CN109439651B - 一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组DNA的方法，其特征在于，包括血液预处理步骤和基因组DNA提取步骤。本发明的有益效果在于：本方法主要用于从人或哺乳动物血液中提取基因组DNA，抽提出的DNA可直接用于PCR、酶切等分子生物学相关实验。本发明的方法针对性强，操作方便简洁，通量高，且硅胶柱回收基因组DNA效率高、纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及基因提取领域，具体涉及一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组DNA的方法。
背景技术
制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，在基因组DNA提取过程中应尽量避免使基因组DNA断裂和降解，以保障基因组DNA的完整性，为下面的研究打下基础。
现有技术的提取方法主要有物理法、化学法和生物酶法。玻璃珠法：是依赖于高频率的剧烈震荡破坏细胞膜释放核酸，对核酸的完整性损伤极大，不能有效的去除红细胞，洗脱液中含有血红蛋白，影响纯度和后期实验。磁珠法：操作步骤偏多，在批量操作过程中易污染，不能有效的去除红细胞，洗脱液中含有血红蛋白，杂质含量高，纯度低，对后期的实验有影响。煮沸法：高温条件下基因组DNA易降解，不能有效的去除红细胞，洗脱液中含有血红蛋白，杂质含量高于磁珠法，对后期的酶切、杂交PCR扩增抑制性强。化学法小批量单管提取：方法类似本发明可以有效的去除红细胞，得率和纯度高，但通量特别低，只适用于几个或几十个样本的操作。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组DNA的方法，该方法针对性强，操作方便简洁，通量高；且硅胶柱回收基因组DNA效率高、纯度高。
为了实现本发明的上述方法，所采用的技术方案是：
一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组DNA的方法，包括如下步骤：
血液预处理步骤：
1)转移500uL～1000uL全血样品至2.2cm 96孔深孔板中，再用排枪加入700uL TRX溶液；
2)用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧，上面垫一层薄的橡胶皮垫，上匀浆机：25HZ，100s；
3)震荡结束后称重配平，于板式离心机5000～6000RCF，2min，轻轻倒掉废液，吸水纸纸上倒扣放置30s(若沉淀仍显明显红色则需再进行步骤4、5，若无直接进行步骤6)；
4)再加入700uL TRX溶液，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧，上面垫一层薄的橡胶皮垫，上匀浆机：25HZ，100s；
5)于板式离心机5000～6000RCF，2min，轻轻倒掉废液，吸水纸上倒扣放置一会(若红细胞残留过多再重复一次步骤3)；
6)加入200uL 1x TE溶液，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧，上面再垫一层薄的橡胶皮垫，上匀浆机：25HZ，100s，结束后于板式离心机中快甩至400RCF；
基因组DNA提取步骤：
1)加入200uL CCF溶液和20μl蛋白酶K(Proteinase K)，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧摇匀，55℃水浴锅中孵化10～40min；
2)加入300uL PR溶液和300uL BA溶液，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧充分摇匀，注意不要倒置摇晃，于板式离心机5000～6000RCF，5min；
3)转移上清液，用1000uL排枪调650uL吸取上清溶液于96孔板式柱子中(柱子套在收集板上，加BA时溶液吸最底层溶液，不要吸到蓝绿色溶液)，于板式离心机中3500RCF，1min，弃废液；
4)用排枪加入500uL漂洗液，于板式离心机5000RCF，1min，弃废液；
5)重复步骤5；
6)用排枪加入500uL 80％乙醇，于板式离心机5000RCF，1min，弃废液；
7)于板式离心机5300RCF，空甩5min，以尽可能除去残留的乙醇；
8)置37℃烘箱中烘15min，以除尽残留的乙醇；
9)用排枪在柱中央悬空加入70μl洗脱液，于板式离心机5000RCF，1min；
10)用排枪在柱中央悬空加入50μl洗脱液，于板式离心机5000RCF，2min；
11)结束后电泳及测核酸浓度，然后置-20℃冰箱保存后待测。
