CN101348784A - 一种提取食用油脂中核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取食用油脂中核酸的方法，按照以下步骤进行：(1)食用油脂中极性成分的萃取，采用水作为萃取剂，用离心的方法进行油液分离；(2)萃取液的浓缩，全部转移萃取液于电热恒温干燥设备或其它干燥设备内，充分干燥；(3)食用油脂中DNA的粗提；(4)粗提DNA的纯化。本方法适用于初榨大豆油、菜籽油、玉米油，精炼大豆油、菜籽油、玉米油、多种调和油，以及花生油、芝麻油、橄榄油、棉籽油、棕榈油等食用油脂的适用于PCR或相应下游实验的DNA的提取。

Description

一种提取食用油脂中核酸的方法

技术领域

本发明涉及一种提取食用油脂中核酸的方法。

背景技术

DNA提取技术的建立是保障PCR或相应下游实验顺利进行的关键，到目前为止，保存较好的生物材料、加工或部分深加工生物材料基本均可做到利用生物技术领域熟知的DNA提取技术(普通DNA提取试剂或利用市售特殊装置如：纯化柱法、磁珠法、超滤离心法等)顺利完成适用DNA的提取过程。就利用PCR等技术进行下游实验而言，许多实验室经常遇到特殊的实验材料难以提取到适用于PCR或相应下游实验的DNA的问题，食用油脂是该特殊实验材料中的一种。多年来，国内外诸多相关实验室均力图建立可重复的、稳定的食用油脂中适用于PCR或相应下游实验的DNA提取方法，但至今尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可重复的、稳定的食用油脂中适用于PCR的DNA的提取方法。

为了达到上述目的，本发明所述的提取食用油脂中核酸的方法，按照以下步骤进行：

(1)食用油脂中极性成分的萃取

采用水作为萃取剂，用离心的方法进行油液分离；

(2)萃取液的浓缩

全部转移萃取液于电热恒温干燥设备或其它干燥设备内，充分干燥；

(3)食用油脂中DNA的粗提；

(4)粗提DNA的纯化。

上述步骤(1)中，在萃取过程中，必须采取离心等方法去除油水界面物质，根据下层水相浑浊程度分多次共需萃取初榨大豆油约400mL-600mL、初榨菜籽油约700mL-1000mL、初榨玉米油约700mL-1000mL、各种精练油约2000-3000mL、花生油、芝麻油等约400mL-600mL、棕榈油600mL-800mL。

当待测油脂为初榨大豆油时，步骤(3)中DNA的粗提按照以下方法进行：取预热至约80-90℃ CTAB提取液8-10mL，分多次小心洗下表面皿上干燥的萃取物，吸取洗下的萃取物转移至15mL离心管。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7500×g室温离心10min；分别小心吸取上清至另一15mL离心管，再次加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，操作同上，小心吸取上清，上清加入0.2至0.3倍体积的预冷异丙醇，充分上下倒置混匀，置0℃约20-40min后10000-12 500×g，4℃离心6min，沉淀置0℃待用；上清于27 000-30 000×g，4℃离心10min，弃取上清，沉淀加入500μL 70％-80％预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27 000-30 000×g，4℃离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥；上述10 000-12 500×g离心所获沉淀加入约1200μL 70％-80％预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27 000-30 000×g，4℃离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。

当待测的油脂为初榨菜籽油、玉米油、花生油、芝麻油、棕榈油、棉籽油或各种精炼油等时，步骤(3)中DNA的粗提按照以下方法进行：取预热至约80-90℃ CTAB提取液8-10mL，充分溶解干燥的萃取物于15mL离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7 500×g室温离心10min；上清按1/10体积加入3M NaAc，混匀，加入LA溶液，混匀，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置约40min-60min后，27 000-30 000×g，4℃离心10min，弃取上清，沉淀加入500μL 70％-80％预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27 000-30 000×g，4℃离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。

