RU2808832C1 - Способ выделения рибонуклеиновой кислоты вируса из спинномозговой жидкости для молекулярно-биологических исследований - Google Patents
Способ выделения рибонуклеиновой кислоты вируса из спинномозговой жидкости для молекулярно-биологических исследований Download PDFInfo
- Publication number
- RU2808832C1 RU2808832C1 RU2022130421A RU2022130421A RU2808832C1 RU 2808832 C1 RU2808832 C1 RU 2808832C1 RU 2022130421 A RU2022130421 A RU 2022130421A RU 2022130421 A RU2022130421 A RU 2022130421A RU 2808832 C1 RU2808832 C1 RU 2808832C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rna
- sample
- csf
- ratio
- resulting
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 title claims abstract description 30
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title description 4
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 title description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 claims abstract description 11
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 9
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims abstract description 5
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229940079862 sodium lauryl sarcosinate Drugs 0.000 claims abstract description 5
- ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[dodecyl(methyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCN(C)CC([O-])=O ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 27
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 10
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 4
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- -1 poly(allylamine) Polymers 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000012232 AGPC extraction Methods 0.000 description 2
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000709700 Coxsackievirus A9 Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000709638 Echovirus E6 Species 0.000 description 1
- 206010014909 Enterovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000083 poly(allylamine) Polymers 0.000 description 1
- 229920000333 poly(propyleneimine) Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- AGGKEGLBGGJEBZ-UHFFFAOYSA-N tetramethylenedisulfotetramine Chemical compound C1N(S2(=O)=O)CN3S(=O)(=O)N1CN2C3 AGGKEGLBGGJEBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к молекулярной биологии. Предложен способ выделения РНК вируса из спинномозговой жидкости (СМЖ), включающий концентрацию образца СМЖ в центробежном вакуумном концентраторе с ускорением 150-300 g и отрицательным давлением 2 кПа до уменьшения конечного объема образца в 4 или в 5 раз; добавление в соотношении 1:10 лизирующего раствора, содержащего 4 М гуанидина тиоцианата, 25 мМ цитрата натрия, 0,5% натрия лаурилсаркозината, 0,1 М 2-меркоптоэтанола, инкубирование смеси до полного растворения компонентов; далее последовательно добавляют в соотношении 1:10:2 1-3 М ацетат натрия, фенол и смесь хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 49:1 при перемешивании; охлаждают и центрифугируют с ускорением 10-13 тыс. g; верхнюю прозрачную водную фазу переосаждают добавлением изопропанола и инкубированием при минус 20°С; полученную РНК дополнительно очищают методом аффинной сорбции с использованием диоксида кремния. Изобретение обеспечивает повышение концентрации и степени очистки РНК при ее выделении из биологических образцов СМЖ с низкой исходной концентрацией возбудителя. 1 ил., 2 табл., 4 пр.
Description
Изобретение относится к способам выделения РНК вируса из спинномозговой жидкости (СМЖ) и может быть использовано в области медицины и молекулярной биологии для индикации и идентификации нейровирулентных РНК-содержащих вирусов с применением полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и других молекулярно-биологических методов.
Известно, что концентрация нейровирулентных вирусов в СМЖ может быть крайне низкой, что затрудняет индикацию и идентификацию возбудителя молекулярно-биологическими методами [1-5]. Применительно к диагностике энтеровирусной инфекции это приводит к необходимости детекции РНК возбудителя в фекалиях, что в свою очередь увеличивает вероятность ложноположительного результата из-за высокой распространенности бессимптомного носительства возбудителя [2]. Использование культуральных методов для повышения концентрации возбудителя применяется, но является длительным и трудоемким [1,5].
Выделение нуклеиновых кислот (НК) из образцов биоматериала включает следующие этапы: высвобождение (лизирование), сепарация (отделение НК от балластных веществ, включая механические примеси, белки и т.п.), очистка (удаление остаточных примесей) и (опционально) концентрирование [6].
Известные методы лизирования включают воздействие солей [7], хаотропных агентов (гуанидина тиоцианат), детергентов (натрия додецилсульфат), ферментов и физических факторов [8,9]. При этом гуанидина тиоцианат является предпочтительным средством лизирования для выделения РНК, поскольку обладает свойством инактивировать нуклеазы [10].
