CN103215251B - 一种分离叶绿体dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分离叶绿体DNA的方法,包括下列步骤：以新鲜的叶片为材料,匀浆后,经过滤、滤液离心获得叶绿体；采用DNaseI、RNaseA和蛋白酶K酶解去除叶绿体外吸附的核DNA获得纯化的叶绿体；裂解叶绿体，纯化叶绿体DNA。与现有技术相比，提取时间节省了近一半，且制备分离的叶绿体DNA纯度较高,以分离的cpDNA为模板完全能够满足PCR和目标基因序列的克隆等常规分子生物学操作的需要，并且分离的cpDNA能够达到高通量测序中对实验样品的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离叶绿体DNA的方法。
背景技术
茶树（Camelliasinensis（L.））隶属于山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物，是我国重要的经济作物之一。因其含有儿茶素类、茶多酚和咖啡碱等多种药用和保健成份，广泛地受到人们的关注。
叶绿体是植物光合作用的器官，同时也是细胞内具有自主遗传信息的细胞器。伴随着生物技术的深入发展，人们发现叶绿体因基因组小,编码区及非编码区进化速率的差异而越来越多地被用于各类分类阶元的系统发育研究，叶绿体基因组结构和序列的信息在揭示物种起源、进化演变及其不同物种之间的亲缘关系等方面具有重要价值。而且,利用叶绿体基因工程来改良作物的产量及重要化合物的含量具有重要意义。
提取较高纯度的叶绿体DNA(cpDNA)是进行对叶绿体基因组测序及序列和结构分析的基础。目前最常用的叶绿体基因组提取纯化方法主要是在以下两种方法的基础上发展建立起来的：高盐缓冲方法和蔗糖或Percoll密度梯度法。在早期，赵衍（赵衍等，1986；1991）将调节低的pH来改变细胞器表面带电状况与蔗糖梯度离心相结合提取水稻cpDNA，龚小松（龚小松等，1991）又将低pH法和高盐缓冲结合起来，用于高粱的cpDNA的纯化，均得到很好的效果，而且操作也快速简便、省去密度梯度离心昂贵、耗时的步骤，对仪器的要求不高，成本较低。然而,茶树叶片具有很多丰富而特有的次生代谢物，在分离纯化叶绿体DNA过程中这些物质很容易被氧化，导致茶树叶绿体基因组DNA的提取因为其叶片的特殊结构和成分而困难重重，且仅采用高盐低pH方法仍有核基因组的污染，因此需要根据茶树叶片的特殊性质，建立一套适用于山茶属乃至所有高等植物的叶绿体DNA提取方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种分离叶绿体DNA的新方法。本发明的方法可以获得纯度很高且完整的叶绿体DNA。
本发明提供的分离叶绿体DNA的方法,包括叶绿体的提取、叶绿体外核DNA的去除和叶绿体DNA的提取三个步骤。
具体的，包括下列步骤：
（1）以新鲜的叶片为材料,匀浆后,经过滤、滤液离心获得叶绿体；
（2）采用DNaseI、RnaseA和蛋白酶K酶解去除叶绿体外吸附的核DNA；
（3）裂解叶绿体，纯化叶绿体DNA，最终得到了纯度非常高的完整的叶绿体DNA。
更为具体的，步骤（1）中：
所述新鲜叶片可为绿叶植物的叶片。优选茶树（Camelliasinensis（L.））的新鲜叶片。所述茶树可选任一品种的茶树。
新鲜叶片可直接用于分离叶绿体；或者也可将新鲜叶片于-80℃冰箱保存备用。
分离叶绿体前无需将叶片置于4℃冰箱中暗处理。
匀浆可采用普通家用榨汁机将叶片充分匀浆。
较佳的，匀浆前，榨汁机经预冷处理。
匀浆时，将叶片与预冷的缓冲液A混合匀浆。
所述缓冲液A的pH为3.6-3.8,每1000ml包括下列组分：
所述缓冲液A的制备方法如下:按比例称取EDTA-Na2，Tris，NaCl，抗坏血酸，加水混匀,调pH至3.6-3.8，再定容。
较佳的，缓冲液A预冷为2-8℃，匀浆时间为0.5-1min。
较佳的，新鲜叶片与缓冲液A的重量体积比为：30-50g:400ml。
较佳的，匀浆液经两层纱布过滤，过滤完毕后挤出残留的液体;再用四层纱布过滤，过滤完毕不要挤压,得到滤液。