所述步骤(4)粗提DNA的利用特制的长片段核酸富集纯化装置来进行，该长片段核酸富集纯化装置包括一个筒状主体1，在两端开口端口包覆半透膜2，在筒状主体上设有取液孔3和加样槽4，取样孔3带有胶塞5。在加样槽下方的部分筒状主体内充填有琼脂糖凝胶，而取液孔下方的部分筒状主体保持为空腔，用作注入电泳缓冲液。具体的操作方法如下：

(a)电泳槽加入电泳缓冲液；

(b)取液孔下方的部分筒状主体的空腔加满电泳缓冲液，并盖紧取液孔胶塞；

(c)将核酸富集纯化装置浸入电泳槽内电泳缓冲液中；

(d)待纯化核酸与上样缓冲液(含指示染料)混匀后，加入到加样槽，并通电；

(e)待指示染料条带全部进入取液孔下方缓冲液中，弃去取液孔下方的缓冲液；

(f)重新注满电泳缓冲液于取液孔下方的空腔，盖紧取液孔胶塞，重新放入电泳槽中，继续通电电泳，收集取液孔下方空腔的缓冲液进行酚氯仿抽提。

本方法适用于初榨大豆油、菜籽油、玉米油，精练大豆油、菜籽油、玉米油、多种调和油，以及花生油、芝麻油、橄榄油、棉籽油、棕榈油等食用油脂的适用于PCR或相应下游实验的DNA的提取。以下将通过本具体地实施方式来对本发明进行详细的描述。

附图说明

图1A大豆油内源基因检测电泳图谱；

图1B菜籽油内源基因检测电泳图谱

图1C玉米油内源基因检测电泳图谱

图1D其余多种植物油内源基因检测电泳图谱；

图1E其余多种植物油内源基因检测电泳图谱

图2A初榨大豆油、精炼大豆油内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)

图2B初榨大豆油、精练大豆油抗除草剂基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)

图2C初榨大豆油、精练大豆油NOS终止子基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)

图2D初榨大豆油、精练大豆油35S启动子基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)

图2E初榨菜籽油、精练菜籽油内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)

图2F初榨玉米油、精练玉米油内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)

图2G花生油、芝麻油、棉籽油、棕榈油、橄榄油植物内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)

图3如图所示为所述的长片段核酸富集纯化装置的结构示意图

具体实施方式

1.试剂(全部试剂均为生物级别或优级纯级别)

1.1生物级别用水

1.2CTAB裂解液：3％CTAB(w/w)，1.4mmol/L氯化钠，0.2％(v/v)巯基乙醇，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl，pH 8.0

1.3TE缓冲液(pH 8.0)：量取10mL 1mol/L Tris-Cl(pH8.0)和2mL 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，加水定容至1000mL，分装后高压灭菌备用

1.4酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)

1.5异丙醇

1.675％乙醇(v/v)

1.7LA溶液

1.8溴化乙锭：1mg/mL

1.9DNA：分子量标记物100bp-2000bp、1000-20000bp

1.10琼脂糖

1.11 50×TAE缓冲液：称取484g Tris，量取114.2mL冰乙酸，200mL 0.5mol/LEDTA(pH 8.0)，溶于蒸馏水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用。使用时，50倍稀释

1.12 10×上样缓冲液：含0.25％溴酚蓝(w/v)，0.25％二甲苯青FF(w/v)，30％甘油(v/v)水溶液

1.13氯化镁

1.14dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP

1.15Taq DNA聚合酶

1.16引物和探针：引物浓度为20pmol/L，探针浓度为20pmol/L

1.17DNA：分子量标记100bp-2000bp

1.18PCR反应缓冲液

1.19UNG酶

2.设备和材料

2.1高速冷冻离心机(最高转速18 000r/min)

2.2台式离心机(最高转速18 000r/min)

2.3微型个人离心机

2.4双温水浴(37℃±1℃、65℃±1℃)

2.5制冰机

2.6电热恒温鼓风干燥箱或其它干燥设备

2.7冰箱(2℃～8℃、-20℃)

2.8超纯水发生器(分子生物学级别)

2.9双蒸水器

2.10生物安全柜

2.11高压灭菌锅

2.12核酸真空干燥系统

2.13核酸蛋白分析仪

2.14凝胶成像分析系统

2.15电泳仪

2.16电泳槽

2.17实时荧光定量PCR仪

2.18基因扩增仪

2.19PCR反应管：200μL

2.20超净工作台

2.21微量可调移液器及配套吸头(2.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL、50μL～200μL、100μL～1000μL、500μL～5000μL)。

2.22离心管(1.5mL、2mL、15mL、50mL)。

2.23表面皿(直径15cm-20cm)

3.实验方法

3.1食用油脂中极性成分的萃取

取50mL离心管4支，每支分别加入25mL双蒸水；每支分别加入25mL油样(棕榈油需加入适量正己烷，使其在室温下呈溶解状态)，充分震荡2min(约300次)，10 000×g室温离心5min，弃取上层油液；再次加入油样，同上震荡、离心，并弃上层油液；同上述操作反复萃取至下层水相尽量浑浊，在萃取过程中，必须采取离心等方法去除油水界面物质，根据下层水相浑浊程度分多次共需萃取初榨大豆油约400mL-600mL、初榨菜籽油约700mL-1000mL、初榨玉米油约700mL-1000mL、各种精练油约2000-3000mL、花生油、芝麻油等约400mL-600mL、棕榈油600mL-800mL。样品极性成分过低可适当增加样品量。

3.2萃取液的浓缩

全部转移萃取液(下层水相)分多次置一表面皿中，于电热恒温鼓风干燥箱或其它干燥设备内，充分干燥。

3.3食用油脂中DNA的粗提

3.3.1初榨油脂(植物油)中的DNA粗提

3.3.1.1初榨大豆油中DNA的粗提

取预热至约80-90℃ CTAB提取液8-10mL，分多次小心洗下表面皿上干燥的萃取物，吸取洗下的萃取物转移至15mL离心管。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7 500×g室温离心10min；分别小心吸取上清至另一15mL离心管，再次加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，操作同上，小心吸取上清，上清加入0.2至0.3倍体积的预冷异丙醇，充分上下倒置混匀，置0℃约20-40min后10 000-12 500×g，4℃离心6min，沉淀置0℃待用；上清于27 000-30 000×g，4℃离心10min，弃取上清，沉淀加入500μL 70％-80％预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27 000-30 000×g，4℃离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥；上述10 000-12 500×g离心所获沉淀加入约1200μL 70％-80％预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27 000-30 000×g，4℃离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。

取预热至约80-90℃ TE缓冲液溶解干燥提取物，此为初榨大豆油DNA粗提物。

3.3.1.2初榨菜籽油中DNA的粗提

取预热至约80-90℃ CTAB提取液8-10mL，分多次洗下表面皿上干燥的萃取物，吸取洗下的萃取物转移至15mL离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7 500×g室温离心10min；上清按1/10体积加入3M NaAc，混匀，加入LA溶液，混匀，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置约40min-60min后，27 000-30 000×g，4℃离心10min，弃取上清，沉淀加入500μL 70％-80％预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27 000-30 000×g，4℃离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。

加入适量预热至约80-90℃的TE缓冲液充分溶解干燥提取物，此为初榨菜籽油DNA粗提物。

3.3.1.3初榨玉米油中DNA的粗提

同初榨菜籽油。

3.3.1.4各种精练油中DNA的粗提

同初榨菜籽油。

3.3.1.5花生油、芝麻油、棕榈油等油脂中DNA的粗提

同初榨菜籽油。

3.4粗提DNA的纯化

按2μL上样缓冲液/15μL样品的比例加入10×上样缓冲液(含指示染料)于DNA粗提物，混匀。

利用特制的长片段核酸富集纯化装置，按操作说明纯化并收集纯化液。如图所示为所述的长片段核酸富集纯化装置的结构示意图。该装置包括一个透明的筒状主体1，在两端开口端口通过密封胶盖8包覆半透膜2，在筒状主体上设有取液孔3和加样槽4，取样孔3带有胶塞5。在加样槽下方的部分筒状主体内充填有琼脂糖凝胶，而取液孔下方的部分筒状主体保持为空腔，用作注入电泳缓冲液。具体的操作说明如下：

(a)电泳槽加入电泳缓冲液；

(b)打开核酸富集纯化装置取液孔胶塞5，用一次性滴管加电泳缓冲液于取液孔内，至加满，盖紧取液孔胶塞；

(c)将核酸富集纯化装置浸入电泳槽内电泳缓冲液中；

(d)待纯化核酸与上样缓冲液(含指示染料)混匀后，加入到加样槽，打开电源，按10V/cm调整电压，并通电；指示染料的分子量比目标核酸的分子量稍小。

(e)待指示染料条带全部进入取液孔下方缓冲液中(即或继续电泳30-60min)，从电泳槽取下富集纯化装置，打开取液孔胶塞，用另一支一次性滴管吸出取液孔内全部液体，加入少量电泳缓冲液于取液孔内，反复小心吸排冲洗后吸出；当指示染料条全部进入取液孔下方缓冲液中时，表明分子量比染料的分子量小的DNA等杂质已从凝胶进入到取液孔下方的缓冲液中，并且由于半透膜的截留，这些杂质停留在取液孔下方的缓冲液中，弃去这部分缓冲液，则去除了分子量比目的DNA小的杂质。

(f)重新注满电泳缓冲液于取液孔内，盖紧取液孔胶塞，重新放入电泳槽中，继续通电，约5-6小时(可适当延长时间)后，关闭电源；

(g)打开取液孔胶塞，用另一支干净的一次性滴管吸出取液孔下方全部液体，于一支1.5mL或2mL离心管，加入少量电泳缓冲液于取液孔内，反复小心吸排冲洗后吸出并同样转移至该离心管，尽量控制总体积在1.6mL内；

混匀上述(g)步骤收集的液体采用酚/氯仿法再次抽提。具体方法为：加入等体积酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7500×g室温离心10min；分别小心吸取上清至另一1.5mL离心管，按1/10体积加入3M NaAc，混匀，加入LA溶液，混匀，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置约40min-60min后，27 000-30 000×g，4℃离心10min，弃取上清，沉淀加入500μL 70％-80％预冷的乙醇，充分上下倒置混匀以清洗沉淀，27000-30000×g，4℃离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。

取预热至约80-90℃TE缓冲液30-50μL充分溶解干燥提取物，此即为DNA纯化产物。

3.5DNA含量的测定

吸取5μL DNA纯化产物，适当稀释，选择O.D.值在0.4-0.8之间读数，计算DNA浓度，调整DNA浓度为100ng/μL，PCR待用。

3.6内源基因的PCR检测

经上述操作所获得的DNA必须利用普通PCR或荧光PCR实验检测到其相应的内源基因，方可确定提取到适用的DNA，并可进一步进行下游实验。

3.6.1普通PCR定性检测

3.6.1.1普通PCR定性检测所用引物序列及反应参数

普通PCR定性检测所用引物序列及反应参数见表1

表1普通PCR定性检测所用引物序列及反应参数

3.6.1.2普通PCR反应体系

普通PCR反应体系见表2

表2普通PCR反应体系

3.6.1.3PCR产物的凝胶电泳检测

制备2％的琼脂糖凝胶，按常规电泳方法，以100bp Ladder DNA Marker作为分子量标记，进行电泳。电泳后，利用凝胶成像仪观察特异性泳带的出现，并拍摄作成像记录。

3.6.2实时荧光PCR定性检测

3.6.2.1实时荧光PCR定性检测所用引物序列和探针序列

实时荧光PCR定性检测所用引物序列和探针序列见表3

表3实时荧光PCR所用引物和探针序列

3.6.2.2实时荧光PCR反应体系

实时荧光PCR反应体系见表4

表4实时荧光PCR反应体系

3.6.2.3实时荧光PCR反应参数

实时荧光PCR反应参数见表5。使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整。

表5实时荧光PCR反应参数¹⁾

3.6.2.4仪器检测通道的选择

设置PCR反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。

4结果判断

4.1普通PCR结果判断

参比DNA分子量标记物，根据凝胶成像仪所观察到的样品DNA的PCR产物特异性泳带的出现，确定利用本方法提取到适用于PCR的DNA。

4.2荧光PCR结果判断

根据常规实时荧光PCR要求，设定基线和阈值

阳性参比相应内源基因扩增结果均C_t≤40；

试剂空白和阴性参比相应内源基因扩增结果均C_t≥40或45(根据PCR时所设定的循环数而定)。

样品DNA相应内源基因扩增结果C_t≤40或45(根据PCR时所设定的循环数而定)，确定利用本方法提取到适用于PCR的DNA。

Claims (6)

1.一种提取食用油脂中核酸的方法，按照以下步骤进行：

(1)食用油脂中极性成分的萃取

采用水作为萃取剂分多次对食用油脂进行萃取，并用离心的方法进行油液分离；

(2)萃取液的浓缩

全部转移萃取液于电热恒温干燥设备或其它干燥设备内，充分干燥；

(3)食用油脂中DNA的粗提；

(4)粗提DNA的纯化。

2.根据权利要求1所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特征在于：在步骤(1)的萃取过程中，采用离心方法去除油水界面物质。

3.根据权利要求1所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特征在于：在步骤(1)中，共需萃取初榨大豆油400mL-600mL、或初榨菜籽油约700mL-1000mL、或初榨玉米油约700mL-1000mL、或者花生油、芝麻油400mL-600mL、或者棕榈油600mL-800mL。

4.根据权利要求1所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特征在于：当待测油脂为初榨大豆油时，步骤(3)中DNA的粗提按照以下方法进行：取预热至约80-90℃CTAB提取液8-10mL，分多次小心洗下表面皿上干燥的萃取物，吸取洗下的萃取物转移至15mL离心管。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7500×g室温离心10min；分别小心吸取上清至另一15mL离心管，再次加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，操作同上，小心吸取上清，上清加入0.2至0.3倍体积的预冷异丙醇，充分上下倒置混匀，置0℃约20-40min后10000-12500×g，4℃离心6min，沉淀置0℃待用；上清于27000-30000×g，4℃离心10min，弃取上清，沉淀加入500μL 70％-80％预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27000-30000×g，4℃离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥；上述10000-12500×g离心所获沉淀加入约1200μL 70％-80％预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27000-30000×g，4℃离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。

5.根据权利要求1所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特征在于：当待测油脂为初榨菜籽油、玉米油、花生油、芝麻油、棕榈油、棉籽油或各种精炼油等时，步骤(3)中DNA的粗提按照以下方法进行：取预热至约80-90℃ CTAB提取液8-10mL，充分溶解干燥的萃取物于15mL离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7500×g室温离心10min；上清按1/10体积加入3M NaAc，混匀，加入LA溶液，混匀，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置约40min-60min后，27000-30000×g，4℃离心10min，弃取上清，沉淀加入500μL 70％-80％预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27000-30000×g，4℃离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。

6.根据权利要求1所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特正在于：所述步骤(4)粗提DNA的纯化利用特制的长片段核酸富集纯化装置来进行，

该长片段核酸富集纯化装置包括一个筒状主体(1)，在两端开口端口包覆半透膜(2)，在筒状主体上设有取液孔(3)和加样槽(4)，取样孔(3)带有胶塞(5)，在加样槽下方的部分筒状主体内充填有琼脂糖凝胶(6)，而取液孔下方的部分筒状主体保持为空腔(7)，用作注入电泳缓冲液；

所述的装置具体的操作方法如下：

(a)电泳槽加入电泳缓冲液；

(b)取液孔下方的部分筒状主体的空腔加满电泳缓冲液，并盖紧取液孔胶塞；

(c)将核酸富集纯化装置浸入电泳槽内电泳缓冲液中；

(d)待纯化核酸与上样缓冲液(含指示染料)混匀后，加入到加样槽，并通电；

(e)待指示染料条带全部进入取液孔下方缓冲液中，弃去取液孔下方的缓冲液；

(f)重新注满电泳缓冲液于取液孔下方的空腔，盖紧取液孔胶塞，重新放入电泳槽中，继续通电电泳，收集取液孔下方空腔的缓冲液进行酚氯仿抽提。

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