CN114450402A - 稳定化的含细胞体液样品的多模式分析 - Google Patents
稳定化的含细胞体液样品的多模式分析 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114450402A CN114450402A CN202080067088.2A CN202080067088A CN114450402A CN 114450402 A CN114450402 A CN 114450402A CN 202080067088 A CN202080067088 A CN 202080067088A CN 114450402 A CN114450402 A CN 114450402A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- blood
- cells
- stabilized
- fraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 title claims abstract description 204
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 295
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 179
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 179
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 179
- -1 poly (oxyethylene) Polymers 0.000 claims abstract description 137
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 120
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 115
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 105
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 claims abstract description 91
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 claims abstract description 91
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 54
- 150000003140 primary amides Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 150000003334 secondary amides Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 150000003511 tertiary amides Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 765
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 380
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 380
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 claims description 264
- 108091092240 circulating cell-free DNA Proteins 0.000 claims description 128
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 123
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 107
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 85
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 78
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 58
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 52
- 229940123169 Caspase inhibitor Drugs 0.000 claims description 51
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 49
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 48
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 43
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 41
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 claims description 36
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 36
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 claims description 35
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 33
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 33
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 30
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims description 28
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 27
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 24
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 22
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- OOBJCYKITXPCNS-REWPJTCUSA-N (3s)-5-(2,6-difluorophenoxy)-3-[[(2s)-3-methyl-2-(quinoline-2-carbonylamino)butanoyl]amino]-4-oxopentanoic acid Chemical compound O=C([C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C=1N=C2C=CC=CC2=CC=1)C(C)C)COC1=C(F)C=CC=C1F OOBJCYKITXPCNS-REWPJTCUSA-N 0.000 claims description 18
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 18
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 18
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 17
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 16
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 15
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 14
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 14
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 12
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 12
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 10
- 210000002358 circulating endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 9
- MIFGOLAMNLSLGH-QOKNQOGYSA-N Z-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F Chemical compound COC(=O)C[C@@H](C(=O)CF)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 MIFGOLAMNLSLGH-QOKNQOGYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 9
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 9
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 9
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 9
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 9
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000008181 tonicity modifier Substances 0.000 claims description 8
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 8
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 7
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 7
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical group 0.000 claims description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 7
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 6
- 229940127255 pan-caspase inhibitor Drugs 0.000 claims description 6
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 6
- 125000006527 (C1-C5) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 claims description 4
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 claims description 4
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 4
- MBHINSULENHCMF-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpropanamide Chemical compound CCC(=O)N(C)C MBHINSULENHCMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims description 4
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 4
- 125000003748 selenium group Chemical group *[Se]* 0.000 claims description 4
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 claims description 4
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 claims description 4
- 125000006273 (C1-C3) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000005864 Sulphur Chemical group 0.000 claims description 3
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 3
- DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N butanamide Chemical compound CCCC(N)=O DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims description 3
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 3
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 claims description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 224
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 77
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 66
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 66
- 108091008721 AR-V7 Proteins 0.000 description 60
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 56
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 53
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 43
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 42
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 36
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 32
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 28
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 28
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 24
- 239000000463 material Substances 0.000 description 23
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 19
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 19
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 18
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 17
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 17
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 16
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 16
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 16
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 12
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 11
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 11
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 11
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 10
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 8
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 239000000092 prognostic biomarker Substances 0.000 description 8
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 8
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 7
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 6
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000018732 detection of tumor cell Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- 108091007413 Extracellular RNA Proteins 0.000 description 5
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 5
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 230000003019 stabilising effect Effects 0.000 description 5
- HKIPCXRNASWFRU-UHFFFAOYSA-N 1,3-difluoropropan-2-one Chemical compound FCC(=O)CF HKIPCXRNASWFRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 4
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 4
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 4
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 4