Для отделения НК от балластных веществ и примесей применяются методы, связанные с разделением в жидкой или твердой фазах [6]. Для отделения НК в жидкой среде используется фенол (который также денатурирует белки), часто в сочетании с хлороформом и изоамиловым спиртом [11]. Последние способствуют разделению фаз с переходом НК в водный раствор, а также препятствуют пенообразованию. Дальнейшим этапом выделения и концентрирования является осаждение НК спиртами (этанолом или изопропанолом) в присутствии солей (ацетата натрия, ацетата аммония, хлорида натрия) [12]. Осажденные НК концентрируются путем центрифугирования и промываются с последующим их растворением. Описанный метод позволяет получать высокоочищенные НК, однако отличается трудоемкостью. Кроме того, спирты помимо НК способны осаждать и другие вещества, содержащиеся в исходных образцах [6].
Отделение НК с использованием твердой фазы предполагает разделение в геле, основанное на разнице молекулярных масс [13], ионообменную хроматографию с обратимой адсорбцией на основе заряда молекул [14, 15] и аффинную хроматографию с обратимой адсорбцией [16]. Последний метод является наиболее распространенным и основан на способности НК адсорбироваться на поверхности диоксида кремния (диатомита) в присутствии спиртов и солей или хаотропных агентов при рН менее 7 в безводной среде. Данный метод отличается технической простотой реализации, поскольку не требует неоднократного промывания осажденной НК с ручным удалением надосадочной жидкости.
Известен способ выделения РНК кишечных вирусов для анализа с использованием обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции (патент РФ №2313792, МПК G01N 33/50, С 12Q1 /68, опубл. 27.12.2007 г.) [20], включающий разрушение вирионов путем прогревания в лизирующем буфере, фракционирование лизата и осаждение целевого продукта, отличающийся тем, что фракционирование лизата проводят путем центрифугирования в присутствии перхлората натрия, РНК осаждают охлажденным изопропиловым спиртом.
Известен способ выделения нуклеиновых кислот из СМЖ (патент США №10633647, МПК C12N 15/10, опубл. 28.04.2020 г.) [18], включающий: получение связывающего фрагмента раствора в технологической камере; смешивание связующего раствора фрагмента с биологическим образцом в технологической камере с целью получения смеси из фрагмента образца; инкубация смеси фрагмента-образца в течение временного окна, тем самым получая раствор, содержащий набор частиц нуклеиновых кислот, связанных фрагментом, и объем отходов; отделение множества связанных с фрагментами частиц нуклеиновых кислот от объема отходов; промывка набора частиц нуклеиновых кислот, связанных с фрагментами; и высвобождение образца нуклеиновой кислоты из набора частиц нуклеиновых кислот, связанных фрагментами. Способ предпочтительно использует связующий фрагмент, содержащий, по меньшей мере, один из поли(аллиламина) и полипропиленимин тетрамина дендримера, оба из которых обратимо связываются и не привязаны к нуклеиновым кислотам на основе рН окружающей среды.
Наиболее близким аналогом (прототипом) к предлагаемому способу является метод выделения РНК с использованием гуанидина тиоцианата, фенола и хлороформа [17] (далее сравниваемый метод №1). Указанный способ выделения общей РНК из биологических образцов различных источников состоит в следующем. РНК отделяют от ДНК после экстракции кислым раствором, содержащим тиоцианат гуанидина, ацетат натрия, фенол и хлороформ, с последующим центрифугированием. В кислых условиях общая РНК остается в верхней водной фазе, в то время как большая часть ДНК и белков остается либо в интерфазе, либо в нижней органической фазе.
Затем общая РНК восстанавливается путем осаждения изопропанолом и может быть использована для нескольких применений. Оригинальный протокол позволяет выделять РНК из клеток и тканей менее чем за 4 часа. Данный метод является одним из наиболее эффективных с точки зрения полноты выделения продукта и степени его очистки [10].
Вместе с тем, он не устраняет проблему низкой концентрации вируса в исходном образце, а получаемый препарат РНК нуждается в повторном переосаждении для удаления остаточного количества примесей, что может приводить к частичной потере РНК.