滤液离心可采用常规速度。
较佳的，滤液离心包括下列步骤：
1）滤液分装后,100-300g离心3-10min,收集上清；
2）将步骤1）获得的上清液，1500-2500g离心10-15min，弃上清；用预冷的缓冲液B重悬沉淀并再次离心弃上清，多次重复此步骤；获得的沉淀即为叶绿体。
所述离心的温度优选4℃。
所述缓冲液B的pH为7.0-9.0,每1000ml包括下列组分：
所述缓冲液B（分离缓冲液）的配制方法如下：按比例将EDTA-Na2，Tris，NaCl加水混匀，调pH至8.0，再加入BSA和β-巯基乙醇,加水定容。
较佳的，新鲜叶片与缓冲液B的重量体积比为：30-50g:200-300ml。
本发明所述分离叶绿体DNA的方法中，所述步骤（2）具体包括下列步骤：
a.向步骤（1）获得的叶绿体中加入预冷的缓冲液C,2-8℃下1500-2500g离心10-15min,弃上清。
b.用缓冲液C重悬步骤a的沉淀，加入DNaseI和RNaseA,37℃反应5-10分钟,然后加入蛋白酶K37℃反应5-10分钟，再加入EDTA-Na2水溶液终止酶解；
c.将步骤b的酶解液用预冷的缓冲液D冲洗，2-8℃、3000-4000g离心15-20min弃上清，获得纯化的叶绿体。
所述缓冲液C的pH为7.0-9.0,每500ml包括下列组分：
所述缓冲液C（清洗缓冲液）的配制方法如下：按配比称取蔗糖，Tris，加双蒸水后，调pH，再加入BSA，并定容。
较佳的，新鲜叶片与步骤a所用缓冲液C的重量体积比为：30-50g:10-100ml
较佳的，新鲜叶片与DNaseI、RnaseA和蛋白酶K的比例为：30-50g新鲜叶片:5-15UDNaseI:100-300ugRNaseA:100-300ug蛋白酶K。
较佳的，加入EDTA-Na2水溶液使EDTA-Na2终浓度达到0.1-1.0mol/L终止酶解。
所述缓冲液D的pH为7.0-9.0,每1000ml包括下列组分：
所述缓冲液D（DNaseI清洗缓冲液）的配制方法如下：按配比称取EDTA-Na2，NaCl，Tris，NaF，加双蒸水,调pH至8.0，再加水定容。
较佳的，新鲜叶片与缓冲液D的重量体积比例为：30-50g：50-100ml。
获得纯化的叶绿体需马上镜检观察，立即用于后续DNA纯化步骤或置沉淀于-20℃长期保存。
纯化获得叶绿体后，可采用常规方法抽提DNA。
进一步改进的，从纯化的叶绿体中抽提DNA的具体包括下列步骤：
A.向纯化的叶绿体沉淀中加入裂解液，65℃裂解30-45min，加入RNaseA，室温-37℃静置5-10分钟获得消化液。
B.向步骤A得到的消化液中加入酚/氯仿/异戊醇混合液,抽提1次；取上清，加入氯仿/异戊醇混合液抽提1次；
C.取上清液加入预冷的异丙醇和1/10体积的5-10mol/L乙酸盐,-20℃放置10-30min,10000-14000rpm离心10-20min,收集沉淀,用70-95v%乙醇冲洗并晾干；
D.加入TE缓冲液溶解。
较佳的，步骤A所用裂解液为PlantDNAzol植物基因组DNA快速提取试剂（杭州莱枫生物科技有限公司）。在裂解叶绿体时，采用该裂解液仅需约30min。
裂解时，如采用室温以上温度，可采用水浴。
步骤B中，所述酚/氯仿/异戊醇混合液中酚：氯仿：异戊醇的体积比为25∶24∶1；氯仿/异戊醇混合液中氯仿：异戊醇的体积比为24∶1。
步骤C中，所述乙酸盐为乙酸钾、乙酸胺和乙酸钠中的至少一种。
步骤D所用TE缓冲液为pH8.0含10mmol/LTris-HCl及1mmol/LEDTA-Na2的水溶液。
TE溶液为如下方法制备得到的溶液:将浓度为lmol/LpH8.0的Tris·Cl水溶液和浓度为0.5mol/LpH8.0的EDTA-Na2水溶液按比例混合，再加入已灭菌的双蒸水定容。
较佳的，新鲜叶片与所用裂解液、酚/氯仿/异戊醇混合液、氯仿/异戊醇混合液和预冷的异丙醇的重量体积比均为：30-50g：1-5ml。新鲜叶片与5-10mol/L乙酸盐的重量体积比均为：30-50g：100-500ul。