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 108091046841 MiR-150 Proteins 0.000 description 4
- 108091081538 Mir-451 microRNA Proteins 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100021768 Phosphoserine aminotransferase Human genes 0.000 description 4
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 4
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 4
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 108091091807 let-7a stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091057746 let-7a-4 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091028376 let-7a-5 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091024393 let-7a-6 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091091174 let-7a-7 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 4
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 4
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 3
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 3
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 3
- 238000009598 prenatal testing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 2
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091034135 Vault RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 108091092259 cell-free RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000000104 diagnostic biomarker Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 229950007919 egtazic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000010658 metastatic prostate carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 2
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000004068 Caspase-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000572 Caspase-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000004066 Caspase-12 Human genes 0.000 description 1
- 108090000570 Caspase-12 Proteins 0.000 description 1
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100026548 Caspase-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004039 Caspase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100021587 Embryonic testis differentiation protein homolog A Human genes 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004705 High-molecular-weight polyethylene Substances 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000898120 Homo sapiens Embryonic testis differentiation protein homolog A Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUAKHGWARZSWIH-UHFFFAOYSA-N N,N‐diethylformamide Chemical compound CCN(CC)C=O SUAKHGWARZSWIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZFKHTAYVUZBIQ-UHFFFAOYSA-N N[Se]N Chemical compound N[Se]N AZFKHTAYVUZBIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 1
- 241001296119 Panteles Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 description 1
- 230000021839 RNA stabilization Effects 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- BFDMCHRDSYTOLE-UHFFFAOYSA-N SC#N.NC(N)=N.ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 Chemical compound SC#N.NC(N)=N.ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 BFDMCHRDSYTOLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091029474 Y RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005103 alkyl silyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000732 arylene group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000010267 cellular communication Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000003040 circulating cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011157 data evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007848 endpoint PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N ethionamide Chemical compound CCC1=CC(C(N)=S)=CC=N1 AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000000893 fibroproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037843 metastatic solid tumor Diseases 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- AJFDBNQQDYLMJN-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylacetamide Chemical compound CCN(CC)C(C)=O AJFDBNQQDYLMJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 125000006353 oxyethylene group Chemical group 0.000 description 1
- 101150111388 pac gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 238000000710 polymer precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 150000003712 vitamin E derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种用于稳定化和分离含细胞体液中包含的多种生物靶标的方法，所述方法包括(A)将含细胞体液与包含一种或多种以下稳定化剂的稳定化组合物接触：(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，和/或(c)至少一种凋亡抑制剂，从而提供稳定化的含细胞体液样品；(B)将稳定化的含细胞体液样品保存稳定化期；和(C)处理稳定化的含细胞体液样品以从稳定化的含细胞体液中富集三种或更多种选自下组的生物靶标：‑细胞亚群，‑胞外核酸，‑胞外囊泡和‑胞内核酸。本方法是有利的，并且能够对来自单个稳定化的含细胞体液样品的不同的生物靶标进行多模式分析。
Description
技术领域
提供了基于液体活检的方法和工作流程，用于从单个稳定化的含细胞体液样品中对不同的感兴趣的生物靶标进行分析。
背景技术
液体活检(LB)作为对人体液(特别是血液、尿液、唾液、母液(liquor)等)中生物靶标(例如细胞、蛋白质、核酸)的分析，是临床实践中用于伴随诊断的有力工具。重要的液体活检分析物，本文中也称为生物靶标，包括稀有细胞、胞外核酸、胞外囊泡、胞内核酸以及特定细胞亚群。癌症和产前检测中的液体活检引起了最大的兴趣，一些目前已有的测试已经被引入常规患者护理中。
众所周知，实体瘤和血液系统恶性肿瘤会脱落生物材料进入体循环中。这些包括细胞(循环肿瘤细胞，也称为CTC)和胞外囊泡(也称为EV)例如外泌体和其他类型的亚细胞膜囊泡(sub-cellular membrane vesicle)。还已知游离的循环核酸含有癌症相关信息，例如关于突变。这些生物材料存在于易于获取的体液中，例如外周全血、腹膜或胸腔积液，并携带包括蛋白质、核酸和脂质的分子信息。由这些循环生物材料提供的分子信息可以与预后、治疗反应、复发或治疗抗性机制相关。现有技术中对于这些生物靶标用于微创测试有很高的兴趣。它们在克服活检挑战方面具有显著优势，并且可以轻松且重复地获得，以提供肿瘤分子信息的微创反映。本领域公认胞外核酸、胞外囊泡或循环肿瘤细胞可以提供有价值的诊断、预后、预测和监测信息。可以使用该信息，例如，通过分析其中包含的生物标志物。生物标志物是待分析的生物样品中可测量的生物分子，其单独或与其他生物标志物组合可以作为一些临床显著状况的指标。生物标志物可以是，例如，诊断、替代、预后和/或预测的。生物标志物可以是，例如，核酸(如DNA或RNA分子)或蛋白质。
血液是液体活检最主要的材料来源。基于细胞的液体活检测试通常依赖于对目标细胞群的分析，例如癌症中的CTC(其他例子为癌症、糖尿病、心血管疾病或急性肾病中的内皮细胞，产前检测中的胎儿细胞，移植学中的器官特异性细胞)(参见，例如，Pantel等，NatRev Clin Oncol，2019年2月；Neumann等.， Comput Struct Biotechnol J，2018，卷16：190-195；Lehmann-Werman等.，Proc Natl Acad Sci U S A.2016年3月29，卷113(13)：E1826-34；Snyder等.，Proc Natl Acad Sci U S A，2011年4月12，卷108(15)：6229-34)。
CTC从癌症患者的原发或转移瘤脱离且能够在血液中找到。这些细胞代表了一种稀有细胞群：在106-108个血细胞的背景中可以发现1-10个CTC，其在循环中的半衰期为2,5小时。CTC是远端转移的种子。癌症患者外周血中 CTC的存在已被引入并验证为总体生存和无病生存的替代标志物，并可用作预后、预测和治疗指导的生物标志物。除了计数以外，对CTC的表型、基因型和转录组特征的检查提供了与治疗和转归相关的信息。然而，由于1)CTC在高背景白细胞(WBC)中的丰度低和2)它们在循环系统中的半衰期短，因此阻碍了CTC分析。由于其稀有性，CTC必须在检测/分析之前进行富集。现有的多种富集方法基本上可以分成依赖标记的和不依赖标记的方法(Joosse等， EMBO Mol Med，2015年1月，卷7(1)：1-11)。然而依赖标记的方法依赖于基于生物学特性的目标细胞群的分离，例如细胞表面特定抗原的表达，而不依赖标记的方法利用肿瘤细胞的物理特性，例如大小、密度、可变形性和其他特征。可以在细胞水平(基于靶蛋白的抗原特异性染色)和分子水平上检测CTC，例如基于肿瘤相关转录本、基因组畸变或表观基因组畸变的检测。
另一种主要的液体活检分析物是胞外核酸，例如循环无细胞 DNA(ccfDNA)。ccfDNA的主要来源是起源于凋亡和坏死细胞的单核小体DNA 片段。此外，胞外DNA也以囊泡结合的凋亡小体、微粒、微囊泡、外泌体或组蛋白/DNA复合物、核小体和病毒体(virtosome)的形式存在。此外，细胞外 RNA存在于外泌体和其他胞外囊泡(EV)中。在癌症患者中，一定比例的ccfDNA 是源自肿瘤细胞的循环肿瘤DNA(ctDNA)。鉴于基因组和表观基因组水平上的肿瘤特异性畸变，可以在野生型ccfDNA的高背景下有效检测ctDNA。现代技术(例如数字微滴PCR、BEAMing、下一代测序)允许基于ccfDNA的液体活检测试到临床实践的开发和快速实施(例如cobas EGFR突变测试v2、Therascreen KRAS测试)。在非侵入性产前检测和移植学中的器官排斥中实施了类似的概念 (分别依赖于检测母体ccfDNA背景中的稀有胎儿DNA片段检测和自体野生型 ccfDNA背景中的器官特异性同种异体DNA检测)。
除了成熟的生物靶标(例如CTC和ccfDNA)以外，在液体活检的情况下还可以分析其他目标分析物，例如胞外囊泡(EV)，包括它们的mRNA和miRNA 含量，循环非编码RNA(miRNA和其他)，以及凝血细胞(血小板)(参见Anfossi 等，Nat Rev Clin Oncol，2018年9月，卷15(9)：541-563；In′t Veld，Wurdinger， Blood，2019年3月4日，pii：blood-2018-12-852830)。
此外，对包含在含细胞体液样品中的细胞亚群(例如外周单核血细胞 (PMBC))的基因组和表观基因组概况分析，可以成为癌症患者早期诊断和免疫监视监测的有用的生物标志物(参见Shen等，Nature，2018年11月，卷 563(7732)：579-583；Abu Ali Ibn Sina等，Nature Communications，2018，卷9，文章编号：4915和Nichita等，Aliment PharmacolTher，2014年3月，卷 39(5)：507-17)。
尽管这些包含在体液样品(如血液)中的生物靶标具有公认的临床潜力，但它们的利用仍然具有挑战性。基于包含于游离循环核酸、EV或CTC中的分子生物标志物的分析来获取癌症相关信息的现有方法通常在灵敏度和/或稳健性方面存在缺陷。鉴于液体活检在个性化医疗中作为伴随诊断的作用，液体活检分析需要完整和标准化的工作流程。分析前条件会显著影响分析测试的结果。如果在抽血后＞3-4小时进行测试，则所有液体活检分析物都需要稳定化。感兴趣的生物靶标的稳定化必须充分且可靠。目前有血液稳定化管(BCT)可用于 CTC分析(例如CellSave、Transfix)或ctDNA分析(Streck BCT、PAXgene血液 ccfDNA管)。一些管，例如Streck BCT，声称与CTC分析相容，然而这些声称基本上限于一种特定的CTC富集和检测技术。此外，使用甲醛或释放甲醛的物质(例如在Streck BCT中使用)具有缺点，因为它们通过诱导核酸分子之间或蛋白质和核酸之间的交联而损害胞外核酸分离的功效和下游分析的功效。
本发明的一个目的是克服现有技术的至少一个缺点并提供改进的基于液体活检的分析方法。特别地，本发明的一个目的是提供允许可靠地富集和分析来自单个含细胞体液样品的多种生物靶标的方法。
发明内容
本公开提供了用于同时稳定化、富集和检测细胞亚群(例如，例如稀有靶细胞(例如CTC))和胞外核酸(例如来自同一含细胞体液样品的胞外DNA)的方法和工作流程，以及用于同时稳定化、富集和分析其他生物靶标(例如来自此类稳定化样品的胞外囊泡(EV))的方法和工作流程。此外，可以从稳定化的含细胞体液样品的细胞部分中分离出高质量的胞内核酸，例如基因组DNA (gDNA)。特别地，提供了对于来自根据本发明收集的且用稳定化技术稳定化的单个含细胞体液样品的胞外DNA、CTC、EV和gDNA的并行液体活检分析的工作流程。
根据第一方面，提供了一种用于稳定化和富集含细胞体液中所包含的多种生物靶标的方法，所述方法包括
(A)将含细胞体液与包含一种或多种以下稳定化剂的稳定化组合物接触：
(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，
(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，和/或
(c)至少一种凋亡抑制剂，
从而提供稳定化的含细胞体液样品；
(B)将稳定化的含细胞体液样品保存稳定化期；
(C)处理稳定化的含细胞体液样品以从稳定化的含细胞体液中分离三种或更多种选自下组的生物靶标：稀有细胞、胞外核酸、胞外囊泡和胞内核酸。
所述方法还可包括
(D)分析富集的三种或更多种生物靶标。
由以下描述和所附权利要求书，本申请的其他目的、特征、优点和方面对于本领域技术人员来说将变得显而易见。然而，应理解，以下描述、所附权利要求书和具体实施例尽管示出了本申请的优选实施方式，但是仅以示例的方式给出。
附图简要说明
图1：MCF7乳腺癌细胞系细胞的免疫细胞化学染色：对人泛细胞角蛋白 (绿色)和细胞核(蓝色)。上图示出未处理的MCF7细胞的染色。下图表示在本公开的稳定化溶液中稳定化30分钟的MCF7细胞的染色。
图2：用Ficoll-Paque密度梯度介质离心后的血液样品。将收集到含EDTA 的BCT中并用PBS稀释的血液样品作为参考。层(从上到下)是：富含凝血细胞的血浆、PBMC环、ficoll、富含红细胞的部分。在用PBS稀释的稳定化样品中，无法观察到上述部分，并且仅在添加了含5％葡萄糖或0.9％NaCl+0.1M 甘油的溶液中存在。这允许恢复正确的层形成以获得不同的部分。
图3.掺入(spike)后，通过AdnaTest前列腺癌面板AR-V7(AdnaTestProstateCancerPanel AR-V7)在实验时间点3、24、30和48小时从收集并储存在PAXgene血液ccfDNA管中的血液中检测掺入的肿瘤细胞。材料：血液被收集到PAXgene血液ccfDNA管中，以20个LNCaP95细胞/5ml血液或20μl PBS/5 ml血液掺入，并储存在2-8℃。CTC富集和检测：AdnaTest前列腺癌面板 AR-V7(AdnaTest ProstateCancerPanel AR-V7)。图3A显示了以20个LNCaP95 细胞/5ml血液掺入的样品的结果，图3B显示了仅以PBS掺入的样品(无掺入对照样品)的结果。