В отличие от способа-прототипа, предлагаемый способ предполагает предварительное концентрирование образца и дополнительную очистку РНК методом аффинной сорбции.
В отличие от другого способа выделения РНК нейровирулентного вируса из СМЖ [18] и от выделения методом аффинной сорбции [16] (далее сравниваемый метод №2), предлагаемый способ включает этапы концентрирования и избирательного растворения РНК с последующим осаждением, что обеспечивает повышение концентрации и степени очистки РНК при ее выделении из биологических образцов (спинномозговой жидкости) с низкой исходной концентрацией возбудителя при ожидаемом отсутствии ингибиторов ОТ и ПЦР.
Техническим результатом заявляемого технического решения является повышение концентрации и степени очистки РНК при ее выделении из биологических образцов СМЖ с низкой исходной концентрацией возбудителя при ожидаемом отсутствии ингибиторов ОТ и ПЦР.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе выделения РНК вируса из спинномозговой жидкости (СМЖ) для молекулярно-биологических исследований, согласно изобретения, образец СМЖ предварительно концентрируют в центробежном вакуумном концентраторе для частичного удаления из него воды с ускорением 150-300 g и отрицательным давлением 2 кПа до уменьшения конечного объема образца не менее чем в 5 раз; к полученному концентрату СМЖ добавляют в соотношении 1:10 лизирующий раствор, содержащий 4 М гуанидина тиоцианата, 25 мМ цитрата натрия, 0,5% натрия лаурилсаркозината, 0,1 М 2-меркоптоэтанола, смесь инкубируют до полного растворения компонентов и к полученному раствору последовательно добавляют в соотношении 1:10:2 1-3 М ацетат натрия, фенол и смесь хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 49:1 при перемешивании; полученный образец охлаждают и центрифугируют с ускорением 10-13 тыс. g; из полученной жидкости отбирают верхнюю прозрачную водную фазу, содержащую растворенную РНК, которую переосаждают добавлением изопропанола и инкубированием при температуре не менее минус 20°С; полученный образец осадка РНК переносят в колонку с мембраной из диоксида кремния и центрифугируют при 10-13 тыс. g; адсорбированную РНК промывают 70-90% раствором этанола и остаток этанола с мембраны удаляют центрифугированием с ускорением 10-13 тыс. g с последующим удалением очищенной РНК с мембраны колонки растворением в воде.
Таким образом сущность изобретения заключается в предварительном концентрировании образца, выделением РНК путем ее высвобождения под воздействием хаотропного агента - гуанидина тиоцианата, сепарации в присутствии фенола и хлороформа в кислой среде с последующим переосаждением и очисткой методом аффинной сорбции диоксидом кремния.
Изобретение поясняется чертежом, представленным на фиг. 1, на котором изображены стадии выделения РНК вируса из спинномозговой жидкости для молекулярно-биологических исследований.
Пример 1. Способ выделения рибонуклеиновой кислоты вируса из спинномозговой жидкости для молекулярно-биологических исследований представлен на фиг. 1 и более подробно реализуется (с минимальным содержанием веществ и других параметров способа) следующим образом. Образец СМЖ объемом 0,5 мл переносят в стерильную пробирку и помещают в центробежный вакуумный концентратор для частичного удаления воды из образца. Образец концентрируется с ускорением 150 g и отрицательным давлением 2 кПа в течение 40 минут. Для предотвращения пересушивания образца процедуру проводят до достижения конечного объема образца 0,1 мл. К 0,1 мл полученного концентрата добавляют 1 мл лизирующего раствора, содержащего 4 М гуанидина тиоцианата, 25 мМ цитрата натрия, рН 6, натрия лаурилсаркозината в концентрации 0,5%, 0,1 М 2-меркоптоэтанола. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 12 минут. К полученному раствору последовательно добавляют 0,1 мл 1 М ацетата натрия, рН 4,0, 1 мл фенола, 0,2 мл смеси хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 49:1; полученную смесь перемешивают встряхиванием вручную в течение 10 секунд. Образец охлаждают на льду в течение 15 минут и центрифугируют с ускорением 10 тыс.g в течение 20 минут при температуре 4°С. Из полученной жидкости отбирают верхнюю прозрачную водную фазу, содержащую растворенную РНК. Раствор переосаждают добавлением 1 мл изопропанола и инкубированием при температуре - 20°С в течение 60 минут. Образец переносят в колонку с мембраной из диоксида кремния и центрифугируют при 10 тыс.g в течение 30 секунд. Адсорбированную РНК дважды промывают 70% раствором этанола объемом 0,5 мл, остаток этанола с мембраны удаляют центрифугированием с ускорением 10 тыс.g в течение 30 секунд и подсушиванием на воздухе при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем РНК элюируют в 25 мкл воды, оставляя мембрану колонки с нанесенной на нее водой в течение 3 минут.