上述优选条件均可任意组合。
与现有技术相比，本发明提取叶绿体DNA的时间节省了近一半，且制备分离的叶绿体DNA纯度较高。紫外分光光度计检测表明,本发明制备的DNA样品的D260nm/D280nm在1.8-2.0之间；产率高达10μgcpDNA/g叶片样品。经过验证,以分离的cpDNA为模板完全能够满足PCR和目标基因序列的克隆等常规分子生物学操作的需要，并且分离的cpDNA能够达到高通量测序中对实验样品的要求。
附图说明
图1为实施例1提取的叶绿体DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为实施例1中DNA用叶绿体特异性引物和核基因特异性引物PCR结果；
图3为实施例2提取的叶绿体DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为实施例3提取的叶绿体DNA的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为常规生化试剂公司购买得到。
实例所采用的分离叶绿体DNA的基本步骤如下：
I．叶绿体的提取，包括如下步骤(1)至步骤(3):
（1）取新鲜茶树叶片用于分离叶绿体或将该叶片转入到-80℃冰箱保存备用,无需将叶片置于4℃冰箱中暗处理,取10-50g叶片置于预冷的榨汁机中,加入300-500ml4℃预冷的缓冲液A,匀浆0.5-1min。匀浆液经两层纱布过滤，过滤完毕后挤出残留的液体;再用四层纱布过滤，过滤完毕不要挤压,得到滤液。
（2)将步骤（1)的滤液分装到50ml离心管中,于4℃下100-300g离心3-10min,取上清，重复此步骤。
（3)将步骤（2)的上清液在4℃下2000g离心10min，弃上清，向沉淀中加入25ml预冷的缓冲液B,用移液枪吸打使沉淀悬浮,在4℃下2000g离心10min,弃上清；重复此步骤，沉淀即为茶树叶绿。
II．叶绿体外核DNA的去除，包括如下步骤(4)至步骤(6):
（4）向步骤（3）沉淀中加入15ml预冷的缓冲液C,4℃下2000g离心10min,弃上清。
（5）向步骤（4）沉淀中加4mL缓冲液C重悬浮，使终体积约为5mL,溶液中加入10ulDNaseI(浓度1U/ul)和10ulRNaseA(20mg/ml),同时加入2ul25mmol/LMgCl2混合均匀,37℃温浴5min；然后加入10ul蛋白酶K(10mg/ml),混合均匀，37℃温浴5min；向反应溶液中加入2mL0.5mol/LEDTA-Na2，使终浓度达到0.2mol/L，终止酶解。
（6)加入50mL预冷的缓冲液D冲洗，4℃、3500g离心20min，弃上清。沉淀即为纯化的叶绿体。马上镜检观察，溶解或置沉淀于-20℃长期保存。
III．叶绿体DNA的提取，包括如下步骤(7)至步骤(10):
（7)向步骤（6)得到的纯净的叶绿体沉淀中加入3-5ml裂解液，65℃水浴30min，加入10ulRNaseA(20mg/ml)，室温——37℃静置5min。所述裂解液为PlantDNAzol植物基因组DNA快速提取试剂。
（8)向步骤（7)得到的消化液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),抽提1次；取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提1次。
（9)取上清液加入等体积预冷的异丙醇和1/10体积的5-10mol/L乙酸盐,-20℃放置10-30min,12000rpm离心15min,收集沉淀,用75％乙醇冲洗两遍,室温晾干。
（10）加入100μlTE（pH8.0）溶解。用分光光度计测定DNA浓度和纯度,得到纯净的叶绿体DNA。