图4.掺入(spike)后，通过AdnaTest前列腺癌面板AR-V7(AdnaTestProstateCancerPanel AR-V7)在实验时间点3、24、48和72小时从收集并储存在PAXgene血液ccfDNA管(图4A；n＝11)和Streck无细胞DNA BCT(图4B； n＝8)中的血液中检测掺入的肿瘤细胞。材料：血液被收集到PAXgene血液 ccfDNA管和无细胞DNA BCT(Streck)中并以20个LNCaP95细胞/5ml血液掺入并储存在2-8℃(PAX)和室温(Streck)。CTC富集和检测：AdnaTest前列腺癌面板AR-V7(AdnaTest ProstateCancerPanel AR-V7)。图4C和4D显示了AdnaTest前列腺癌面板AR-V7(AdnaTest ProstateCancerPanel AR-V7)在 PAXgene血液ccfDNA稳定化血液中的性能，其掺入20个LNCaP95/5ml血液并储存在或2-8℃或室温下3、24、48或72小时。材料：血液被收集到PAXgene 血液ccfDNA管中，以20个LNCaP95细胞/5ml血液掺入。CTC富集和检测： AdnaTest前列腺癌面板AR-V7(AdnaTest ProstateCancerPanelAR-V7)。
图5：显示了当处理EDTA-稳定化的血液或使用根据本发明的稳定化技术稳定化的血液时使用Parsortix细胞富集工作流程的细胞捕获效率。收集在 PAXgene血液ccfDNA管中的血液在室温下储存3天后相容，甚至可以进行处理。
图6：通过RT-qPCR分析从纯化的EV中获取的RNA。较低的Ct值指示更好的结果。
图7：AdnaTest选择(AdnaTestSelect)和-检测(-Detect)程序的示意图，其中可以选择在CTC富集后收集CTC耗竭的血液用于后续ccfDNA和gDNA分离(另参见图11)。
图8：在储存时间内，在CTC富集(CTC耗竭的血液)和对照样品(即未CTC 富集的样品)中，人18S rDNA基因的66和500bp片段(分别为左图和右图)表达的绝对差异评估。箱线图显示中位数(水平线)和25-75％四分位距(框图(box)) 以及数据范围的最小值和最大值(须线(whisker))和异常值(须线外的点)。p值对应于双尾未配对t检验。
图9：在掺入后3小时和所有时间点(3-72小时，n＝11个供者，12个未 CTC富集的样品和32个CTC-耗竭的样品)，从全血(即未CTC富集的样品， n＝3名供者)和CTC富集后的样品(n＝8名供者)的200μl细胞部分中评估gDNA 产量。所有数据以箱线图示出，框图内为中位数和四分位数，尾部为10/90％。个体数据点被覆盖为圆圈。p-值对应于双尾未配对t检验。
图10：根据本发明的方法与PAXgene血液ccfDNA管相容的基于液体活检的分析的不同选项的概述。
图11：基于液体活检的示例性工作流程，用于分析来自单个稳定化的血液样品的多种靶标。如本文所公开的，在根据步骤(D)处理稳定化的血液样品之前，使用根据本发明的稳定化技术还允许稳定化的血液样品在室温下存储更长的时期。
图12：左图：在用Ficoll-Paque离心之后，血液样品被收集到EDTA和 PAXgene血液ccfDNA管中(分别为左和右)。层(从上到下)为：富含凝血细胞的血浆、PBMC环、富含红细胞的部分。在用PBS稀释的PAX样品中上述部分没有清晰分离。右图：与EDTA样品相比(作为参照，n＝8)，PAX-稳定化的样品中观察到的MNC回收率的相对差异。
图13：掺入(spike)后，通过AdnaTest ProstateCancerPanel AR-V7在实验时间点3、24、30、48、72、120和144小时从收集并储存在PAXgene血液ccfDNA 管中的血液中检测掺入的肿瘤细胞。材料：血液被收集到PAXgene血液ccfDNA 管中，以20个LNCaP95细胞/5ml血液掺入并储存在2-8℃。CTC富集和检测：AdnaTest前列腺癌面板AR-V7(AdnaTestProstateCancerPanel AR-V7)。图 13显示了AdnaTest前列腺癌面板AR-V7(AdnaTestProstateCancerPanel AR-V7) 测试用于检测收集到PAXgene血液ccfDNA管中的掺入血液中的肿瘤细胞的性能。
图14：关于储存温度的测试性能。CTC富集并通过AdnaTest前列腺癌面板AR-V7(AdnaTest ProstateCancerPanel AR-V7)检测，在掺入后储存在室温的实验时间点3、24、48和72小时(图14A)或在掺入后储存在2-8℃的3、24、 30、48、72、120和144小时(图14B)。材料：血液被收集到PAXgene血液ccfDNA 管中，以20个LNCaP95细胞/5ml血液掺入。
图15：关于掺入肿瘤细胞数的测试性能用于评估检测限(LOD)。掺入(spike) 后，通过AdnaTest前列腺癌面板AR-V7(AdnaTest ProstateCancerPanel AR-V7) 在实验时间点3、24、48、72、120和144小时从收集并储存在PAXgene血液 ccfDNA管中的血液中检测掺入的肿瘤细胞。材料：血液被收集到PAXgene血液ccfDNA管中，以5个LNCaP95细胞/5ml血液(图15A)或20个LNCaP95 细胞/5ml血液(图15B)掺入并储存在2-8℃。CTC富集和检测：AdnaTest前列腺癌面板AR-V7(AdnaTest ProstateCancerPanel AR-V7)。
图16：依赖于血浆生成方案的测试性能。血液样品被用于CTC富集，CTC- 耗竭血液被用于血浆生成(图16A)。替代地，首先生成血浆(以1900g持续15 分钟)然后细胞部分被用PBS重建达到初始体积并用于CTC富集(图16B)。掺入(spike)后，通过AdnaTest前列腺癌面板AR-V7(AdnaTest ProstateCancerPanel AR-V7)在实验时间点3、24、48和72小时从收集并储存在PAXgene血液 ccfDNA管中的血液中能够检测掺入的肿瘤细胞，这两种血浆生成的方法相似。
图17：依赖于血浆生成方案的在EZ1仪器上的测试性能。如图16中相同的两种血浆生成方法是通过首先CTC富集然后生成血浆(图17A)或首先生成血浆然后富集CTC(图17B)执行的。当如图16中执行的相同的实验使用适用于 EZ1的AdnaTest在EZ1仪器上(自动化解决方案)进行时，观察到相似的结果。掺入后，通过AdnaTest前列腺癌面板AR-V7(AdnaTestProstateCancerPanel AR-V7)在实验时间点3、24、48、72和144小时从收集并储存在PAXgene血液ccfDNA管中的血液中检测掺入的肿瘤细胞。
图18：掺入后，在实验时间点3、24、48和72小时，从收集并储存在 PAXgene血液ccfDNA管中的血液中，通过AdnaTest前列腺癌面板 AR-V7(AdnaTestProstateCancerPanel AR-V7)检测掺入的肿瘤细胞(图18A、 18C、18E和18G)，与AdnaTest前列腺癌(也称为“ProstateDirect”；图18B、18D、 18F和18H)相比较。材料：血液被收集到PAXgene血液ccfDNA管中，以 LNCaP95细胞/5ml血液掺入。图18A和18B显示了通过掺入20个LNCaP95 细胞/5ml血液并储存在2-8℃测试的性能。图18C和18D显示了通过掺入20 个LNCaP95细胞/5ml血液并储存在室温测试的性能。图18E和18F显示了通过掺入5个LNCaP95细胞/5ml血液并储存在2-8℃测试的性能。图18G和18H 显示了使用替代性血浆生成技术测试的性能，其中首先生成血浆，细胞部分被用于CTC富集。
图19：AdnaTest结肠癌的性能。掺入后，通过AdnaTest结肠癌(AdnaTestColonCancer)在实验时间点3、24、48和72小时从收集并储存在PAXgene血液ccfDNA管(图19A)和ACD-A BCT(图19B)中的血液中检测掺入的肿瘤细胞。材料：血液被收集到PAXgene血液ccfDNA管和ACD-A BCT中，以20 个T48细胞/5ml血液掺入并储存在2-8℃。CTC富集和检测：AdnaTest结肠癌(AdnaTest ColonCancer)。图19A和19B显示PAXgene血液ccfDNA管与AdnaTest结肠癌(AdnaTest ColonCancer)相容且允许在样品储存72小时内时检测肿瘤细胞(100％灵敏度)。
图20：掺入的肿瘤细胞(50MCF7)的检测速率，在收获后(图20A)和盒内染色(in-cassette staining)(图20B)。“T”是指在室温储存的天数(0、1、2、3天)。
图21：Parsortix富集后肿瘤细胞IF染色。荧光绿-抗泛-角蛋白(kerating) 抗体染色(肿瘤细胞特异性)；荧光蓝-DAPI(核染色)。储存0(T0)或2(T2)天。
图22：基于Parsotix富集后储存在PAXgene血液ccfDNA管中，掺入的肿瘤细胞的检测，通过使用AdnaTest前列腺癌面板AR-V7的部分检测(图22A) 与AdnaTest前列腺癌(也称为“ProstateDirect”；图22B)相比较。图22显示了细胞掺入PAX ccfDNA-收集的血液样品并储存长达3天，能够像掺入EDTA-收集的样品一样高效检测到。
图22：基于Parsotix富集后储存在PAXgene血液ccfDNA管中，掺入的肿瘤细胞的检测，通过使用AdnaTest前列腺癌面板AR-V7的部分检测(图22A) 与AdnaTest前列腺癌(也称为“ProstateDirect”；图22B)相比较。图22显示了细胞掺入PAX ccfDNA-收集的血液样品并储存长达3天，能够像掺入EDTA-收集的样品一样高效检测到。
图23：如实施例7中所用的用于ccfRNA、ccfDNA和gDNA的分析的多模式工作流程。
图24a：在血液收集(测试时间点＝TTP0)后直接生成并使用指定试剂盒提取的PAXgene和EDTA血浆中，miR150、let7a和miR451微小RNA、ACTB mRNA和18S rDNA(ccfDNA)的qPCR分析的CT值。
图24b：计算在全血储存1、3或6天后产生的PAXgene和EDTA血浆的 miR150、let7a、miR451微小RNA和ACTB mRNA的qPCR分析的倍数变化(相对于TTP0)。使用指定的试剂盒提取RNA。
图25a：在血液收集(TTP0)后直接产生并使用指定试剂盒提取的PAXgene、StreckcfDNA、Streck RNA和Biomatrica血浆中，miR150、let7a和miR451微小RNA的qPCR分析的CT值。
图25b：计算在储存3天后(T3d)产生的PAXgene、Streck cfDNA、Streck RNA和Biomatrica血浆的miR150、let7a、miR451微小RNA和18S rDNA的 qPCR分析的倍数变化(相对于TTP0)。使用指定的试剂盒提取RNA。
图26：从PAXgene血液ccfDNA管、Streck cfDNA、Streck RNA和 Biomatrica管中的全血中提取的gDNA的浓度和DNA完整性指数(DNA integrity index)(DIN)评估。在第一个血浆离心步骤后，使用QIAamp血液DNA 试剂盒从细胞部分提取DNA并用TapeStation系统上的Agilent Genomic DNA
分析。
发明详述
本公开提供了一种用于稳定化和富集含细胞体液中包含的多种生物靶标的有利方法，所述方法包括
(A)将含细胞体液与包含一种或多种以下稳定化剂的稳定化组合物接触：
(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，
(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，和/或
(c)至少一种凋亡抑制剂，
从而提供稳定化的含细胞体液样品；
(B)将稳定化的含细胞体液样品保存稳定化期；
(C)处理稳定化的含细胞体液样品以从稳定化的含细胞体液中富集三种或更多种选自下组的生物靶标：至少一种细胞亚群、胞外核酸、胞外囊泡和胞内核酸。
所述方法还可包括
(D)进一步处理富集的三种或更多种生物靶标用于分析。
随后详细描述本方法的各个单独步骤以及本方法的合适的和优选的实施方式。
步骤(A)
在步骤(A)中，将含细胞体液与包含以下的一种或多种、两种或更多种、或所有三种稳定化剂的稳定化组合物接触：
(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，
(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，和/或
(c)至少一种凋亡抑制剂，
从而提供稳定化的含细胞体液样品。可以包含稳定化组合物，例如预填充 -在收集容器(例如收集管)中。可以将含细胞生物样品引入收集容器中。将含细胞生物体液与稳定化组合物接触的步骤离体发生。
公开了单独试剂在稳定化含细胞体液样品中的有利稳定化作用以及包含这些试剂的组合的有利稳定化组合物，例如在WO2013/045457、 WO2013/045458、WO2014/146780、WO2014/146781、WO2014/146782、 WO2014/049022、WO2015/140218和WO2017/085321中，通过引用纳入本文。包含稳定化剂试剂(a)至(c)的组合的有利稳定化组合物也在本文他处描述并参考本公开。
如在随后的实施例中所证明并由上述文件支持，对包含在含细胞体液中的不同感兴趣的生物靶标进行并行处理和分析是可能的。在与含细胞体液接触时，本方法中使用的稳定化技术有利地稳定化许多感兴趣的生物靶标，包括稀有细胞(例如循环肿瘤细胞)、胞外核酸(例如胞外DNA和RNA)、胞外囊泡和胞内核酸(例如基因组DNA)。正如在随后的实施例中所证明的，可以从稳定化的含细胞的体液样品中回收多种感兴趣的生物靶标，并对其进行经典的分析和检测方法。这使得能够对来自单个稳定化的含细胞体液中的不同的高度感兴趣的生物靶标进行多模式分析。
步骤(B)
在(B)中将稳定化的含细胞体液样品保存预定的稳定化期。
稳定化的含细胞体液样品可以，例如被直接处理或在稳定化后不久(例如3 小时内)处理或可以被保存延长的储存期。特别有利的是稳定化的含细胞体液样品可以保存延长的储存期。包含在稳定化的样品中的生物靶标也在延长的储存期中被保留。
在实施方式中，在处理步骤(C)之前，(B)包含储存稳定化的含细胞体液样品。储存可以包括，例如，将稳定化的含细胞体液样品从收集和稳定化的位点转移到不同的位点以进一步处理。
在进行处理步骤(C)之前，稳定化的含细胞体液样品可以被保存长达12小时或长达24小时。如实施例中所证明的，在进行处理步骤(C)之前，稳定化的含细胞体液样品可以被保存长达30小时、长达36小时或长达48小时。在实施方式中，在进行处理步骤(C)之前，稳定化的含细胞体液样品可以被保存长达50小时或长达72小时。
当将稳定化的含细胞体液样品保存预定的稳定化期时，如果稳定化的样品没有经历冷冻步骤是有利的。冷冻步骤可能会损坏所包含的细胞。因此避免冷冻步骤是有利的，因为它支持含细胞体液样品的保存。
在实施方式中，在预定的稳定化期间，将稳定化的含细胞体液样品保存在室温(例如15-25℃)。在另一个实施方式中，样品被冷却并被，例如，保存在，例如1-14℃，例如1-12℃或2-10℃或2-8℃。在实施方式中稳定化的含细胞体液样品例如血液可以在2-8℃被保存长达72小时。
在实施方式中，在进行处理步骤(C)之前，稳定化的含细胞体液样品可以被保存至少4小时或至少6小时。在实施方式中，在进行处理步骤(C)之前，稳定化的含细胞体液样品可以被保存至少8小时或至少12小时。在实施方式中，在进行处理步骤(C)之前，稳定化的含细胞体液样品可以被保存至少24小时、至少30小时或至少48小时直至72小时(或更长)。
步骤(C)
稳定化期之后，处理稳定化的含细胞体液样品以从稳定化的含细胞体液中富集三种或更多种选自下组的生物靶标：至少一种细胞亚群、胞外核酸、胞外囊泡和胞内核酸。
如本文所公开的，非常有利的是，多种不同的感兴趣的生物靶标被稳定化在含细胞体液内，且随后能够被从同一个稳定化的样品中回收，而且这甚至是在延长的稳定化期之后。这使得在高效的工作流程中，从单个稳定化的含细胞体液中对多种不同的生物靶标进行并行/同时回收和分析。
如本文所公开的，在一个实施方式中，被富集的至少一个细胞群包含或基本由目标稀有细胞组成。在实施方式中，目标稀有细胞是肿瘤细胞，例如循环肿瘤细胞(CTC)。如背景中所讨论的，肿瘤细胞，例如CTC，代表特别感兴趣的生物靶标。
如本文中所讨论的，将稳定化的含细胞体液样品分离成至少一个细胞-耗竭部分和至少一个含细胞部分是有利的。从而可以将包含在含细胞体样品中的细胞浓缩在提供的含细胞部分中。至少一个含细胞部分可以包含有核细胞。在实施方式中，至少一个含细胞部分基本由有核细胞组成。
用于处理步骤(C)中稳定化的含细胞体液以及生物靶标的适合和优选的实施方式如下所述。
实施方式A
根据实施方式A，在(C)中处理包括
(aa)将稳定化的含细胞体液样品分离成至少一个含细胞部分和至少一个细胞-耗竭部分；
(bb)进一步处理含细胞部分，其中进一步处理含细胞部分包括
(i)从含细胞部分中富集至少一个细胞亚群，例如包含目标稀有细胞的；和/或
(ii)从含细胞部分富集，例如，纯化胞内核酸(例如基因组DNA)；
(cc)进一步处理细胞-耗竭部分，其中进一步处理细胞-耗竭部分包括
(i)从细胞-耗竭部分富集，例如，纯化胞外核酸(例如胞外DNA)；和/或
(ii)从细胞-耗竭部分富集胞外囊泡。
在本实施方式中，稳定化的含细胞体液样品(例如血液)被分离(aa)为至少一个含细胞部分(例如含有核血细胞和CTC)和细胞-耗竭部分(例如血浆)。合适的分离方法是本领域已知的(例如涉及离心和/或过滤)且在本文他处描述。例如，当处理稳定化的血液样品(抗凝)时，根据步骤(aa)使用基于离心的分离方法，稳定化的血液样品可以被分离为细胞-耗竭部分(血浆)、含细胞部分(血沉棕黄层，包含白细胞和，如果存在的话，CTC和任选地，血小板)和红细胞部分。在步骤(bb)中血沉棕黄层可以被进一步处理为含细胞部分，在(cc)中血浆部分可以被进一步处理为细胞-耗竭部分。
然后，所获得的感兴趣的含细胞部分在(bb)中被进一步处理。至少一个细胞亚群例如目标稀有细胞(例如CTC)可以从所获得的含细胞部分中富集出来(见(i))。此外，胞内核酸(例如基因组DNA)可以被富集，从而从含细胞部分中纯化出来(见(ii))。在实施方式中，至少一个细胞亚群(例如包含稀有细胞(例如 CTC))和胞内核酸(例如基因组DNA)作为感兴趣的生物靶标都被从含细胞部分中富集出来。例如，在(i)中，技术人员可以先从含细胞部分分离感兴趣的细胞亚群，例如包含稀有细胞(例如CTC)，然后在(ii)中，随后从其中目标细胞亚群 (例如稀有细胞)已被去除/耗竭的剩余的含细胞部分中纯化胞内核酸(例如基因组DNA)。有利地，该实施方式允许使用含细胞部分的全部体积用于分离目标细胞亚群，在一个实施方式中其包含稀有细胞(例如CTC)。这是有利的，考虑到特定细胞(例如CTC)通常非常稀有，以至于希望处理大量的含细胞部分以确保稀有细胞(例如CTC)(如果包含)能够被富集到足够数量用于后续检测。在其他实施方式中，含细胞部分被分成至少两个等分，其中至少一个等分用于富集感兴趣的细胞亚群(例如包含稀有细胞)，至少一个等分用于富集胞内核酸，例如基因组DNA。
在(cc)中所获得的细胞-耗竭的部分被进一步处理以从细胞-耗竭部分(例如血浆)中分离胞外核酸和/或富集胞外囊泡。如本文所公开的，在有利的实施方式中，从细胞-耗竭部分(例如血浆)纯化胞外DNA。此外，如实施例所证明的，可以从细胞-耗竭部分富集胞外囊泡。下文还描述了用于富集胞外囊泡的示例性合适和优选的方法。在实施方式中，胞外囊泡和胞外核酸，优选胞外DNA，都是从细胞-耗竭部分富集出来。例如，技术人员可以先从细胞-耗竭部分分离胞外囊泡，然后从其中胞外囊泡已被提前去除的剩余的细胞-耗竭部分中富集胞外DNA。在其他实施方式中，细胞-耗竭部分被分成至少两个等分，其中至少一个等分用于富集胞外囊泡，至少一个等分用于从中纯化胞外核酸，例如胞外DNA。
实施方式B
根据实施方式B，在(C)中处理包括
(aa)从稳定化的含细胞体液样品中富集至少一个细胞亚群，例如包含目标稀有细胞的；
