ES2535809T3 - Métodos para aislar ácidos nucleicos - Google Patents

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Abstract

Un método para la purificación de un ácido nucleico, que comprende las etapas de: (a) adsorber en un sustrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo que consiste en gel de sílice, fibras de vidrio, fibras de cuarzo, zeolitas y partículas con atracción magnética recubiertas con vidrio la secuencia de ácido nucleico independientemente de una composición que contiene (i) un tampón acuoso, (ii) sales en una concentración igual a o mayor de 1 M, (iii) un compuesto orgánico no ácido miscible en agua que comprende un grupo funcional de Fórmula I, W ≡ Z (Fórmula I) en la que W es un átomo de carbono o un átomo de azufre y Z es un átomo de oxígeno o un átomo de nitrógeno, en el que el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en un grupo oxo, un grupo sulfoxo, un grupo ciano, y un grupo carbonilo de una función carbamoilo o una amida pero que no pertenece a una función carboxi, y el compuesto orgánico no ácido miscible en agua se selecciona del grupo que consiste en acetilacetona, dimetilsulfóxido, dietilcetona, metiletilcetona, metilpropilcetona, isobutilmetilcetona, gamma-butirolactona, gamma-valerolactona, propilencarbonato y N-metil-2-pirrolidona y en el que la composición de la etapa (a) contiene del 1 al 50 por ciento en volumen del compuesto orgánico no ácido miscible en agua, y el compuesto orgánico no ácido miscible en agua se disuelve para formar una fase líquida homogénea, y (iv) el ácido nucleico; (b) opcionalmente lavar con una solución de lavado el sustrato con el ácido nucleico adsorbido; seguido de (c) poner en contacto el sustrato con el ácido nucleico adsorbido con una solución que contiene sales en una concentración menor en comparación con la composición de la etapa (a), desorbiendo de este modo el ácido nucleico del sustrato; y (d) separar la solución con el ácido nucleico desorbido del sustrato, purificando de este modo el ácido nucleico; y opcionalmente (e) precipitar el ácido nucleico desorbido de la solución de la etapa (d) y aislar el ácido nucleico precipitado, purificando de este modo adicionalmente el ácido nucleico.

Description

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retirada usado depende del tipo de recipiente en el que se realice la incubación. Las etapas adecuadas incluyen retirar el líquido mediante pipeteo o aspiración.
Otro ejemplo es la unión del ácido nucleico en la solución de adsorción con un vellón de vidrio. Los kits comerciales proporcionan con frecuencia dicho vellón en el fondo de una columna. La solución de adsorción que contiene el ácido nucleico se transfiere a la columna y se pasa a través del vellón aplicando fuerza. El término "fuerza" incluye fuerza gravitacional y, preferentemente, fuerza centrífuga. Se prefiere en gran medida el procedimiento de "columna de centrifugación" en el que la disolución de adsorción se pasa a través del filtro debido a la aplicación de fuerza por medio de centrifugación. Otros modos de pasar la solución de adsorción a través del vellón incluyen la aplicación de presión o succión.
El material con el ADN o ARN unido puede después lavarse al menos una vez. Preferentemente, la solución de lavado contiene entre más de 1 y menos de 100 por ciento en volumen del compuesto orgánico no ácido miscible en agua. También preferentemente, la solución de lavado contiene entre 1 y 100 por cien en volumen del compuesto orgánico no ácido miscible en agua. Más preferentemente, la solución de lavado es una mezcla de 1-50 % en volumen de un compuesto orgánico no ácido miscible en agua en agua. Otra solución de lavado muy preferida es una mezcla del 40-80 % en volumen de un compuesto orgánico no ácido miscible en agua con agua. Otra solución de lavado preferida en gran medida es una mezcla del 50-99 % en volumen de un compuesto orgánico no ácido miscible en agua con agua. Se prefiere aún más una solución de lavado que es una mezcla de aproximadamente el 70 % en volumen de un compuesto orgánico no ácido miscible en agua con agua. También se prefiere para lavar el compuesto orgánico no ácido miscible en agua, es decir también se entiende que el compuesto líquido puro como se obtiene de proveedores comerciales está abarcado por la expresión "solución de lavado".
Se usa una solución de lavado que no provoca que el (al menos un) ácido nucleico o los ácidos nucleicos diana se liberen de la superficie del material pero que retira por lavado los contaminantes no deseados tan exhaustivamente como sea posible. Esta etapa de lavado tiene lugar preferentemente incubando el material con el ácido nucleico o los ácidos nucleicos diana unidos con la solución de lavado. El material se resuspende preferentemente durante esta etapa. También preferentemente, en caso de que el material sea un vellón de vidrio o un empaquetado en una columna, la etapa de lavado tiene lugar aclarando la columna con la solución de lavado. Preferentemente, la solución de lavado se pasa a través de la columna aplicando presión, succión, fuerza centrífuga o fuerza gravitacional. Lo anterior se aplica igualmente cuando el compuesto orgánico no ácido miscible en agua se usa en forma pura.
La solución de lavado contaminada se retira preferentemente justo igual que en la etapa descrita anteriormente para unión del ácido nucleico con el material de substrato. Después de la última etapa de lavado, el material puede secarse brevemente en vacío, o puede permitirse que se evapore el fluido. También puede realizarse una etapa de pretratamiento usando acetona.