所述方法中,所述茶树样品、所述缓冲液A、所述缓冲液B、所述缓冲液C、所述DNaseI、所述RNase、所述蛋白酶K、步骤(5)的所述EDTA-Na2水溶液、所述缓冲液D、所述裂解液、步骤(9)的所述乙酸盐水溶液和所述TE溶液的配比为:30-50g茶树样品:400ml缓冲液A:200-300ml缓冲液B:10-100ml缓冲液C:5-10UDNaseI:100-300ugRNaseA:100-300ug蛋白酶K：2ml0.5mol/LpH8.0的EDTA·Na2溶液:50-100ml缓冲液D:1-5ml裂解液:100-500ul的5-10mol/L乙酸盐水溶液:50-200ulTE溶液。
步骤(2)中,所述的离心参数具体可为:200g3-10分钟;步骤(3)、(4)中,所述的离心参数具体为:2000g10-15分钟;步骤(6)中,所述离心的参数为:3500g15-20分钟。
步骤(5)具体可为,向步骤（4）沉淀中加入所述缓冲液C、DNaseI和RNaseA后,37℃反应5-10分钟,然后加入蛋白酶K37℃反应5-10分钟，再加入所述EDTA-Na2水溶液。
步骤(7)具体可为，所步骤（6）所述叶绿体加入所述裂解液，所述裂解液为PCB裂解液，65℃裂解30-45min。
步骤(7)中,在步骤(6)的溶液中加入所述RNaseA,37℃水浴5-10分钟。
步骤(9)中,所述乙酸盐为乙酸钾、乙酸胺和乙酸钠中的至少一种。
试剂配方：
缓冲液A,每1000ml包括下列组分：
缓冲液B,每1000ml包括下列组分：
缓冲液C,每500ml包括下列组分：
所述缓冲液D,每1000ml包括下列组分：
实施例1
茶树叶绿体DNA的提取
缓冲液的配制：
缓冲液A（提取缓冲液）的配制方法如下：称取7.45gEDTA-Na2，6.05gTris，73gNaCl，44g抗坏血酸，加双蒸水至800ml,调pH至3.6，再加水定容至1000ml。
缓冲液B（分离缓冲液）的配制方法如下：称取7.45gEDTA-Na2，6.05gTris，73gNaCl，加双蒸水至800ml,调pH至8.0，再加入1gBSA，2mlβ-巯基乙醇,加水定容至1000ml。
缓冲液C（清洗缓冲液）的配制方法如下：称取6.48g蔗糖，3.03gTris，加双蒸水至400ml，调pH至8.0，再加入0.5gBSA，并定容至500ml。
缓冲液D（DNaseI清洗缓冲液）的配制方法如下：称取18.61gEDTA-Na2，73gNaCl，6.05gTris，2.05gNaF，加双蒸水至800ml,调pH至8.0，再加水定容至1000ml。
TE溶液的制备方法如下:取1ml，浓度为lmol/LpH8.0的Tris·Cl水溶液和200ul，浓度为0.5mol/LpH8.0的EDTA-Na2水溶液，再加入已灭菌的双蒸水定容至100ml。
（1）取新鲜茶树叶片50g,加入400ml4℃预冷的缓冲液A,匀浆1min。匀浆液经两层纱布过滤，过滤完毕后挤出残留的液体;再用四层纱布过滤，过滤完毕不要挤压,得到滤液。
（2）将步骤（1)的滤液分装到50ml离心管中,于4℃下200g离心3-5min,取上清，重复此步骤。
（3)将步骤（2)的上清液在4℃下2000g离心10min，弃上清,加入25ml预冷的缓冲液B,用移液枪吸打使沉淀悬浮,在4℃下2000g离心10min,弃上清；重复此步骤,沉淀即为茶树叶绿体。
所述叶绿体外核DNA的去除包括如下步骤(4)至步骤(6):
(4)向步骤（3）沉淀中加入15ml预冷的缓冲液C,4℃下2000g离心10min,弃上清。
(5)向步骤（4）沉淀中加4mL缓冲液C重悬浮，使终体积约为5mL,溶液中加入10ulDNaseI(浓度1U/ul)和10ulRNaseA(20mg/ml),同时加入2ul25mmol/LMgCl2混合均匀,37℃温浴5min；然后加入10ul蛋白酶K(10mg/ml),混合均匀，37℃温浴5min；向反应溶液中加入2mL0.5mol/LEDTA-Na2，使终浓度达到0.2mol/L，终止酶解。
（6)加入50mL预冷的缓冲液D冲洗，4℃、3500g离心20min，弃上清。沉淀即为纯化的叶绿体。
所述叶绿体DNA的提取包括如下步骤(7)至步骤(10):
（7）向步骤（6)得到的纯净的叶绿体沉淀中加入3ml裂解液PCB，65℃水浴30min，加入10ulRNaseA(20mg/ml)，室温静置5min。