在本发明的一个优选实施例当中，所述基因组DNA提取步骤9当中，所述70μl洗脱液为加热至70℃的洗脱液，使用其进行一次洗脱，再进行所述步骤10后，可将DNA得率进一步提高20-30％。
在本发明的一个优选实施例当中，所述的TRX溶液为：红细胞裂解液。
在本发明的一个优选实施例当中，所述的CCF溶液为：白细胞裂解液。
在本发明的一个优选实施例当中，所述的TE溶液为：Tris/EDTA缓冲液。
在本发明的一个优选实施例当中，所述的PR溶液为：反应中和液。
在本发明的一个优选实施例当中，所述的BA溶液为：正丁醇溶液。
本发明的有益效果在于：
本方法主要用于从人或哺乳动物血液中提取基因组DNA，抽提出的DNA可直接用于PCR、酶切等分子生物学相关实验。本发明的方法针对性强，操作方便简洁，通量高，且硅胶柱回收基因组DNA效率高、纯度高。
附图说明
图1为本方法提取的基因组DNA示意图；
图2为玻璃珠法提取的基因组DNA示意图；
图3为磁珠法提取的基因组DNA示意图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施例不得用于解释对本发明的限制。
血液预处理步骤：
转移500uL～1000uL全血样品至2.2cm 96孔深孔板中，再用排枪加入700uL TRX溶液。
用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧，上面垫一层薄的橡胶皮垫，上匀浆机：25HZ，100s。
震荡结束后称重配平，于板式离心机5000～6000RCF，2min，轻轻倒掉废液，吸水纸纸上倒扣放置30s(若红细胞残留过多再重复上述步骤)。
加入200uL 1x TE溶液，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧，上面再垫一层薄的橡胶皮垫，上匀浆机：25HZ，100s，结束后于板式离心机中快甩至400RCF。
提取基因组DNA操作步骤：
加入200uL CCF溶液和20μl Proteinase K，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧摇匀，55℃水浴锅中孵化:10～40min。
注意：保温时间取决于血样的新鲜程度，新鲜的血样，55℃保温10min足以使细胞裂解，释放出基因组DNA。而存放久的血样，保温则视裂解效果而定，裂解完全的血样应是透明不粘稠的液体。
加入300uL PR溶液和300uL BA溶液，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧充分摇匀，勿倒置摇，于板式离心机5000RCF，5min。
转移上清液，用1000uL排枪调650uL吸取上清溶液于96孔板式柱子中(柱子套在收集板上，加BA时溶液吸最底层溶液，不要吸到蓝绿色溶液)，于板式离心机中3500RCF，1min，弃废液。
用排枪加入500uL漂洗液，于板式离心机5000RCF，1min，弃废液。
重复步骤10。
用排枪加入500uL 80％乙醇，于板式离心机5000RCF，1min，弃废液。
于板式离心机5300RCF，空甩5min，以尽可能除去残留的乙醇。
置37℃烘箱中烘15min，以除尽残留的乙醇。
用排枪在柱中央悬空加入70μl洗脱液，于板式离心机5000RCF，1min。
用排枪在柱中央悬空加入50μl洗脱液，于板式离心机5000RCF，2min。
结束后电泳及测核酸浓度，然后置-20℃冰箱保存。
注意：将洗脱液加热至70℃，有助于提高回收得率，再用50ul洗脱液进行第二次洗脱可以提高20％～30％的DNA得率。
基因组DNA检测
用分光光度计测量基因组DNA含量，OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA，当DNA样品中含有蛋白质或者其他小分子污染时，会影响DNA吸光值的准确测定，一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度，并通过1％琼脂糖电泳凝胶判定DNA的完整性，也可以判定样品中是否有RNA污染(提取的DNA,会有较大的RNA污染，这时候做电泳可以明确看到RNA的条带,而且有时候会比DNA带更为明显，如果提取过程中RNA降解了,那么会看到DNA条带下面有一片很亮的拖带)。
参见图1-图3：
如图1所示，本方法提取的基因组DNA，纯度高，无杂质。
如图2所示，玻璃珠法提取的基因组DNA，有些样品研磨不充分，DNA机械损伤严重。
如图3所示，磁珠法提取的基因组DNA，蛋白及其他杂质含量较高。
本发明的原理在于：
以全血为基因组DNA提取的材料，在全血提取基因组DNA的过程中就要从有核的白细胞中提取基因组DNA，因此，提取全血中的基因组DNA有以下几个步骤：一、破裂红细胞，利用红细胞与白细胞膜结构的差异，用表面活性剂先使红细胞破裂，离心后收集有核的白细胞。二、释放DNA，采用离子型表面活性剂使蛋白质变性细胞膜破裂释放DNA，利用硅胶柱膜选择性吸附样品中基因组DNA，而不吸附蛋白质和其它非核酸类物质。三、去除蛋白及杂质，采用蛋白变性溶液溶解蛋白质，经洗涤步骤，即可得到样品基因组DNA。