Пример 2. Способ выделения рибонуклеиновой кислоты вируса из спинномозговой жидкости для молекулярно-биологических исследований (фиг. 1) более подробно реализуется (с максимальным содержанием веществ и других параметров способа) следующим образом. Образец СМЖ объемом 0,6 мл переносят в стерильную пробирку и помещают в центробежный вакуумный концентратор для частичного удаления воды из образца. Образец концентрируется с ускорением 300 g и отрицательным давлением 2 кПа в течение 60 минут. Для предотвращения пересушивания образца процедуру проводят до достижения конечного объема образца 0,15 мл. К 0,15 мл полученного концентрата добавляют 1 мл лизирующего раствора, содержащего 4 М гуанидина тиоцианата, 25 мМ цитрата натрия, рН 8, натрия лаурилсаркозината в концентрации 0,5%, 0,1 М 2-меркоптоэтанола. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. К полученному раствору последовательно добавляют 0,1 мл 3 М ацетата натрия, рН 4,0, 1 мл фенола, 0,2 мл смеси хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 49:1; полученную смесь перемешивают встряхиванием вручную в течение 15 секунд. Образец охлаждают на льду в течение 15 минут и центрифугируют с ускорением 13 тыс. g в течение 20 минут при температуре 4°С. Из полученной жидкости отбирают верхнюю прозрачную водную фазу, содержащую растворенную РНК. Раствор переосаждают добавлением 1 мл изопропанола и инкубированием при температуре - 20°С в течение 70 минут. Образец переносят в колонку с мембраной из диоксида кремния и центрифугируют при 13 тыс. g в течение 40 секунд. Адсорбированную РНК дважды промывают 90% раствором этанола объемом 0,5 мл, остаток этанола с мембраны удаляют центрифугированием с ускорением 13 тыс. g в течение 60 секунд и подсушиванием на воздухе при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем РНК элюируют в 25 мкл воды, оставляя мембрану колонки с нанесенной на нее водой в течение 5 минут.
Ниже приведены примеры 3-4 конкретного выполнения заявляемого способа.
Пример 3. Сравнительные результаты выделения РНК Echovirus Е6 с использованием предлагаемого способа и двух альтернативных методов-аналогов.
Результаты выделения РНК сравнивали, используя продукт выделения для ОТ-ПЦР в соответствии с ранее описанной методикой, применяемой для генотипирования энтеровирусов [19]. Образцы РНК из СМЖ выделяли предлагаемым методом по примеру 1, а также методом с использованием гуанидина тиоцианата, фенола и хлороформа (далее метод №1) и методом аффинной сорбции с диоксидом кремния (далее метод №2). Образцы РНК использовали для постановки ОТ-ПЦР, результаты визуализировали с использованием электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Ампликоны выделяли из геля и очищали с использованием коммерческого набора «Cleanup Standard)) (производитель ЗАО «Евроген))) и концентрацию продукта измеряли с использованием спектрофотометра.
Концентрация продукта ОТ-ПЦР, РНК для постановки которой была выделена предлагаемым методом, была статистически значимо выше, чем в группе метода №1 и метода №2 (критерий Краскела-Уоллиса 8,96, df=2, р=0,01; post-hoc тест Коновера-Аймана: р=0,0022 для предлагаемого метода и метода №1, р=0,0005 для предлагаемого метода и метода №2, таблица 1).
Пример 4. Сравнительные результаты выделения РНК Coxsackievirus А9 с использованием предлагаемого метода и двух альтернативных методов. Образцы РНК из СМЖ выделяли предлагаемым методом по примеру 2, а также методом с использованием гуанидина тиоцианата, фенола и хлороформа (далее метод №1) и методом аффинной сорбции с диоксидом кремния (далее метод №2).