（8）向步骤（7)得到的消化液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),抽提1次；取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提1次。
（9)取上清液加入等体积预冷的异丙醇和1/10体积的5mol/L乙酸钠,-20℃放置30min,12000rpm离心15min,收集沉淀,用75％乙醇冲洗两遍，室温晾干。
（10）加入100μlTE（pH8.0）溶解。
用分光光度计测定DNA浓度为30ng/ul，OD260/OD280比值为1.83，显示纯度较好。
将叶绿体DNA进行琼脂糖凝胶电泳,见图1。
（11）以步骤（10）中的DNA为模板，进行PCR扩增。
核基因组特异性引物序列：Primer_F:TAGCAATGGTGGAAGAGTGCPrimer_R:GTGGGCGATGAAACTGATG
叶绿体基因组特异性引物序列：Primer_F:TCATTGCTGCTCCTCCAGTAPrimer_R:GAAAAACTTCCTTGACCGATTG
PCR体系：
PCR循环条件：94℃，5min;
94℃，30s;
55℃，30s;
72℃，30s;30cycles;
72℃，10min;4℃，hold
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,见图2。
实施例2
山茶叶绿体DNA的提取
缓冲液的配制：
缓冲液A（提取缓冲液）的配制方法如下：称取6gEDTA-Na2，4gTris，60gNaCl，50g抗坏血酸，加双蒸水至800ml,调pH至3.7，再加水定容至1000ml。
缓冲液B（分离缓冲液）的配制方法如下：称取6gEDTA-Na2，4gTris，73g60gNaCl，加双蒸水至800ml,调pH至7.0，再加入0.3gBSA，1.5mlβ-巯基乙醇,加水定容至1000ml。
缓冲液C（清洗缓冲液）的配制方法如下：称取6g蔗糖，2gTris，加双蒸水至400ml，调pH至7.0，再加入1.5gBSA，并定容至500ml。
缓冲液D（DNaseI清洗缓冲液）的配制方法如下：称取15gEDTA-Na2，60gNaCl，4gTris，1gNaF，加双蒸水至800ml,调pH至7.0，再加水定容至1000ml。
TE溶液的制备方法如下:取1ml，浓度为lmol/LpH8.0的Tris·Cl水溶液和200ul，浓度为0.5mol/LpH8.0的EDTA·Na2水溶液，再加入已灭菌的双蒸水定容至100ml。
（1）取新鲜山茶叶片50g,加入400ml4℃预冷的缓冲液A,匀浆1min。匀浆液经两层纱布过滤，过滤完毕后挤出残留的液体;再用四层纱布过滤，过滤完毕不要挤压,得到滤液。
（2）将步骤（1)的滤液分装到50ml离心管中,于4℃下200g离心3-5min,取上清，重复此步骤。
（3)将步骤（2)的上清液在4℃下2000g离心10min，弃上清,加入25ml预冷的缓冲液B,用移液枪吸打使沉淀悬浮,在4℃下2000g离心10min,弃上清；重复此步骤,沉淀即为茶树叶绿体。
所述叶绿体外核DNA的去除包括如下步骤(4)至步骤(6):
(4)向步骤（3）沉淀中加入15ml预冷的缓冲液C,4℃下2000g离心10min,弃上清。
(5)向步骤（4）沉淀中加4mL缓冲液C重悬浮，使终体积约为5mL,溶液中加入10ulDNaseI(浓度1U/ul)和10ulRNaseA(20mg/ml),同时加入2ul25mmol/LMgCl2混合均匀,37℃温浴5min；然后加入10ulProteinaseK(10mg/ml),混合均匀，37℃温浴5min；向反应溶液中加入2mL0.5mol/LEDTA-Na2，使终浓度达到0.2mol/L，终止酶解。
（6)加入50mL预冷的缓冲液D冲洗，4℃、3500g离心20min，弃上清。沉淀即为纯化的叶绿体。
所述叶绿体DNA的提取包括如下步骤(7)至步骤(10):
（7）向步骤（6)得到的纯净的叶绿体沉淀中加入3ml裂解液PCB，65℃水浴30min，加入10ulRNaseA(20mg/ml)，室温静置5min。