Posteriormente, las condiciones pueden invertirse, por ejemplo, se reduce la concentración del agente caotrópico o el compuesto orgánico no ácido miscible en agua para eluir el ADN o ARN unido con el material. Preferentemente, el proceso para separar el sustrato, por ejemplo, las partículas de vidrio magnéticas, del resto de la muestra se realiza sedimentando el material biológico inmovilizado, por ejemplo, por fuerza gravitatoria o mediante el uso de un imán, en el caso de partículas de vidrio magnéticas y la retirada del sobrenadante. Después, las partículas de vidrio magnéticas con el material biológico inmovilizado se resuspenden en una solución acuosa sin o con solamente una cantidad pequeña de agente caotrópico y/o un compuesto orgánico no ácido miscible en agua. Como alternativa, la suspensión puede diluirse con una solución sin o con solamente una cantidad pequeña de agente caotrópico y/o un compuesto orgánico no ácido miscible en agua. Se conocen tampones de esta naturaleza del documento DE 37 24 442 y Jakobi, R., et al., Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201. Los tampones de elución con un bajo contenido en sal son en particular tampones con un contenido de menos de 0,2 mol/l. Preferentemente, el tampón de elución contiene la sustancia Tris para fines de tamponamiento. También preferentemente, el tampón de elución es agua desmineralizada. La solución que contiene ADN o ARN purificado puede usarse ahora para otras reacciones. Opcionalmente, el ácido nucleico o los ácidos nucleicos pueden precipitarse de la solución usando, por ejemplo, etanol o isopropanol. El precipitado también puede someterse a etapas de lavado adicionales. Se conocen bien por el experto en la materia métodos de este tipo y se describen en detalle en Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición, CSHL Press, 2001.
Para las etapas de lavado en los métodos de la invención, se usan preferentemente líquidos que son adecuados para procesos en biología molecular, en particular procesos de purificación de ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) que usan la unión de estas sustancias con partículas de vidrio en ciertas condiciones. Los líquidos preferidos comprenden un compuesto orgánico no ácido miscible en agua que comprende un grupo funcional de Fórmula I,
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en la que W es un átomo de carbono o un átomo de azufre y Z es un átomo de oxígeno o un átomo de nitrógeno. Preferentemente, el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en un grupo oxo, un grupo sulfoxo, un
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láminas de filtro de vidrio, cuarzo o cerámica, y/o una membrana que contiene gel de sílice y/o partículas o fibras de soportes minerales y tejidos de cuarzo o lana de vidrio. También se prefiere que el sustrato comprenda partículas que puedan atraerse magnéticamente. Más preferentemente, las partículas que pueden atraerse magnéticamente se recubren con un sustrato mineral seleccionado del grupo que consiste en gel de sílice, vidrio, cuarzo y zeolitas. Aún más preferentemente, el sustrato comprende partículas que pueden atraerse magnéticamente recubiertas con vidrio. El ácido nucleico o los ácidos nucleicos diana pueden detectarse y determinarse. Se prefiere el método de purificación anteriormente descrito, seguido de una etapa de determinación o detección o métodos de purificación seguidos de una etapa de amplificación y determinación o detección. El ácido nucleico o los ácidos nucleicos diana de interés pueden estar contenidos en una matriz de ácidos nucleicos no diana, y pueden ser incluso un componente menor en dicha mezcla de ácidos nucleicos específicos. Los expertos en la materia conocen métodos de detección de ADN adecuados y se describen en libros de texto convencionales como Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición, CSHL Press, 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, NY, 1987. También puede haber etapas de purificación adicionales antes de llevar a cabo la etapa de detección de ADN como por ejemplo una etapa de precipitación. Los métodos de detección pueden incluir pero sin limitación la unión o intercalación de colorantes específicos como bromuro de etidio que se intercala en el ADN bicatenario y cambia su fluorescencia a continuación. El ADN purificado también puede separarse por métodos electroforéticos, opcionalmente después de una digestión de restricción, y visualizarse posteriormente. También hay ensayos basados en sondas que aprovechan la hibridación de oligonucleótidos con secuencias específicas y detección posterior del híbrido. También es posible secuenciar el ADN después de etapas adicionales conocidas por los expertos en la materia. Otros métodos aplican una diversidad de secuencias de ADN a una microplaca de silicio con la que se unen sondas específicas y producen una señal cuando se unen secuencias complementarias.
La invención también abarca la mezcla de componentes proteicos y no proteicos que comprenden ácidos nucleicos en los que los ácidos nucleicos comprenden ADN o ARN o ambos.
La invención también abarca muestras biológicas, de las que se purifican ácidos nucleicos, que comprenden virus o células bacterianas, así como células aisladas de organismos multicelulares como por ejemplo células humanas y animales tales como leucocitos, y compuestos químicos inmunológicamente activos de alto y bajo peso molecular tales como haptenos, antígenos, anticuerpos y ácidos nucleicos, plasma sanguíneo, líquido cerebral, esputo, heces, muestras de ensayo de biopsia, médula ósea, enjuagues bucales, suero sanguíneo, tejidos, orina o mezclas de los mismos. La presente invención también abarca muestras biológicas tales como un fluido del cuerpo humano o animal; preferentemente la muestra biológica es sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo u orina. El plasma sanguíneo es preferentemente EDTA, heparina o plasma sanguíneo citratado. En una realización de la invención la muestra biológica comprende células bacterianas, células eucarióticas, virus o mezclas de los mismos. Una muestra biológica como se ha ejemplificado anteriormente, preferentemente en una forma procesada tal como un lisado, puede ser parte de la composición de la que se adsorbe el ácido nucleico (diana) con el sustrato.
También se prefiere que la mezcla de ácidos nucleicos y material proteico comprenda ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) o ambos, preferentemente el ADN o ARN o ambos derivan de un virus o un (al menos un) microorganismo. El virus puede ser virus de la hepatitis A (VHA), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus del papiloma humano (VPH) o parvovirus B19.
También se prefiere que un componente de ácido nucleico diana y los otros ácidos nucleicos se purifiquen esencialmente como se ha descrito anteriormente. Después el componente de ácido nucleico diana se manipula y detecta adicionalmente, es decir se amplifica con la reacción en cadena de la polimerasa que amplifica específicamente secuencias diana hasta cantidades detectables. Otras reacciones de amplificación posibles son la reacción en cadena de la ligasa (LCR, Wu, D.Y., y Wallace, R.B., Genomics 4 (1989) 560-569, y Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193); Reacción en Cadena de la Polimerasa Ligasa (Barany, F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16); Gap-LCR (Publicación de Patente PCT Nº WO90/01069); Reacción en Cadena de Reparación (Publicación de Patente Europea Nº EP 0 439 182 A2), 3SR (Kwoh, D.Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; Guatelli, J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878; Publicación de Patente PCT Nº WO 92/08800), y NASBA (Patente de Estados Unidos Nº 5.130.238). Además, hay amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), y amplificación Q-beta (para una revisión véase por ejemplo Whelen, A.C., y Persing, D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373; Abramson, R.D., y Myers, T.W., Curr. Opin. Biotechnol. 4 (1993) 41-47).
Se prefiere particularmente el método de detección TaqMan® desvelado en el documento WO 92/02638 y las Patentes de Estados Unidos correspondientes US 5.210.015; US 5.804.375; US 5.487.972. Este método aprovecha la actividad exonucleasa de una polimerasa para generar una señal. En detalle, el componente de ácido nucleico diana se detecta por un proceso que comprende poner en contacto la muestra con un oligonucleótido que contiene una secuencia complementaria de una región del componente de ácido nucleico diana y un oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria de una segunda región de la misma cadena de secuencia componente de ácido nucleico diana, pero que no incluye la secuencia de ácido nucleico definida por el primer oligonucleótido, para crear una mezcla de dobles cadenas durante las condiciones de hibridación, en el que las dobles cadenas
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comprenden el ácido nucleico diana hibridado con el primer oligonucleótido y con el oligonucleótido marcado de modo que el extremo 3’ del primer oligonucleótido está adyacente al extremo 5' del oligonucleótido marcado. Después esta mezcla se trata con una ácido nucleico polimerasa dependiente del molde que tiene una actividad nucleasa 5' a 3' en condiciones suficientes para permitir que la actividad nucleasa 5' a 3' de la polimerasa escinda el oligonucleótido marcado, hibridado, y libere fragmentos marcados. La señal generada por la hidrólisis del oligonucleótido marcado se detecta y/o se mide. La tecnología TaqMan® elimina la necesidad de que se forme y se haga detectable un complejo de reacción unido a fase sólida. En términos más generales, se desvela un procedimiento para la purificación de un componente de ácido nucleico diana seguido de una etapa de detección en el que la reacción de amplificación y/o detección es en una fase de solución homogénea.
Es útil una suspensión que contiene un sustrato en forma de un material en polvo dispersado en un compuesto orgánico no ácido miscible en agua que comprende un grupo funcional de Fórmula I,
W  Z (Fórmula I)
en la que W es un átomo de carbono o un átomo de azufre y Z es un átomo de oxígeno o un átomo de nitrógeno. Preferentemente, el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en un grupo oxo, un grupo sulfoxo, un grupo ciano y un grupo carbonilo de una función carbamoilo o una amida pero que no pertenecen a una función carboxi. Más preferentemente, el compuesto orgánico no ácido miscible en agua se selecciona del grupo que consiste en acetona, acetilacetona, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, dietilcetona, metiletilcetona, metilpropilcetona, isobutilmetilcetona, gamma-butirolactona, gamma-valerolactona, propilencarbonato y N-metil-2-pirrolidona. También es útil que la suspensión descrita anteriormente se use en procesos automáticos para la purificación de un (al menos un) ácido nucleico. Los dispositivos de procesamiento automático capaces de realizar un método de la invención, tales como robots con un dispositivo de pipeteo, tienen con frecuencia recipientes abiertos que contienen soluciones, por ejemplo soluciones madre, y suspensiones tales como la suspensión mencionada anteriormente. A este respecto es ventajoso que las fases líquidas de las soluciones y/o suspensiones contengan un disolvente que bajo presión atmosférica normal y a temperatura ambiente tenga una baja tendencia a evaporarse. Por lo tanto, muy preferentemente, el compuesto orgánico no ácido miscible en agua es dimetilsulfóxido. También muy preferentemente, el compuesto orgánico no ácido miscible en agua es N-metil-2-pirrolidona.
Preferentemente, el sustrato comprende un sustrato mineral en polvo poroso o no poroso seleccionado del grupo que consiste en gel de sílice, vidrio, cuarzo y zeolitas. También preferentemente, el sustrato comprende un sustrato mineral en polvo poroso o no poroso seleccionado del grupo que consiste en óxidos metálicos y/u óxidos mixtos metálicos, alúmina, titania, zirconia y materiales predominantemente consistentes en vidrio. También se prefiere que el sustrato comprenda partículas que pueden atraerse magnéticamente. Más preferentemente, las partículas que pueden atraerse magnéticamente se recubren con un sustrato mineral seleccionado del grupo que consiste en gel de sílice, vidrio, cuarzo y zeolitas. Aún más preferentemente, el sustrato comprende partículas que pueden atraerse magnéticamente recubiertas con vidrio.
También es útil el uso de un compuesto orgánico no ácido miscible en agua que comprende un grupo funcional de Fórmula I,
W  Z (Fórmula I)
en la que W es un átomo de carbono o un átomo de azufre y Z es un átomo de oxígeno o un átomo de nitrógeno, para realizar los métodos de acuerdo con la invención descritos en el presente documento.
Preferentemente, el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en un grupo oxo, un grupo sulfoxo, un grupo ciano y un grupo carbonilo de una función carbamoilo o una amida pero que no pertenece a una función carboxi. Más preferentemente, el compuesto orgánico no ácido miscible en agua se selecciona del grupo que consiste en acetona, acetilacetona, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, dietilcetona, metiletilcetona, metilpropilcetona, isobutilmetilcetona, gamma-butirolactona, gamma-valerolactona, propilencarbonato y N-metil-2-pirrolidona. También es útil que la suspensión descrita anteriormente se use en procesos automáticos para la purificación de un (al menos un) ácido nucleico. Los dispositivos de procesamiento automático capaces de realizar un método de la invención, tales como robots con un dispositivo de pipeteo, con frecuencia tienen recipientes abiertos que contienen soluciones, por ejemplo soluciones de reserva, y suspensiones tales como la suspensión mencionada anteriormente. A este respecto es ventajoso que las fases líquidas de las soluciones y/o suspensiones contengan un disolvente que bajo presión atmosférica normal y a temperatura ambiente tenga una baja tendencia a evaporarse. Por lo tanto, muy preferentemente, el compuesto orgánico no ácido miscible en agua es dimetilsulfóxido. También muy preferentemente, el compuesto orgánico no ácido miscible en agua es N-metil-2-pirrolidona.
También es útil el uso de un compuesto orgánico no ácido miscible en agua que comprende un grupo funcional de Fórmula I,
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en la que W es un átomo de carbono o un átomo de azufre y Z es un átomo de oxígeno o un átomo de nitrógeno, para preparar una suspensión por medio de dispersión de un sustrato en dicho compuesto orgánico no ácido miscible en agua para formar una suspensión de dicho sustrato.
Preferentemente, el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en un grupo oxo, un grupo sulfoxo, un grupo ciano y un grupo carbonilo de una función carbamoilo o una amida pero que no pertenece a un grupo carboxi. Más preferentemente, el compuesto orgánico no ácido miscible en agua se selecciona del grupo que consiste en acetona, acetilacetona, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, dietilcetona, metiletilcetona, metilpropilcetona, isobutilmetilcetona, gamma-butirolactona, gamma-valerolactona, propilencarbonato, y N-metil-2-pirrolidona. También es útil que la suspensión descrita anteriormente se use en procesos automáticos para la purificación de un (al menos un) ácido nucleico. Los dispositivos de procesamiento automático capaces de realizar un método de la invención, tales como robots con un dispositivo de pipeteo, tienen con frecuencia recipientes abiertos que contienen soluciones, por ejemplo soluciones madre, y suspensiones tales como la suspensión mencionada anteriormente. A este respecto es ventajoso que las fases líquidas de las soluciones y/o suspensiones contengan un disolvente que bajo presión atmosférica normal y a temperatura ambiente tenga una baja tendencia a evaporarse. Por lo tanto, muy preferentemente, el compuesto orgánico no ácido miscible en agua es dimetilsulfóxido. También muy preferentemente, el compuesto orgánico no ácido miscible en agua es N-metil-2-pirrolidona.
Preferentemente, el sustrato comprende un sustrato mineral poroso o no poroso en polvo seleccionado del grupo que consiste en gel de sílice, vidrio, cuarzo y zeolitas. También preferentemente, el sustrato comprende un sustrato mineral poroso o no poroso en polvo seleccionado del grupo que consiste en óxidos metálicos y/u óxidos mixtos metálicos, alúmina, titania, zirconia y materiales predominantemente consistentes en vidrio. También se prefiere que el sustrato comprenda partículas que pueden atraerse magnéticamente. Más preferentemente, las partículas que pueden atraerse magnéticamente se recubren con un sustrato mineral seleccionado del grupo que consiste en gel de sílice, vidrio, cuarzo y zeolitas. Aún más preferentemente, el sustrato comprende partículas que pueden atraerse magnéticamente recubiertas con vidrio.
Es útil además el uso de una suspensión descrita anteriormente para realizar un método de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento.
También son útiles kits. Dichos kits conocidos en la técnica comprenden además utensilios de plástico que pueden usarse durante el procedimiento de preparación de muestras como por ejemplo placas de microtitulación en el formato de 96 o 384 pocillos o simplemente tubos de reacción ordinarios fabricados por ejemplo por Eppendorf, Hamburgo, Alemania, y todos los otros reactivos para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la invención. Por lo tanto, el kit puede contener adicionalmente un material con una afinidad por ácidos nucleicos (y el (al menos un) componente de ácido nucleico diana), preferentemente el material con una afinidad por ácidos nucleicos (y el (al menos un) componente de ácido nucleico diana) comprende un material con una superficie de sílice. Preferentemente, el material con una superficie de sílice es un vidrio. Más preferentemente, el material con una afinidad por ácidos nucleicos es una composición que comprende partículas de vidrio magnéticas, es decir partículas que pueden atraerse magnéticamente recubiertas con vidrio. Otro material preferido con una afinidad por ácidos nucleicos es un intercambiador aniónico. El kit puede comprender además o adicionalmente un tampón de lisis que contiene por ejemplo agentes caotrópicos, detergentes o mezclas de los mismos que permiten la lisis de células. Estos componentes del kit descrito anteriormente pueden proporcionarse por separado en tubos o recipientes de almacenamiento. Dependiendo de la naturaleza de los componentes, estos pueden proporcionarse incluso en un único tubo o recipiente de almacenamiento. El kit puede comprender además o adicionalmente una solución de lavado que es adecuada para la etapa de lavado de las partículas de vidrio magnéticas cuando está unido a las mismas ADN o ARN. Esta solución de lavado puede contener un compuesto orgánico no ácido miscible en agua descrito en este documento y/o agentes caotrópicos en una solución tamponada o soluciones con un pH ácido sin un compuesto orgánico no ácido miscible en agua descrito en el presente documento y/o agentes caotrópicos como se han descrito anteriormente. Con frecuencia la solución de lavado u otras soluciones se proporcionan como soluciones madre que se tienen que diluir antes de su uso. El kit puede comprender además o adicionalmente un eluyente o tampón de elución, es decir una solución o un tampón (por ejemplo Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) o agua pura para eluir el ADN o ARN unido a las partículas de vidrio magnéticas. Además, pueden estar presentes reactivos adicionales o soluciones tamponadas que pueden usarse para el proceso de purificación de un ácido nucleico, es decir ADN o ARN.
También es útil un kit de partes, que contiene (a) una solución madre concentrada de una sal de tampón y una sal caotrópica seleccionada del grupo que consiste en perclorato sódico, clorhidrato de guanidina, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina y yoduro sódico; (b) un compuesto orgánico no ácido miscible en agua que comprende un grupo funcional de Fórmula I,
W  Z (Fórmula I)
en la que W es un átomo de carbono o un átomo de azufre y Z es un átomo de oxígeno o un átomo de nitrógeno y el compuesto orgánico no ácido miscible en agua se selecciona del grupo que consiste en acetona, acetilacetona, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, dietilcetona, metiletilcetona, metilpropilcetona, isobutilmetilcetona, gamma-butirolactona,
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sustrato; (d) opcionalmente lavar con una solución de lavado el sustrato con el ácido nucleico adsorbido; seguido de
(e) poner en contacto el sustrato con el ácido nucleico adsorbido con una solución que contiene sales en una concentración menor en comparación con la composición de la etapa (a), desorbiendo de este modo el ácido nucleico del sustrato; y (f) separar la solución con el ácido nucleico desorbido del sustrato; y (g) detectar en la solución de la etapa (f) la presencia del ácido nucleico, determinando de este modo la presencia del ácido nucleico. Preferentemente, el ácido nucleico se determina por amplificación del ácido nucleico por medio de la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos, una sonda de detección específica y una mezcla de amplificación, por lo que la amplificación se controla en tiempo real. También se prefiere determinar el ácido nucleico hibridando el ácido nucleico con una sonda de hibridación y detectar y/o cuantificar el híbrido. El experto en la materia es consciente del hecho de que no solamente un ácido nucleico puede actuar como una sonda de hibridación sino que también puede usarse un ácido nucleico que comprende uno o más análogos nucleosídicos. Además, se conocen en la técnica análogos de ácido nucleico tales como PNA que son capaces de formar híbridos detectables con ácidos nucleicos. Se entiende que el ácido nucleico para determinar es ADN o ARN. Se prefiere en gran medida el método anterior, por el que el ácido nucleico es ARN y la etapa (g) comprende (i) transcribir de forma inversa el ARN para formar un ADNc, (ii) amplificar posteriormente, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa, el ADNc, (iii) detectar la presencia del ADNc determinando de este modo la presencia del ácido nucleico.
Los inventores también han descubierto que un diéter cíclico miscible en agua es un compuesto orgánico no ácido adecuado para realizar los métodos de acuerdo con la invención.
Por lo tanto, también es útil un método para la purificación de un ácido nucleico, que comprende las etapas de: a) adsorber en un sustrato de ácido nucleico de una composición que contiene (i) un tampón acuoso, (ii) sales en una alta concentración, (iii) un diéter cíclico miscible en agua y (iv) el ácido nucleico; b) opcionalmente lavar con una solución de lavado el sustrato con el ácido nucleico adsorbido; seguido de c) poner en contacto el sustrato con el ácido nucleico adsorbido con una solución que contiene sales en una concentración menor en comparación con la composición de la etapa (a), desorbiendo de este modo el ácido nucleico del sustrato; y d) separar la solución con el ácido nucleico desorbido del sustrato, purificando de este modo el ácido nucleico; y opcionalmente (e) precipitar el ácido nucleico desorbido de la solución de la etapa (d) y aislar el ácido nucleico precipitado, purificando adicionalmente de este modo el ácido nucleico. Preferentemente, el diéter cíclico miscible en agua es dioxano.
Preferentemente, la composición de la etapa (a) contiene del 1 al 50 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Más preferentemente, la composición de la etapa (a) contiene del 2 al 35 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Aún más preferentemente, la composición de la etapa (a) contiene del 3 al 30 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Mucho más preferentemente, la composición de la etapa (a) contiene aproximadamente el 4 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Mucho más preferentemente, la composición de la etapa (a) contiene aproximadamente 15 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Mucho más preferentemente, la composición de la etapa (a) contiene aproximadamente 25 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua.
Preferentemente, las sales en la composición de la etapa (a) son sales caotrópicas en concentraciones de 1 a 8 M. Más preferentemente, dichas sales caotrópicas se seleccionan del grupo que consiste en perclorato sódico, clorhidrato de guanidina, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina y yoduro sódico.
También preferentemente, las sales en la composición de la etapa (a) están en concentraciones de 1 a 10 M y dichas sales se seleccionan del grupo que consiste en cloruro de litio, cloruro sódico, cloruro potásico, acetato sódico, urea, y mezclas de los mismos.
Preferentemente, la solución de lavado contiene el diéter cíclico miscible en agua. Más preferentemente, la solución de lavado contiene del 1 al 50 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Aún más preferentemente, la solución de lavado contiene del 2 al 35 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Aún más preferentemente, la solución de lavado contiene del 3 al 30 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Mucho más preferentemente, la solución de lavado contiene aproximadamente un 4 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Mucho más preferentemente, la solución de lavado contiene aproximadamente el 15 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Mucho más preferentemente, la solución de lavado contiene aproximadamente el 25 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua.
Preferentemente, el sustrato comprende un sustrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo que consiste en gel de sílice, fibras de vidrio, fibras de cuarzo y zeolitas. También preferentemente, el sustrato comprende un sustrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo que consiste en óxidos metálicos y/u óxidos mixtos metálicos, alúmina, titania, zirconia y materiales predominantemente consistentes en vidrio. También se prefiere que el sustrato mineral tenga un tamaño de partícula de 0,1 µm a 1000 µm. También se prefiere que los materiales de soporte minerales porosos, cuando se empleen, tienen un tamaño de poro de 2 a 1000 nm. Más preferentemente, los materiales de soporte porosos o no porosos, especialmente zeolitas, están en forma de empaquetamientos sueltos. Aún más preferentemente, el sustrato mineral consiste en láminas de filtro en forma de vidrio, cuarzo o láminas de filtro de cerámica y/o una membrana que contiene gel de sílice y/o partículas o fibras de
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soportes minerales y tejidos de cuarzo o lana de vidrio. También se prefiere que el sustrato comprenda partículas que pueden atraerse magnéticamente. Más preferentemente, las partículas que pueden atraerse magnéticamente se recubren con un sustrato mineral seleccionado del grupo que consiste en gel de sílice, vidrio, cuarzo y zeolitas. Aún más preferentemente, el sustrato comprende partículas que pueden atraerse magnéticamente recubiertas con vidrio.
Es útil además un método para adsorber un ácido nucleico en un sustrato, que comprende las etapas de (a) proporcionar el ácido nucleico en una solución acuosa que contiene sales en una alta concentración y un diéter cíclico miscible en agua; y (b) añadir la solución acuosa de la etapa (a) al sustrato. Preferentemente, el diéter cíclico miscible en agua es dioxano.
Preferentemente, la solución acuosa de la etapa (a) contiene del 1 al 50 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Más preferentemente, la solución acuosa de la etapa (a) contiene del 2 al 35 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Aún más preferentemente, la solución acuosa de la etapa (a) contiene del 3 al 30 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Mucho más preferentemente, la solución acuosa de la etapa (a) contiene aproximadamente el 4 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Mucho más preferentemente, la solución acuosa de la etapa (a) contiene aproximadamente el 15 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Mucho más preferentemente, la solución acuosa de la etapa (a) contiene aproximadamente el 25 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua.
Preferentemente, las sales en la solución acuosa de la etapa (a) son sales caotrópicas en concentraciones de 1 a 8
M. Más preferentemente, dichas sales caotrópicas se seleccionan del grupo que consiste en perclorato sódico, clorhidrato de guanidina, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidinio y yoduro sódico.
También preferentemente, las sales en la solución acuosa de la etapa (a) están en concentraciones de 1 a 10 M y dichas sales se seleccionan del grupo que consiste en cloruro de litio, cloruro sódico, cloruro potásico, acetato sódico, urea, y mezclas de los mismos.
Preferentemente, el sustrato comprende un sustrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo que consiste en gel de sílice, fibras de vidrio, fibras de cuarzo y zeolitas. También preferentemente, el sustrato comprende un sustrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo que consiste en óxidos metálicos y/u óxidos mixtos metálicos, alúmina, titania, zirconia y materiales predominantemente consistentes en vidrio. También se prefiere que el sustrato mineral tenga un tamaño de partícula de 0,1 µm a 1000 µm. También se prefiere que los materiales de soporte mineral porosos, cuando se empleen, tengan un tamaño de poro de 2 a 1000 nm. Más preferentemente, los materiales de soporte porosos o no porosos, especialmente zeolitas, están en forma de empaquetamientos sueltos. Aún más preferentemente, el sustrato mineral consiste en láminas de filtro en forma de láminas de filtro de vidrio, cuarzo o cerámica y/o una membrana que contiene gel de sílice y/o partículas o fibras de soportes minerales y tejidos de cuarzo o lana de vidrio. También se prefiere que el sustrato comprenda partículas que pueden atraerse magnéticamente. Más preferentemente, las partículas que pueden atraerse magnéticamente se recubren con un sustrato mineral seleccionado del grupo que consiste en gel de sílice, vidrio, cuarzo y zeolitas. Aún más preferentemente, el sustrato comprende partículas que pueden atraerse magnéticamente recubiertas con vidrio.
