CN111019940A - 一种直接提取全血基因组dna的提取液及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种直接提取全血基因组DNA的提取液，其特征在于，包括裂解液、第一漂洗液、第二漂洗液，Proteinase K。本发明还公开了使用所述提取液的提取方法。本发明的有益效果在于：本方法主要可以直接从人、哺乳动物及禽类全血中快速提取基因组DNA，本方法样本无需预处理无需先去除红细胞，孵化好的样本缓冲液无需混合胍盐、酒精，可直接过硅胶吸附柱、磁珠吸附等，整个过程无须苯酚和氯仿抽提，无须异丙醇或乙醇沉淀，抽提出的DNA可直接用于PCR、酶切、杂交等分子生物学下游相关实验。本发明的方法针对性强，操作方便快速，且通量高，可以使用单个硅胶吸附柱、96孔硅胶吸附柱和磁珠，且硅胶柱回收基因组纯更高可直接用于二代测序。
Description
技术领域
本发明涉样本裂解及基因提取领域，具体涉及一种直接提取全血基因组DNA的提取液及其提取方法。
背景技术
制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，在基因组DNA提取过程中应尽量避免使基因组DNA断裂和降解，以保障基因组DNA的完整性，为下面的研究打下基础。
现有技术的提取方法主要有物理法、化学法和生物酶法，而不同的现有方法都具有一些局限性。
玻璃珠法是依赖于高频率的剧烈震荡破坏细胞膜释放核酸，对核酸的完整性损伤极大，不能有效的去除红细胞蛋白，洗脱液中含有血红蛋白，影响纯度和后期实验。
普通高盐法则需先去除红细胞，操作步骤偏多，在多次操作过程中易污染，对后期的实验有很大的影响。
煮沸法在高温条件下基因组DNA极易降解，不能有效的去除红细胞，洗脱液中含有血红蛋白，杂质含量高，对后期的酶切、杂交PCR扩增、测序抑制性较强。
化学单管提取法的得率或纯度比上述三种方法都要理想，但通量低，现有的化学单管提取法只适用于几个或几十个样本的操作，实用性不强。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的之一在于一种直接提取全血基因组DNA的提取液。
本发明的目的之二在于提供一种直接提取全血基因组DNA的硅胶吸附柱提取方法，该方法在保证了回收基因组DNA提取效率和提取纯度的条件下，操作更加方便简洁且通量更高，更符合现行的高通量测序的前处理的需要。本发明的目的之三在于一种直接提取全血基因组DNA的磁珠吸附提取方法。
为了实现本发明的目的之一，所采用的技术方案是：
一种直接提取全血基因组DNA的提取液，包括裂解液、第一漂洗液、第二漂洗液，Proteinase K；
在所述裂解液当中，按1升的浓度计算，包括如下组分：
20mM～25mM Tris；
40mM～50mM EDTA；
0.4M～0.5M NACL；
4.5M～5M GuHCl；
5％～7％ Tween-20；
1％～2％ Triton X-100；
在所述第一漂洗液当中，按1升的浓度计算，包括如下组分：
15mM～20mM Tris；
10mM～15mM EDTA；
0.4M～0.5M NaAc；
1.5％～2％ Tween-20；
65％～70％ EOH；
在所述第二漂洗液当中，按1升的浓度计算，包括如下组分：
20mM～50mM Tris；
在所述洗脱液当中，按1升的浓度计算，包括如下组分：
4.5mM～5mM Tris；
0.01mM～0.05mM EDTA；
所述Proteinase K为10mg/ml～20mg/ml的Proteinase K；
其中，所述裂解液、第一漂洗液、第二漂洗液及洗脱液的pH均为8.0；
为了实现本发明的目的之二，所采用的技术方案是：
一种直接提取全血基因组DNA的硅胶吸附柱提取方法，包括如下步骤：
第一步：在试管中加入200μl全血后直接加入400-600μl裂解液、13-16μlProteinase K混匀，在55-65℃的范围下水浴加热15-25min；
第二步：将水浴加热后的样品溶液进行离心吸附，所述离心吸附的速度为7500-8500rpm，离心吸附后倒去废液；
第三步：在吸附有样品的吸附柱中加入400-600μl第一漂洗液后以7500-8500rpm的速度离心进行漂洗，漂洗次数为至少一次后弃去废液；
第四步：在进行了第三步后的吸附柱中加入400-600μl第二漂洗液后以7500-8500rpm的速度离心进行漂洗，漂洗次数为至少一次后弃去废液；
第五步：向吸附柱中央滴加50-100μl洗脱液后以11000-13000rpm速度离心得所述DNA溶液。
