CN108060208A - 一种蛇胆汁的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛇胆汁的鉴别方法，该方法通过找出蛇类胆汁的特异性DNA片段，设计出特异性引物，通过PCR技术，扩增出蛇胆汁的特异性cytb片段，以对其他动物的胆汁进行区分，快速有效地鉴别出蛇胆汁的真伪。本发明的鉴别方法操作简单，重复性好准确度高，能有效地控制蛇胆汁的质量，为合理地使用蛇胆汁提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及中医药技术领域，具体是一种蛇胆汁的鉴别方法。
背景技术
蛇胆首载于《名医别录》，为蚺蛇胆和蝮蛇胆，《本草纲目》列于鳞部第四十三卷鳞之二蛇类项下，并增收了乌蛇胆和鳞蛇胆。《中国药典》20L5年版四部收载蛇胆汁为眼镜蛇科、游蛇科或蝰科动物多种蛇的胆汁，但目前药用来源的蛇胆远远超出以上范围。由于蛇胆具有独特的药用价值，加上市场需求量大，自然资源递减，市场上含蛇胆的中药制剂较多，常见的有蛇胆川贝散、蛇胆川贝液、蛇胆追风丸、蛇胆川贝枇杷膏等。市场上蛇胆的伪品时有发现，报道的掺假物有鸡、鸭、鱼、猪、牛等动物胆汁和淀粉糊、青菜汁、明胶液、色素以及熟地黄提取液等 ，以及油胆(用机油刺激蛇鼻腔或蛇体，使胆汁增多而质差)或蜜胆或将蛇胆多次浸泡，再把蛇胆与酒液分别销售使胆汁稀薄质差。多年来，国内外研究者一直致力于运用各种分析方法进行蛇胆的质量控制研究。
发明内容
本发明的目的是提供了一种蛇胆汁的鉴别方法，拟建立一种通过PCR方法鉴别出蛇胆汁及其他掺假动物胆汁的检验方法，以达到快速有效的鉴别出蛇胆汁的真伪，在药用上能正确地鉴别蛇胆汁，从源头上控制药品质量和保障用药安全。
本发明所述蛇胆汁的鉴别方法包括以下步骤：
（1）活蛇宰杀取蛇胆，按重量比1:1保存于体积浓度为50%的乙醇中；
（2）模板DNA提取：
1）取样品500μL，置1.5mL离心管中，氮气吹干，按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒操作提取：加入缓冲液GA 200µL，蛋白酶K（20mg/mL）20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB 200µL，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，简短离心，把瓶盖和瓶壁上的液珠甩下来，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，把瓶盖和瓶壁上的液珠甩下来，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，离心（转速为每分钟12000转）30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD 500µL，离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW 600µL反复洗脱2次，每次离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，离心（转速为每分钟12000转）2分钟，取洗脱液，作为供试品溶液，置-20℃保存备用。
2）取蛇胆汁对照药材50mg，加入缓冲液GA 200µL，蛋白酶K（20mg/mL）20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB 200µL，混匀，70℃放置10分钟，离心（转速为每分钟12000转）2分钟，取上清液至新离心管中，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，把瓶盖和瓶壁上的液珠甩下来，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，离心（转速为每分钟12000转）30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD 500µL，离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW 600µL反复洗脱2次，每次离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，离心（转速为每分钟12000转）2分钟，取洗脱液，作为对照药材模板DNA溶液，置-20℃保存备用。
（3）PCR反应：
L）鉴别引物：5´AGGACAAATATCRTTCTGAGC 3´和5´ARAARTTTTCTGGGTCRTTAAA 3´；
2）PCR反应体系：在200µL离心管中进行，反应总体积为 20µL，反应体系包括10☓PCR缓冲液2.0µL，dNTP（2.5mmol/L）0.6µL，鉴别引物（10µmol/L）各0.5µL，高保真Taq DNA聚合酶（5U/µL）0.5µL，模板1µL，无菌双蒸水14.9µL；
3）将离心管置于PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性3分钟，循环反应35次（95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒），延伸（72℃）7分钟。
（4）电泳检测：
L）照琼脂糖凝胶电泳法，胶浓度为1.5%，胶中加入核酸凝胶染色剂GeLRed；供试品与对照药材PCR反应溶液的上样量分别为3～5µL，DNA分子量标记上样量为2µL（0.5µg/µL）；
2）电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在250～500bp应有单一DNA 条带。空白对照无条带。
本发明的有益效果是：
本发明通过找出蛇类胆汁的特异性DNA片段，设计出特异性引物，再通过PCR技术，扩增出蛇胆汁的特异性cytb片段，以对其他动物的胆汁进行区分。通过建立蛇胆汁类的PCR鉴定方法，能够有效地对蛇胆汁和其他动物类胆汁进行真伪鉴定，有利于从源头上控制药品质量和保障用药安全。本发明的鉴别方法操作简单，重复性好准确度高，能有效地控制蛇胆汁的质量，为合理地使用蛇胆汁提供科学依据。
附图说明
图1为引物cytb1 58℃蛇胆汁样品验证扩增电泳图，图中1表示空白对照，2表示蛇胆汁对照药材，3表示狗胆汁，4表示猪胆汁，5表示羊胆汁，6表示牛胆汁，7表示草鱼胆汁，8表示鸭胆汁，9表示鸡胆汁，10表示蟒蛇胆汁，11表示赤链蛇胆汁，12表示蝰蛇胆汁，13表示玉斑水蛇胆汁，14表示铅色水蛇胆汁，15表示蝮蛇胆汁，16表示蕲蛇胆汁，17表示眼镜蛇胆汁，18表示水赤链蛇胆汁，19表示黑眉水蛇胆汁，20表示王锦蛇胆汁，21表示百花锦蛇胆汁，22表示三索锦蛇胆汁，23表示眼镜王蛇胆汁，24表示金环蛇胆汁，25表示银环蛇胆汁，26表示滑鼠蛇胆汁，27表示乌梢蛇胆汁，28表示金边水蛇胆汁，29表示灰鼠蛇胆汁，30表示2000DNA marker；
图2为引物cytb1 58℃混合胆汁扩增电泳图，图中1表示10000DNA marker，2表示混合蛇胆汁基因组1，3表示混合蛇胆汁基因组2，4表示混合蛇胆汁基因组3，5表示混合蛇胆汁基因组4，6表示混合蛇胆汁基因组5，7表示空白对照。
具体实施方式
为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。
实施例1
一种蛇胆汁的鉴别方法，方法包括以下内容：
1、仪器与试药：
（1）蛇胆汁材料：蛇类样品收集自广东、广西等地区的20种活蛇宰杀取蛇胆，按重量比1:1保存于体积浓度为50%的乙醇中，其他7种非蛇类动物的胆从广西南宁市菜市场购买。蛇类样品由广西食品药品检验所黄清泉主管药师鉴定，凭证标本保存于广西食品药品检验所标本室， 见表1
表1 试验材料
Table 1 Source of materials
（2） 仪器：S1000 型PCR扩增仪 ( Applied Biosystem 公司)；EppendorfMastercycler® nexus gradient；电泳仪（BIO-RAD）；微量紫外分光光度计 (Nano ValuePLUS)； GelDoc XR+全自动凝胶成像系统(BIO-RAD )；ME203电子天平(Mettle)；MIKRO220R型高速冷冻离心机（Hettich）； 漩涡震荡仪( Scientific in-dustries 公司)。
（3）试剂：琼脂糖购自BIOWEST公司； GelRed购自BIOTIUM公司； rTaq DNA 聚合酶、DL 2000 DNA Marker 购自TaKaRa公司；Q5酶购自MEW ENGLEND；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（DP304）购自天根公司；引物由华大基因合成，其他试剂均为国产分析纯。
2、鉴别方法中条件的探索包括以下内容：
（1）模板DNA提取：因为蛇胆汁为液体类样品，含DNA较少，申请人尝试了胆汁直接提取、胆汁氮气吹干和胆汁12000转离心5分钟后的沉淀物等不同的方法处理后提取DNA，同时也对蛇胆囊衣也进行DNA提取。采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行提取，采用通用引物COI进行扩增以检验DNA的质量。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，三种方法均有效提出DNA，但氮气吹干后提取效果较好，蛇胆汁直接提取效果较差，经测序结果比对，蛇胆衣和蛇胆汁提取出来的DNA均一致。说明蛇胆汁能够提取出蛇类的DNA。
针对蛇胆汁液体类样品，使用胆汁直接提取DNA效率不高，而经过氮气吹干胆汁后再进行提取，使得DNA提取的纯度和浓度均大大提高。经对20种蛇胆汁类药材及其7种其他动物胆汁进行提取，利用Cytb1引物扩增，均获得约300bp大小的扩增产物，说明该提取方法提取的DNA可以满足PCR反应的要求。
（2）引物设计：经NCBI数据库中下载snake coi，cytb，16s等基因序列，进行同源比对，针对保守区域，应用oligo 6.0软件设计简并引物。其中Coi基因设计1对引物；Cytb设计2对引物，分别命名为Cytb和Cytb1；16s设计1对引物。引物序列见表2
表2 引物序列
TabLe 2 Primers
（3）PCR扩增条件的确定：取蛇胆汁（阳性样品）及其他动物胆汁（阴性样品）DNA模板，用上述4种引物进行扩增，20μL反应体系，采用41.7℃，49℃，55.1℃，61℃不同的退火温度在梯度PCR扩增仪上进行，反应体系及扩增条件见表3，反应结束后取PCR反应产物5μL，加入2μL 6 × Loading buffer( Takara公司) 于GelRed染色的1%琼脂糖凝胶电泳检测。经摸索，发现Coi和16s引物在不同的退火温度下对阳性样品和阴性样品的扩增条带均非常亮，所以不优先考虑它们的条件优化。而引物Cytb和引物Cytb1，能够有效的从阳性样品中扩增cytb片段（Tm=49 度），不能从大部分阴性样品中扩增Cytb片段（Tm=49℃），但条件仍需进一步优化。继而用Cytb和Cytb1引物在Tm温度（60℃、58℃、55℃）对所有阳性样品和阴性样品进行PCR扩增，取5μL的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。结果表明cytb引物对于阴性样品时有扩增，而cytb1引物在60℃时对所有的阴性样品均不能扩增到目的条带，但同时也不能对所有的阳性样品进行扩增，在58℃、55℃对于所有的阴性样品和水都没有扩增，对所有阳性样品进行扩增。
表3反应体系及扩增条件
PCR reaction conditions
因蛇胆汁类药材有其特殊性，其伪品可以为所有的动物胆汁，常见的就有哺乳类、鱼类、家禽类等，种类繁多DNA差异较大。为建立准确、快速、简便的蛇胆汁类药材分子鉴别方法并确定其准确性，针对研究好的 PCR反应条件，在此基础上进一步依次对PCR反应过程中变性温度、变性和退火时间、循环次数进行优化，最终确定了PCR反应参数为95℃预变性3分钟，循环反应35次（95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒），延伸（72℃）7分钟。经对所有的20种蛇胆汁和7种伪品进行扩增，均能到得到较理想效果。
3、经过2项条件的探索确定最终鉴别方法包括以下步骤：
（1）模板DNA提取：
1）取样品500μL，置1.5mL离心管中，氮气吹干，按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒操作提取：加入缓冲液GA 200µL，蛋白酶K（20mg/mL）20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB 200µL，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，简短离心，把瓶盖和瓶壁上的液珠甩下来，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，把瓶盖和瓶壁上的液珠甩下来，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，离心（转速为每分钟12000转）30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD 500µL，离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW 600µL反复洗脱2次，每次离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，离心（转速为每分钟12000转）2分钟，取洗脱液，作为供试品溶液，置-20℃保存备用。
2）取蛇胆汁对照药材50mg，加入缓冲液GA 200µL，蛋白酶K（20mg/mL）20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB 200µL，混匀，70℃放置10分钟，离心（转速为每分钟12000转）2分钟，取上清液至新离心管中，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，把瓶盖和瓶壁上的液珠甩下来，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，离心（转速为每分钟12000转）30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD 500µL，离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW 600µL反复洗脱2次，每次离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，离心（转速为每分钟12000转）2分钟，取洗脱液，作为对照药材模板DNA溶液，置-20℃保存备用。
（2）PCR反应：
1）鉴别引物：5´AGGACAAATATCRTTCTGAGC 3´和5´ARAARTTTTCTGGGTCRTTAAA 3´；