También es útil un método para adsorber un ácido nucleico en un sustrato, que comprende las etapas de (a) proporcionar el ácido nucleico en una solución acuosa que contiene sales en una alta concentración; (b) proporcionar el sustrato en forma de material en polvo; (c) proporcionar un diéter cíclico miscible en agua; (d) dispersar el sustrato de la etapa (b) en el diéter cíclico miscible en agua de la etapa (c) para formar una suspensión de dicho sustrato; y (e) mezclar la solución acuosa de la etapa (a) con la suspensión de la etapa (d). Preferentemente, el diéter cíclico miscible en agua es dioxano.
Preferentemente, la composición de la etapa (e) contiene del 1 al 50 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Más preferentemente, la composición de la etapa (e) contiene del 2 al 35 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Aún más preferentemente, la composición de la etapa (e) contiene del 3 al 30 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Aún más preferentemente, la composición de la etapa (e) contiene aproximadamente el 4 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Aún más preferentemente, la composición de la etapa (e) contiene aproximadamente el 15 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua. Aún más preferentemente, la composición de la etapa (e) contiene aproximadamente el 25 por ciento en volumen del diéter cíclico miscible en agua.
Preferentemente, las sales de la composición de la etapa (e) son sales caotrópicas en concentraciones de 1 a 8 M. Más preferentemente, dichas sales caotrópicas se seleccionan del grupo que consiste en perclorato sódico, clorhidrato de guanidina, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidinio y yoduro sódico.
También preferentemente, las sales en la composición de la etapa (e) están en concentraciones de 1 a 10 M y dichas sales se seleccionan del grupo que consiste en cloruro de litio, cloruro sódico, cloruro potásico, acetato sódico, urea, y mezclas de los mismos.
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metil-2-pirrolidona (NMP). Los eluatos con ARN purificado se analizaron después en un gel de agarosa. Las bandas en los carriles 1 - 8, es decir preparaciones de ARN usando MGP resuspendidas en agua, son muy débiles y apenas pueden reproducirse. M indica un marcador de tamaño. Los carriles 9 - 16 muestran bandas de ARN de preparaciones usando MGP
5 resuspendidas en NMP.
Figura 1b. Se aisló ARN de 106 células HeLa en repeticiones cuádruples usando el protocolo y kit respectivos del Sistema MagNA Pure (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nº de catálogo 3186229). Para estos aislamientos, los MGP (partículas de vidrio magnéticas) se
10 resuspendieron en alcohol isopropílico (isopropanol) o en N-metil-2-pirrolidona (NMP). Los eluatos con ARN purificado se analizaron después en un gel de agarosa.
Figura 2. Se aisló ADN a partir de 1 ml de sangre en repeticiones óctuples usando el protocolo y kit respectivos del Sistema MagNA Pure (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nº de catálogo
15 3186229). Para estos aislamientos, las MGP (partículas de vidrio magnéticas) se resuspendieron en isopropanol o en N-metil-2-pirrolidona o en agua. Los eluatos con ADN purificado se analizaron después en un gel de agarosa.
Figuras 3a, 3b. Señal de fluorescencia durante PCR TaqMan. El eje x indica el número de ciclos de PCR, el eje
20 y la señal de fluorescencia como se mide por el detector en [mV]. Las curvas "R300" reflejan las señales obtenidas con 10.000 copias de ARN diana de control positivo en agua purificada. Las curvas de "R30" reflejan las señales obtenidas con 1.000 copias de ARN diana de control positivo en agua purificada. Se proporcionan curvas adicionales para "NMP" (1-metil-2pirrolidona), "PC" (propilencarbonato), "yBL" (gamma-butirolactona) y "sin BC" (sin la adición de
25 un acondicionador de unión).
Ejemplo 1
Aislamiento de ADN usando fibra de vidrio
30 Se incubaron 1.000 µl de sangre completa de un donante sano con 100 µl de solución de proteinasa K (Roche Id. Nº 745723; 90 mg disueltos en 4,5 ml de agua) y 1.200 µl de tampón de unión caotrópico (Guanidinio-HCl 6 M, Tris HCl 10 mM Triton X100 20 % pH 4,4) a 70 °C durante 10 minutos.
35 Después de añadir 500 µl de (a) isopropanol, (b) acetonitrilo, (c) dimetilsulfóxido o (d) metiletilcetona, el lisado se transfirió a un tubo de filtro de fibra de vidrio (tubo de filtro tomado del kit de Macherey y Nagel Cat. Nº 740 954.20). Después de centrifugar durante 3 minutos a 1.900 x g el flujo continuo se descartó y el tubo de filtro se colocó en un tubo de recogida. Se pipetearon 2.000 µl de un tampón de retirada de inhibidor iónico alto (Guanidinio-HCl 5 M, Tris 20 mM etanol 60 % pH 6,6) en el filtro de fibra de vidrio y se centrifugó durante 1 minuto a 3.000 x g. Seguido de dos
40 etapas de lavado con 2.000 µl de tampón de lavado (NaCl 20 mM, Tris HCl 2 mM, etanol al 80 %, pH 7,5) y centrifugación durante 5 minutos a 3.000 x g. El flujo continuo se descartó. Se usó un nuevo tubo de recogida. Se realizó la elución del ADN con 300 µl de tampón Tris caliente a 70 °C (10 mM, pH 8,5). Después de un tiempo de incubación de 5 minutos el tubo se centrifugó durante 5 minutos a 3.000 x g.