(bb)将稳定化的含细胞体液样品分离为含细胞部分和细胞-耗竭部分，从中富集且因此去除细胞亚群(例如包含目标稀有细胞)；
(cc)进一步处理细胞-耗竭部分，其中进一步处理细胞-耗竭部分包括
(i)从细胞-耗竭部分富集胞外核酸，任选地，胞外DNA；和/或
(ii)从细胞-耗竭部分富集胞外囊泡；和
(dd)任选地，从含细胞部分富集胞内核酸，优选基因组DNA。
在步骤(aa)中，从稳定化的含细胞体液样品中富集至少一个细胞亚群，例如包含目标稀有细胞(例如CTC)的。为了从生物样品中先分离感兴趣的目标细胞亚群(例如包含稀有细胞的)，然后将稳定化的样品分离成含细胞的和细胞- 耗竭的部分，减少细胞亚群的整体处理时间。如果细胞亚群包含或基本上由稀有细胞组成，这是特别有利的，其防止对这些稀有的、因而珍贵的细胞造成损害。在一个实施方式中，稀有细胞(例如CTC)被从整体稳定化的含细胞体液样品中富集出来。有利地，这允许使用全部收集的样品体积来分离稀有细胞(例如CTC)。这是有利的，考虑到特定细胞(例如CTC)通常非常稀有，以至于希望处理更大的样品体积以确保能够富集并检测所包含的稀有细胞(例如CTC)。
在步骤(bb)中，从中去除了目标稀有细胞(或其他感兴趣的细胞亚群)的稳定化的含细胞体液样品被分离成含细胞部分和细胞-耗竭部分。因此，如果步骤(aa)中全部收集体积的稳定化的含细胞体液样品被用于富集稀有细胞，已去除稀有细胞的稳定化的含细胞体液样品的全部(或如果需要，其部分)被处理以提供含细胞部分和细胞-耗竭部分。
在步骤(cc)中，细胞-耗竭部分被进一步处理。上文结合实施方式A描述了细节，参考相应的公开内容，其也适用于此。
此外，在步骤(dd)中，从含细胞部分中可以富集胞内核酸，例如基因组 DNA。
实施方式C
根据实施方式C，在(C)中处理包括
(aa)将稳定化的含细胞体液样品分为至少两个等分并从所提供的等分中的至少一个富集至少一个感兴趣的细胞群，例如，包含稀有细胞的；
(bb)提供至少一个含细胞部分和至少一个细胞-耗竭部分；
(cc)进一步处理细胞-耗竭部分，其中进一步处理细胞-耗竭部分包括
(i)从细胞-耗竭部分富集胞外核酸，任选地，胞外DNA；和/或
(ii)从细胞-耗竭部分富集胞外囊泡；和
(dd)任选地，从含细胞部分富集胞内核酸，优选基因组DNA。
在步骤(aa)中，稳定化的含细胞体液样品被分成至少两个等分。至少一个等分被用于富集至少一个感兴趣的细胞群，其可以，例如，包含或基本由目标稀有细胞(例如CTC)组成。因此，提供了至少一个等分的稳定化的含细胞体液样品，稀有细胞被从中去除。如果富集另一个感兴趣的细胞亚群，也同样适用。至少一个其他等分对应于未从中去除稀有细胞(或其他感兴趣的细胞亚群)的原始稳定化含细胞体液。
在步骤(bb)中提供至少一个含细胞部分和至少一个细胞-耗竭部分。步骤 (bb)可以包括将从中富集了目标细胞群(例如包含或基本由稀有细胞(例如CTC) 组成的)稳定化的含细胞体液样品和/或在步骤(aa)中未被用于富集目标细胞群的任何剩余的稳定化的含细胞体液样品(等分)分离为含细胞部分和细胞-耗竭部分。如果在稳定化的含细胞体液样品被分成至少两个等分，仅处理目标细胞未被从中除去的一个等分以提供含细胞部分和细胞-耗竭部分是可能的。替代性地，其中目标细胞被除去的至少一个等分可以与原始稳定化体液样品的其他等分(其中目标细胞未被除去)重新结合。这种合并有利地增加了所获得的细胞- 耗竭部分和含细胞部分的体积，其有益于进一步处理并分析这些部分。
步骤(cc)和可选步骤(dd)对应于实施方式B，参见上文。
下文还描述了将样品分离成至少一个含细胞部分和至少一个细胞-耗竭部分的示例性合适和优选的方法。这种方法可用于步骤(C)，特别是实施方式A 至C。
下文还描述了可用于步骤(C)，特别是实施方式A至C中的用于富集稀有细胞例如CTC和其他目标细胞亚群的示例性合适和优选的方法。如本文所公开的，回收的靶细胞，例如稀有细胞，可以在步骤(D)中被进一步处理，例如，为了分离胞内核酸(例如RNA)，然后进行后续检测。
下文还描述了可用于步骤(C)，特别是实施方式A至C中的用于富集胞外囊泡例如外泌体的示例性合适和优选的方法。如本文所公开的，回收的胞外囊泡可以在步骤(D)中被进一步处理，例如，为了分离核酸(例如RNA)，然后进行后续检测。
用于将含细胞体液样品分离为含细胞部分和细胞-耗竭部分的方法
用于将含细胞体液分离为，即，至少一个含细胞部分和，即，至少一个细胞-耗竭部分的方法是本领域熟知的，因此不需要详述。常用方法包括但不限于离心、过滤和密度梯度离心。也可以组合不同的方法。此类常用方法可以有利地与根据本发明的稳定化技术结合使用，其有利地允许避免使用交联剂进行稳定化，从而可以使用常用的、已建立的方法。执行该方法从而保持所包含细胞的完整性。这是有利的，因为分离过程中细胞破裂会污染，例如包含于细胞 -耗竭部分的胞外核酸，和从被破碎的细胞中释放出来的细胞核酸。
根据一个实施方式，至少进行一个离心步骤，以分离含细胞部分和细胞- 耗竭部分。在实施方式中，离心可以在800至3000x g的范围内进行，例如1000 至2500x g或1500至2000x g。离心持续时间可以在5-20分钟之间，例如10-15 分钟。技术人员可以选择合适的条件。细胞-耗竭部分可以作为上清回收。细胞-耗竭部分可以被从所获得的一个或多个细胞部分中去除，并经过第二次离心步骤，任选地，以更高的速度进行，以确保任何剩余的细胞和颗粒物质(例如细胞碎片)被从细胞-耗竭部分去除。这对随后从细胞-耗竭部分纯化的胞外核酸(例如胞外DNA)可能是有利的。执行过滤步骤以提供细胞-耗竭部分也在本公开的范围内。这样的方法在本领域是熟知的，例如用于从血样中获得血浆以随后纯化胞外核酸，例如胞外DNA(参见例如Chiu等，2001 Clinical Chemistry 47：9 1607-1613；Sorber等，Cancers 2019，11，458)。如果希望从细胞-耗竭的部分中作为感兴趣的一种或多种生物靶标回收外泌体和/或血小板，选择一种或多种分离方案，使得外泌体和/或血小板留在细胞-耗竭部分中，并因此可以从中回收。细胞部分，例如在第一次离心步骤之后所获得的，可以用作含细胞部分，如本文所述进一步处理(例如为了分离胞内核酸，例如基因组DNA和/或从中富集目标细胞(例如CTC))。
合适的基于离心和/或过滤的分离方法可以包括但不限于：
-在1900x g离心(15分钟)以从一个或多个细胞部分中分离细胞-耗竭部分，细胞耗竭部分在1900x g离心(10分钟)。
-离心1600x g(10分钟)以从一个或多个细胞部分中分离细胞-耗竭部分，细胞耗竭部分在16000x g离心(10分钟)。
-离心1600x g(10分钟)以从一个或多个细胞部分中分离细胞-耗竭部分，随后过滤细胞-耗竭部分，例如使用0.2μm-0.8μm过滤器。
-离心1600x g(10分钟)和16000g(10分钟)，随后过滤，例如，使用0.2μm -0.8μm过滤器。
-离心1000rpm(10分钟)和3000rpm(10分钟)。
其他组合和变化也是可能的。
所提供的细胞耗竭部分在实施方式中是基本无细胞的，以避免，例如，所包含的生物靶标(例如胞外核酸或胞外囊泡)被细胞成分污染。这种无细胞部分可以使用上述基于离心和/或过滤的方法获得。所获得的细胞-耗竭/无细胞部分可以被转移到新的容器中。它可以直接处理，例如，为了从中纯化胞外核酸和 /或胞外囊泡，或可以被储存(例如冷却或冷冻)直到使用。被进一步处理的所获得的含细胞部分可能包含可以从中分离的有核细胞和目标细胞(例如稀有细胞) 和/或胞内核酸(例如基因组DNA)。
根据一个核心实施方式，含细胞体液是血液。血液样品有核心意义，因为血液样品被广泛用于诊断目的。如果含细胞体液是血液，优选稳定化组合物包含抗凝剂，例如螯合剂，例如EDTA。稳定化后的血液样品可以被处理，以提供细胞-耗竭的血浆部分和含细胞的细胞部分，例如血沉棕黄层，然后其被进一步处理。产生血浆的方法是本领域熟知的，包括但不限于离心和过滤及这些方法的组合。
细胞亚群和此类亚群的富集，特别是稀有细胞例如循环肿瘤细胞
根据一个实施方式，步骤(C)包括从稳定化的含细胞体液样品富集细胞亚群。目标细胞亚群可以直接从稳定化的含细胞体液中富集，或其可以从稳定化的含细胞体液的含细胞的因而细胞部分富集(其可以通过将稳定化的含细胞体液样品分离为含细胞部分和细胞-耗竭部分获得)。富集的细胞亚群可以如本文所述被进一步处理和分析(例如通过分析所获得的细胞和/或从中分离胞内核酸)。
所需的细胞亚群可用本领域已知的方法富集。下文描述了合适的方法，也可以与稀有细胞的富集及其类似方法结合用于其他细胞群体，例如，使用基于亲和捕获的方法，特定细胞可以基于它们的细胞表面特性富集。此外，细胞可以基于其密度被分离而富集。例如，密度梯度离心能在特定层中富集PBMC和其他细胞类型。也可以通过分选技术(例如FACS分选)分别富集特定的细胞，细胞群。
根据一个实施方式，步骤(C)包括富集稀有细胞。因此，根据一个实施方式，富集的细胞亚群包含目标稀有细胞。富集的细胞亚群也可能基本由目标稀有细胞组成。这取决于所用的富集方法。
稀有细胞是在较大的背景细胞群体中低丰度的细胞。稀有细胞的浓度通常为或低于1/105个细胞。因此，稀有细胞的检测、定量和富集是挑战性的。稀有细胞对于多种应用是非常重要的，例如许多癌症的诊断和预防、产前诊断和病毒感染的诊断。典型的稀有细胞是循环肿瘤细胞(CTC)、循环胎儿细胞(例如在母体血液中循环)、干细胞和被病毒或寄生虫感染的细胞。这种稀有细胞，例如，在血液样品中和其他体液中发现，且可以从中富集出来。可被富集的其他稀有细胞类型是循环内皮细胞(CEC)和循环内皮祖细胞(EPC)。循环成熟内皮细胞(CEC)是用于癌症、糖尿病、心血管或急性肾病中的内皮障碍的潜在的生物标志物，已观察到频率为在106-108个白细胞中10-100个CEC与此相比，估计CTC的频率更低，在106-108个白细胞中有1到10个CTC。
本领域已知并描述了不同的方法，用于富集稀有细胞例如CTC，已知的方法可与本发明结合使用(参见例如Neumann等，Comput Struct Biotechnol J， 2018，卷16：190-195；Haber等，Cancer Discov.2014年6月；4(6)：650-661和 Chen，Lab Chip：2014年2月21日；14(4)：625-645)。稀有细胞的富集、分离或定量可以通过多种方法完成，例如基于物理特性，例如细胞大小、密度、可变形性、形状、电极化性(electrical polarizeability)和磁化率(magnetic susceptibility) 和/或细胞的生物特性，例如表面特性(例如细胞表面的标志物基因表达)。基于梯度的离心(例如使用Ficoll梯度)是一种常用的方法，以富集具有一定密度的特定细胞类型。过滤能够基于细胞大小富集稀有细胞。另一个CTC富集原则是使用微流体。与过滤方法相比，微流体系统允许收获富集CTC的细胞悬浮液，用于下游分析，例如免疫荧光标记，用于单细胞分离。CTC和其他稀有细胞也可以基于其电荷差异被分离。总之，CTC富集策略大致落入不同的类别，取决于它们是否依赖于肿瘤细胞的物理特性、其独特细胞表面标志物的表达、或耗竭丰富细胞(例如正常白细胞)以富集未加标签的CTC。为了富集CTC，也可以使用免疫磁性方法，例如基于抗体介导的癌细胞捕获。
根据一个实施方式，目标稀有细胞是包含于含细胞体液样品中的肿瘤细胞。优选地，循环肿瘤细胞(CTC)作为目标稀有细胞被从稳定化的体液样品(例如稳定化的血液样品)中捕获。如背景中所公开的，循环肿瘤细胞是本领域熟知的。通常，CTC是已经从原发肿瘤脱落到脉管系统或淋巴中的细胞，并在循环中被带到全身。CTC可以是主动地(actively)或非主动地(inactively)脱落。它们可以作为单细胞或作为聚集物在血液和淋巴系统中循环，即所谓的循环肿瘤微栓子。因此CTC起源于原发肿瘤且能够构成活的种子，随后在重要的远端器官生长出其他的肿瘤(转移)。它们被认为与癌症转移密切相关，癌症转移是癌症死亡的主要原因。CTC也可以起源于转移。CTC已经在许多不同的癌症中被鉴定，人们普遍认为，在外周血中发现的CTC起源于实体瘤，并参与了实体瘤向远端部位的血源性转移扩散。本文所用的术语CTC特别地包括来源于所有类型的肿瘤的循环细胞，特别是实体瘤，特别是转移性实体瘤。本文所用的术语CTC特别地包括但不限于：(i)CTC，是证实的癌细胞，具有完整的、有活力的细胞核，表达细胞角蛋白或上皮标志物分子，如EpCam，并且不存在 CD45；(ii)细胞角蛋白阴性(CK-)CTC，是癌症干细胞或正在进行上皮-间质转化(EMT)的细胞，可能缺乏细胞角蛋白或上皮标记物(如EpCam和CD45)的表达；(iii)凋亡的CTC，即正在经历凋亡(细胞死亡)的传统CTC；(iv)小型CTC，通常是细胞角蛋白阳性和CD45阴性，但其大小和形状类似于白细胞，(v)休眠的CTC，以及两个或更多个体CTC的CTC簇，例如，任何上述类型的CTC 或上述类型的CTC的混合物结合在一起。CTC簇可能包含例如传统的、小型的和/或CK-的CTC。
CTC通常是体液中非常稀有的细胞。为了提供CTC的信息，需要富集肿瘤细胞或去除血液中的其他有核细胞。任何适合从稳定化的含细胞的体液样品或从其获得的含细胞部分中富集CTC的方法都可以与本方法结合使用。因为 CTC通常是稀有的，常用的CTC富集程序大多将其他细胞类型与所需的CTC 共同分离，使得富集的CTC在一定程度上是包含于正常细胞的背景中的。然而，此类方法富集了CTC，因此是富集用于分析的CTC的有用方法。从各种生物样品中富集CTC的方法是本领域熟知的，也已总结于上文。下文简要描述了示例性的合适方法。
可以使用各种基于物理和/或亲和捕获的方法富集CTC。CTC可以通过以下方法富集：包括CTC细胞的正向选择，例如通过直接靶向CTC的方法，或包括负向选择，例如通过耗竭非-CTC细胞(如果是血液，例如白细胞)的方法。同样可行的方法是通过大小(使用例如基于过滤的方法)、可变形性或密度或其他物理方法富集CTC。此外，可以使用上述方法的组合。
根据优选的实施方式，CTC是通过亲和捕获富集的。这种基于亲和力的捕获方法特异性地将CTC结合到表面(例如珠、膜或其他表面)。通过使用一种或多种结合至存在于CTC的结构(例如表位或抗原)的结合剂(例如抗体)实现对 CTC的特异性。在实施方式中，所述一种或多种结合剂结合存在于CTC上的肿瘤相关标志物。例如，可以通过使用能够捕获CTC细胞的抗体涂覆的固相(例如磁珠)富集CTC。对于CTC捕获，可以使用以高特异性和亲和力与所需CTC 细胞上的表位或抗原结合的两个或更多抗体的组合。根据肿瘤类型，还可以选择结合剂以靶向CTC上的表位或抗原。例如，CTC上可以存在不同的结构，例如表位或抗原，其能够被结合剂(例如抗体)靶向，这取决于原发肿瘤类型，也考虑潜在的EMT或肿瘤干细胞表型变化。使用基于相应的结合剂(例如抗体) 的捕获平台是有利的，因为它也可以富集在例如上皮-间质转化(EMT)的过程中经历表型变化或显示肿瘤干性的CTC。根据一个优选的实施方式，结合剂靶向的表位是上皮-和/或肿瘤相关-抗原，例如EpCAM、EGFR和HER2。用于富集循环肿瘤细胞的市售可得的系统为AdnaTest(恰根公司(QIAGEN))。
另一种基于正向选择并因此代表获得CTC的合适CTC富集方法的方法是基于对上皮细胞的计数，这些上皮细胞通过靶向上皮细胞表面标志物EpCAM 的抗体-磁性纳米颗粒偶联物与血液分离，以及随后的用针对细胞角蛋白(CK8、 18、19)的荧光标记抗体和荧光核染色来鉴定CTC。市售可得的系统CellSearch (美纳里尼/沃瑞迪有限公司(Menarini/Veridex LLC))中使用了相应的方法。其他已知的用于CTC富集因而CTC分离的方法包括但不限于Epic科学方法、ISET 测试、使用微流体细胞分选仪(μFCS，它采用改进的堰式物理屏障来分离并捕获CTC，例如从未处理的全血中(基于它们的大小差异)、ScreenCell(一种基于过滤的装置，其允许从例如人全血中灵敏且特异地分离CTC)、Clearbridge、Parsortix和IsoFlux。
根据一个实施方式，稳定化的样品是血液样品并且步骤(C)包括从稳定化的样品中富集PBMC，任选地使用基于密度梯度离心的富集方法。下文描述了合适的方法。如背景所公开的，外周单核血细胞(PMBC)的基因组和/或表观基因组概况分析代表了用于癌症患者早期诊断和监测免疫监视的感兴趣的生物标志物。此外，它还可用于分析所包含的CTC，例如通过分离胞内核酸(例如 RNA)并检测CTC特异性目标核酸分子。此外，所富集的PBMC部分可用于进一步富集并因此从中纯化特定细胞类型，例如CTC。
根据一个实施方式，含细胞体液样品是血液且步骤(C)包括从稳定化的样品中作为细胞亚群富集目标淋巴细胞。根据一个实施方式，淋巴细胞选自T4 和/或T8淋巴细胞。根据一个实施方式，从免疫缺陷患者中获得稳定化的血液样品。在这种样品中分析T4和T8淋巴细胞有特殊的诊断价值。
根据一个实施方式，含细胞体液样品是血液且步骤(C)包括从稳定化的样品中作为细胞亚群富集血小板，任选地，其中执行步骤(D)，包括从富集的血小板中分离RNA。从血液样品中富集血小板的方法是本领域已知的并且可以与本发明结合使用。在实施方式中，富含血小板的血浆(PRP)通过离心从稳定化的(抗凝的)血液样品中获得。用于获得富含血小板的血浆的合适方法在本领域中有所描述(也参见Sorber等，2019)，并且可以用于和/或适用于本公开。富含血小板的血浆耗竭了其他白细胞和红细胞。然后可以使用本领域已知的方法分别从所获得的富含血小板的血浆，其部分中分离血小板。在实施方式中，未用于分离血小板的剩余的血浆部分可以进一步处理，用于从中分离胞外核酸 (例如ccfDNA)和/或外泌体。在实施方式中，在从所获得的上清中分离胞外核酸和/或外泌体之前，剩余的血浆部分被再次离心和/或过滤以去除剩余的细胞或细胞碎片。
根据一个实施方式，含细胞体液样品是血液且步骤(C)包括从稳定化的样品中作为目标细胞亚群富集母细胞(blast cell)。母细胞通过亲和捕获富集，任选地，使用磁性颗粒。母细胞可以是，例如，通过靶向细胞表面标志物(任选地， CD34和/或CD117)富集。母细胞的分析很有用，例如，在稳定化血液样品获取自急性髓性白血病患者时。
如上所述，可以从稳定化的含细胞体液样品中富集的其他稀有细胞类型是循环内皮细胞(CEC)和循环内皮祖细胞(EPC)。可以基于特定标志物(包括但不限于CD31、CD34、CD105、CD133和CD146)鉴定和富集此类靶细胞。
密度梯度离心步骤
根据一个实施方式，处理步骤(C)包括使稳定化的血液样品或其细胞部分经历密度梯度离心步骤。进行密度梯度离心步骤允许将稳定化的含细胞体液样品分离成细胞-耗竭的血浆部分(或细胞-耗竭的液体，如果处理从稳定化的含细胞体液样品作为输入材料获取的细胞部分)和不同的含细胞部分。在实施方式中，为了获得含细胞部分和细胞-耗竭部分，首先在步骤(C)中处理稳定化的含细胞体液样品。如上所述的方法(例如离心和/或过滤)可以用于此目的。例如稳定化的血液样品可以被分离成血浆部分和细胞部分。然后所获得的血浆部分可以用于富集(i)胞外核酸和/或(ii)胞外囊泡，如本文他处所述。然后所获得细胞部分可以进行密度梯度离心。为此目的，可以用稀释溶液稀释细胞部分。然后经稀释的细胞部分进行密度梯度离心。然后密度梯度离心程序可以按照对于含细胞体液(例如血液)的已知和描述来执行。
密度梯度离心的实施方式在下文中以稳定化的血液样品为例进行描述。然而，也可以相应地处理其他类型的稳定化的含细胞体液样品。
稳定化的血液样品(或其细胞部分)与密度梯度介质接触。合适的密度梯度介质是市售可得的，包括但不限于
和Lymphopure。密度梯度离心技术(例如
Paque、
)可用于根据不同的细胞密度将外周血单核细胞与全血的其他成分(包括红细胞和多形核细胞(例如粒细胞)) 分离。在进行密度梯度离心步骤之前，优选在使稳定化的血液样品(或其细胞部分)与密度梯度介质接触之前，用稀释溶液稀释稳定化的血液样品(或其细胞部分)。稀释比率可以至少为1∶1。稀释的稳定化血液样品(或其稀释的细胞部分) 可以被分层放置在密度梯度介质的顶部(优选)或下方，离心，以从血浆中分离不同的细胞群，通常会导致红细胞和粒细胞沉淀到管的底部，单核细胞(包括稀有细胞，例如CTC)，由于它们的密度较低，在中间相层中保持在梯度介质层上方，在那里它们可以被收集和分析。然而，如本文所述和本领域已知，可以人为地改变细胞群的密度以实现它们沉降在不同的含细胞层中。例如，将 RosetteSepTM CTC富集混合物(干细胞技术公司(StemCell Technologies))与
分离结合使用，允许通过利用四聚体抗体复合物进行CTC富集，其将表达CD45的白细胞与红细胞交联，因此人为地改变被标记的白细胞的密度并导致它们沉淀到底部，以富集中间相层用于CTC。
