KR20150017611A - 세포로부터 핵산을 분리하기 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

염을 포함한 조성물을 이용하여 세포로부터 핵산을 분리하는 방법, 핵산이 고체 지지체 표면에 흡착하는 것을 방지하기 위한 조성물 및 세포로부터 핵산을 분리하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

세포로부터 핵산을 분리하기 위한 방법{Method for separation of nucleic acid from cells}
본 개시는 염을 포함한 조성물을 이용하여 세포로부터 핵산을 분리하는 방법, 핵산이 고체 지지체 표면에 흡착하는 것을 방지하기 위한 조성물 및 세포로부터 핵산을 분리하기 위한 키트에 관한 것이다.
대부분의 암 환자는 1차 종양으로 사망하는 것이 아니다. 신체를 통해 이동하는 악성 종양 세포에 의한 암전이에 의해 사망에 이르게 된다. 암 전이는 일련의 복잡한 순차적인 단계를 포함한다. 1) 1차 위치로부터 주변 조직으로의 확장 단계, 2) 체강 및 혈관 침투 단계, 3) 순환계를 통해 원거리의 위치로 수송하기 위한 종양 세포 방출 단계, 4) 정지 부위로의 조직의 재침습 단계, 5) 종양 세포의 생존, 혈관 형성 및 종양 성장을 촉진하도록 새로운 환경에 적응하는 단계가 있다.
암환자로부터 얻어진 생체 시료는 순환성 종양 세포(circulating tumor cell; CTC)와 같은 희귀 세포를 포함할 수 있다. 순환성 종양 세포는 일반적으로 건강한 개체의 세포에서는 발견되지 않는 마커를 함유한다. 따라서, 이러한 마커를 이용하여, 순환성 종양 세포(CTC)와 같은 생체 시료 내 희귀 세포(rare cell)를 분리한 뒤, 세포 내의 게놈 DNA를 추출하고 증폭하여 유전자 변이를 분석할 수 있다. 이러한 희귀 세포 내의 게놈 DNA의 유전자 정보 분석을 통해 암 조기 진단, 생존 가능성 예측, 적절한 항암제 처방과 관련된 많은 정보를 얻어낼 수 있다.
그러나, CTC는 혈액 내에 매우 극소량으로 존재하므로, 이를 효과적으로 분리하는 것뿐만 아니라, 분리된 극소량의 CTC로부터 가능한 많은 정보를 얻어낼 수 있는 분석 기술이 필요하다.
혈액 내의 CTC를 분리하는 가장 일반적인 방법은 비드(bead)나 마이크로칩(microchip)과 같은 고체 지지체에 특정 항체(예를 들어, anti-EpCAM)를 고정시켜 면역친화성(immonoaffinity)을 이용하여 분리하는 방법이 있다. 이렇게 분리된 CTC로부터 게놈 DNA를 추출하는데 있어서, DNA의 손실을 최소화 하기 위해 CTC와 비드의 분리 없이 추출할 필요가 있다. 그러나, 이 경우 조건에 따라 게놈 DNA가 고체 지지체에 흡착되어 후속 분석(예를 들어, ligation, RT-qPCR)에 적용할 수 없는 문제가 발생한다. 일반적인 희귀 세포에서 게놈 DNA를 추출하는 방법의 경우 고체 지지체의 존재 여부를 고려하지 않고 있으므로 방법에 따라서는 흡착이 발생할 수 있다.
따라서, 고체 지지체를 이용하여 CTC 등의 희귀 세포를 분리하여 게놈 DNA를 추출하는 과정에서, 게놈 DNA의 고체 지지체에의 흡착을 방지할 수 있는 방법에 대한 요구가 있다.
상기 요구에 대응하여, 본 개시는 염을 포함한 조성물을 이용하여 세포로부터 핵산을 분리하는 방법, 핵산이 고체 지지체 표면에 흡착하는 것을 방지하기 위한 조성물 및 세포로부터 핵산을 분리하기 위한 키트를 제공하고자 한다.
일 양상은 세포를 포함하는 시료와 고체 지지체를 인큐베이션시켜 상기 세포를 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계; 상기 세포와 부착된 고체 지지체를 100mM 내지 300mM의 알칼리 금속염을 포함하고, pH 6~8인 조성물에서 현탁시키는 단계; 및 상기 세포를 파쇄(lysis)하여 수득된 용액으로부터 핵산을 얻는 단계를 포함하는, 세포로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공한다.