45 Análisis del ADN aislado
Los rendimientos de ADN se calcularon a partir de la medición de DO260nm usando un fotómetro convencional. La pureza se evaluó calculando la relación DO260/280 nm. Los resultados (n = 2) se representan en la Tabla 1.
50 Tabla 1
Aislamiento de ADN de 1.000 µl de sangre completa
adsorción en el sustrato en presencia de
Rendimiento (medido por la determinación de DO a 260 nm) Pureza (relación 260/280 nm)
(a) isopropanol
24,1 µg/ml de sangre 1,89
(b) acetonitrilo
22,2 µg/ml de sangre 1,88
(c) dimetilsufóxido
23,5 µg/ml de sangre 1,90
(d) metiletilcetona
33,5 µg/ml de sangre 1,81
Ejemplo 2 Aislamiento de ARN en el instrumento MagNA Pure LC
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Para las dos primeras etapas de lavado la alícuota de tampón de lavado se transfirió a la columna de centrifugación y la columna se centrifugó a 4.300 x g durante 1 min. La tercera etapa de lavado se alteró porque la columna se centrifugó a 13.200 x g durante 3 min.
5 En lugar de retirar el tampón de lavado por medio de centrifugación (tercera etapa de lavado, véase anteriormente) la fase sólida se secó como alternativa a 65 °C durante 10 min. Elución 10 Para esta etapa se usó tampón de elución que contenía el siguiente compuesto disuelto en agua: Tabla 6
cantidad
unidad sustancia fabricante número de producto
3,3
mmol/l TrisHCl pH 7,5 Fluka 93372
Se transfirió un volumen de 150 µl de tampón de elución a la columna de centrifugación y la columna se centrifugó a
15 4.300 x g durante 1 min. El eluato se recogió para análisis posterior.
Ejemplo 5
Análisis de ARN
20 Se procesaron muestras de suero con adición de 10.000 copias de un ARN diana de control positivo (ARN de virus de la hepatitis C purificado) como se ha descrito en el Ejemplo 4. El contenido del ARN diana en el eluato se determinó por medio de PCR TaqMan usando un kit de detección de VHC Roche.
25 Para el cálculo de la tasa de recuperación (= cantidad encontrada después del proceso/cantidad antes del proceso) se procesaron patrones con el procedimiento de detección. Las Figuras 3a y 3b muestran la curva "R300", correspondiente a 10.000 copias (es decir tasa de recuperación del 300 %) y la curva "R30" correspondiente a 1.000 copias (es decir, tasa de recuperación del 30 %).
30 Las Figuras 3a y 3b ilustran el resultado de un experimento típico. Aunque un experimento de control sin acondicionador de unión ("sin BC") conduce a tasas de recuperación muy bajas (sin diana hallada), la adición de un acondicionador de unión ("NMP": N-metil-2-pirrolidona, "PC": propilencarbonato o "GBL": gamma-butirolactona) conduce a una tasa de recuperación de más del 50 % para el ARN de control.
35 Los procedimientos de preparación de muestras que dejan impurezas en el eluato pueden alterar la formación de señal durante el proceso de PCR TaqMan. Se controló por lo tanto la formación de señal para estimar la calidad/pureza de la preparación de ARN. El valor de la señal de fluorescencia después del último ciclo de PCR se tomó como una medida. Como referencia se usaron cantidades conocidas de ARN de control positivo limpio (el mismo que se añadió al suero) en agua pura. Las Figuras 3a y 3b ilustran el resultado de un experimento típico.
40 Aunque la formación de señal de fluorescencia fue despreciable en las preparaciones sin acondicionador de unión (principalmente debido a la recuperación ausente), la adición de acondicionador de unión conduce a una formación de señal mejorada que es comparable a la formación de señal hallada con una diana pura.
Ejemplo 6
45 Tiempo de procesamiento de muestras
Se procesaron muestras recibidas de un hospital, teniendo las muestras valores potenciados de triglicéridos, de acuerdo con el siguiente protocolo:
50 Se incubó un volumen de 750 µl de suero durante 5 min con 75 µl de solución de proteinasa K (actividad enzimática
6.000 U/ml, sin actividad DNasa ni RNAsa) a 37 °C. A continuación, se añadió un volumen de 1.405 µl de tampón de lisis (de acuerdo con la Tabla 4) y se mezcló. Posteriormente, se añadieron 880 µl de gamma-butirolactona o, como alternativa, 880 µl de etanol al 96 % y se mezcló, dando como resultado dos tipos diferentes de solución de
55 adsorción.
Cada solución de adsorción se procesó a una presión constante de +100 kPa mediante un dispositivo de columna que contenía un vellón de fibra de vidrio (usado de un kit "High Pure" de Roche) en un diámetro de 5 mm y un grosor de 1 mm. Se midió el tiempo de paso del volumen completo a través del dispositivo (también denominado "tiempo de
60 unión"). Los resultados se resumen en la Tabla 7.
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Claims (1)

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