2）PCR反应体系：在200µL离心管中进行，反应总体积为 20µL，反应体系包括10☓PCR缓冲液2.0µL，dNTP（2.5mmol/L）0.6µL，鉴别引物（10µmol/L）各0.5µL，高保真Taq DNA聚合酶（5U/µL）0.5µL，模板1µL，无菌双蒸水14.9µL；
3）将离心管置于PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性3分钟，循环反应35次（95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒），延伸（72℃）7分钟。
（3）电泳检测：
1）照琼脂糖凝胶电泳法，胶浓度为1.5%，胶中加入核酸凝胶染色剂GeLRed；供试品与对照药材PCR反应溶液的上样量分别为3～5µL，DNA分子量标记上样量为2µL（0.5µg/µL）；
2）电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在250～500bp应有单一DNA 条带；空白对照无条带。见图1-2。
Claims (1)
1.一种蛇胆汁的鉴别方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）样品制备：活蛇宰杀取蛇胆，按重量比1:1保存于体积浓度为50%的乙醇中；
（2）模板DNA提取：
1）取样品500μL，置1.5mL离心管中，氮气吹干，按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒操作提取：加入缓冲液GA 200µL，蛋白酶K20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB 200µL，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，简短离心，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，离心30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD 500µL，以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW 600µL反复洗脱2次，每次以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再以12000转/分钟离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，以12000转/分钟离心2分钟，取洗脱液，作为供试品溶液，置-20℃保存备用；
2）取蛇胆汁对照药材50mg，加入缓冲液GA 200µL，蛋白酶K20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB 200µL，混匀，70℃放置10分钟，以12000转/分钟离心2分钟，取上清液至新离心管中，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，以12000转/分钟离心30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD 500µL，以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW 600µL反复洗脱2次，每次以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，以12000转/分钟离心2分钟，取洗脱液，作为对照药材模板DNA溶液；置-20℃保存备用；
（3）PCR反应：
1）鉴别引物：5´AGGACAAATATCRTTCTGAGC 3´和5´ARAARTTTTCTGGGTCRTTAAA 3´；
2）PCR反应体系：在200µL离心管中进行，反应总体积为 20µL，反应体系包括10☓PCR缓冲液2.0µL，浓度为2.5mmol/L 的dNTP 0.6µL，浓度为10µmol/L鉴别引物各0.5µL，浓度为5U/µL的高保真Taq DNA聚合酶0.5µL，模板1µL，无菌双蒸水14.9µL；
3）将离心管置于PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性3分钟，将反应95℃30秒、58℃30秒和72℃30秒连续循环35次，72℃延伸7分钟；
（4）电泳检测：
1）照琼脂糖凝胶电泳法，胶浓度为1.5%，胶中加入核酸凝胶染色剂GeLRed；供试品与对照药材PCR反应溶液的上样量分别为3～5µL，DNA分子量标记上样量为2µL，浓度为0.5µg/µL；
2）电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。
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