Claims (7)
1.一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组DNA的方法，其特征在于，
包括如下步骤：
血液预处理步骤：
1)转移500uL～1000uL全血样品至2.2cm 96孔深孔板中，再用排枪加入700uL TRX溶液；
2)用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧，上面垫一层薄的橡胶皮垫，上匀浆机：25HZ，100s；
3)震荡结束后称重配平，于板式离心机5000～6000RCF，2min，轻轻倒掉废液，吸水纸纸上倒扣放置30s，若沉淀仍显明显红色则需再进行步骤4、5，若无直接进行步骤6；
4)再加入700uL TRX溶液，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧，上面垫一层薄的橡胶皮垫，上匀浆机：25HZ，100s；
5)于板式离心机5000～6000RCF，2min，轻轻倒掉废液，吸水纸上倒扣放置一会，若红细胞残留过多再重复一次步骤3；
6)加入200uL 1x TE溶液，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧，上面再垫一层薄的橡胶皮垫，上匀浆机：25HZ，100s，结束后于板式离心机中快甩至400RCF；
基因组DNA提取步骤：
1)加入200uL CCF溶液和20μl蛋白酶K(Proteinase K)，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧摇匀，55℃水浴锅中孵化10～40min；
2)加入300uL PR溶液和300uL BA溶液，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧充分摇匀，注意不要倒置摇晃，于板式离心机5000～6000RCF，5min；
3)转移上清液，用1000uL排枪调650uL吸取上清溶液于96孔板式柱子中，于板式离心机中3500RCF，1min，弃废液；
4)用排枪加入500uL漂洗液，于板式离心机5000RCF，1min，弃废液；
5)重复步骤5；
6)用排枪加入500uL 80％乙醇，于板式离心机5000RCF，1min，弃废液；
7)于板式离心机5300RCF，空甩5min，以尽可能除去残留的乙醇；
8)置37℃烘箱中烘15min，以除尽残留的乙醇；
9)用排枪在柱中央悬空加入70μl洗脱液，于板式离心机5000RCF，1min；
10)用排枪在柱中央悬空加入50μl洗脱液，于板式离心机5000RCF，2min；
11)结束后电泳及测核酸浓度，然后置-20℃冰箱保存后待测。
2.如权利要求1所述的一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组DNA的方法，其特征在于，所述基因组DNA提取步骤9当中，所述70μl洗脱液为加热至70℃的洗脱液，使用其进行一次洗脱，再进行所述步骤10后，可将DNA得率进一步提高20-30％。
3.如权利要求1所述的一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组DNA的方法，其特征在于，所述的TRX溶液为：红细胞裂解液。
4.如权利要求1所述的一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组DNA的方法，其特征在于，所述的CCF溶液为：白细胞裂解液。
5.如权利要求1所述的一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组DNA的方法，其特征在于，所述的TE溶液为：Tris/EDTA缓冲液。
6.如权利要求1所述的一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组DNA的方法，其特征在于，所述的PR溶液为：反应中和液。
7.如权利要求1所述的一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组DNA的方法，其特征在于，所述的BA溶液为：正丁醇溶液。
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| 家禽血液基因组DNA的快速提取;孙朕等;《安徽农业科学》;20100601(第16期);全文 * |
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