为了实现本发明的目的之三，所采用的技术方案是：
一种直接提取全血基因组DNA的磁珠吸附提取方法，包括如下步骤：
第一步：在试管中加入200μl全血后直接加入400-600μl裂解液、13-16μlProteinase K混匀，在55-65℃的范围下水浴加热15-25min；
第二步：在水浴后的样品中加入400-600μl异丙醇后混匀再加入25-35μl gDNA磁珠后二次混匀后室温静置，移去上清液；
第三步：将室温静置后的样品中加入600-800μl第一漂洗液后混匀，将混匀后的样品放置在磁力架上静置后进行至少一次磁力翻转，移去上清液；
第四步：在第三步的样品当中加入700-700μl第二漂洗液后混匀，将混匀后的样品放置在磁力架上静置后进行至少一次磁力翻转，移去上清液；
第五步：将所述第四步得到的下层样品进行干燥后加入90-110μl洗脱液后镇散磁珠后静置分层后，得到的上清液中即含有纯化的基因组DNA溶液。
在本发明的一个优选实施例中，所述第二步的室温静置前翻转混匀至少一次。
在本发明的一个优选实施例中，所述第三步的加入漂洗液前还包括至少一次的磁力翻转混匀。
在本发明的一个优选实施例中，所述第四步进行至少一次。
本发明的有益效果在于：
本方法主要可以直接从人、哺乳动物及禽类全血中快速提取基因组DNA，本方法样本无需预处理无需先去除红细胞，孵化好的样本缓冲液无需混合胍盐、酒精，可直接过硅胶吸附柱、磁珠吸附等，整个过程无须苯酚和氯仿抽提，无须异丙醇或乙醇沉淀，抽提出的DNA可直接用于PCR、酶切、杂交等分子生物学下游相关实验。
本发明的方法针对性强，操作方便快速，且通量高，可以使用单个硅胶吸附柱、96孔硅胶吸附柱和磁珠，且硅胶柱回收基因组纯更高可直接用于二代测序。
附图说明
图1为本方法提取的基因组DNA提取示意图。
图2为高温煮沸法的基因组DNA提取示意图。
图3为玻璃珠法的基因组DNA提取示意图。
具体实施方式
本发明的原理在于：
以全血为基因组DNA提取的材料，在全血提取基因组DNA的过程中就要从有核的白细胞中提取基因组DNA，因此，提取全血中的基因组DNA有以下几个步骤：
一、破裂红细胞，利用红细胞与白细胞膜结构的差异，用表面活性剂Triton X-100先使红细胞破裂，采用Tween-20表面活性剂使蛋白质变性细胞膜破裂释放DNA。
二、再利用高盐GuHCl溶解血红蛋白，利用硅胶柱膜选择性吸附样品中基因组DNA，利用磁珠高盐吸附的特性和分离纯化DNA，而不吸附蛋白质和其它非核酸类物质。
三、去除蛋白及杂质，采用蛋白变性溶液溶解蛋白质，经洗涤步骤，即可得到样品基因组DNA。
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施例不得用于解释对本发明的限制。
一：硅胶吸附柱提取法
1)在1.5ml EP管中加入200μl全血，无需任何处理直接加入500μl裂解液，15μlProteinase K，混匀，在60℃水浴锅中加热20min，期间混匀1次。
2)从水浴锅中取出样品，将溶液全部倒入离心吸附柱中，吸附柱放入收集管内，8000rpm，离心1min，取出吸附柱，倒掉收集管中废液。
3)向吸附柱中加入500μl漂洗液Wa，8000rpm，离心30s，取出吸附柱，倒掉收集管中废液。
4)向吸附柱中加入500μl漂洗液Wash，8000rpm，离心30s，取出吸附柱，倒掉收集管中废液。
5)重复4一次。
6)取出吸附柱，并倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm，离心1min，以尽量除去残留的乙醇。
7)将吸附柱置于新的1.5ml离心管中室温环境干燥3～5min。
8)向吸附柱靠近吸附膜中央悬空滴加50-100μl洗脱液(预先将洗脱液在65℃预热使用可以提高洗脱效率)。12000rpm，离心1min，离心管内收集到液体即为DNA溶液。根据用途将样品DNA置于4℃或-20℃长期保存。
二：磁珠吸附提取法
A.在1.5ml EP管中加入200μl全血，无需任何处理直接加入500μl裂解液，15μlProteinase K混匀，在60℃水浴锅中孵化20min，期间混匀1次。
B.从水浴锅中取出样品，打开管盖，加入500μl异丙醇，均匀，再加入30μl gDNA磁珠，再次均匀，盖上管盖，室温静置5分钟，中间翻转混匀一次。
C.将样品放到磁力架上，静置1分钟。中间翻转1-2次，以便将管盖内的磁珠也吸附下来。打开管盖，移去EP管内和管盖内的上清
D.从磁力架取下样品，加入700μl漂洗液Wa，混匀后翻转2-3次，将样品放到磁力架上，静置1分钟。中间翻转1-2次，以便将管盖内的磁珠也吸附下来，打开管盖，移去EP管内和管盖内的上清。
E.从磁力架取下样品，加入800μl漂洗液Wash，混匀后翻转2-3次，将样品放到磁力架上，静置1分钟。中间翻转1-2次，以便将管盖内的磁珠也吸附下来，打开管盖，移去上清。
F.重复步骤E一次，尽可能移去全部上清包括管盖内的上清。
G.开盖，室温放置10min或60℃干燥3min。
H.加入100μl洗脱液充分振散磁珠，室温静置5分钟，将样品放到磁力架上，静置1分钟，转移上清至新1.5ml EP管。(预先将洗脱液在65℃预热使用可以提高洗脱效率，上清中含有纯化的基因组DNA溶液，结束后电泳及测核酸浓度，根据用途将样品DNA置于4℃或-20℃长期保存。)
基因组DNA检测
用紫外分光光度计测量全血基因组DNA含量，OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA，当DNA样品中含有蛋白质或者其他小分子污染时，会影响DNA吸光值的准确测定，一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度，并通过1％琼脂糖电泳凝胶判定DNA的完整性，也可以判定样品中是否有RNA污染(提取的DNA,会有较大的RNA污染，这时候做电泳可以明确看到RNA的条带,而且有时候会比DNA带更为明显，如果提取过程中RNA降解了,那么会看到DNA条带下面有一片很亮的拖带)。
参见图1-图3：
如图1所示，本方法提取的基因组DNA，纯度高，无杂质。
如图2所示，高温煮沸法提取的基因组DNA，蛋白及其他杂质含量较高。
如图3所示，玻璃珠法提取的基因组DNA，有些样品研磨不充分，DNA机械损伤严重。
高温煮沸法
在1.5mL灭菌Ep管中加入100μ全血，加入100μL灭菌双蒸水。将上述Ep管煮沸10min后,经14000rpm/min离心10min,吸取上清液作为PCR反应模板。
玻璃珠法
在1.5mL灭菌Ep管中加入100μ全血，加入100μL灭菌双蒸水，0.2g玻璃珠。将上述Ep管置于匀浆研磨仪上60Hz，5min,经14000rpm/min离心10min,吸取上清液作为PCR反应模板。
现在有试剂盒(捷瑞生物，GK1041小量血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型))
1.取1ml血液置于干净的2.0ml离心管中，12,000rpm离心10min，弃上清，向沉淀中加800μl TBP Solution，用1ml Tip头轻轻吹打使其彻底混匀，室温放置3～5min而后10,000rpm离心1min，弃上清。
2.重复上述步骤一次，若血样仍显明显红色则需再次重复上述步骤，当沉淀为淡红色或无色后用150μl TE震荡悬浮，充分混匀。
提取基因组DNA操作步骤:
3.在上述处理好的150μl样品中加入300μl TBM Solution，混匀；再加入2ul Boiled RNase A，混匀，55℃保温10min；再加入4μl Proteinase K，混匀，55℃保温30min。
4.加入300ul PB Solution混匀，再添加300ul氯仿充分混匀，12,000rpm，室温离心5min，此时溶液分为3层，上层为透明水相，DNA溶于其中，中间层为红色杂质，下层为有机相。
5.用1-ml Tip头将上层水相(约700ul)全部转移到套放于2-ml Collection Tube的GenClean Column柱中。8,000rpm，室温离心1min。
6.取出GenClean柱，并倒掉Collection Tube中的废液，将GenClean柱重新放回Collection Tube中，加入600μl Wash Solution，8,000rpm，室温离心1min。
7.取出GenClean柱，并倒掉Col lection Tube中的废液，将GenClean柱重新放回Collection Tube中，加入500μl Wash Solution，8,000rpm，室温离心1min。
8.取出GenClean柱，并倒掉Col lection Tube中的废液，将GenClean柱重新放回Collection Tube中，12,000rpm，室温离心1min，以除去残留的Wash Solution。
9.将GenClean柱放入新的已灭菌的1.5-ml离心管中，在柱膜中央加入40～70μlElution Buffer，室温放置3～5min。12,000rpm，室温离心1min。离心管内液体即为基因组DNA。根据用途，样品可于4℃或-20℃保存。