상기 세포를 고체 지지체에 부착시키는 단계에서, 세포는 각종 세포, 특히 희귀 세포에서 유래한 것일 수 있다.
상기 희귀 세포는 생체 시료(body fluid)에 존재하는 것일 수 있다. 상기 생체 시료는 타액, 소변, 혈액, 혈청, 신체 조직 및 세포 배양액을 포함할 수 있다. 또한, 상기 희귀 세포는 내피 세포, 태내 순환에서의 태아 세포, 박테리아 세포, 심근 세포, 상피 세포 및 바이러스 감염된 세포로부터 얻어질 수 있다.
상기 희귀 세포는 정상적인 생체 시료에는 존재하지 않지만, 비정상적 상태, 예를 들어 감염성 질환, 만성 질환, 손상 또는 임신을 나타내는 표지로서 존재할 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 또는, 상기 희귀 세포는 정상적인 생체 시료에도 존재할 수 있지만, 정상적인 생체 시료에 통상적으로 존재하는 빈도 미만의 빈도수로 존재하는 세포를 포함할 수 있다. 고형 종양으로부터 전이되거나 미소전이되는 고형 종양의 순환 세포를 포함한다. 고형 종양의 순환 세포는 순환성 종양 세포(circulating tumor cell; CTC), 암 줄기 세포, 및 종양으로 이동되는 세포(예를 들어, 화학유인으로 인함), 예를 들어 순환 내피 전구세포, 순환 내피 세포, 순환 전혈관형성(pro-angiogenic) 골수 세포, 및 순환 수지상 세포를 포함한다.
상기 순환성 종양 세포(CTC)는 종양 세포에서 떨어져 나와 혈관 속을 떠도는 세포로서, 전이성 암종을 가진 환자로부터 얻어진 생체 시료 또는 세포 배양액으로부터 얻어질 수 있다. 상기 전이성 암종은 대장암, 소장암, 직장암, 항문암, 식도암, 췌장암, 위암, 신장암, 자궁암, 유방암, 폐암, 임파선암, 갑상선암, 전립선암, 백혈병, 피부암, 결장암, 뇌종양, 방광암, 난소암 및 담낭암 등을 포함한다.
상기 고체 지지체는 임의의 형상을 가질 수 있다. 상기 고체 지지체는 구형, 플레이트, 비드, 또는 다각면체일 수 있다. 상기 비드는 크기(직경)가 90 내지 150 nm, 5nm 내지 1,000㎛, 또는 1㎛ 내지 50㎛ 일 수 있다. 상기 비드는 자성 비드, 실리카 비드, 폴리스티렌 비드, 유리 비드 또는 셀룰로오스 비드를 포함할 수 있다. 상기 자성 비드는 강체를 띠는 Fe, Ni, Cr 의 금속 및 이의 산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함할 수 있다. 상기 비드는 예를 들어, 자성 실리카 비드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 비드는 중합체, 유기 물질, 규소, 또는 유리에 강체를 띠는 금속으로 코팅될 수 있다.
상기 비드 또는 마이크로 칩 표면은 희귀 세포와 친화성을 갖는 리간드로 처리될 수 있다. 상기 리간드는 항체, 핵산, 단백질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 희귀 세포의 세포 결정 인자에 대해 결합 특이성을 갖는 1 종 이상의 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 스트렙트아비딘이 부착된 비드에 바이오틴이 결합된 세포에 특이적인 항체를 반응시키면, 스트렙트아비딘과 바이오틴의 특이적인 친화성 결합에 의해 비드에 항체가 결합하게 된다. 여기에 희귀 세포를 포함한 시료를 접촉시키면, 특정 희귀 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 상기 희귀 세포에 결합할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 자성 비드 표면의 항체와 희귀 세포의 세포 결정 인자가 결합하면, 자기장 구배를 이용하여 희귀 세포와 결합된 비드만을 분리할 수 있다.
또한, 상기 항체는 종양 관련 항원에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 상기 종양 관련 항원은 EpCAM, 종양관련 당단백질-72(TAG-72), 종양관련항원 CA 125, 전립선 특이막 항원(PSMA), 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), 루이스 Y 종양관련 항원, 암배아 항원(CEA), CEACAM5, HMFG PEM, 점액소 MUC1, MUC18 및 사이토케라틴 종양 관련 항원에 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
상기 항체가 결합된 비드로서, 상업적으로 시판되는 Dynabeads Genomic DNA Blood (Invitrogen), Dynabeads anti-E.coli O157(Invitrogen), CELLectionTM Biotin Binder Kit (Invitrogen), MagAttract Virus Min M48 Kit(Qiagen) 등을 사용할 수 있다.
상기 세포에 결합능을 갖는 리간드가 고정화된 고체 지지체와 세포를 포함한 시료를 인큐베이션시킬 수 있다. 인큐베이션 조성물은 고체 지지체의 리간드와 표적 세포가 결합할 수 있는 적절한 pH, 온도 등의 조건을 가질 수 있다.
상기 조성물에서 현탁시키는 단계는, 염을 포함한 조성물로 현탁할 수 있다. 상기 염은 NaCl, KCl, LiCl 또는 이들의 조합을 포함하는 알칼리 금속염일 수 있다. 상기 염을 포함하는 조성물은 염 효과(salt effect)를 발생시켜 핵산이 고체 지지체에의 의도치 않은 흡착을 방지할 수 있다. 염 효과는 염 이온들이 입자의 표면에 붙는 힘이, 핵산이 고체 지지체에 흡착되는 힘, 예를 들면 정전기적 인력보다 더 강한 것일 수 있다. 상기 염의 농도는 0 초과 400 mM 이하, 100 내지 300 mM, 100 내지 400 mM, 200 내지 300mM 또는 300 mM일 수 있다.
또한, 상기 조성물의 pH는 약 6 내지 9, 약 6 내지 8 또는 약 8일 수 있다. pH는 산 용액, 예를 들어, HCl, 아세트산 용액, 염기 용액, 예를 들어, NaOH 등, 또는 적정한 버퍼 용액을 첨가하여 조절할 수 있다. 상기 pH 범위로 조성물의 pH를 적정할 경우, 조성물의 염의 효과와 pH 적정의 시너지로 핵산의 고체 지지체에의 흡착을 더 효율적으로 방지시킬 수 있다.
상기 조성물은 유기 용매를 더 포함할 수 있다. 상기 유기 용매는 비프로톤성 용매(aprotic solvent)일 수 있다. 상기 비프로톤성 용매는 산성 수소가 없는 용매일 수 있다. 상기 비프로톤성 용매는 아세톤, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 포름아미드, 디메틸 술폭시드(DMSO), 아세트아미드, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 유기 용매의 농도는 0 내지 10 부피%, 예를 들면, 0.5 내지 10, 1 내지 10, 2 내지 10, 5 내지 10, 1 내지 5, 또는 2 내지 5 부피%일 수 있다.
상기 세포를 파쇄하여 핵산을 얻는 단계에서, 세포의 파쇄는 초음파분해, 프렌치 프레스 셀(French press cell), 균질화, 분쇄(grinding), 동결-해동 용해, 및 세포를 물리적 또는 기계적으로 용해시키는 다양한 다른 방법을 사용할 수 있다. 상기 핵산은 DNA 및 RNA를 포함할 수 있다.
상기 수득된 용액은 상기 고체 지지체에 부착된 세포를 파쇄한 후에 자성체 또는 원심분리기 등을 이용하여 고체 지지체 및 고체 지지체에 흡착된 세포 파쇄물(cell debris)을 제거한 후의 용액을 의미한다. 본 개시에 따른 방법을 적용할 경우, 세포가 파쇄된 후 핵산 특히 게놈 DNA가 고체 지지체에 흡착이 되지 않기 때문에, 핵산은 상기 수득된 용액에 포함되어 있고, 수득된 용액 속에 포함된 핵산을 얻을 수 있다.
상기 핵산을 분리하는 방법은, 세포를 파쇄하기 전에 상기 고체 지지체를 양쪽성 이온 물질(zwitterionic material)로 코팅하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 양쪽성 이온 물질는 쯔비터 이온성(zwitterionic polymer) 폴리머를 포함할 수 있다. 상기 쯔비터 이온성 폴리머는 PCB(polycarboxybetaine) 등을 포함할 수 있다. 상기 양쪽성 이온 물질은 2-메타크릴로일옥시 에틸 포스포릴콜린(2-methacryloyloxy ethyl phosphorylcholine)을 포함할 수 있다. 또한, 상기 양쪽성 이온 물질은 0 ~ 0.5 부피%, 0.002 ~ 0.4 부피% 또는 0.2 부피% 의 농도로 코팅될 수 있다.
상기 방법에 의해 분리된 핵산을 PCR을 이용하여 증폭할 수 있다. "PCR"이란 중합효소 연쇄반응을 의미하는 것으로, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 상기 PCR 방법으로는 실시간(real-time) PCR 또는 RT-qPCR(reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction)을 이용할 수 있다. 상기 RT-qPCR은 RNA를 역전사 효소를 사용하여 RNA에 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)로 실시간 PCR 방법으로 증폭하는 것을 말한다.
다른 양상은 100mM 내지 300mM의 알칼리 금속염을 포함하고, 상기 알칼리 금속염은 NaCl, KCl, LiCl, 또는 그 조합이며, pH 6~8인 것인, 핵산이 고체 지지체 표면에 흡착하는 것을 방지하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 유기 용매를 더 포함할 수 있는데, 상기 유기 용매는 아세톤, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 포름아미드, 디메틸 술폭시드(DMSO) 또는 아세트아미드 등의 비프로톤성 용매(aprotic solvent)를 포함할 수 있다.
특정 세포와 결합능이 있는 고체 지지체로 표적 세포를 분리한 후에, 분리된 세포와 고체 지지체를 염을 포함한 조성물로 현탁하면, 탈이온수(D.W.)로 현탁하는 것보다 훨씬 효율적으로 핵산의 고체 지지체에의 흡착을 방지할 수 있다.
다른 일 양상은 상기 조성물을 포함하는, 세포로부터 핵산을 분리하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 표적 세포와 친화성이 있는 리간드가 고정화된 고체 지지체, 라이시스(lysis) 용액, 및 세척액을 포함할 수 있다. 상기 고체 지지체는 비드 또는 마이크로 칩을 포함할 수 있다.
상술한 조성물은 핵산을 추출하기 위해, 고체 지지체에 결합된 세포의 세포막을 용해시켜 노출된 핵산의 고체 지지체에의 흡착을 최소화 하는 것을 가능하게 한다. 이를 통해 예를 들어, 생체 시료 내에 극소량으로 존재하는 CTC 등의 희귀 세포로부터 게놈 DNA의 손실을 최소화하여 게놈 DNA에 관한 가능한 많은 정보를 얻을 수 있다.
또한, 상술한 조성물, 키트 또는 핵산 분리방법을 이용하면, 별도의 물리적 조작 등을 통한 분리체의 제거 없이 분리된 CTC와 같은 희귀 세포의 유전정보 분석을 위한 DNA의 효율적 추출 및 증폭 가능하다.
도 1은 현탁 용액의 pH에 따른 증폭량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 현탁 용액의 pH를 선정된 조건으로 고정했을 때, 염의 농도에 따른 증폭량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 현탁 용액의 pH 및 염 농도를 선정된 조건으로 고정했을 때 유기용매 농도에 따른 증폭량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 현탁 용액의 pH 및 염 농도를 선정된 조건으로 고정했을 때 코팅에 따른 증폭량을 나타낸 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1 : 핵산이 고체 지지체 표면에 결합하는 것을 방지하기 위한 조성물
인간 폐 조직의 상피 세포인 HCC827 (ATCC)세포를 10% FBS(Fetal Bovine Serum)이 보충된 RPMI1640 배지에 배양한 다음, Trypsin-EDTA (sigma)를 사용하여 회수하고, 세포 카운팅 장비인 Scepter (Millipore)를 이용하여 계수하였다. 연속 희석(serial dilution)을 통해 2~3 ul 내에 표적 세포수가 약 10개 들어오게 조절한 다음, 96 웰 플레이트(well plate)에 시딩(seeding)하고 정확한 세포수를 재확인하였다.
원하는 세포수가 카운팅되면 PBS(Phosphate Buffered Saline) 1ml이 담긴 1.5ml 튜브에서 프로토콜에 따라 전처리된 DynaBead® Epithelial Enrich Invitrogen) 100ul와 함께 20분　로테이션하였다. DynaBead®는 자성 비드로서, 인간 상피 항원 EpCAM에 대한 모노클로날 항체 BerEP4로 코팅된 것이다. DynaBead®는 평균 입경이 약4.5um 이다. 그 다음에 자석을　이용해 상등액을 제거하였다.
상기에서 준비된 세포와 결합된 비드를 다음 조건의 용액에 현탁(suspension)한 뒤, GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification Kit　(Sigma)의 프로토콜에 따라 핵산을 분리 및 증폭을 진행하였다. 구체적으로, 상기 프로토콜에 따라, 세포 파쇄 및 단편화(lysis and fragmentation), 라이브러리 제조(library preparation) 및 DNA증폭의 단계를 중단(pause) 없이 차례로 수행하였다. 구체적으로, 세포 파쇄 및 단편화는 먼저, 상기 분리된 세포가 결합된 비드를 9ul의 하기 조건의 용액 중에 첨가하고 현탁시켰다. 현탁은 상기 비드와 용액을 포함한 튜브를 10초간 보텍싱하여 수행하였다. 대조군으로서, 상기 세포가 결합된 비드를 9ul의 탈이온수 중에 첨가하고 동일한 조건으로 현탁하였다. 다음으로, 2uL의 Proteinase K 용액을 32uL의 10x 단일세포 파쇄 및 단편화 버퍼(Single cell lysis & Fragmentation buffer)에 첨가함으로써, 파쇄 및 단편화 버퍼 용액을 제조하였다. 이를 철저하게 보텍싱하였다. 1uL의 파쇄 및 단편화 버퍼 용액를 상기 현탁액에 첨가하고, 철저하게 보텍싱하였다. 혼합물을 50℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, 정확히 4분 동안 99℃로 가열하였다. 얼음으로 식히고, 스핀다운하여 라이브러리 제조에 사용하였다.
(1) pH 에 따른 추출 및 증폭
pH에 따른 게놈 DNA 추출 및 증폭 실험을 하기 표 1의 4가지 조건에서 실시하였다. 현탁 조성물의 염 농도를 동일하게 유지하고(300mM), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), 1X PBS (150mM NaCl, 15mM sodium phosphate) 및 TE(Tris-EDTA buffer: 10mM Tris, 1mM EDTA)으로 현탁 조성물의pH를 6.0, 7.4 및 8.0으로 각각 조정하였다. 조건 4는 비교예로서 탈이온수로 현탁하였다.
　 1 2 3 4
pH 6.0 7.4 8.0 탈이온수
버퍼 시약 MES (10mM) 1X PBS 1X TE
최종 염(NaCl)농도 300mM
도 1은 현탁 조성물의 pH에 따른 증폭량을 나타낸 그래프이다. 표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이,pH 6.0인 조건 1일 때, DNA의 증폭량이 약 90 ng/ul로 탈이온수를 사용한 비교예보다도 낮았다. pH 7.4인 조건 3()과 pH 8.0인 조건 4가 비교예보다 훨씬 많은 DNA 증폭량을 보여주었다. 특히, pH 8.0의 TE 버퍼를 사용한 조건 3에서 증폭량이 최대임을 확인할 수 있었다.
(2) 염 농도에 따른 추출 및 증폭
염 농도에 따른 게놈 DNA 추출 및 증폭 실험을 하기 표 2의 4가지 조건에서 실시하였다. 현탁 조성물의 pH를 8.0으로 동일하게 유지하고, 현탁 조성물의 염 농도를 각각 150mM, 300mM 및 450mM으로 조정하였다. 조건 4는 비교예로서 탈이온수로 현탁하였다.
　 1 2 3 4
최종 염(NaCl)농도 150mM 300mM 450mM D.W.
버퍼 시약 1X TE (pH 8.0)
도 2는 현탁 용액의 pH를 선정된 조건으로 고정했을 때, 염의 농도에 따른 증폭량을 나타낸 그래프이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 염의 농도가 150mM 또는 300mM일 경우에는 탈이온수를 사용한 비교예보다 훨씬 많은 증폭량을 보였지만, 염의 농도가 450mM일 경우에는 비교예와 거의 차이가 없었다. 특히, 염 농도가 300mM인 경우 증폭량이 최대임을 알 수 있었다.
(3) 유기 용매에 따른 추출 및 증폭
유기 용매에 따른 게놈 DNA 추출 및 증폭 실험을 하기 표 3의 4가지 조건에서 실시하였다. 현탁 조성물의 pH 및 염 농도를 pH 8.0 및 NaCl 300mM로 일정하게 유지하고, 포름아미드를 0, 5, 및 10%로 조정하였다. 조건 4는 비교예로서 탈이온수로 현탁하였다.
　 1 2 3 4
포름아미드(%) 0 5 10 D.W.
버퍼 시약 1X TE (pH 8.0)
최종 염(NaCl)농도 300mM
도 3은 현탁 용액의 pH 및 염 농도를 선정된 조건으로 고정했을 때 유기용매 농도에 따른 증폭량을 나타낸 그래프이다.. 도 3에 나타낸 바와 같이, 유기용매의 첨가에 따른 증폭량의 증가 효과는 크지 않지만 상대적으로 5%에서 최대임을 알 수 있었다.
(4) 폴리머 코팅에 따른 추출 및 증폭
세포와 비드를 인큐베이션시켜 세포를 비드에 결합시킨 후에, 세포와 결합된 비드를 0, 0.2 또는 0.4% BL802　(2-methacryloyloxy ethyl phosphorylcholine, BioLipidure 사 제조) 용액 500ul에　첨가하고15분간 로테이션하고 PBS로 1번 세척한 다음 상등액을 완전히 제거하였다.　준비된 각각의 비드를 5% 포름아미드 및 300mM NaCl를 함유 1X TE (Tris-EDTA) 버퍼 용액 9ul에 첨가하고 현탁하였다. 그 다음에, GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification Kit　(Sigma) 프로토콜에 따라 상기 현탁액으로부터 핵산을 분리 및 증폭하였다. 대조군으로서 비드를 코팅하지 않고 탈이온수에 상기 세포가 결합된 비드를 현탁하였다.
(5)정량 PCR
하기 표 4의 각 조건으로 처리되어 증폭된DNA 50ng, 프라이머 250nM, 2X SYBR Master mix(Exiqon), 탈이온수를 혼합하여, PCR 장비인LightCycler?C480 장비를 이용하여 하기와 같이 정량PCR을 진행하였다.
구체적으로, 하기 표 4의 조건을 갖는 현탁 조성물을 준비하였다. 조건 1과 2는 본 개시에 따른 조건이고, 조건 3은 비드가 있고, 현탁액이 D.W.인 비교조건이고, 조건 4는 비드가 없고, 현탁액이 탈이온수인 비교조건이다.
　 1 2 3 4
버퍼 1X TE (pH 8.0) 1X TE (pH 8.0) 탈이온수 탈이온수
최종 염(NaCl)농도 NaCl 300mM NaCl 300mM X X
포름아미드 5% 5% X X
BL 802 코팅 X 0.2% X X
비드 O O O X
PCR에 사용된 표적 서열, 및 프라이머 서열은 표 5에 나타낸 바와 같다. 표 5의 표적 서열과 프라이머로, 각 표적 서열을 프라이머를 이용하여 정량 PCR를 실시하였다. 표적 서열 Ch2, Ch4, Ch12 및 Ch13에 대해서는, 95℃에서 10분간 1 사이클(cycle) 후, 90℃에서 10초, 60℃에서 45초, 72℃에서 15초로 45 사이클 진행하였다. 표적 서열 EGFR19(epithelial growth factor receptor 19)에 대해서는 95℃에서 10분간 1 사이클, 95℃에서 10초, 72℃에서 15초간 45 사이클 진행하였다.
표적 서열(locus) 프라이머
Ch2 Forward : SEQ ID NO: 1
Reverse : SEQ ID NO: 2
Ch4 Forward : SEQ ID NO: 3
Reverse : SEQ ID NO: 4
Ch12 Forward : SEQ ID NO: 5
Reverse : SEQ ID NO: 6
Ch13 Forward : SEQ ID NO: 7
Reverse : SEQ ID NO: 8
EGFR19 Forward : SEQ ID NO: 9
Reverse : SEQ ID NO: 10
상기 표 4의 비드가 있는 조건 1~3 (0, 0.2%, control) 및 비드가 없는 조건 4에서 증폭된 DNA를 이용하여 게놈 DNA의 5개의 위치(site)에 대한 정량 PCR을 진행하였다. 그 결과는 다음과 같다. 여기서 각 표적 서열에 대해 기재된 값은 Cp값의 평균(표준편차)를 의미하는데(n=6), Cp(crossing point) 값이란 프로브의 분리에 의해 생기는 형광의 양이 기본값(baseline level)을 넘어서 감지될 수 있을 정도로 두드러지게 증가하는 시점의 주기수이며, DNA를 정량하는데 사용될 수 있다. 검출 %는 총 실험 횟수 (5 sites x 6 반복)에서 NTC와 유의하게 차이가 있는 실험 횟수를 의미한다.