Результаты выделения РНК сравнивали, как описано в Примере 3.
Концентрация продукта ОТ-ПЦР, РНК для постановки которой была выделена предлагаемым методом, была статистически значимо выше, чем в группе метода №1 и метода №2 (критерий Краскела-Уоллиса 6.74, df=2, р=0,03; post-hoc тест Коновера-Аймана: р=0,0109 для предлагаемого метода и метода №1, р=0,0047 для предлагаемого метода и метода №2, таблица 2).
Источники научно-технической и патентной информации
1. Kermanian М. и др. Enrichment of cerebrospinal fluid samples on cell culture for enhancement of sensitivity of mumps and enterovirus detection by multiplex RT-PCR // Diagn Microbiol Infect Dis. 2008. T. 60, №4. C. 375-379.
2. Harvala H. и др. Recommendations for enterovirus diagnostics and characterisation within and beyond Europe // Journal of Clinical Virology. 2018. T. 101. C. 11-17.
3. Edridge A.W.D. и др. Viral Metagenomics on Cerebrospinal Fluid // Genes (Basel). 2019. T. 10, №5. C. 332.
4. Miller S. и др. Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid // Genome Res. 2019. T. 29, №5. C. 831-842.
5. Faleye T.O.C., Adewumi M.O., Adeniji J.A. Defining the Enterovirus Diversity Landscape of a Fecal Sample: A Methodological Challenge? // Viruses. 2016. T. 8, №1. С. E18.
6. Thatcher S.A. DNA/RNA Preparation for Molecular Detection // Clinical Chemistry. 2015. T. 61, №1. c. 89-99.
7. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells // Nucleic Acids Res. 1988. T. 16, №3. C. 1215.
8. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA //Nucleic Acids Res. 1979. T. 7, №6. C. 1513-1523.
9. van Tongeren S.P., Degener J.E., Harmsen H.J.M. Comparison of three rapid and easy bacterial DNA extraction methods for use with quantitative real-time PCR // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2011. T. 30, №9. С.1053-1061.
10. Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on // Nat Protoc. 2006. Т. 1, №2. C. 581-585.
11. Moore D., Dowhan D. Purification and concentration of DNA from aqueous solutions // Curr Protoc Mol Biol. 2002. T. Chapter 2. C. Unit 2.1 A.
12. Eickbush Т.Н., Moudrianakis E.N. The compaction of DNA helices into either continuous supercoils or folded-fiber rods and toroids // Cell. 1978. T. 13, №2. C. 295-306.
13. Adeli K., Ogbonna G. Rapid purification of human DNA from whole blood for potential application in clinical chemistry laboratories // Clin Chem. 1990. T. 36, №2. C. 261-264.
14. Polski J.M. и др. Rapid and effective processing of blood specimens for diagnostic PCR using filter paper and Chelex-100 // Mol Pathol. 1998. T. 51, №4. C. 215-217.
15. Feng G. и др. A new ion-exchange adsorbent with paramagnetic properties for the separation of genomic DNA // Analyst. 2011. T. 136, №22. C. 4822-4829.
16. Vogelstein В., Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose // Proc Natl Acad Sci USA. 1979. T. 76, №2. C. 615-619.
17. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal Biochem. 1987. T. 162, №1. С. 156-159 (прототип).
18. Патент США №10633647, МПК C12N 15/10, опубл. 28.04.2020 г.
19. Nix W.A., Oberste M.S., Pallansch M.A. Sensitive, Seminested PCR Amplification of VP1 Sequences for Direct Identification of All Enterovirus Serotypes from Original Clinical Specimens // Journal of Clinical Microbiology. 2006. T. 44, №8. C. 2698-2704.
20. Патент РФ №2313792, МПК G01N33/50, С 12Q1/68, опубл. 27.12.2007 г.