如实施例中所示，根据本发明使用的以稳定化血液样品的稳定化组合物可以在其中稳定化剂(a)到(c)被组合使用的实施方式中导致在密度梯度离心之后提供改变的层图案(1ayer pattern)。为了避免处理错误，预处理稳定化的血液样品(或其细胞部分)以确保稳定化的血液样品(或其细胞部分)在密度梯度离心时提供类似于普通的EDTA稳定化的血液样品(或其细胞部分)的层图案的层图案是有利的。发现如果用不同于常用的PBS的稀释溶液稀释稳定化的血液样品 (或其细胞部分)，则可以实现。使用的稀释溶液可以是本文所述的低渗溶液或等渗溶液。可以以至少1∶1的比率进行稀释。
在一个实施方式中，所述稀释溶液包含张性调节剂(tonicity modifier)。张性调节剂是本领域已知的，包括例如盐类(如氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠、碳酸钙、乳酸钠)和多元醇的化合物，例如糖类(葡萄糖、葡聚糖、右旋糖、乳糖、海藻糖)和糖醇(如甘油、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇)。稀释溶液可以包含多元醇。本文所用术语″多元醇″是指具有多个羟基基团的物质，包括糖(还原糖和非还原糖)和糖醇。多元醇还可以包含至少三个、至少四个或至少五个羟基基团。在某些实施方式中，多元醇分子量≤600Da(例如，从120至400Da的范围内)。″还原糖″是一种含有游离醛或酮基团，且能够还原金属离子或与蛋白质中的赖氨酸和其他氨基基团共价反应的糖。″非还原糖″是指缺乏游离的醛或酮基团的糖，其不会被温和的氧化剂(例如费林氏溶液(Fehling′s solution)或贝内迪克特溶液(Benedict′s solution))氧化。还原糖和非还原糖的例子是技术人员已知的。在实施方式中，所包含的化合物(张性调节剂/多元醇)能够渗透细胞膜。
在实施方式中，所包含可以充当张性调节剂的多元醇是糖或糖醇。也可以使用糖和/或糖醇的组合。糖可以是还原糖或非还原糖。在实施方式中，糖是还原糖。在实施方式中，稀释溶液包含葡萄糖。在一个实施方式中，稀释溶液包含还原糖，任选地，葡萄糖，浓度在2-10％、3-7％或4-6％(w/v)范围内。在其他实施方式中，稀释溶液包含糖醇，任选地，甘油。在实施方式中，稀释溶液包含盐。盐可以作为张性调节剂。盐可以是碱金属盐，任选地，氯化物盐，例如氯化钠。在实施方式中，稀释溶液包含糖醇(例如甘油)和盐，任选地，碱金属盐(例如氯化钠)。在一个实施方式中，稀释溶液包含至多0.5M甘油和至多 2％氯化钠，任选地，其中该稀释溶液包含0.7-1.2％氯化钠和0.075-0.15M甘油。在实施方式中，稀释溶液选自(i)5％(w/v)葡萄糖，(ii)0.9％NaCl+0.1M甘油，和(iii)包含至少一种张性调节剂且具有对应于在(i)或(ii)中所定义的稀释溶液的渗透压的渗透压，或其中所述渗透压在(i)或(ii)中所定义的溶液渗透压的 +/-20％、+/-15％或+/-10％的范围内的稀释溶液。
根据一个实施方式，稀释溶液包含DMSO。稀释溶液可以包含浓度为 1％-10％(v/v)，例如1％-5％(v/v)的DMSO。
在实施方式中，稳定化的血液样品在稀释溶液中孵育不超过10分钟，不超过5分钟或不超过3分钟，然后将稀释的稳定化血液样品(或其细胞部分)与密度梯度介质接触。优选地，稀释的稳定化血液样品(或其细胞部分)在稀释后直接处理，并与密度梯度介质接触。
如实施例中所示，这种稀释溶液的使用有利地恢复了稳定化血液细胞的密度，因而确保了在密度梯度离心之后可以形成如在EDTA-稳定化的血液样品中所形成的基本相同的层类型。密度梯度离心后，形成不同的层，其中形成不同的PBMC层。所形成的层可以包括(从上到下)：顶层(例如，如果是稳定化的血液样品，包含血浆，或如果在处理稳定化的血液样品的细胞部分时，主要包含稀释溶液)，PBMC层(还包括CTC，如果存在于稳定化的样品中)、密度梯度介质层以及粒细胞和红细胞。可以在粒细胞/红细胞层以下形成另一层。重要的是 PBMC层的独特形成，因为该层可以作为细胞亚群的进一步处理，例如用于 CTC分析。在一个实施方式中，因此，该方法包括收集形成的PBMC层，从而提供PBMC部分。可以洗涤收集的PBMC部分。洗涤可以使用缓冲液进行，任选地，PBS缓冲液或其他合适的缓冲液。可以进一步处理和/或分析收集的 PBMC层。如背景所公开的，外周单核血细胞(PMBC)的基因组和/或表观基因组概况分析代表了用于癌症患者早期诊断和监测免疫监视的感兴趣的生物标志物。此外，可以用于从中富集特定细胞类型，例如CTC。如果稳定化的血液样品经过密度梯度离心，可能在PBMC层顶部形成的血浆部分也可以被进一步处理，或可以被弃去。用于处理血浆的实施方式在本文他处描述。
在一个实施方式中，所述方法包括使用收集的PBMC部分用于富集或检测循环肿瘤细胞。
如此富集的生物靶标可以在步骤(D)中进一步处理并分析。例如，可以从收集的PBMC部分中纯化基因组DNA，从中，循环肿瘤细胞任选地被预先耗竭。此外，可以对至少部分PBMC细胞进行白细胞计数或其他分析。此外，可以从收集的PBMC部分中富集特定细胞类型。
胞外核酸和胞外核酸的富集
根据一个实施方式，步骤(C)包括从稳定化的含细胞体液样品中获得细胞- 耗竭的部分，并从所获得的细胞-耗竭部分富集(特别地，纯化)胞外核酸。
如本文所用，一种或多种“胞外核酸”或“细胞外核酸”，特别是指不包含在细胞中但包含在含细胞体液样品的胞外部分中的核酸。相应的胞外核酸也通常称为无细胞核酸。这些术语在本文中用作近义词。从循环体液(例如血液)中获得的无细胞核酸也称为循环无细胞核酸，例如ccfDNA或ccfRNA。可以从获取自含细胞体液的细胞-耗竭部分(例如血浆或血清，优选血浆)富集胞外核酸。术语“胞外核酸”指的是，例如，胞外RNA和胞外DNA。在体液的无细胞部分中发现的典型胞外核酸的例子包括但不限于哺乳动物胞外核酸，例如，胞外肿瘤相关或肿瘤衍生的DNA和/或RNA、其他胞外疾病相关的DNA和/或RNA、表观遗传修饰的DNA、胎儿DNA和/或RNA、小干扰RNA(例如miRNA和 siRNA)，以及非哺乳动物胞外核酸，例如病毒核酸、释放到胞外核酸群中的病原体核酸(例如来自原核生物(例如细菌)、病毒、真核寄生虫或真菌)。胞外核酸群通常包含一定量的从受损或死亡的细胞中释放出来的胞内核酸。例如，血液中存在的胞外核酸群通常包含从受损的或死亡的细胞中释放的胞内珠蛋白mRNA。这是在体内发生的自然过程。存在于胞外核酸群的此类胞内核酸甚至可以用于后续的核酸检测方法中的对照目的。本文所述的稳定化方法尤其降低了在含细胞体液被收集之后，由于样品的离体处理，包含于胞外核酸群中的胞内核酸(例如基因组DNA)的量显著增加的风险。因此，使用根据本发明的稳定化技术显著减少或甚至防止了由于离体处理而引起的胞外核酸群的改变。
富集的、优选纯化的胞外核酸可以优选地包含或基本由胞外DNA组成。胞外DNA，例如从循环体液中获得的ccfDNA(循环无细胞DNA)，是用于诊断应用的有价值的工具，因此在本领域中广泛用于诊断和预后目的。
在一个实施方式中，分离的胞外核酸包含或基本由胞外RNA组成。本领域熟知且已有描述，从含细胞体液样品中获得的细胞-耗竭部分(如果是稳定化的血液样品，例如血浆)包含胞外RNA。
用于纯化胞外核酸的本领域已知且也可以商购的合适的方法和试剂盒例如：
循环核酸试剂盒(恰根公司(QIAGEN)、QIAsymphony DSP循环DNA试剂盒、Chemagic循环NA试剂盒(Chemagen)、NucleoSpin血浆XS试剂盒(Macherey-Nagel)、血浆/血清循环DNA纯化试剂盒(Norgen Biotek)、血浆/血清循环RNA纯化试剂盒(Norgen Biotek)、高纯度病毒核酸大体积试剂盒(罗氏(Roche))和其他市售可得的试剂盒，适用于提取和纯化胞外核酸。它还参考了WO 2013/045432和WO2016/198571中公开的方法。所述方法特别适合用于从利用本文所述稳定化方法稳定化的血液样品中获取的血浆中纯化胞外核酸，例如胞外DNA。
在一个实施方式中，不从预富集的胞外囊泡中分离胞外核酸，而是从细胞 -耗竭部分，如果是血液，例如血浆或血清(优选血浆)。
在一个实施方式中，进行后续步骤(D)，包括检测在步骤(C)被纯化的胞外核酸中的一种或多种目标分子。
胞外囊泡和胞外囊泡的富集
根据一个实施方式，步骤(C)包括从稳定化的含细胞体液样品中获得的细胞耗竭部分富集胞外囊泡。
如本文所用术语胞外囊泡(EV)特别地指任何类型的细胞起源的分泌囊泡。 EV可大致分为外泌体、微囊泡(MV)和凋亡小体。EV例如外泌体和微囊泡是细胞分泌的小囊泡。已经发现EV可以通过许多不同的体液循环，包括血液和尿液，这使得它们很容易获得。由于EV组成与亲本细胞类似，循环EV是有价值的生物标志物来源。循环EV可以由外泌体和MV的混合物构成。它们包含核酸(例如mRNA、miRNA、其他小RNA)、DNA和蛋白质，防止被脂质双层降解。内容物被相应地特定地包装，并代表局部和远端细胞通讯的机制。它们能够在细胞之间运输RNA。EV(例如外泌体)是循环生物标志物的丰富且多样的来源。来源细胞可以是健康细胞或癌细胞。EV(例如外泌体)通常是由癌细胞主动分泌(actively secret)，特别是分裂中的癌细胞。作为肿瘤微环境的一部分，EV(例如外泌体)似乎在成纤维细胞生长、促纤维增生反应、以及上皮-间质转化(EMT)和SC的启动以及治疗抗性的建立以及转移和治疗抗性的启动中发挥重要作用。外泌体比CTC小，且包含每种生物标志物的少量拷贝。与CTC 相比，EV更容易获得，因为它们以非常大的数量存在于体液(例如约109-1012囊泡每ml血浆)。
如上所述，本方法在一个实施方式中包括胞外囊泡的富集。任何适合从稳定化的含细胞体液样品中分离因而富集胞外囊泡的方法都可以与本方法结合使用。如本文所公开，首先可以处理稳定化的含细胞体液样品以提供细胞-耗竭部分，如果是稳定化的血液样品，例如血浆。本文中公开了用于提供细胞- 耗竭部分的不同的选择。然后，可以从细胞-耗竭部分(例如血浆)富集胞外囊泡。术语“富集”再次以广义使用，涵盖胞外囊泡的富集或纯化。去除细胞成分后，几乎可以从任何生物流体中富集胞外囊泡。用于富集胞外囊泡(例如外泌体)的合适方法是本领域已知的，因此在本文中无需详述。下文简要描述了用于富集胞外囊泡的示例性合适方法。
胞外囊泡，包括外泌体，可以从稳定化体液的细胞-耗竭部分(例如血浆或血清)富集。例如，可以通过超速离心、超滤、梯度和亲和捕获或相应方法的组合来富集胞外囊泡。许多方案和市售产品可用于胞外囊泡/外泌体分离，并且是技术人员已知的。下文描述了示例性的、非限制性的分离方法。
可以富集胞外囊泡，特别是外泌体，例如，通过涉及超速离心的方法。Thery 等(细胞培养上清液和生物液中外泌体的分离和表征(Isolation and Characterization ofExosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids.)3.22单元，亚细胞分级分离和细胞器分离(Subcellular Fractionation and Isolation ofOrganelles)，于《新编细胞生物学方案》(Current Protocols in Cell Biology)，约翰·威利父子公司(John Wiley and Sons Inc.)，2006)描述了示例性的超速离心分离方法。因此，根据一个实施方式，通过超速离心富集胞外囊泡。
为了增加富集的胞外囊泡的纯度，在富集胞外囊泡之前可以去除细胞和细胞碎片(以及任选地，如果需要的话，凋亡小体)，例如，通过离心或过滤。例如，可以使用过滤方法排除≥0.8μm，≥0.7μm或≥0.6μm的颗粒。
根据一个实施方式，可以通过亲和捕获至固相富集胞外囊泡。根据一个实施方式，胞外囊泡(例如外泌体)可以通过免疫磁性捕获富集，使用定向针对暴露于胞外囊泡(例如，在外泌体膜上)的蛋白质的抗体涂覆的磁珠。
根据一个实施方式，通过将细胞-耗竭的样品通过囊泡捕获材料捕获胞外囊泡。可以洗涤已结合的胞外囊泡，随后洗脱。基于亲和捕获的商业系统，例如exoEasy试剂盒(恰根公司(QIAGEN))可用于胞外囊泡纯化且可以与本发明结合使用。
基于使用体积排除聚合物的方法，例如PEG，也被描述用于分离EV。其中，该聚合物通过束缚水分子并将不易溶解的成分(例如胞外囊泡)挤出溶液，允许通过短低速离心来收集胞外囊泡。利用这一原则的商业产品是ExoQuick (系统生物学公司，美国芒廷维尤)和总外泌体分离试剂(生物技术公司(Life Technologies)，美国卡尔斯巴德)。因此，根据一个实施方式，通过使用体积排除聚合物沉淀来富集胞外囊泡。此外，胞外囊泡(例如外泌体)可以基于其密度富集，例如通过将样品分层到不连续的蔗糖或碘克沙醇梯度上，并进行高速离心。因此，根据一个实施方式，胞外囊泡，例如外泌体，通过密度梯度离心富集。
根据一个实施方式，胞外囊泡包括或主要由外泌体和/或微囊泡组成。根据一个实施方式，胞外囊泡包括或主要由外泌体组成。因此，在实施方式中，富集的生物靶标基本由外泌体组成。
如本文所公开的，回收的胞外囊泡可以在步骤(D)中被进一步处理，例如，为了从中分离核酸(例如RNA)。因此，可以从富集的胞外囊泡中纯化RNA，例如尤其是富集的外泌体。因此，可以通过分析存在于胞外囊泡(例如外泌体) 的RNA分子获得相关分子信息。EV已被证明含有多种小RNA种类，包括 miRNA、piRNA、tRNA(及其片段)、穹窿体RNA(vault RNA)、Y RNA、rRNA 的片段以及长非编码RNA和mRNA。
本文描述了用于RNA分离的示例性和优选方法。
胞内核酸和胞内核酸的富集
根据一个实施方式，步骤(C)包括从稳定化的含细胞体液样品中富集(例如纯化)胞内核酸作为生物靶标。可以从稳定化的含细胞生物样品的等分中纯化胞内核酸，或可以将稳定化的含细胞生物样品分离为含细胞和细胞-耗竭部分，且可以从含细胞部分(分别为其等分/部分)纯化胞内核酸。任选地，目标细胞群 (例如包括或基本由稀有细胞组成)可以已经被预先去除，因此可以从稳定化的含细胞体液和/或其浓缩的含细胞部分(例如，稀有目标细胞群已经从中耗竭)富集胞内核酸。
此外，首先，可以从稳定化的含细胞体液中富集细胞的亚群，并从该亚群富集胞内核酸。本文描述了合适的实施方式。
如本文所述，细胞可以被富集并因此浓缩在含细胞部分中。胞内核酸可以选自RNA和基因组DNA。根据一个实施方式，作为生物靶标富集基因组DNA。因此，根据一个实施方式，该方法包括从稳定化的含细胞体液样品中获得细胞部分并从该细胞部分富集基因组DNA，其中，在基因组DNA分离之前，该细胞部分被储存，任选冷冻。
用于纯化胞内核酸(例如RNA和基因组DNA)的合适方法是本领域熟知的，在本文中也进行了简要描述。
根据一个实施方式，步骤(C)包括富集至少循环肿瘤细胞、基因组DNA和循环无细胞DNA作为生物靶标。
步骤(D)
步骤(D)包括处理富集的三种或更多种生物靶标用于分析。特别地，分析可以包括检测一种或多种生物标志物分子。
根据一个实施方式，步骤(C)包括富集细胞亚群，例如包括或基本由稀有细胞(例如CTC)组成的亚群，且其中随后的步骤(D)包括分析富集的细胞亚群。细胞分析对于基础细胞研究、药物发现、诊断和预后可能很重要。该分析可以在分子水平(DNA、RNA、蛋白质、分泌分子等等)或细胞水平(细胞代谢、细胞形态、细胞-细胞相互作用等)上进行。因此，随后步骤(D)可以包括在细胞水平上分析富集的细胞亚群(包括或基本由稀有细胞如CTC组成)和/或从所富集的细胞亚群中富集胞内核酸，例如RNA。如本文所公开的，富集的稀有细胞优选是循环肿瘤细胞。
因此，步骤(D)可以包括裂解所富集的细胞亚群(例如包括或基本由稀有细胞组成)，以释放胞内核酸用于后续纯化。用于纯化基因组DNA以及RNA的适合的方法是本领域熟知的，并且因此无需详细描述。
根据一个实施方式，步骤(D)包括检测在步骤(C)中富集的胞外核酸中的一种或多种目标分子。
根据一个实施方式，步骤(C)包括从稳定化的含细胞体液样品中获得的细胞耗竭部分富集胞外囊泡，且其中后续步骤(D)包括从所述富集的胞外囊泡中富集RNA。如本文所公开的，胞外囊泡可以包括或基本由外泌体组成。
根据一个实施方式，步骤(D)包括从细胞富集RNA，优选从富集的稀有细胞中，和/或从富集的胞外囊泡中。所富集的RNA可以包括或由mRNA和/或非编码RNA组成。在实施方式中，纯化的RNA包括miRNA，或基本由长达350nt、长达300nt或长达250nt的小RNA组成，其包括miRNA。
根据一个实施方式，步骤(C)包括富集至少循环肿瘤细胞和循环无细胞 DNA以及此外基因组DNA和/或胞外囊泡作为生物靶标，步骤(D)包括
-分析富集的循环肿瘤细胞，其中分析包括从富集的稀有细胞中富集 RNA，并检测富集的RNA中的一种或多种目标核酸分子(即，例如，允许检测和/或表征富集的循环肿瘤细胞)；和
-检测循环无细胞DNA中的一种或多种目标核酸分子。
此外，如果基因组DNA被额外富集，可以检测基因组DNA中的一种或多种目标核酸分子。如果胞外囊泡被额外富集，可以从胞外囊泡中富集核酸(例如RNA)，并且可以在富集的核酸中检测一种或多种目标核酸分子。
如果步骤(C)中血小板被富集，可以从该血小板中纯化核酸(例如RNA)，并且可以在步骤(D)中在纯化的核酸中检测一种或多种目标核酸分子。
因此，根据一个优选的实施方式，步骤(D)包括检测分离的核酸中的一种或多种目标核酸分子。步骤(D)可以包括逆转录分离的RNA以提供cDNA。步骤(D)可以进一步包括进行至少一个扩增步骤(例如，聚合酶链式反应、等温扩增、全基因组扩增等)。根据一个实施方式，步骤(D)包括进行定性或定量聚合酶链式反应。根据一个实施方式，步骤(D)包括进行测序反应。根据一个实施方式，步骤(D)包括分析一种或多种完整细胞，任选地所述细胞是循环肿瘤细胞。
根据一个实施方式，在步骤(D)中检测的至少一种目标核酸分子具有以下一个或多个特征：
-它是癌症相关肿瘤标志物；
-它是诊断、预后和/或预测性生物标志物；
-它是预后或预测性生物标志物；
-它与实体癌有关，任选地为转移性癌；
-它与乳腺癌或前列腺癌有关，特别是转移性乳腺癌和转移性前列腺癌；
-它是积极的或消极的反应标志物；和/或
-它是治疗标志物。
根据一个实施方式，该至少一种目标核酸分子形成一组目标核酸分子的部分。因此，步骤(D)可以包括检测一组目标核酸分子。一组可以包括至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或至少50种目标核酸分子。检测一组目标核酸分子(例如使用相应的一组引物和，任选地，探针)是有利的，例如，为了表征富集的CTC。
根据一个实施方式，步骤(D)包括从循环肿瘤细胞中分离RNA并在分离的 RNA中检测生物标志物RNA分子。
在实施方式中，步骤(D)包括富集细胞的免疫荧光染色。富集的细胞可以是目标细胞，例如，目标稀有细胞。在实施方式中，可以通过免疫荧光染色分析CTC。染色可以使用例如针对待染色的感兴趣的目标细胞特异性的标志物的单克隆或多克隆抗体。例如，如果是CTC，可以对细胞进行细胞角蛋白、Epcam、 EGFR、E-钙粘蛋白、HER2、PSA、PSMA和/或其他CTC标志物染色。此外，染色可能涉及排除标志物的染色，以排除髓源。这种标志物可以包括CD45和 /或CD14。
RNA的富集
在实施方式中，本方法包括从细胞(例如稀有细胞，例如CTC)中富集，例如，纯化RNA。本方法还包括从胞外囊泡中分离RNA。术语“富集”再次以广义使用，涵盖，例如RNA的分离和纯化。合适的RNA分离方法是本领域技术人员熟知的，并且因此无需在本文中详细描述。下文简要说明了示例性实施方式。
方法，例如，基于使用酚和/或离液盐，可用于RNA分离。合适的方法的实例包括但不限于提取、固相提取、基于聚硅酸的纯化、基于磁性颗粒的纯化、苯酚-氯仿提取、阴离子-交换色谱法(使用阴离子-交换表面)、电泳、沉淀及其组合。相应的方法是本领域熟知的。如果DNA与RNA被富集在一起，可以去除DNA，例如，通过DNA酶消化。特异性分离RNA的方法也是本领域熟知的，基本上没有DNA污染。如所讨论的，剩余的DNA还可以通过DNA酶消化去除，和/或如果通过扩增检测生物标志物RNA分子的表达，可以使用跨内含子引物。
用于分离RNA的基于苯酚/氯仿的有机提取方法的例子是Chomczynski 方法(Chomczynski和Sacchi，1987：单步法RNA分离，通过酸性硫氰酸胍-苯酚 -氯仿提取.Anal.Biochem.(162)：156-159)及其变体。一个基于苯酚/氯仿的商业产品的例子是miRNeasy小型试剂盒(恰根公司(QIAGEN))。它提供高质量和高产量的总RNA，包括来自各种不同生物样品的小RNA。
根据一个实施方式，RNA分离包括将RNA结合到固相和从固相洗脱 RNA。可以在洗脱前洗涤RNA。实现RNA结合到固相上的合适的固相和相容的化学物质是本领域技术人员已知的，包括但不限于二氧化硅固相和具有阴离子交换部分的固相。
根据一个实施方式，RNA分离包括将RNA结合至固相，例如，特别是二氧化硅固相，其中至少一种离液剂(例如胍盐)和/或至少一种醇(例如异丙醇或乙醇)是用于RNA结合。离液剂和醇的合适的实施方式浓度是本领域技术人员已知的。可以任选地洗涤结合的RNA，并洗脱RNA。
根据一个实施方式，RNA分离包括将RNA结合到有阴离子交换部分的固相和从固相洗脱RNA。特别地，可以使用基于电荷转换(charge-switch)原则的分离方法。合适的具有阴离子交换部分的固相的例子包括但不限于用阴离子交换基团官能化的材料，例如颗粒材料或柱。阴离子交换部分的例子是单胺、二胺、多胺和含氮芳族或脂族杂环基团。在允许RNA与阴离子交换部分结合的结合条件下，RNA被结合至固相。为此，可以使用合适的pH和/或盐条件，如本领域技术人员已知的。结合的RNA任选地，被洗涤。可以使用任何合适的洗脱方法，且合适的实施方式是本领域技术人员已知的。洗脱可以，例如，涉及改变pH值。因此，洗脱可以，例如，在洗脱pH高于结合pH的情况下发生。同样地，可以使用离子强度帮助或影响洗脱。也可以通过加热和/或振摇来帮助洗脱。
可以裂解/消化细胞(例如，富集的CTC)和/或富集的胞外囊泡，以从细胞或胞外囊泡中释放RNA以分离RNA。合适的裂解方法是本领域熟知的。细胞和/或胞外囊泡可以与一种或多种裂解剂接触以破碎，分别地，裂解。这些可以包括破碎剂，例如裂解缓冲液。在裂解期间，应当保护RNA免受核酸酶的降解。通常，裂解程序可以包括但不限于对样品的机械、化学、物理和/或酶促作用。此外，可以添加还原剂例如β-巯基乙醇或DTT用于裂解，以帮助，例如，核酸酶的变性。根据一个实施方式，至少一种离液剂，例如优选至少一种离液盐，用于裂解，并且，因此，破碎。合适的离液剂和特别是合适的离液盐是本领域技术人员已知的。
根据一个实施方式，步骤(D)中富集的RNA部分包括或由mRNA组成。步骤(D)涵盖RNA(其包括mRNA(以及其他RNA类型))的纯化，以及mRNA的选择性纯化。可以获得基本上纯的mRNA，例如，通过使用RNA分离方法，其选择性地从消化的样品中分离mRNA(但不包括其他RNA类型)。纯化的 mRNA也可以循序分离，例如，通过首先富集总RNA，然后选择性地从分离的总RNA中富集mRNA。合适的选择性mRNA分离方法是本领域技术人员众所周知的，并且因此无需详细描述。一种已经建立的方法是基于寡聚(dT)捕获至固相(例如柱或磁珠)，其允许通过其多聚(A)尾特异性地分离mRNA。根据一个实施方式，从获得的细胞裂解物(例如从稀有细胞裂解物(例如CTC裂解物)) 中分离mRNA。根据一个实施方式，从获得的细胞裂解物(例如CTC裂解物) 中直接分离mRNA，如实施例中所示。可以使用包含寡聚d(T)部分(例如寡聚 d(T)25部分)的固相(例如磁珠或柱)从裂解物中捕获mRNA。根据进一步的实施方式，首先分离总RNA，然后从总RNA中分离mRNA，例如通过寡聚d(T) 捕获或其他合适的方法。根据一个实施方式，从所获得的胞外囊泡裂解物/消化物中分离总RNA。根据一个实施方式，然后从总囊泡RNA中分离mRNA，例如通过寡聚d(T)捕获或其他合适的方法。
根据一个实施方式，步骤(D)中分离的RNA包括miRNA，或基本由长达 350nt、长达250nt或长达200nt的小RNA组成，其包括miRNA。因此，步骤 (D)可以涵盖RNA(其包括miRNA(以及其他RNA类型))的纯化，以及小RNA 分子的特异性纯化，其包括miRNA但耗竭了大RNA分子(例如，具有400nt 或更大的长度)。用于将小RNA分子与大RNA分子分开地特异性富集的合适的方法是本领域熟知的，因而无需在本文中描述。
如本文公开的，分离的RNA(例如mRNA)可以被逆转录为cDNA，随后扩增。扩增提供对应于所供测试的一种或多种目标核酸分子的扩增子。技术人员可以决定用于扩增的合适引物。根据一个实施方式，通过使用所获得的cDNA 作为模板进行多重-PCR，并行地确定两种或更多目标核酸分子(例如生物标志物RNA)的表达。技术人员可以决定用于扩增的合适引物。此外，通过进行，例如，逆转录聚合酶链式反应，逆转录步骤可以与扩增步骤结合。根据一个实施方式，在分离的RNA中确定至少一种生物标志物RNA分子的表达包括进行定量聚合酶链式反应。在一个实施方式中，进行半定量PCR。在另一个实施方式中，该方法不是半定量的。进行定量PCR(qPCR)是有利的，因为它允许确定生物标志物RNA分子在CTC和/或EV中是否是，例如，过表达的。用于进行定量PCR的合适方法是本领域技术人员熟知的，因此在本文中无需详述。然后可以记录在定量PCR中获取的对于单独的一种或多种标志物RNA分子分析的Ct值，并用于提供表达概况分析。根据一个实施方式，在逆转录步骤之后和进行定量PCR反应之前，进行预扩增步骤。这种预扩增步骤可以改进灵敏度。考虑到CTC通常是稀有的，这可能是有利的。通过预扩增，对应于所分析的一种或多种目标核酸分子(例如一种或多种生物标志物RNA分子)的cDNA 分子，为随后的扩增步骤(其优选为qPCR)提供了更多DNA材料。这可以改进结果。
含细胞体液样品
有利地，含细胞体液样品可以是液体活检样品。在一个实施方式中，含细胞体液可以是循环体液。含细胞体液可以选自血液、尿液、唾液、滑液、羊水、泪液、淋巴液、母液(liquor)(脑脊液)、汗液、腹水、乳汁、支气管灌洗液、腹腔积液和胸腔积液、骨髓抽吸物和乳头抽吸物、精浆(semen)/精液(seminal fluid)、身体分泌物或身体排泄物。含细胞体液也可以是诊断性白细胞单采 (leukapheresis)的产物。在一个实施方式中，含细胞体液选白血液和尿液。在一个实施方式中，它是血液。在一个实施方式中，血液是外周血。
本方法可以作为体外方法使用从对象获取的生物样品进行，例如，人对象，例如癌症患者。在一个实施方式中，其中至少一种生物靶标是稀有细胞(例如肿瘤细胞，例如CTC)，含细胞体液包含或怀疑包含这种稀有细胞。
如实施例所证明的，稀有细胞(例如循环肿瘤细胞)、胞外核酸(例如 ccfDNA)、胞外囊泡(例如外泌体)和细胞部分或其特定亚群的胞内核酸，可以从相同的稳定化样品(例如血液样品)中用本方法富集并分析。所述工作流程能够并行分析可能富集自同一稳定化含细胞体液的多个不同的生物靶标。
根据本发明使用的稳定化技术
如上所述，步骤(A)包括将含细胞体液与包含以下稳定化剂的一种或多种、两种或更多种、或优选所有三种的稳定化组合物接触：
(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，
(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，和/或
(c)至少一种凋亡抑制剂。
从而提供稳定化的含细胞体液样品。
公开了稳定化剂(a)至(c)的实施方式和浓度，以及稳定化组合物的有利实施方式，例如在WO2015/140218中，通过引用纳入本文。下文也简要描述了合适的实施方式。
至少一种伯、仲或叔酰胺
根据一个实施方式，稳定化组合物包括至少一种伯、仲或叔酰胺。如本文所公开的，该酰胺可以是羧酸酰胺、硫代酰胺或硒代酰胺。优选地，它是羧酸酰胺。
根据一个实施方式，该组合物相应地包含一种或多种根据式1的化合物
其中R1是氢残基或烷基残基，优选C1-C5烷基残基、C1-C4烷基残基或 C1-C3烷基残基，更优选C1-C2烷基残基，R2和R3相同或不同，并且选自氢残基和烃残基，优选烷基残基，碳链长度为1-20个原子，以直链或支链方式排列，R4为氧、硫或硒残基，优选R4为氧。
也可以使用一种或多种根据式1的化合物。在实施方式中，其中R1是烷基残基，R1的链长度优选为1或2。根据式1的化合物的R2和/或R3是相同的或不同的，选自氢残基和烃残基，其中优选为烷基残基。根据一个实施方式， R2和R3都是氢。根据一个实施方式，R2和R3之一是氢，另一个为烃残基。根据一个实施方式，R2和R3是相同的或不同的烃残基。烃残基R2和/或R3 可以彼此独立地选自：烷基，包括短链烷基和长链烷基、烯基、烷氧基、长链烷氧基、环烷基、芳基、卤代烷基、烷基甲硅烷基(alkylsilyl)、烷基甲硅烷氧基(alkylsilyloxy)、亚烷基、烯二基(alkenediyl)、亚芳基、羧酸基和羰基(关于这些残基参见例如WO 2013/045457，第20至21页，通过引用并入本文)。R2 和/或R3的链长度n的值特别地可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19和20。根据一个实施方式，R2和R3碳链长度为1-10，优选1-5，更优选1-2。根据一个实施方式，R2和/或R3是烷基残基，优选C1-C5烷基残基。优选地，根据式1的化合物是羧酸酰胺，因此 R4是氧。它可以是伯、仲或叔羧酸酰胺。
根据一个实施方式，根据式1的该化合物为N，N-二烷基-羧酸酰胺。优选的R1、R2、R3和R4基团如上所述。根据一个实施方式，根据式1的化合物选自下组：N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二乙基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺和N，N- 二乙基甲酰胺。同样合适的是相应的硫代类似物，其包含硫而不是氧作为R4。优选地，使用至少一种根据式1的化合物，其不是根据GHS分类的有毒试剂。根据一个实施方式，根据式1的该化合物为N，N-二烷基丙酰胺，例如N，N-二甲基丙酰胺。
稳定化组合物可以包含一种或多种根据式1’的化合物
其中R1是氢残基或烷基残基，优选C1-C5烷基残基，更优选甲基残基，R2和R3是相同或不同的烃残基，碳链长度为1-20个原子，以直链或支链方式排列，R4为氧、硫或硒残基。式1’包含在上文讨论的式1中，并且与其相比受限于R2和R3是相同或不同的烃残基(不是氢)。另外，残基 R1至R4对应于以上针对式1讨论的那些，且其指的是上述公开也适用于此处。
优选地，组合物包括丁酰胺和/或N，N-二烷基丙酰胺，更优选N，N-二甲基丙酰胺。
根据一个实施方式，稳定化组合物包含一种或多种伯、仲或叔酰胺，其浓度范围选自0.4％至38.3％、0.8％至23.0％、2.3％至11.5％、3.8％至9.2％、 5％至15％和7.5％至12.5％。上述浓度指的是(w/v)或(v/v)，取决于伯、仲或叔酰胺是否为液体。优选使用至少一种伯、仲或叔羧酸酰胺。根据一个实施方式，含细胞体液样品与稳定化组合物接触，其包含一种或多种伯、仲或叔酰胺(和任选地用于稳定化的其他添加剂)，所得混合物/稳定化的含细胞体液样品包含所述酰胺(或酰胺的组合)，浓度范围为0.25％至5％，例如 0.3％至4％、0.4％至3％、0.5％至2％或0.75％至1.5％。
至少一种聚(氧乙烯)聚合物
根据一个实施方式，稳定化组合物包含至少一种聚(氧乙烯)聚合物。如其所参考的WO2015/140218中详细描述的，聚(氧乙烯)聚合物表现出有利的稳定化特性。因此，稳定化组合物包含聚(氧乙烯)聚合物是有利的。
聚(氧乙烯)聚合物优选为聚乙二醇。可以使用未取代的聚乙二醇。本申请中针对聚(氧乙烯)聚合物所述的所有公开，通常特异地适用并特别地意指优选的实施方式聚乙二醇，即使没有明确说明。聚(氧乙烯)聚合物可以以各种分子量使用。聚(氧乙烯)聚合物可以是式HO-(CH2CH2O)n-H，其中n是整数且取决于分子量。
发现聚(氧乙烯)聚合物的稳定化效果与其分子量有关。发现较高分子量的聚(氧乙烯)聚合物比较低分子量的聚(氧乙烯)聚合物是更有效的稳定化剂。为了使用较低分子量的聚(氧乙烯)聚合物实现高效的稳定化，与较高分子量的聚 (氧乙烯)聚合物相比，通常建议使用较高的浓度。然而，对于一些应用，优选的是保持用于稳定化的添加剂的量较低。因此，在实施方式中，较高分子量的聚(氧乙烯)聚合物用作稳定化剂，因为它允许使用较低浓度的聚(氧乙烯)聚合物，同时对含细胞体液样品和其中包含的感兴趣的生物靶标实现强稳定化效果。
根据一个实施方式，稳定化组合物包含聚(氧乙烯)聚合物，其是具有至少 1500的分子量的高分子量聚(氧乙烯)聚合物。所包含的高分子量聚(氧乙烯)聚合物的分子量可以选自：1500至50000、1500至40000、2000至30000、2500 至25000、3000至20000、3500至15000和4000至12500的范围内。附加或替代地，稳定化组合物包含至少一种分子量低于1500的聚(氧乙烯)聚合物，优选分子量为1000或更低的低分子量聚(氧乙烯)聚合物。在一个实施方式中，低分子量聚(氧乙烯)聚合物的分子量的分子量选自：100至1000、200至800、200 至600和200至500。
根据一个实施方式，在步骤(A)中与含细胞体液接触的稳定化组合物包含高分子量的聚(氧乙烯)聚合物，其优选为聚乙二醇，浓度选自：0.4％至35％ (w/v)，例如0.8％至25％(w/v)、1.5％至20％(w/v)、2.5％至17.5％(w/v)、3％至15％(w/v)、4％至10％(w/v)或3％至5％(w/v)。合适的浓度可以由技术人员确定，且尤其取决于高分子量的聚(氧乙烯)聚合物是否是单独使用或与其他聚 (氧乙烯)聚合物(例如低聚(氧乙烯)聚合物)结合使用，以及稳定化组合物用于稳定化一定量的含细胞体液样品时的量(例如体积)。高分子量聚(氧乙烯)聚合物可以以2.2％至33.0％(w/v)的浓度范围单独使用合适的浓度范围可以选自 4.4％至22.0(w/v)％、6.6％至16.5％(w/v)和8.8％至13.2％(w/v)。当高分子量聚 (氧乙烯)聚合物与低分子量聚(氧乙烯)聚合物组合使用时，浓度可以在0.4％至 30.7％(w/v)的范围内。合适的浓度范围可以选自0.8％至15.3％(w/v)、1％至10％ (w/v)、1.5％至7.7％(w/v)、2.5％至6％(w/v)、3.1％至5.4％(w/v)和3％至4％ (w/v)。
根据一个实施方式，含细胞体液样品与稳定化组合物接触，其包含高分子量聚(氧乙烯)聚合物(和任选地用于稳定化的其他添加剂)，所得混合物/稳定化的含细胞体液样品包含浓度范围为0.05％至4％(w/v)，例如0.1％至3％(w/v)、 0.2％至2.5％(w/v)、0.25％至2％(w/v)、0.3％至1.75％(w/v)和0.35％至1.5％(w/v) 的所述高分子量聚(氧乙烯)聚合物。在稳定化的含细胞体液样品中高分子量聚 (氧乙烯)聚合物的浓度范围可以为0.25％至1.5％(w/v)，例如范围为0.3％至 1.25％(w/v)、0.35％至1％(w/v)或0.4％至0.75％(w/v)。
根据一个实施方式，稳定化组合物包含低分子量聚(氧乙烯)聚合物，其优选为聚乙二醇，浓度为0.8％至92.0％，例如3.8％至76.7％、11.5％至53.7％、 19.2％至38.3％、20％至30％或20％至27.5％。根据一个实施方式，浓度为11.5％至30％。上述浓度指的是(w/v)或(v/v)，取决于低分子量聚(氧乙烯)聚合物是否为液体。
根据一个实施方式，含细胞体液样品与稳定化组合物接触，其包含低分子量聚(氧乙烯)聚合物(和任选地其他用于稳定化的添加剂)，所得混合物/稳定化的含细胞体液样品包含浓度范围为0.5％至10％的低分子量聚(氧乙烯)聚合物。在稳定化的含细胞体液样品中低分子量聚(氧乙烯)聚合物的浓度范围可以为 1.5％至9％，例如范围为2％至8％、2至7％、2.5％至7％和3％至6％。
在一个实施方式中，稳定化组合物包含具有至少1500的分子量的高分子量聚(氧乙烯)聚合物的聚(氧乙烯)聚合物且包含具有1000或更小的分子量的低分子量聚(氧乙烯)聚合物。在一个实施方式中，稳定化组合物包含为高分子量聚(氧乙烯)聚合物的聚(氧乙烯)聚合物和为低分子量聚(氧乙烯)聚合物的聚(氧乙烯)聚合物，其中所述高分子量聚(氧乙烯)聚合物的分子量在选自1500至 50000、2000至40000、3000至30000、3000至25000、3000至20000和4000 至15000的范围内，并且其中所述低分子量聚(氧乙烯)聚合物具有分子量在选自100至1000、200至800、200至600和200至500的范围内。合适的浓度如上所述。
至少一种凋亡抑制剂
根据一个实施方式，稳定化组合物包含至少一种凋亡抑制剂。优选地，凋亡抑制剂是胱天蛋白酶抑制剂(caspase inhibitor)。合适的凋亡抑制剂和胱天蛋白酶抑制剂描述于WO 2013/045457 A1和WO 2013/045458 A1。其中所公开的胱天蛋白酶抑制剂通过引用纳入本文。可以用于根据本发明的方法中的包含一种或多种胱天蛋白酶抑制剂的有利的稳定化组合物，也公开于WO 2014/146780 A1、WO 2014/146782 A1、WO 2014/049022 A1、WO2014/146781 A1、WO2015/140218和WO 2017/085321。
优选地，胱天蛋白酶抑制剂是细胞可渗透的(cell-permeable)。胱天蛋白酶基因家族的成员在凋亡中起重要作用。已经利用单独胱天蛋白酶的底物偏好或特异性用于开发成功地竞争胱天蛋白酶结合的肽。通过将胱天蛋白酶-特异性肽与，例如醛、腈或酮化合物偶联，能产生可逆或不可逆的胱天蛋白酶活化的抑制剂。例如，氟甲基酮(FMK)衍生肽例如Z-VAD-FMK作为有效的可逆抑制剂，不会增加细胞毒性作用。在N-末端和O-甲基侧链处用苄氧羰基基团(BOC) 合成的抑制剂表现出增强的细胞渗透性。其他合适的胱天蛋白酶抑制剂是在 C-末端用苯氧基基团合成的。一个例子是Q-VD-OPh，其为细胞可渗透的、不可逆的广谱胱天蛋白酶抑制剂，它比胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK更有效地防止凋亡且因而支持稳定化。
根据一个实施方式，胱天蛋白酶抑制剂是泛胱天蛋白酶抑制剂，因此是广谱胱天蛋白酶抑制剂。根据一个实施方式，胱天蛋白酶抑制剂包含或由肽或蛋白质组成。根据一个实施方式，胱天蛋白酶抑制剂包含修饰的胱天蛋白酶特异性肽。优选地，所述胱天蛋白酶-特异性肽被醛、腈或酮化合物修饰。根据一个实施方式，用O-苯氧基(OPh)或氟甲基酮(FMK)基团修饰胱天蛋白酶特异性肽，优选在羧基末端。合适的包含或由蛋白质或肽组成的胱天蛋白酶抑制剂和包含修饰的胱天蛋白酶特异性肽的胱天蛋白酶抑制剂公开于WO 2013/045457 的表1，通过引用纳入本文。该表提供胱天蛋白酶抑制剂的例子。在一个实施方式中，胱天蛋白酶抑制剂是肽的胱天蛋白酶抑制剂，其为具有O-苯氧基(OPh) 基团修饰的，优选是在羧基末端，和/或具有谷氨酰胺(Q)基团修饰的，优选在N-末端。在一个实施方式中，所包含的胱天蛋白酶抑制剂是Q-VD-OPh。
根据一个实施方式，胱天蛋白酶抑制剂选自下组：Q-VD-OPh、 Z-VAD(OMe)-FMK和Boc-D-(OMe)-FMK。根据一个实施方式，胱天蛋白酶抑制剂选自下组：Q-VD-OPh和Z-VAD(OMe)-FMK。在一个优选的实施方式中，广谱胱天蛋白酶抑制剂Q-VD-OPh被用于稳定化。Q-VD-OPh是细胞可渗透的并抑制通过凋亡的细胞死亡。Q-VD-OPh即使在极高浓度下也对细胞无毒，并且包含与氨基酸缬氨酸和天冬氨酸偶联的羧基末端的苯氧基基团。它在防止通过三种主要凋亡途径介导的凋亡中同样有效：胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-10，和胱天蛋白酶-12(Caserta等，2003)。
步骤(A)中使用的稳定化组合物可以包含一种或多种胱天蛋白酶抑制剂，特别是包含修饰的胱天蛋白酶特异性肽(例如Q-VD-OPh)的胱天蛋白酶抑制剂，其量足以对包含在生物样品中的胞外核酸群产生稳定化作用。根据一个实施方式，稳定化组合物包含某浓度的胱天蛋白酶抑制剂，该浓度以在稳定化组合物与预期体积的待稳定化的含细胞生物体液接触之后获得终浓度为0.1μM 至25μM、0.5μM至20μM、1μM至17μM、2μM至16μM，更优选3μM 至15μM的胱天蛋白酶抑制剂。5μM至15μM范围的终浓度非常合适，例如，用于稳定化血液样品。
根据一个实施方式，稳定化组合物和(因而)稳定化剂包含浓度选自以下的胱天蛋白酶抑制剂：0.35μg/ml至70μg/ml、0.7μg/ml至63μg/ml、1.74μg/ml 至59μg/ml、10.5μg/ml至56μg/ml、或15μg/ml至50μg/ml、20μg/ml至45 μg/ml、25μg/ml至40μg/ml和30μg/ml至38μg/ml。浓度可以选自0.7μg/ml 至45μg/ml和1.74μg/ml至40μg/ml。根据一个实施方式，稳定化组合物和(因而)稳定化剂包含浓度选自以下的胱天蛋白酶抑制剂0.68μM至136μM、1.36μM至122.5μM、3.38μM至114.72μM、20.4μM至109μM或29.2μM至97.2 μM、38.9μM至87.5μM、48.6μM至77.8μM和58.3μM至74μM。浓度可以选自20.4μM至97.2μM和29.2μM至87.5μM。