（8）向步骤（7)得到的消化液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),抽提1次；取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提1次。
（9)取上清液加入等体积预冷的异丙醇和1/10体积的5mol/L乙酸钠,-20℃放置30min,12000rpm离心15min,收集沉淀,用75％乙醇冲洗两遍,室温晾干。
（10）加入100μlTE（pH8.0）溶解。
用分光光度计测定DNA浓度和纯度为25ng/ul，OD260/OD280比值为1.85，显示纯度较好。
将叶绿体DNA进行琼脂糖凝胶电泳,见图3。
实施例3
菝葜叶绿体DNA的提取
缓冲液的配制：
缓冲液A（提取缓冲液）的配制方法如下：称取9gEDTA-Na2，8gTris，100gNaCl，30g抗坏血酸，加双蒸水至800ml,调pH至3.8，再加水定容至1000ml。
缓冲液B（分离缓冲液）的配制方法如下：称取9gEDTA-Na2，8gTris，100gNaCl，加双蒸水至800ml,调pH至9.0，再加入3gBSA，3mlβ-巯基乙醇,加水定容至1000ml。
缓冲液C（清洗缓冲液）的配制方法如下：称取9g蔗糖，4gTris，加双蒸水至400ml，调pH至9.0，再加入0.2gBSA，并定容至500ml。
缓冲液D（DNaseI清洗缓冲液）的配制方法如下：称取30gEDTA-Na2，100gNaCl，8gTris，3gNaF，加双蒸水至800ml,调pH至9.0，再加水定容至1000ml。
TE溶液的制备方法如下:取1ml，浓度为lmol/LpH8.0的Tris·Cl水溶液和200ul，浓度为0.5mol/LpH8.0的EDTA·Na2水溶液，再加入已灭菌的双蒸水定容至100ml。
（1）取新鲜菝葜叶片50g,加入400ml4℃预冷的缓冲液A,匀浆1min。匀浆液经两层纱布过滤，过滤完毕后挤出残留的液体;再用四层纱布过滤，过滤完毕不要挤压,得到滤液。
（2）将步骤（1)的滤液分装到50ml离心管中,于4℃下200g离心3-5min,取上清，重复此步骤。
（3)将步骤（2)的上清液在4℃下2000g离心10min，弃上清,加入25ml预冷的缓冲液B,用移液枪吸打使沉淀悬浮,在4℃下2000g离心10min,弃上清；重复此步骤,沉淀即为茶树叶绿体。
所述叶绿体外核DNA的去除包括如下步骤(4)至步骤(6):
(4)向步骤（3）沉淀中加入15ml预冷的缓冲液C,4℃下2000g离心10min,弃上清。
(5)向步骤（4）沉淀中加4mL缓冲液C重悬浮，使终体积约为5mL,溶液中加入10ulDNaseI(浓度1U/ul)和10ulRNaseA(20mg/ml),同时加入2ul25mmol/LMgCl2混合均匀,37℃温浴5min；然后加入10ul蛋白酶K(10mg/ml),混合均匀，37℃温浴5min；向反应溶液中加入2mL0.5mol/LEDTA-Na2，使终浓度达到0.2mol/L，终止酶解。
（6)加入50mL预冷的缓冲液D冲洗，4℃、3500g离心20min，弃上清。沉淀即为纯化的叶绿体。
所述叶绿体DNA的提取包括如下步骤(7)至步骤(10):
(7)向步骤（6)得到的纯净的叶绿体沉淀中加入3ml裂解液PCB，65℃水浴30min，加入10ulRNaseA(20mg/ml)，室温静置5min。
(8)向步骤（7)得到的消化液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),抽提1次；取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提1次。
(9)取上清液加入等体积预冷的异丙醇和1/10体积的5mol/L乙酸钠,-20℃放置30min,12000rpm离心15min,收集沉淀,用75％乙醇冲洗两遍,室温晾干。
（10）加入100μlTE（pH8.0）溶解。
将叶绿体DNA进行琼脂糖凝胶电泳,见图4。