Claims (1)
- Способ выделения РНК вируса из спинномозговой жидкости (СМЖ) для молекулярно-биологических исследований, характеризующийся тем, что образец СМЖ предварительно концентрируют в центробежном вакуумном концентраторе для частичного удаления из него воды с ускорением 150-300 g и отрицательным давлением 2 кПа до уменьшения конечного объема образца в 4 или в 5 раз; к полученному концентрату СМЖ добавляют в соотношении 1:10 лизирующий раствор, содержащий 4 М гуанидина тиоцианата, 25 мМ цитрата натрия, 0,5% натрия лаурилсаркозината, 0,1 М 2-меркоптоэтанола, смесь инкубируют до полного растворения компонентов и к полученному раствору последовательно добавляют в соотношении 1:10:2 1-3 М ацетат натрия, фенол и смесь хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 49:1 при перемешивании; полученный образец охлаждают и центрифугируют с ускорением 10-13 тыс. g; из полученной жидкости отбирают верхнюю прозрачную водную фазу, содержащую растворенную РНК, которую переосаждают добавлением изопропанола и инкубированием при температуре минус 20°С; полученный образец осадка РНК переносят в колонку с мембраной из диоксида кремния и центрифугируют при 10-13 тыс. g; адсорбированную РНК промывают 70-90% раствором этанола и остаток этанола с мембраны удаляют центрифугированием с ускорением 10-13 тыс. g с последующим удалением очищенной РНК с мембраны колонки растворением в воде.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2808832C1 true RU2808832C1 (ru) | 2023-12-05 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2382081C2 (ru) * | 2008-03-12 | 2010-02-20 | Объединенный Институт Ядерных Исследований | Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот |
| RU2585232C1 (ru) * | 2015-05-06 | 2016-05-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БиоСилика" | Способ выделения микрорнк из биологических жидкостей |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2382081C2 (ru) * | 2008-03-12 | 2010-02-20 | Объединенный Институт Ядерных Исследований | Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот |
| RU2585232C1 (ru) * | 2015-05-06 | 2016-05-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БиоСилика" | Способ выделения микрорнк из биологических жидкостей |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHOMCZYNSKI P., SACCHI N. "The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on"; Natural protocols, 2006, v.1, N 2, p.581-585. VOGELSEIN B., GILLESPIE D. "Preparative and analytical purification of DNA from agarose"; Proceedings of the National Academy of Sciences, 1979, v.76(2), p.615-619. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10947527B2 (en) | Compositions and methods for purifying nucleic acids from stabilization reagents | |
| KR101005924B1 (ko) | 핵산 추출 장치 | |
| ES2535809T3 (es) | Métodos para aislar ácidos nucleicos | |
| CN109385418B (zh) | 一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法及试剂 | |
| CN108410951B (zh) | 一种新的核酸提取试剂及其应用 | |
| McCaustland et al. | Application of two RNA extraction methods prior to amplification of hepatitis E virus nucleic acid by the polymerase chain reaction | |
| US9006420B2 (en) | Method for concentrating and isolating biomolecules or viruses | |
| KR101006562B1 (ko) | 핵산 추출 방법 | |
| AU1633199A (en) | Methods of nucleic acid isolation | |
| JP2005508641A (ja) | 核酸の単離および精製 | |
| EP2115123A2 (en) | Selective lysis of sperm cells | |
| JP2019521640A (ja) | タンパク質系試料回収マトリックス及び装置 | |
| WO2022008591A1 (en) | Method for isolating nucleic acid | |
| JP2004500002A (ja) | Ｄｎａを単離するための溶出試薬、方法およびキット | |
| RU2808832C1 (ru) | Способ выделения рибонуклеиновой кислоты вируса из спинномозговой жидкости для молекулярно-биологических исследований | |
| ES2965460T3 (es) | Método automatizable para el aislamiento de ácidos nucleicos | |
| CN111718927A (zh) | 一种提高核酸稳定性的保存液及其应用 | |
| ES2665280T3 (es) | Métodos para la extracción y purificación de componentes de muestras biológicas | |
| Thatcher | Nucleic acid isolation | |
| JP2003529314A (ja) | Ｄｎａを単離し、増幅し、そして特性化するための方法 | |
| CN112251490B (zh) | 一种RNA pulldown的回收试剂盒及其应用 | |
| US10982207B2 (en) | Method of isolating nucleic acids for long sequencing reads | |
| CN108866042B (zh) | 一种微量rna的提取方法 | |
| JP4519247B2 (ja) | 核酸の抽出精製用試薬 | |
| RU2628695C1 (ru) | Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления |