙布过滤。
5.根据权利要求1所述的草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，步骤4)中所述Percoll密度梯度分离液的配置方法为：以悬浮缓冲液B为溶剂，将Percoll细胞分离液加入其中，分别配置成30％(v/v)和70％(v/v)的密度梯度分离液，在每支离心管中依次缓慢添加等量的30％和70％的密度梯度分离液。
6.根据权利要求1所述的草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述悬浮缓冲液B的配比为：
7.根据权利要求1所述的草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，步骤6)中所述的蛋白酶K的浓度为8-12mg/ml，加入体积量为叶绿体悬浮液的(0.3-0.4)％；(18-22)％的十二烷基硫酸钠的加入体积优选为叶绿体悬浮液的(18-20)％；β-巯基乙醇的加入体积优选为叶绿体悬浮液的(0.2-0.3)％。
8.根据权利要求1所述的草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，缓冲液C的配比为：
9.根据权利要求1所述的草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，步骤7)中苯酚/氯仿/异戊醇混合液的各成分体积比为苯酚：氯仿：异戊醇为(24-26)：(23-25)：1；氯仿/异戊醇混合液的各成分体积比为氯仿：异戊醇为(23-25)：1。
10.根据权利要求1所述的草莓叶绿体基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，步骤8)和步骤9)中2-4mol醋酸钠的加入体积量为体系的8-12％，异丙醇的加入体积量为体系的0.7-0.9倍。
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