Claims (5)
1.一种分离茶树、山茶或菝葜叶绿体DNA的方法,包括下列步骤：
(1)以新鲜的叶片为材料,匀浆后,经过滤、滤液离心获得叶绿体；
(2)采用DNaseI、RnaseA和蛋白酶K酶解去除叶绿体外吸附的核DNA获得纯化的叶绿体；
(3)裂解叶绿体，纯化叶绿体DNA；
进行PCR扩增：
核基因组特异性引物序列：Primer_F:TAGCAATGGTGGAAGAGTGC
Primer_R:GTGGGCGATGAAACTGATG
叶绿体基因组特异性引物序列：Primer_F:TCATTGCTGCTCCTCCAGTA
Primer_R:GAAAAACTTCCTTGACCGATTG；
所述步骤(2)具体包括下列步骤：
a.向步骤(1)获得的叶绿体中加入预冷的缓冲液C,2-8℃下1500-2500g离心10-15min,弃上清；
b.用缓冲液C重悬步骤a的沉淀，加入DNaseI和RNaseA,37℃反应5-10分钟,然后加入蛋白酶K37℃反应5-10分钟，再加入EDTA-Na2水溶液终止酶解；
c.将步骤b的酶解液用预冷的缓冲液D冲洗，2-8℃、3000-4000g离心15-20min弃上清，获得纯化的叶绿体；
所述缓冲液C的pH为7.0-9.0,每500ml包括下列组分：
所述缓冲液D的pH为7.0-9.0,每1000ml包括下列组分：
所述更为具体的，步骤(1)中，匀浆时，将叶片与预冷的缓冲液A混合匀浆，所述缓冲液A的pH为3.6-3.8,每1000ml包括下列组分：
步骤(1)中，滤液离心包括下列步骤：
1)滤液分装后,100-300g离心3-10min,收集上清；
2)将步骤1)获得的上清液，1500-2500g离心10-15min，弃上清；用预冷的缓冲液B重悬沉淀并再次离心弃上清，多次重复此步骤；获得的沉淀即为叶绿体；
所述缓冲液B的pH为7.0-9.0,每1000ml包括下列组分：
30-50g:400ml；所述新鲜叶片与所述缓冲液B的重量体积比为：30-50g:200-300ml；新鲜叶片与步骤a所用缓冲液C的重量体积比为：30-50g:10-100ml；新鲜叶片与缓冲液D的重量体积比例为：30-50g：50-100ml；新鲜叶片与DNaseI、RnaseA和蛋白酶K的比例为：30-50g新鲜叶片:5-10UDNaseI:100-300ugRNaseA:100-300ug蛋白酶K；
所述步骤(3)具体包括下列步骤：
A.向纯化的叶绿体中加入裂解液，65℃裂解30-45min，加入RNaseA，室温-37℃静置5-10分钟获得消化液，所用裂解液为PlantDNAzol植物基因组DNA快速提取试剂；
B.向步骤A得到的消化液中加入酚/氯仿/异戊醇混合液,抽提1次；取上清，加入氯仿/异戊醇混合液抽提1次；
C.取上清液加入预冷的异丙醇和1/10体积的5-10mol/L乙酸盐,-20℃放置10-30min,10000-14000rpm离心10-20min,收集沉淀,用70-95v％乙醇冲洗并晾干；
加入TE缓冲液溶解。
2.如权利要求1所述分离茶树、山茶或菝葜叶绿体DNA的方法,其特征在于，所述步骤b中，加入EDTA-Na2水溶液使EDTA-Na2终浓度达到0.1-1.0mol/L终止酶解。
3.如权利要求1所述分离茶树、山茶或菝葜叶绿体DNA的方法,其特征在于，步骤B中，所述酚/氯仿/异戊醇混合液中酚：氯仿：异戊醇的体积比为25∶24∶1；氯仿/异戊醇混合液中氯仿：异戊醇的体积比为24∶1。
4.如权利要求1所述分离茶树、山茶或菝葜叶绿体DNA的方法,其特征在于，步骤(3)的步骤B中，所述乙酸盐为乙酸钾、乙酸胺和乙酸钠中的至少一种。
5.如权利要求1所述分离茶树、山茶或菝葜叶绿体DNA的方法,其特征在于，新鲜叶片与所用裂解液、酚/氯仿/异戊醇混合液、氯仿/异戊醇混合液和预冷的异丙醇的重量体积比均为：30-50g：1-5ml；新鲜叶片与5-10mol/L乙酸盐的重量体积比为：30-50g：10-50ul。
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