CN101117634A - 一种分离棉花叶绿体dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于棉花基因工程技术领域，具体涉及一种分离棉花叶绿体DNA的新方法。包括：以幼嫩的叶片为材料，用普通家用榨汁机将叶片充分匀浆，利用A、B、C、D四种缓冲溶液，常规速度离心，依次通过完整叶绿体的分离，裂解及叶绿体DNA(cpDNA)分离纯化三个连续步骤，最终获得棉花叶绿体DNA纯品。本发明制备分离的叶绿体DNA质量较高，紫外分光光度计检测表明，本发明制备的DNA样品的D260nm/D280nm在1.6－1.8之间；产率高达1－10μg cpDNA/g叶片样品。经过验证，以分离的cpDNA为模板完全能够满足特异性酶切、RAPD、PCR和目标基因序列的克隆等常规分子生物学操作的需要。与现有技术相比，本发明不需要超高速离心机，也不需要通过蔗糖密度梯度离心分离等设备和步骤。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种分离棉花叶绿体DNA的方法。
背景技术
叶绿体是绿色植物进行光合作用的主要细胞器，虽然其功能的表达存在着对细胞核的依赖性，但仍具有相对独立的遗传物质，即叶绿体DNA(cpDNA)。高等植物的叶绿体基因组大小大多数在120-160kb之间，其DNA分子都是以共价、闭合、环状双链形式存在，分子内基因排列紧密，内元插入序列很少。叶绿体基因组编码了许多与光合作用和叶绿体自身蛋白质合成有关的重要组分，其中一些基因可以用于分子生物学研究以提高作物产量和赋予作物抗除草剂性状等，因此引起了科学家广泛的兴趣(方玉达，刘大钧，1999；马永飞等，2003)。迄今为止，几乎所有作物的叶绿体基因组已被详细研究过，其中水稻、烟草等作物的叶绿体DNA的全序列已被分析出来。
高等植物叶绿体基因组转化研究虽然起步较晚，但与植物细胞核基因组转化研究相比却具有其突出的优点，包括外源基因在叶绿体DNA上定点整合、高效表达、无花粉逃逸和母性遗传等优点(侯丙凯，陈正华，2001；张中林，2000)。高等植物的叶绿体转化工作最早在烟草中获得了成功(Svab，1990)，后来陆续在拟南芥(Sikdar等，1998)、水稻(Khan and Maliga，1999)、马铃薯(Sidorov等，1999)、番茄(Ruf.，2001)、油菜(Hou，2003；Skarjinskaia，2003)、大豆(Dufourmantel等，2004)、矮 牵牛花(Zubko.，2004)、胡萝卜(Kumar等，2004a)、棉花(Kumar等，2004b)和莴苣(Lelivelt等，2005)中 获得成功，这些叶绿体转化体系的建立，使得高等植物叶绿体转化已经成为植物基因工程研究中的新热点(Gewolb，2002；Maliga，2003；Grevich and Daniell，2005)。
叶绿体转化通常利用两段相邻的目的植物叶绿体DNA序列作为同源重组片段，以叶绿体基因启动子、终止子构建叶绿体表达载体。psbA基因表达产物是光系统II作用中心蛋白D1，参与光诱导的电子转移过程，该基因的启动子和终止子的效率都非常高，因此，在许多植物叶绿体转化载体中均采用烟草的psbA基因启动子、终止子来调控目标基因的表达(GrevichandDaniell，2005)。2006年，棉花叶绿体DNA序列测定完成，这一研究进展将为棉花棉花叶绿体转化提供有力的保障，使棉花叶绿体相关序列的克隆成为可能。
但要进行上述研究的必须前提就是得到足够量的、高纯度的、完整的cpDNA。目前，较常采用的方法是用差速离心和DNase消化纯化叶绿体，然后通过CsCl密度梯度超速离心纯化cpDNA。这类方法成本高、耗时长、产率低。同时由于对实验设备的要求比较高，特别是需要价格昂贵超、高速离心机和匀浆机，限制了上述方法的广泛应用。
棉花叶片具有很多丰富而特有的次生代谢物，如棉酚、单宁、多酚类等成分，棉酚和单宁，在分离纯化叶绿体DNA过程中这些物质很容易被氧化，与叶绿体DNA发生不可逆结合而污染分离的DNA，并且这类次生代谢产物还将大大降低蛋白酶K和RNase A的活性。因此，针对棉花所具有的特有性质，在cpDNA分离过程中必须采取独特的工艺及试剂配方才能有效提高叶绿体DNA分离效率：
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种不需要超高速离心机，也不需要通过蔗糖密度梯度离心分离棉花叶绿体DNA的方法。本发明的方法分离的棉花叶绿体DNA具有高质量和高产率等显著优点，适合于棉花叶绿体基因工程等分子生物学操作的需要。
本发明是这样实现的：
1、一种分离棉花叶绿体DNA的方法，其特征在于，从棉花叶片的叶肉中分离出完整的叶绿体；对所述的叶绿体进行裂解，得到叶绿体DNA粗品，对该叶绿体DNA粗品进行纯化，得到叶绿体DNA纯品，按照以下步骤制备：
1)取幼嫩棉花叶片作为分离叶绿体的材料，将叶片置于4℃冰箱中黑暗处理24h，然后用于分离叶绿体或将该叶片转入到-70℃冰箱保存备用，取适量叶片，用冰块预先使榨汁机冷却，然后加入样品4倍体积预冷的4℃缓冲液A于榨汁机的容器中，迅速将样品投入缓冲液A中，启动榨汁机，匀浆约1min，然后用医用纱布过滤该匀浆，得到滤液；
2)将步骤1)的滤液分装到离心管中，于4℃下2500rpm离心10min，弃上清，得到沉淀；
3)向步骤2)的沉淀中加入缓冲液B，用移液枪吸打使沉淀悬浮，然后将悬浮液分装到的塑料离心管中，在4℃下2500rpm离心10min，弃上清；
4)用缓冲液C将沉淀重新悬浮，并将悬浮液转移到塑料离心管中，加入缓冲液C，4℃下2500rpm离心10min，弃上清，沉淀即为棉花叶绿体；
5)向步骤4)得到的叶绿体沉淀中加入缓冲液D，充分悬浮，得到悬浮液；
6)向步骤5)的悬浮液中依次加入终浓度为0.5％的十六烷基磺酸钠，终浓度为2％的十二烷基肌胺酸钠和浓度为10mg/ml的125μl蛋白酶K，充分摇匀，于37℃，保温3h，在保温期间间隔半小时轻轻摇动该悬浮液，得到含有cpDNA的消化液；
7)向步骤6)得到的消化液中加入体积比为25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇，抽提2-3次；
8)取上清液加入终浓度为0.02mol/l醋酸钠和2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃放置过夜，1000rpm离心30min，收集沉淀，用70％乙醇冲洗一遍，室温放置15min，12000rpm离心5min，风干叶绿体DNA，将叶绿体DNA溶于400μl的pH为8.0的TE溶液中，然后加入30ul的RNA酶(5mg/ml)，37℃，保温2h.；
9)再向步骤8)得到的经RNA酶消化的溶液中加入等体积氯仿，抽提2-3次，上清液加入终浓度为0.02mol/l醋酸钠和2.5倍体积的预冷无水乙醇，挑出叶绿体DNA，用70％乙醇浸泡2-3小时，浸泡期间用70％乙醇洗涤2-3次，弃去乙醇，风干，加TE溶液溶解，用分光光度计测定DNA浓度和纯度，得到提纯的叶绿体DNA；
其中，缓冲液的组分及配比如下：
缓冲液A
按重量体积计：
Tris 6.1g/L，
EDTA 9.3g/L，
Nacl 73.1g/L，
抗坏血酸 44.0g/L，
聚乙烯吡咯烷酮， 15.0g/L，
补充水分至1L，调pH至3.6；
缓冲液B
按重量体积计：
Tris 6.1g/L，
EDTA 9.3g/L，
Nacl 73.1g/L，
β-巯基乙醇 0.78g/L，
牛血清蛋白 1.0g/L，
补充水分至1L，调pH至8.0；
缓冲液C
按重量体积计：
150mmol/L Nacl 8.8g/L，
100Nacl EDTA 37.2g/L，
补充水分至1L，调pH至8.0；
缓冲液D
按重量体积计：
Tris 6.1g/L，
EDTA 9.3g/L，
二乙基二硫代氨基甲酸钠 1.0g/L，
补充水分至1L，调pH至8.0。
本发明的效果是：
1、本发明的效果之一是获取的cpDNA质量高，能够保持DNA完整，产率高。本发明抽提的cpDNA可以用来进行酶切、PCR、RAPD及目标序列的克隆，说明cpDNA的质量完全可以满足分子生物学实验的要求；每克鲜重棉花叶片可以分离1-10μg cpDNA，与报道的棉花核DNA的分离产率相当。
2、本发明的效果之三是经济，高效。本发明使用的药品大都为普通的生化试剂，价格低廉，没有利用试剂盒或昂贵的药品。使用家用的榨汁机代替昂贵的匀浆器，利用普通离心机代替高速离心机，所使用的仪器为普通分子生物学实验常用的仪器，无需添加新设备，大大节约了实验成本。从时间上来看，一个工作日即可完成全部实验。因此本方法在推广和应用上有较大的优势。
附图说明
图1：是本发明的棉花cpDNA电泳检测结果，图中：1-6，分别是不同批次分离的cpDNA样品。
图2：是本发明设计的引物S-170的RAPD扩增图谱，图中：M：分子量标准；1-6：分别是不同的批次分离的cpDNA样品。
图3：是包含psbA基因启动子、终止子片段的PCR扩增产物电泳图，图中：M：分子量标准；1-5：分别是样品扩增出的预期为312bp的psbA基因启动子序列；C：阴性对照；6-10：分别是样品扩增出的预期为383bp的psbA基因终止子序列。
图4：是本发明克隆得到的psbA基因启动子全长312bp序列(方框内为该基因的调控序列)。
图5：是本发明克隆得到的psbA基因终止子序列(方框内粗体表示调控序列元件)。
图6.是本发明其中实施例中的棉花品种“TM-1”与已经测序的棉花品种“珂字312”的叶绿体psbA基因启动子序列的比较，图中：Query：为TM-1的序列；Sbjct：为珂字312的序列
图7.是本发明其中实施例中的棉花品种“TM-1”与已经测序的棉花品种“珂字312”的叶绿体psbA基因终止子序列比较，图中：Query：为TM-1的序列；Sbjct：为珂字312的序列
具体实施方式
实施例1
本实施例的实验材料为陆地棉标准系Tm-1(Lin et al.，2003)。取田间或盘栽的幼嫩棉花叶片50g，蒸馏水冲洗后稍晾干，置于保鲜袋内于黑暗处饥饿处理过夜，或置于-70℃保存备用。
1、完整叶绿体的分离
(1)取田间棉花植株新展开的幼嫩叶片作为分离棉花叶绿体的材料，将叶片放置于冰箱中(4℃)黑暗处理24h，然后转入到超低温(-70)℃冰箱保存(或者直接用于分离叶绿体)称取叶片50克左右。用冰块预先使榨汁机冷却，然后加入样品4倍体积预冷的4℃缓冲液A于榨汁机中，迅速将样品加入到容器中，启动榨汁机，匀浆约1min，然后用医用纱布过滤匀浆。
(2)将滤液分装到250ml离心管中，4℃下2500rpm离心10min，弃上消。
(3)往沉淀中加入200ml缓冲液B(使用前加入10mm/l的β-巯基乙醇)，用移液枪轻轻吸打使沉淀充分悬浮，然后将悬浮液分装到50ml的塑料离心管中，然后在4℃下2500rpm离心10min，弃上清。
(4)用5ml缓冲液C将沉淀重新悬浮，并将悬浮液转移到50ml的塑料离心管中，补加30ml缓冲液C，4℃下2500rpm离心10min，弃上清，沉淀即为纯化的叶绿体，在显微镜下检查叶绿体的完整性。
2、叶绿体的裂解
(1)往上述分离的叶绿体沉淀中加入10ml缓冲液D充分悬浮。
(2)再往悬浮液中依次加入1/20体积的10％的十六烷基磺酸钠(SDS)，1/5体积10％十二烷基肌胺酸钠(Sarkosyl)以及125μl蛋白酶K(10mg/ml)，充分摇匀，37℃，保温3h，期间间隔半小时轻轻摇动。在此过程中，叶绿体双层膜被消化，cpDNA被释放到消化液中。
3、及叶绿体DNA(cpDNA)分离纯化
(1)向消化液中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提数次，至界面干净，
(2)取上清液加1/10体积的0.2mol/l醋酸钠和2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃放置过夜。1000rpm离心30min，收集沉淀，用70％乙醇冲洗一遍，室温放置15min，12000rpm离心5min，风干，溶于400μlTE(pH＝8.0)，然后加入30ul的RNA酶(5mg/ml)。37℃，保温2h.。
(3)再按上述方法加入等体积氯仿抽提2-3次，上清液加1/10体积的0.2mol/l醋酸钠和2.5倍体积的预冷无水乙醇(不要混匀)，在界面上看到透明絮状沉淀，用弯沟针头挑出，用70％乙醇浸泡1天，中间换2-3次乙醇，最后倒掉乙醇，风干，加TE溶解，在分光光度计测定DNA浓度及质量。
其中，缓冲液的组分及配比如下：
缓冲液A
按重量体积计
Tris 6.1g/L
EDTA 9.3g/L
Nacl 73.1g/L
抗坏血酸 44.0g/L
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)， 15.0g/L
补充水分至1L，调pH至3.6；
缓冲液B
按重量体积计
Tris 6.1g/L
EDTA 9.3g/L
Nacl 73.1g/L
β-巯基乙醇 0.78g/L
牛血清蛋白 1.0g/L
补充水分至1L，调pH至8.0；
缓冲液C
按重量体积计
150mmol/L Nacl 8.8g/L
100Nacl EDTA 37.2g/L
补充水分至1L，调pH至8.0；
缓冲液D
按重量体积计
Tris 6.1g/L
EDTA 9.3g/L
二乙基二硫代氨基甲酸钠 1.0g/L
补充水分至1L，调pH至8.0。
实施例2
凝胶电泳及紫外分光光度计检测cpDNA质量：
取5μL提取的叶绿体DNA在0.8％的琼脂糖凝胶上用90V×60mA电泳30min后，置于BIO-RAD凝胶成像系统观察结果并成像。取4μL cpDNA稀释50倍后，在Beckman-DU 800型紫外分光光度计上测定D260nm及D280nm。
从图1可以看出，所提取的cpDNA片段大小在20000bp左右，带型整齐一致，表明cpDNA纯度较高，没有明显拖尾及弥散现象，表明提取的DNA完整性比较好。
采用紫外分光光度检测的结果也可以看出大部分样品的D260/D280在1.6-1.8之间，表明cpDNA的纯度较高(表1)。
表1棉花cpDNA D260及D280测定结果
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| D260D280D260/D280 | 0.140.081.75 | 0.200.121.67 | 0.200.111.72 | 0.180.111.82 | 0.160.091.78 | 0.210.121.75 |
试验品种为：陆地棉标准系Tm-1。
实施例2
棉花cpDNA为模板进行的RAPD反应
RAPD扩增程序参照本申请人所在的作物遗传改良国家重点实验室报道的方法(Lin et al.，2003)，所用随机引物及PCR试剂均购买自上海生工(http://www.sangon.com/)公司。该引物序列为：ACCGGTTCCC，PCR反应在GeneAmp PCR System 9700热循环仪上进行，PCR反应体积为20μl，其中含1x buffer、0.2mMdNTPs、1.5mM Mg2+、0.5mM primer、1U Taq酶和25ng DNA模板，剩余部分由ddH2O补足。热循环参数设置为：94℃预变性2min，94℃变性1min，36℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，然后于4℃冰箱中保存。产物在1.4％的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，紫外透射仪观察并照相。以所提取的cpDNA为模板进行RAPD反应，扩增图谱如图2所示。所有样品均扩增出较多且清晰的条带，没有拖尾的现象，表明所提取的cpDNA的质量足以进行后续的PCR扩增反应。
实施例3
PCR检测DNA提取和纯化效果：
psbA基因的启动子、终止子引物设计如下：
启动子引物：正向引物：5’-CCCGGGCAACCCATTTTTAGTATC-3’；反向引物：
5’-TTAATCATCAGGGACTCCCAAGCG-3’。
终止子引物：正向引物5′AGACTTTGGTTTTAGTGTATACGAG 3′；
反向引物5’-TGCCTTGATCCACTTGGCTACA-3’。
预期的扩增片段分别为310、380bp的psbA基因启动子和终止子片段。
20ul体系进行PCR扩增程序：
Taq polymerase 1mol/L，25mmol/L MgCl21.5μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，10×Buffer 2.5μL，10μmol/L正、反向引物各0.25μL，模板DNA40ng，总体积25μL。PCR反应程序：94℃预变性5min，接着94℃变性1min、58℃退火30s、72℃连接1min循环38次，最后72℃延伸5min。以提取的cpDNA为模板进行PCR反应，其扩增图谱如图2所示。
实施例4
psbA基因启动子克隆
对回收的psbA基因启动子、终止子目标片段，进行克隆测序，测序载体为PUCm-T，具体操作参照试剂盒上的说明书进行。用DNAMAN分析软件进行分析，确定所获片段的DNA序列情况，克隆到的psbA基因启动子全长312bp(图3)，所含的调控序列元件包括-35区(TTGACA)、-10区(TATACT)以及转录起始位点(AATAACAAGC)，还包含翻译调控序列RBS2(TGATGAT)。
实施例5
psbA基因终止子克隆
对回收的psbA基因终止子目标片段，进行克隆测序，测序载体为PUCm-T，具体操作参照试剂盒上的说明书进行，测序结果进行blastn分析，将获得的序列与公布棉花的叶绿体DNA序列进行同源性比较。用DNAMAN分析软件进行分析，确定所获片段的DNA序列情况
克隆到的psbA基因终止子全长为383bp(图5)。其中推测的转录终止子调控序列“AGGAGCAAT....N32...ATTGCTCCT”可形成发卡结构，以终止转录。
实施例6
TM-1与珂字312的叶绿体psbA基因启动子序列比较
对测序结果进行blastn分析，将获得的本发明中所用材料TM-1的叶绿体psbA基因启动子序列与已报道的棉花品种珂字312的叶绿体DNApsbA基因启动子序列(GENEBANK登陆号：NC-007944)进行同源性比较，结果表明，本发明获得的DNA片段与上述报道的棉花品种叶绿体DNA片段序列为100％同源，说明本发明制备分离的DNA确实为棉花叶绿体DNA，该DNA样品完全可以用于棉花叶绿体目标序列的克隆和分子生物学操作。
实施例7
TM-1与珂字312的叶绿体psbA基因终止子序列比较
测序结果进行blastn分析，将获得的本发明中所用材料TM-1的叶绿体psbA基因终止子序列与已经公布测序结果的棉花品种珂字312的叶绿体DNApsbA基因终止子序列(GENEBANK登陆号：NC-007944)进行同源性比较，结果表明，获得的DNA片段与已经测序的叶绿体DNA片段，为100％同源，分离的DNA确实为棉花叶绿体DNA，且能够用于目标序列的克隆，为棉花叶绿体基因工程的进一步开展奠定了良好基础。
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Claims (1)
1.一种分离棉花叶绿体DNA的方法，其特征在于，从棉花叶片的叶肉中分离出完整的叶绿体；对所述的叶绿体进行裂解，得到叶绿体DNA粗品，对该叶绿体DNA粗品进行纯化，得到叶绿体DNA纯品，按照以下步骤制备：
1)取幼嫩棉花叶片作为分离叶绿体的材料，将叶片置于4℃冰箱中黑暗处理24h，然后用于分离叶绿体或将该叶片转入到-70℃冰箱保存备用，取适量叶片，用冰块预先使榨汁机冷却，然后加入样品4倍体积预冷的4℃缓冲液A于榨汁机的容器中，迅速将样品投入缓冲液A中，启动榨汁机，匀浆约1min，然后用医用纱布过滤该匀浆，得到滤液；
2)将步骤1)的滤液分装到离心管中，于4℃下2500rpm离心10min，弃上清，得到沉淀；
3)向步骤2)的沉淀中加入缓冲液B，用移液枪吸打使沉淀悬浮，然后将悬浮液分装到的塑料离心管中，在4℃下2500rpm离心10min，弃上清；
4)用缓冲液C将沉淀重新悬浮，并将悬浮液转移到塑料离心管中，加入缓冲液C，4℃下2500rpm离心10min，弃上清，沉淀即为棉花叶绿体；
5)向步骤4)得到的叶绿体沉淀中加入缓冲液D，充分悬浮，得到悬浮液；
6)向步骤5)的悬浮液中依次加入终浓度为0.5％的十六烷基磺酸钠，终浓度为2％的十二烷基肌胺酸钠和浓度为10mg/ml的125μl蛋白酶K，充分摇匀，于37℃，保温3h，在保温期间间隔半小时轻轻摇动该悬浮液，得到含有cpDNA的消化液；
7)向步骤6)得到的消化液中加入体积比为25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇，抽提2-3次；
8)取上清液加入终浓度为0.02mol/l醋酸钠和2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃放置过夜，1000rpm离心30min，收集沉淀，用70％乙醇冲洗一遍，室温放置15min，12000rpm离心5min，风干叶绿体DNA，将叶绿体DNA溶于400μl的pH为8.0的TE溶液中，然后加入30ul的RNA酶(5mg/ml)，37℃，保温2h.；
9)再向步骤8)得到的经RNA酶消化的溶液中加入等体积氯仿，抽提2-3次，上清液加入终浓度为0.02mol/l醋酸钠和2.5倍体积的预冷无水乙醇，挑出叶绿体DNA，用70％乙醇浸泡2-3小时，浸泡期间用70％乙醇洗涤2-3次，弃去乙醇，风干，加TE溶液溶解，用分光光度计测定DNA浓度和纯度，得到提纯的叶绿体DNA；
其中，缓冲液的组分及配比如下：
缓冲液A
按重量体积计：
Tris 6.1g/L，
EDTA 9.3g/L，
Nacl 73.1g/L，
抗坏血酸 44.0g/L，
聚乙烯吡咯烷酮， 15.0g/L，
补充水分至1L，调pH至3.6；
缓冲液B
按重量体积计：
Tris 6.1g/L，
EDTA 9.3g/L，
Nacl 73.1g/L，
β-巯基乙醇 0.78g/L，
牛血清蛋白 1.0g/L，
补充水分至1L，调pH至8.0；
缓冲液C
按重量体积计：
150mmol/L Nacl 8.8g/L，
100Nacl EDTA 37.2g/L，
补充水分至1L，调pH至8.0；
缓冲液D
按重量体积计：
Tris 6.1g/L，
EDTA 9.3g/L，
二乙基二硫代氨基甲酸钠 1.0g/L，
补充水分至1L，调pH至8.0。
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