　실험조건 Ch2 Ch4 Ch12 Ch13 EGFR19 검출　%
1(0.0%) 37.1(+1.5) 23.8(+1.3) 28.7(+4.7) 31.9(+4.8) 23.4(+0.6) 93
2(0.2%) 34.8(+4.2) 26.4(+5.9) 34.5(+8.3) 26.6(+2.4) 23.9(+0.9) 87
3(탈이온수) N.D. N.D. N.D. N.D. 37.7(+2.0) 0
4(No Bead) 28.0(+6.3) 22.9(+0.9) 26.9(+2.1) 27.6(+6.6) 23.6(+1.5) 100
NTC N.D. N.D. N.D. N.D. 31.9(+0.2) 　
NTC: no template control
ND: not determined
상기 표 6에서, 조건 3의 경우, NTC와 차이가 없는 것으로 보아 DNA가 검출되지 않은 것으로 확인되었다. 반면, 조건 1 및 2의 경우, 대부분 NTC와 유의하게 차이가 있는 것으로 보아, DNA가 검출됨을 알 수 있으며 조건 1과 2간의 차이는 없는 것으로 보인다. 조건 1 및 2의 경우, 비록 비드가 없는 경우에 비해 Cp값이 커지는 경향이 있으나 NTC와 유의하게 구별이 되므로 DNA 검출에는 문제가 없을 것으로 보인다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Method for separation of nucelic acid from cells <130> PN101043 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 1 catggctcac tggcttacaa 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> primer <400> 2 ttgcctctta cagaggagca g 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 3 gcaaaatcca taccctttct gc 22 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> primer <400> 4 tctttccctc tacaaccctc taacc 25 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> primer <400> 5 tttgatgtta ggacacgctg aaa 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> primer <400> 6 aaaaacggaa gaagtctctt ggc 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> primer <400> 7 gtcagaagac tgaaaacgaa gcc 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> primer <400> 8 gcttgccaca ctcttcttca agt 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 9 agccaggaac gtactggtga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 10 ctcactttgc ctccttctgc 20

Claims (13)

  1. 세포를 포함하는 시료와 고체 지지체를 인큐베이션시켜 상기 세포를 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계;
    상기 세포와 부착된 고체 지지체를 100mM 내지 300mM의 알칼리 금속염을 포함하고, pH 6~8인 조성물에서 현탁시키는 단계; 및
    상기 세포를 파쇄(lysis)하여 수득된 용액으로부터 핵산을 얻는 단계를 포함하는, 세포로부터 핵산을 분리하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 고체 지지체는 상기 세포와 결합하는 리간드로 코팅된 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 알칼리 금속염은 NaCl, KCl, LiCl, 또는 그 조합인 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 세포를 파쇄하기 전에 상기 고체 지지체를 폴리머로 코팅하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 폴리머는 쯔비터 이온성 폴리머(zwitterionic polymer)인 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 유기 용매를 더 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 유기 용매는 아세톤, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 포름아미드, 디메틸 술폭시드(DMSO), 아세트아미드, 또는 그 조합을 포함하는 비프로톤성 용매인 것인 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 유기 용매의 농도는 0~10 중량 부피%인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 수득된 용액으로부터 얻은 핵산을 PCR에 적용하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 100mM 내지 300mM의 알칼리 금속염을 포함하고, 상기 알칼리 금속염은 NaCl, KCl, LiCl, 또는 그 조합이며, pH 6~8인 것인, 핵산이 고체 지지체 표면에 흡착하는 것을 방지하기 위한 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 유기 용매를 더 포함하는 것인 조성물.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 고체 지지체는 상기 핵산을 포함하는 세포와 결합하는 리간드로 코팅된 것인 조성물.
  13. 청구항 10의 조성물을 포함하는, 세포로부터 핵산을 분리하기 위한 키트.
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