上述提及的胱天蛋白酶抑制剂浓度，在包含稳定化组合物(剂)和待稳定化的含细胞体液的混合物中和稳定化组合物(剂)中，例如应用于单胱天蛋白酶抑制剂的使用以及胱天蛋白酶抑制剂组合的使用。当使用泛胱天蛋白酶抑制剂，特别是修饰的胱天蛋白酶特异性肽例如Q-VD-OPh和/或Z-VAD(OMe)-FMK 时，上述浓度特别合适。修饰的胱天蛋白酶特异性肽的另一个例子是 Boc-D-(OMe)-FMK。上述浓度是，例如，特别适合于稳定化血液样品的。用于单独胱天蛋白酶抑制剂和/或用于其他含细胞生物样品的合适的浓度范围可以由技术人员确定，例如，通过在实施例中所述的测试试验中测试各自的胱天蛋白酶抑制剂的不同浓度。
稳定化组合物的其他成分
含细胞体液也可以与其他添加剂接触，其优选地包含于稳定化组合物中。
根据一个实施方式，其他添加剂是螯合剂。螯合剂是能够通过有机化合物的两个或更多原子与金属形成配位键的有机化合物。螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(ethylenedinitrilotetraacetic acid)(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸 (DTPA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和N，N-双(羧甲基)甘氨酸(NTA)此外，羧酸盐例如柠檬酸盐或草酸盐。根据一个优选的实施方式，EDTA用作螯合剂。如本文所用，术语″EDTA″尤其表示EDTA化合物的EDTA部分，例如，K2EDTA、 K3EDTA或Na2EDTA。使用螯合剂例如EDTA还具有抑制核酸酶例如DNA酶和RNA酶的有利效果，从而，例如，防止胞外核酸被核酸酶降解。以较高浓度使用/添加的EDTA支持稳定化效果。
如果含细胞体液样品是血液，抗凝剂被用作其他添加剂。抗凝剂包括但不限于肝素、螯合剂和羧酸盐，例如柠檬酸盐或草酸盐。在一个有利的实施方式中，抗凝剂是螯合剂，例如EDTA。例如，可以使用K2EDTA。如果待稳定化的体液是血液，该实施方式特别有用。
根据一个实施方式，其他添加剂是至少一种选自硫醇的化合物，其为N- 乙酰基-半胱氨酸或谷胱甘肽、水溶性维生素和水溶性维生素E衍生物。如WO 2017/085321中所公开的，如果稳定化组合物另外包含胱天蛋白酶抑制剂，这是有利的，并以灭菌形式提供。
根据一个实施方式，所用的稳定化技术具有以下一个或多个特征：
(i)含细胞体液样品的稳定化不涉及一定浓度添加剂的使用，其中所述添加剂会诱导或促进有核细胞的裂解；
(ii)稳定化不诱导蛋白质-核酸或蛋白质-蛋白质交联；
(iii)稳定化不涉及诱导蛋白质-核酸和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂的使用，例如甲醛、福尔马林、多聚甲醛或甲醛释放剂；
(iv)稳定化不涉及毒性试剂的使用；和/或
(v)稳定化剂被包含在含有水的稳定化组合物中。
特别地，优选用于提供稳定化的含细胞体液样品的稳定化组合物不包含诱导蛋白质-DNA和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂。诱导蛋白质-DNA和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂是，例如甲醛、福尔马林、多聚甲醛或甲醛释放剂。交联剂导致核酸分子或核酸和蛋白质之间的分子间或分子内共价键。这种作用会导致在从复杂的生物样品中纯化或提取后这种稳定化的和部分交联的核酸的回收率降低。例如，因为在全血样品中循环核酸的浓度已经相对低，任何进一步减少这种核酸产量的测量应当被避免。当检测和分析来源于恶性肿瘤或来自怀孕前三个月发育中的胎儿的非常稀有的核酸分子时，这可能特别重要。因此，优选在灭菌的稳定化组合物中不包含甲醛释放剂，分别地，不另外用于稳定化。因此，根据一个实施方式，稳定化组合物中不包含交联剂例如甲醛或甲醛释放剂，分别地，不另外用于稳定化。此外，如所述，稳定化组合物优选不包含任何会诱导有核细胞或一般细胞裂解的添加剂，例如，离液盐。正如实施例中所证明的那样，与涉及使用交联剂(如甲醛、甲醛释放剂等)的已知最先进的稳定化剂和方法相比，这是一个重要的优势，因为它允许从稳定化的含细胞体液样品中高效回收感兴趣的生物靶标(例如CTC、胞外核酸、细胞亚群和胞内核酸)。
使用不含能够释放醛的成分的稳定化组合物是有利的。这能够避免对随后从稳定化的样品中分离核酸的损害。
在稳定化组合物中稳定化剂的有利组合
根据一个实施方式，所使用的稳定化组合物包括：
(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，和
(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，优选高分子量聚乙二醇和低分子量聚乙二醇；和
(c)任选地至少一种凋亡抑制剂，优选胱天蛋白酶抑制剂。
根据一个实施方式，所使用的稳定化组合物包括：
(a)至少一种伯、仲或叔酰胺；
(b)任选地至少一种聚(氧乙烯)聚合物；
(c)至少一种凋亡抑制剂，优选胱天蛋白酶抑制剂。
根据一个实施方式，所使用的稳定化组合物包括：
(a)任选地至少一种伯、仲或叔酰胺；
(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物；
(c)至少一种凋亡抑制剂，优选胱天蛋白酶抑制剂。
根据一个实施方式，所使用的稳定化组合物包括：
(a)至少一种伯、仲或叔酰胺；
(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物；
(c)至少一种胱天蛋白酶抑制剂。
上文描述了对于单独的稳定化剂(a)至(c)合适的和优选的实施方式以及合适和优选的浓度。
根据一个实施方式，含细胞体液，其优选为血液，接触：
a)一种或多种根据上述式1的化合物；
b)至少一种具有至少3000的分子量的高分子量聚(氧乙烯)聚合物和任选地至少一种具有1000或更小的分子量的低分子量聚(氧乙烯)聚合物；
c)至少一种胱天蛋白酶抑制剂；和
d)任选地，螯合剂，优选EDTA。
根据一个实施方式，血液接触：
a)一种或多种根据上述式1的化合物；
b)至少一种具有分子量范围为3000-40000，例如范围为3000至30000或 3500至25000的高分子量聚(氧乙烯)聚合物，以及至少一种具有分子量为1000 或更小，例如范围为100至800，200至800或200至500的低分子量聚(氧乙烯)聚合物；
c)至少一种胱天蛋白酶抑制剂，优选泛胱天蛋白酶抑制剂，任选地， Q-VD-OPh；和
d)抗凝剂，其优选为螯合剂，优选EDTA，
其中在血液样品已经与所述添加剂和任选地用于稳定化的其他添加剂接触之后，所得的混合物/稳定化的血液样品包含
-浓度范围为0.3％至4％，例如0.5至3％、0.5至2％或0.75至1.5％的根据式1的一种或多种化合物，
-高分子量聚(氧乙烯)聚合物，浓度范围为0.2％至1.5％(w/v)，例如0.25％至1.25％(w/v)、0.3％至1％(w/v)或0.4％至0.75％(w/v)，
-低分子量聚(氧乙烯)聚合物，浓度范围为1.5％至10％，例如2％至6％，和
-胱天蛋白酶抑制剂，浓度范围为1μM至10μM，例如3μM至7.5μM。
稳定化组合物可以是液体。指定的浓度对于血液样品的稳定化是特别优选的。例如，可以使用0.5ml至2.5ml、0.5ml至2ml、优选1ml至2ml或1ml至 1.5ml的液体稳定化组合物。包含以下所示浓度的稳定剂的此类稳定化组合物可用于稳定化，例如10ml血液。
具体实施方式
下面再次描述本发明的其他实施方式。本发明特别地还提供以下项：
1.一种用于稳定化和富集含细胞体液中多种生物靶标的方法，所述方法包括
(A)将含细胞体液与包含一种或多种以下稳定化剂的稳定化组合物接触：
(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，
(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，和/或
(c)至少一种凋亡抑制剂，
从而提供稳定化的含细胞体液样品；
(B)将稳定化的含细胞体液样品保持稳定化期；和
(C)处理稳定化的含细胞体液样品以从稳定化的含细胞体液富集三种或更多种选自下组的生物靶标
-至少一个细胞亚群，
-胞外核酸，
-胞外囊泡，和
-胞内核酸
2.如实施方式1所述的方法，其中富集的细胞亚群包含目标稀有细胞。
3.如实施方式1或2所述的方法，其中细胞亚群基本由目标稀有细胞组成。
4.如实施方式1-3中任一项所述的方法，其中目标稀有细胞选自下组：肿瘤细胞，特别是循环肿瘤细胞(CTC)、胎儿细胞、干细胞、被病毒或寄生虫感染的细胞、循环内皮细胞(CEC)和循环内皮祖细胞(EPC)。
5.如实施方式1-4中任一项所述的方法，其中，所述目标稀有细胞为循环肿瘤细胞。
6.如实施方式1-5中一项或多项所述的方法，其中胞内核酸是从稳定化的体液样品或其含细胞部分分离而来，任选地，其中所述胞内核酸是基因组DNA。
7.如实施方式1-6中一项或多项所述的方法，其中步骤(C)包括处理稳定化的含细胞体液样品以从所述稳定化的含细胞体液富集三种或更多种选自下组的生物靶标：
-稀有细胞，优选循环肿瘤细胞，
-胞外核酸，
-胞外囊泡和
-胞内核酸
8.如实施方式1-7中一项或多项所述的方法，其中步骤(C)包括从稳定化体液样品中获取至少一个含细胞部分和至少一个细胞-耗竭部分，任选地其中细胞-耗竭部分通过涉及离心和/或过滤的分离方法与至少一个细胞部分分离开。
9.如实施方式1-8中任一项所述的方法，其中在(C)中处理包括
(aa)将稳定化的含细胞体液样品分离成至少一个含细胞部分和至少一个细胞-耗竭部分；
(bb)进一步处理含细胞部分，其中进一步处理含细胞部分包括
(i)从含细胞部分中富集细胞亚群，优选包含目标稀有细胞的；和/或
(ii)从含细胞部分富集胞内核酸(例如基因组DNA)；
(cc)进一步处理细胞-耗竭部分，其中进一步处理细胞-耗竭部分包括
(i)从细胞-耗竭部分富集胞外核酸，任选地，胞外DNA；和/或
(ii)从细胞-耗竭部分富集胞外囊泡。
10.如实施方式1-8中任一项所述的方法，其中在(C)中处理包括
(aa)从所述稳定化的含细胞体液样品中富集细胞亚群，优选包含目标稀有细胞；
(bb)将稳定化的含细胞体液样品分离为含细胞部分和细胞-耗竭部分，从中去除目标细胞亚群；
(cc)进一步处理细胞-耗竭部分，其中进一步处理细胞-耗竭部分包括
(i)从细胞-耗竭部分富集胞外核酸，任选地，胞外DNA；和/或
(ii)从细胞-耗竭部分富集胞外囊泡；和
(dd)任选地，从含细胞部分富集胞内核酸，优选基因组DNA。
11.如实施方式1-8中任一项所述的方法，其中在(C)中处理包括
(aa)将稳定化的含细胞体液样品分为至少两个等分并从所提供的等分中的至少一个富集细胞亚群，优选包含稀有细胞；
(bb)提供至少一个含细胞部分和至少一个细胞-耗竭部分；
(cc)进一步处理细胞-耗竭部分，其中进一步处理细胞-耗竭部分包括
(i)从细胞-耗竭部分富集胞外核酸，任选地，胞外DNA；和/或
(ii)从细胞-耗竭部分富集胞外囊泡；和
(dd)任选地，从含细胞部分富集胞内核酸，优选基因组DNA。
12.如实施方式1-11中任一项所述的方法，所述方法还包括
(D)处理富集的三种或更多种生物靶标用于分析。
13.如实施方式12所述的方法，其中步骤(C)包括富集目标稀有细胞，其中随后的步骤(D)包括分析富集的稀有细胞，任选地，其中分析富集的稀有细胞包括在细胞水平上和/或通过从富集的稀有细胞中富集胞内核酸(优选RNA)来分析富集的稀有细胞。
14.如实施方式13所述的方法，其中步骤(D)包括检测富集的胞内核酸，任选地，其中检测包括扩增和/或测序。
15.如实施方式13或14所述的方法，其中所述胞内核酸包括mRNA。
16.如实施方式1-15中一项或多项所述的方法，其中步骤(C)包括从稳定化的含细胞体液样品中获取细胞-耗竭部分，并从所获取的细胞-耗竭部分富集胞外核酸。
17.如实施方式16所述的方法，其中胞外核酸包含或基本由胞外DNA组成。
18.如实施方式16或17所述的方法，其中胞外核酸包含或基本由胞外 RNA组成。
19.如实施方式12-18中一项或多项所述的方法，其中步骤(D)包括在步骤 (C)所获取的胞外核酸中检测一种或多种目标分子。
20.如实施方式6-19中一项或多项所述的方法，其中步骤(C)包括从稳定化的含细胞体液样品中获取的细胞耗竭部分富集胞外囊泡，且其中后续步骤(D) 包括从所述分离的胞外囊泡中富集RNA。
21.如实施方式1-20中一项或多项所述的方法，其中胞外囊泡包括或基本由外泌体组成。
22.如实施方式1-21中一项或多项所述的方法，包括富集，优选纯化， RNA，任选地，其中RNA富集包括将RNA结合至固相和从固相洗脱结合的 RNA。
23.如实施方式12-22中一项或多项所述的方法，其中步骤(D)包括从细胞，优选从富集的目标稀有细胞中，和/或从富集的胞外囊泡中富集(优选纯化)RNA。
24.如实施方式22或23所述的方法，其具有以下一个或多个特征：
(i)富集的RNA包含或基本上由mRNA组成；
(ii)富集的RNA包括miRNA，或基本由长达350nt、长达300nt或长达 250nt的小RNA组成，其包括miRNA。
25.如实施方式12-24中一项或多项所述的方法，其中步骤(D)包括在所富集(优选纯化)的核酸中检测一种或多种目标核酸分子。
26.如实施方式25所述的方法，其中所述至少一种目标核酸分子具有以下一个或多个特征：
-它是癌症相关肿瘤标志物；
-它是诊断、预后和/或预测性生物标志物；
-它是预后或预测性生物标志物；
-它与实体癌有关，任选地为转移性癌；
-它与乳腺癌或前列腺癌有关，特别是转移性乳腺癌和转移性前列腺癌；
-它是积极的或消极的反应标志物；
-它是治疗标志物；和/或
-它形成一组目标核酸分子的部分，任选地，其中一组包括至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或至少50种目标核酸分子。
27.如实施方式12-26中一项或多项所述的方法，其中步骤(D)包括以下一个或多个：
(i)其包括逆转录纯化的RNA以提供cDNA；
(ii)其包括进行至少一个扩增步骤；
(iii)其包括进行定量聚合酶链式反应；和/或
(iv)其包括分析完整细胞，任选地，其中细胞是循环肿瘤细胞。
28.如实施方式1-27中一项或多项所述的方法，包括通过亲和捕获富集目标稀有细胞和/或胞外囊泡。
29.如实施方式1-28中一项或多项所述的方法，其中所述含细胞体液具有以下一个或多个特征：
-它是循环体液；
-它选自血液、尿液、唾液、滑液、羊水、泪液、淋巴液、母液、脑脊液、汗液、腹水、乳汁、支气管灌洗液、腹腔积液和胸腔积液、骨髓抽吸物和乳头抽吸物、精浆/精液、身体分泌物或身体排泄物；
-它选自血液和尿液；和/或
-它是血液。
30.如实施方式1-21中一项或多项所述的方法，其中该稳定化组合物包括至少一种伯、仲或叔酰胺。
31.如实施方式30所述的方法，其中该稳定化组合物包括至少一种根据式1的伯、仲或叔酰胺
其中R1是氢残基或烷基残基，优选C1-C5烷基残基、C1-C4烷基残基或 C1-C3烷基残基，更优选C1-C2烷基残基，R2和R3相同或不同，并且选自氢残基和烃残基，优选烷基残基，碳链长度为1-20个原子，以直链或支链方式排列，R4为氧、硫或硒残基，优选R4为氧。
32.如实施方式31所述的方法，其中该至少一种根据式1的化合物是伯、仲或叔羧酸酰胺。
33.如实施方式30或31所述的方法，其中稳定化组合物包括N，N-二烷基丙酰胺，优选N，N-二甲基丙酰胺和/或丁酰胺。
34.如实施方式1-33中一项或多项所述的方法，其中该稳定化组合物包括至少一种聚(氧乙烯)聚合物。
35.如实施方式34所述的方法，其中聚(氧乙烯)聚合物是聚乙二醇。
36.如实施方式34或35所述的方法，其中所述稳定化组合物具有以下一个或多个特征：
a)所包含的聚(氧乙烯)聚合物为未取代的聚乙二醇；
b)该组合物包含聚(氧乙烯)聚合物，其是具有至少1500的分子量的高分子量聚(氧乙烯)聚合物；
c)该组合物包含至少一种具有低于1500分子量的聚(氧乙烯)聚合物，优选具有1000或更低的分子量的低分子量聚(氧乙烯)聚合物，任选地，其中所述分子量范围选自100至1000、200至800、200至600和200至500；
d)该组合物包含具有至少1500的分子量的高分子量聚(氧乙烯)聚合物的聚(氧乙烯)聚合物且包含具有1000或更少的分子量的低分子量聚(氧乙烯)聚合物；和/或
e)该组合物包含为高分子量聚(氧乙烯)聚合物的聚(氧乙烯)聚合物和具有 1000或更低分子量的低分子量聚(氧乙烯)聚合物的聚(氧乙烯)聚合物，其中所述高分子量聚(氧乙烯)聚合物的分子量在选自1500至50000、2000至40000、3000至30000、3000至25000、3000至20000和4000至15000的范围内，和/ 或其中所述低分子量聚(氧乙烯)聚合物具有分子量在选自100至1000、200至 800、200至600和200至500的范围内。
37.如实施方式1-36中一项或多项所述的方法，其中该稳定化组合物包含至少一种凋亡抑制剂，优选胱天蛋白酶抑制剂。
38.如实施方式37所述的方法，其中所述凋亡抑制剂，其中的胱天蛋白酶抑制剂具有以下一个或多个特征：
a)该胱天蛋白酶抑制剂是泛胱天蛋白酶抑制剂；
b)该胱天蛋白酶抑制剂包含胱天蛋白酶-特异性肽；
c)该胱天蛋白酶抑制剂包含修饰的胱天蛋白酶-特异性肽，其为，优选在羧基末端，用O-苯氧基(OPh)基团修饰的；
d)该胱天蛋白酶抑制剂包含修饰的胱天蛋白酶-特异性肽，其为，优选在 N-末端，用谷氨酰胺(Q)基团修饰的；
e)该胱天蛋白酶抑制剂选自下组：Q-VD-OPh、Boc-D-(OMe)-FMK和 Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK；
f)所述胱天蛋白酶抑制剂选自下组：Q-VD-OPh和 Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK；和/或
g)该胱天蛋白酶抑制剂是Q-VD-OPh。
39.如实施方式1-38中一项或多项所述的方法，其中所述稳定化组合物包括：
由变体A
(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，优选如实施方式31-33中任一项所定义的，和
(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，优选如实施方式35或36所定义的，和
(c)任选地至少一种凋亡抑制剂，优选如实施方式38中所定义的胱天蛋白酶抑制剂；
由变体B
(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，优选如实施方式31-33中任一项所定义的，
(b)任选地，至少一种聚(氧乙烯)聚合物，优选如实施方式35或36所定义的，和
(c)至少一种凋亡抑制剂，优选如实施方式38中所定义的胱天蛋白酶抑制剂；
由变体C
(a)任选地，至少一种伯、仲或叔酰胺，优选如实施方式31-33中任一项所定义的，
(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，优选如实施方式35或36所定义的，和
(c)至少一种凋亡抑制剂，优选如实施方式38中所定义的胱天蛋白酶抑制剂。
40.如实施方式39所述的方法，其中稳定化组合物包含：
(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，优选如实施方式31-33中任一项所定义的，
(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，优选如实施方式35或36所定义的，和
(c)至少一种凋亡抑制剂，优选如实施方式38中所定义的胱天蛋白酶抑制剂。
41.如实施方式1-40中一项或多项所述的方法，其具有以下一个或多个特征：
(i)该含细胞体液样品的稳定化不涉及一定浓度添加剂的使用，其中所述添加剂会诱导或促进有核细胞的裂解；