本方法相比CN109609493A无需先去除红细胞，无需过多的操作步骤带来交叉污染，需要样本体积少，得率高，无须异丙醇或乙醇沉淀，无需沉淀很长时间的离心，本方法可直接过硅胶吸附柱、磁珠吸附来回收DNA等，适用范围广，操作方便快捷，整个过程在30min～1h内可以完成。
Claims (6)
1.一种直接提取全血基因组DNA的提取液，其特征在于，包括裂解液、第一漂洗液、第二漂洗液，Proteinase K；
在所述裂解液当中，按1升的浓度计算，包括如下组分：
20mM～25mM Tris；
40mM～50mM EDTA；
0.4M～0.5M NACL；
4.5M～5M GuHCl；
5％～7％Tween-20；
1％～2％Triton X-100；
在所述第一漂洗液当中，按1升的浓度计算，包括如下组分：
15mM～20mM Tris；
10mM～15mM EDTA；
0.4M～0.5M NaAc；
1.5％～2％Tween-20；
65％～70％EOH；
在所述第二漂洗液当中，按1升的浓度计算，包括如下组分：
20mM～50mM Tris；
在所述洗脱液当中，按1升的浓度计算，包括如下组分：
4.5mM～5mM Tris；
0.01mM～0.05mM EDTA；
所述Proteinase K为10mg/ml～20mg/ml的Proteinase K；
其中，所述裂解液、第一漂洗液、第二漂洗液及洗脱液的pH均为8.0。
2.如权利要求1所述的一种直接提取全血基因组DNA的硅胶吸附柱提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步：在试管中加入200μl全血后直接加入400-600μl裂解液、13-16μlProteinase K混匀，在55-65℃的范围下水浴加热15-25min；
第二步：将水浴加热后的样品溶液进行离心吸附，所述离心吸附的速度为7500-8500rpm，离心吸附后倒去废液；
第三步：在吸附有样品的吸附柱中加入400-600μl第一漂洗液后以7500-8500rpm的速度离心进行漂洗，漂洗次数为至少一次后弃去废液；
第四步：在进行了第三步后的吸附柱中加入400-600μl第二漂洗液后以7500-8500rpm的速度离心进行漂洗，漂洗次数为至少一次后弃去废液；
第五步：向吸附柱中央滴加50-100μl洗脱液后以11000-13000rpm速度离心得所述DNA溶液。
3.如权利要求1所述的一种直接提取全血基因组DNA的磁珠吸附提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步：在试管中加入200μl全血后直接加入400-600μl裂解液、13-16μlProteinase K混匀，在55-65℃的范围下水浴加热15-25min；
第二步：在水浴后的样品中加入400-600μl异丙醇后混匀再加入25-35μl gDNA磁珠后二次混匀后室温静置；
第三步：将室温静置后的样品中加入600-800μl第一漂洗液后混匀，将混匀后的样品放置在磁力架上静置后进行至少一次磁力翻转，移去上清液；
第四步：在第三步的样品当中加入700-700μl第二漂洗液后混匀，将混匀后的样品放置在磁力架上静置后进行至少一次磁力翻转，移去上清液；
第五步：将所述第四步得到的下层样品进行干燥后加入90-110μl洗脱液后镇散磁珠后静置分层后，得到的上清液中即含有纯化的基因组DNA溶液。
4.如权利要求3所述的一种直接提取全血基因组DNA的磁珠吸附提取方法，其特征在于，所述第二步的室温静置前翻转混匀至少一次。
5.如权利要求3所述的一种直接提取全血基因组DNA的磁珠吸附提取方法，其特征在于，所述第三步的加入漂洗液前还包括至少一次的磁力翻转混匀。
6.如权利要求3所述的一种直接提取全血基因组DNA的磁珠吸附提取方法，其特征在于，所述第四步进行至少一次。
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|---|---|---|---|
| CN201911356963.4A CN111019940A (zh) | 2019-12-25 | 2019-12-25 | 一种直接提取全血基因组dna的提取液及其提取方法 |
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- 2019-12-25 CN CN201911356963.4A patent/CN111019940A/zh active Pending
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