(ii)该稳定化不诱导蛋白质-核酸或蛋白质-蛋白质交联；
(iii)该稳定化不涉及诱导蛋白质-核酸和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂的使用，例如甲醛、福尔马林、多聚甲醛或甲醛释放剂；
(iv)该稳定化不涉及毒性试剂的使用；和/或
(v)该稳定化剂被包含在含有水的稳定化组合物中。
42.如实施方式1-41中一项或多项所述的方法，其中所述稳定化组合物包括螯合剂，任选地，EDTA。
43.如实施方式1-42中一项或多项所述的方法，其中含细胞体液是血液且其中稳定化组合物包含抗凝剂，优选螯合剂。
44.如实施方式1-43中一项或多项所述的方法，其中所述含细胞体液，优选血液，接触：
a)一种或多种根据上述式1的化合物；
b)至少一种具有至少3000的分子量的高分子量聚(氧乙烯)聚合物和任选地至少一种具有1000或更小的分子量的低分子量聚(氧乙烯)聚合物；
c)至少一种胱天蛋白酶抑制剂；和
d)任选地，螯合剂，优选EDTA。
45.如实施方式1-44中一项或多项所述的方法，其中所述含细胞体液是血液且血液接触：
a)一种或多种根据上述式1的化合物；
b)至少一种具有分子量范围为3000-40000，例如范围为3000至30000或 3500至25000的高分子量聚(氧乙烯)聚合物，以及至少一种具有分子量为1000 或更小，例如范围为100至800，200至800或200至500的低分子量聚(氧乙烯)聚合物；
c)至少一种胱天蛋白酶抑制剂，优选泛胱天蛋白酶抑制剂，任选地， Q-VD-OPh；和
d)抗凝剂，其优选为螯合剂，优选EDTA，
其中在血液样品已经与所述添加剂和任选地用于稳定化的其他添加剂接触之后，所得的混合物/稳定化的血液样品包含
-浓度范围为0.3％至4％，例如0.5至3％、0.5至2％或0.75至1.5％的根据式1的一种或多种化合物，
-高分子量聚(氧乙烯)聚合物，浓度范围为0.2％至1.5％(w/v)，例如0.25％至1.25％(w/v)、0.3％至1％(w/v)或0.4％至0.75％(w/v)，
-低分子量聚(氧乙烯)聚合物，浓度范围为1.5％至10％，例如2％至6％，和
-胱天蛋白酶抑制剂，浓度范围为1μM至10μM，例如3μM至7.5μM。
46.如实施方式1-45中任一项所述的方法，其中处理步骤(C)包括将该稳定化的含细胞体液样品或获取自该稳定化的含细胞体液样品的含细胞部分经历密度梯度离心步骤，任选地，其中所述含细胞体液样品是血液。
47.如实施方式46所述的方法，其中稳定化的血液样品或获取自所述稳定化的血液样品的含细胞部分与密度梯度介质接触。
48.如实施方式46或47所述方法，其中在进行密度梯度离心步骤之前，优选在使稀释的样品与密度梯度介质接触之前，用稀释溶液稀释稳定化的血液样品或获取自稳定化的血液样品的含细胞部分。
49.如实施方式48所述的方法，其中稳定化的血液样品或获取自所述稳定化的血液样品的含细胞部分用稀释溶液稀释，所述稀释溶液具有以下一个或多个特征：
(a)它是低渗溶液或等渗溶液；
(b)它包含张性调节剂；
(c)它包含多元醇，任选地，糖或糖醇；
(d)它包含糖，任选地，葡萄糖；
(e)它包含糖醇，任选地，甘油；和/或
(f)它包含盐，任选地，碱金属盐，任选地，氯化物盐。
50.如实施方式48或49所述的方法，其中稀释溶液包含还原糖，任选地，葡萄糖，浓度在2-10％、3-7％或4-6％(w/v)范围内。
51.如实施方式48-50中任一项所述的方法，其中稀释溶液包含糖醇，任选地，甘油和盐，任选地，碱金属盐。
52.如实施方式51所述的方法，其中稀释溶液包含至多0.5M甘油和至多 2％氯化钠，任选地，其中该稀释溶液包含0.7-1.2％氯化钠和0.075-0.15M甘油。
53.如实施方式48-52中任一项所述的方法，其中与EDTA稳定化的血液样品相比，在密度梯度离心后，该稀释溶液实现了能够从稳定化的样品中去除至少60％或至少70％的白细胞。
54.如实施方式48-53中任一项所述的方法，其中稀释溶液选自：
(i)5％(w/v)葡萄糖，
(ii)0.9％NaCl+0.1M甘油，和
(iii)稀释溶液，其包含至少一种张性调节剂且具有对应于在(i)或(ii)中所定义的所述稀释溶液的渗透压的渗透压，或其中所述渗透压在(i)或(ii)中所定义的所述溶液渗透压的+/-20％、+/-15％或+/-10％的范围内的稀释溶液。
55.如实施方式48-54中一项或多项所述的方法，其中稳定化的血液样品或获取自稳定化的血液样品的含细胞部分在稀释溶液中孵育不超过10分钟、不超过5分钟或不超过3分钟，然后将稀释的样品与密度梯度介质接触，其中优选地，在稀释后，通过将稀释的样品与密度梯度介质接触，稀释的样品被直接处理。
56.如实施方式46-55中一项或多项所述的方法，其中，密度梯度离心后，形成不同的层，其中所形成的层包括PBMC层。
57.如实施方式56所述的方法，包括收集形成的PBMC层，从而提供 PBMC部分。
58.如实施方式56或57所述的方法，包括从收集的PBMC部分中分离循环肿瘤细胞。
59.如实施方式46-58中任一项所述的方法，包括从收集的PBMC部分分离基因组DNA，从中任选地预先删去循环肿瘤细胞。
60.如实施方式46-59中任一项所述的方法，包括使用缓冲液洗涤收集的 PBMC部分，任选地，使用PBC缓冲液。
61.根据实施方式46-59中任一项所述的方法，其中至少部分PBMC细胞经过白细胞计数。
62.如实施方式1-61中任一项所述的方法，包括从稳定化的含细胞体液样品中获取细胞部分并从该细胞部分分离基因组DNA，其中，在基因组DNA分离之前，该细胞部分被储存，任选地，被冷冻。
63.如前述实施方式中任一项所述的方法，包括使用细胞分选富集细胞群或个体细胞。
64.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中含细胞体液样品是血液且步骤(C)包括从稳定化的样品中作为细胞亚群富集目标淋巴细胞。
65.如实施方式64所述的方法，其中淋巴细胞选自T4和/或T8淋巴细胞。
66.如实施方式64或65所述的方法，其中从免疫缺陷患者中获取稳定化的血液样品。
67.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中含细胞体液样品是血液且步骤(C)包括从稳定化的样品中作为细胞亚群富集血小板，任选地，其中执行步骤(D)，包括从富集的血小板中分离RNA。
68.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中含细胞体液样品是血液且步骤(C)包括从稳定化的样品中作为细胞亚群富集母细胞。
69.如实施方式68所述的方法，其中母细胞通过亲和捕获富集，任选地，使用磁性颗粒。
70.如实施方式68或69所述的方法，其中母细胞是通过靶向细胞表面标志物(任选地，CD34和/或CD117)富集的。
71.如实施方式68-70中任一项所述的方法，其中从急性髓性白血病患者中获取稳定化的血液样品。
72.如实施方式1-71中任一项所述的方法，其中步骤(B)包括在步骤(C)之前运输和/或储存稳定化的含细胞体液样品。
73.如实施方式72所述的方法，其中储存包括将稳定化的含细胞体液样品从收集和稳定化的位点转移到不同的位点以进行处理。
74.如实施方式1-73中任一项所述的方法，其中稳定化的含细胞体液样品在处理步骤(C)之前保持多达12小时或多达24小时。
75.如实施方式1-74中任一项所述的方法，其中稳定化的含细胞体液样品在处理步骤(C)之前保持多达36小时或多达48小时。
76.如实施方式1-75中任一项所述的方法，其中稳定化的含细胞体液样品在处理步骤(C)之前保持多达60小时或多达72小时。
77.如实施方式1-76中任一项所述的方法，包括在处理步骤(C)之前将稳定化的含细胞体液样品保持至少6小时、至少8小时或至少12小时。
78.如实施方式1-77中任一项所述的方法，包括在处理步骤(C)之前将稳定化的含细胞体液样品保持至少16小时、至少24小时或至少48小时。
79.如实施方式1-79中一项或多项所述的方法，其中步骤(C)包括分离至少循环肿瘤细胞、基因组DNA和循环无细胞DNA作为生物靶标。
80.如实施方式79所述的方法，其中进行步骤(D)且包括从循环肿瘤细胞中分离RNA并在分离的RNA中检测生物标志物RNA分子。
81.如实施方式81所述的方法，其中分离的RNA是mRNA。
82.如实施方式49-54中任一项所定义的稀释溶液用于处理稳定化的血液样品或其含细胞部分的用途，其中所述血液样品用稳定化组合物稳定化，其包含(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，和/或至少一种凋亡抑制剂，任选地，稳定化组合物如实施方式30-44中任一项所定义。
83.如实施方式83所述的用途，用于恢复包含的单核细胞的密度，优选用于密度梯度离心。
84.如实施方式82或83所述的用途，其中稀释溶液与稳定化的血液样品或其含细胞部分接触，然后与密度梯度介质接触。
本发明不受本文所公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法或材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实施方式的实践或测试。数值范围包括限定该范围的数值。本文提供的标题不是本发明的各种方面或实施方式的限制，可以参考说明书整体理解本发明的各种方面或实施方式。
在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指代物，除非上下文中另有明确的说明。术语“包括”、“具有”、“包含”和它们的变体被同义地使用并且被解释为非限制性的。在整个说明书中，在组合物被描述为包含成分或材料的情况下，除非另有说明，否则预期组合物在实施方式中也可以基本上由或由所列举的成分或材料的任何组合组成。对“本公开”和“本发明”等的引用包括本文所教导的单个或多个方面，等等。本文教授的方面由术语“发明”涵盖。
优选选择并组合本文描述的优选实施方式，并且由优选实施方式的相应组合产生的具体主题也属于本公开的范畴。
术语“富集”和类似术语在本文中以广义使用且涵盖例如任何形式的富集，例如，特别是分离和纯化目标(例如核酸，如DNA和/或RNA，稀有细胞，如循环肿瘤细胞、胞外囊泡等，从样品中)。
实施例
以下实施例表明，如本公开的方法具有重要优势，从而允许基于使用如本公开的稳定化技术收集并稳定化的单个含细胞体液样品的进行多模式分析。
1)保存了用本公开的稳定化技术稳定化的所包含细胞的抗原组成 (antigenicmakeup)。
2)本发明的稳定化技术可以与不同的稀有细胞富集技术(例如密度梯度离心、Parsortix装置、AdnaTest技术、CellSearch)结合使用。
3)本公开的稳定化技术可以用于细胞转录组(例如所包含细胞的RNA内容物，例如稀有细胞和/或丰富细胞)分析。
4)本公开的稳定化技术可以用于循环转录组(例如来自胞外囊泡的RNA) 分析。
5)本公开的稳定化技术允许多模测试(multimodality testing)(例如分析来自单个稳定化血液样品的CTC、ccfDNA和白细胞衍生的基因组DNA(gDNA))。
以下实施例表明，本方法中使用的稳定化技术有利地实现了掺入的肿瘤细胞的稳定化，此外还保留了它们的核心表面结构、转录组和基因组。在PAXgene 血液ccfDNA溶液(根据本发明的稳定化组合物)中稳定化的MCF7肿瘤细胞系细胞的免疫细胞化学染色证明了与未稳定化的MCF7相当的结果，表明细胞抗原组成和形态的保留。此外，可以通过向稳定化的样品(例如血液样品)中添加特定溶液来恢复细胞密度，从而允许使用梯度密度离心分离细胞。这种方法可以实现经典的基于密度的血液部分分离，例如为了在一层中富集并因此浓缩 PBMC和CTC。
基于不依赖标记的富集和细胞读出(Parsortix，ANGLE plc)和使用分子读出的依赖标记的富集(AdnaTest前列腺癌面板AR-V7，恰根公司GmbH)，证明了用本公开的稳定化技术稳定化的收集的血液作为前端溶液对于不同CTC 分析工作流程的相容性。结果表明，这两种方法都与根据本发明的稳定化技术相容，具有高水平的CTC稳定化和回收率。此外，富集的CTC能够有利地用于基于RNA的分析。这些数据提供了收集到包含根据本发明的稳定化组合物的收集管中的细胞的充分转录组稳定化的证据。下面的实施例进一步证明，不仅细胞RNA，还有循环RNA(包装在胞外囊泡EV中)也可用于分析。用根据本发明的稳定化技术稳定化的含细胞体液样品因此适用于包含在例如血液的含细胞体液样品中的不同生物靶标的多模测试。如基于AdnaTest前列腺癌面板AR-V7测试的基于已建立的工作流程的示例所示，单个稳定化的血液样品可用于分析CTC、ccfDNA和白细胞衍生的基因组DNA。
执行的实施例阐释如下：
1.实施例1：评估使用根据本发明的稳定化技术稳定化的细胞上的抗原组成保存。未处理的和稳定化的MCF7癌细胞系细胞的免疫细胞化学染色
MCF7细胞离心涂片的制备
人乳腺癌细胞系细胞(MCF7)用作CTC模型用于评估PAXgene血液 ccfDNA稳定化溶液(PAXccfDNA)对抗原保存和可及性的作用。PAXgene血液 ccfDNA稳定化溶液是市售可得的根据本发明的稳定化组合物，其包含稳定化剂(a)至(c)和抗凝剂。它包含(1.5ml)在市售可得的PAXgene血液ccfDNA管 (PreAnalytiX)中。
培养的MCF7细胞被胰蛋白酶消化，在PBS中洗涤并在PBS或 PAXccfDNA溶液中在室温下孵育30分钟。随后，制备细胞离心涂片，在室温干燥过夜并在+4C下储存至染色。
免疫细胞化学染色
将细胞离心涂片上的细胞固定、透化、针对抗体的非特异性结合处理(封闭步骤)，并用针对人泛-细胞角蛋白的荧光标记的抗体和用于核染色的DAPI 在室温染色1小时。随后，细胞离心涂片被洗涤、覆盖并在1周内通过荧光显微镜分析。
结果
来自荧光标记的抗-人泛细胞角蛋白抗体对未稳定化和(在稳定化溶液中) 稳定化的癌细胞的特异性信号的存在证明了对在PAXgene血液ccfDNA管中稳定化的细胞进行抗原组成评估的可行性(图1)。
泛-细胞角蛋白在稳定化的样品中的细胞表面被很好地检测到，表明细胞表面抗体得以保留。核染色证实了染色细胞的细胞角蛋白的胞质染色和保留的核(即形态)。
2.实施例2：稳定化技术用于CTC富集和分析的用途
2.1.稳定化技术与ficoll-密度离心的组合用于CTC富集
Ficoll-密度离心是一种常用的方法，用于分离血液部分，因此细胞群根据其密度分离成部分。有核血细胞的密度约为1.062g/ml，当在ficoll层(1.077g/ml) 或类似密度梯度介质上离心时，可以有效地与红细胞(1.092g/ml)和血小板 (1.030g/ml)分离。产生的界面包含PBMC部分，包括CTC和其他稀有有核细胞。
观察到，如果用普通PBS缓冲液稀释，用PAXgene血液ccfDNA稳定化溶液稳定的血液不会形成血浆/PBMC/红细胞层，如同用EDTA-保存的血液(作为参照)通常观察到的那样(见图2)。
基于这些观察，尤其是测试了不同的略低渗和等渗稀释溶液以恢复 PAXccfDNA-稳定化的血细胞的密度。等渗0.9％NaCl被认为是参照。接下来，将含有能够渗透细胞膜的物质(例如甘油)的等渗溶液加入到稀释溶液中进行测试。目的是获得适合用于基于不同密度获得感兴趣的部分的典型层形成，特别是用于多模式分析。功效以ficoll-密度离心后回收的白细胞(WBC)的数量来测量。
血液样品的处理
使用收集到EDTA(BD)或PAXgene血液ccfDNA管(PreAnalytiX)中的全血。为了获得EDTA稳定化的血液，使用了BD真空采血管(BD Vacutainer)(稳定化血液中的EDTA浓度约为1.8mg/ml)。
取4ml全血，用4m1分别的稀释溶液稀释指定的时间(见下文)，并在4ml 的Ficoll-Paque PLUS(GE医疗公司(GE Healthcare)，密度1.077g/ml)上分层。在没有加速和制动的情况下立即以400xg离心样品40分钟。离心后，弃取上部血浆部分，仅将PBMC环转移到新的15m1管中，用PBS填充满并以300xg 离心10分钟(最大加速和制动)。去除上清后，将沉淀重新悬浮在200μl PBS 中并用于进行WBC计数(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))。考虑到 PAXccfDNA管的1，15稀释系数，计算每毫升全血的WBC量。
测试设置
测试了以下包含不同张性调节剂和浓度的稀释溶液(表1)：
表1：基于密度的MNC(单核细胞)富集测试的物质和孵育时间
结果
用PBS稀释的未孵育的EDTA血液用作WBC计数的参照。
为了获得与EDTA-稳定化的血液基本相应的经典梯度密度离心层图案，全血最有效的稀释溶液包括：5％葡萄糖(葡萄糖被血细胞吸收)和0.9％NaCl+ 0.1M甘油。包含0.9％NaCl+0.1M甘油的稀释溶液对皱缩的细胞也有正常化的作用，显然是由于甘油对细胞膜的渗透。在最后的实验中，5％葡萄糖和0.9％ NaCl+0.1M甘油(分别为参照的79％和80％)在没有延长孵育时间的情况下，获得了非常好的、相当的WBC恢复结果(见表2，图2)。也可以使用包含至少一种张性调节剂并具有与本实验中鉴定的范例稀释溶液相似渗透压(如 +/-20％、+/-15％或+/-10％)的不同稀释溶液，它们对实现所需层图案和至少 50％、至少60％、优选至少65％的WBC回收率的积极作用可以通过常规实验确定。
表2
2.2.用稳定化技术和AdnaTest前列腺癌面板AR-V7的组合进行CTC检测。
AdnaTest CTC富集依赖于细胞的免疫磁性分离，基于其表面上靶蛋白的表达进行捕获。富集细胞的检测依赖于肿瘤细胞特异性转录物的检测。根据制造商的建议，可以使用新鲜采集的EDTA血液(抽血后4小时内)或采集到 ACD-A管中并在+4℃下储存长达30小时的血液。
(a)材料和方法
细胞培养
LNCaP95细胞在37℃和5％CO2条件下在不含酚红含10％活性炭剥离的血清和10％青霉素/链霉素的RPMI 1640中单层培养。
血液收集和样品制备
在获得书面知情同意后，通过肘静脉穿刺将21名健康志愿者的全血收集到PAXgene血液ccfDNA管(PreAnalytiX，瑞士)中，并根据制造商的说明在抽血后立即将管倒置8次。
为了比较研究(见下文(c))，根据制造商的说明，将健康供者的血液收集到PAXgene血液ccfDNA管和供应商Streck的BCT中。
每个供者和采血管(BCT)合并血样，在抽血后30分钟内将5ml等分到15 ml锥形管中，并立即掺入。在每个样品中人工掺入20个LNCaP95或20μl PBS 细胞后，将血液样品储存在2-8C或室温下，直到根据研究设计进行处理。
使用AdnaTest前列腺癌面板AR-V7富集和检测肿瘤细胞
AdnaTest前列腺癌面板AR-V7利用AdnaTest前列腺癌选择(AdnaTestProstateCancerSelect)程序涵盖的CTC富集步骤。对于CTC检测，产生来自富含CTC部分的cDNA。
AdnaTest前列腺癌面板AR-V7依靠基于实时PCR的读数来检测前列腺特异性PSA、PSMA、AR和AR-V7转录物，GAPDH作为管家(基因)，CD45 作为白细胞标志物。如果检测到至少一种癌症特异性转录物，则认为检测呈阳性。
AR-V7测定包括非特异性cDNA预扩增步骤，增加了测定的灵敏度。由于预扩增步骤(18个循环)，扩增不再是线性的，目标基因表达的定量是不可行的。AR-V7测试是根据制造商的建议进行的。
数据评估
已知LNCaP95细胞对PSMA、AR和AR-V7呈阳性并且具有不稳定的PSA 表达。因此，所有测试均基于PSMA、AR和AR-V7转录物的检测进行评估，而PSA被排除在分析之外。
使用非配对双尾T-检验(使用ggplot2和ggpubr包的R-统计版本3.5.1)对 ccfDNA产量和gDNA产量进行统计评估。
(b)根据本发明的稳定化组合物与CTC检测的相容性
在第一组实验中，评估了使用根据本发明的稳定化技术收集和稳定化的血液与用于检测掺入的肿瘤细胞的AdnaTest前列腺癌面板AR-V7的相容性。收集到包含根据本发明的稳定化组合物的管中的来自10个供者的全血样品对于每个供者合并，以5ml样品等分到15ml锥形管中。每个血液样品被人工掺入 20个LNCaP95细胞或添加20μl PBS作为无掺入对照。该设置允许评估在收集的稳定化血液中是否可检测到CTC，以及稳定化剂本身是否对测试性能有任何影响(分别为掺入样品和无掺入对照)。所有样品在2-8℃下储存，直到在掺入后3小时、24小时、30小时和48小时进行处理。
数据表明，在所有实验时间点(掺入3小时、24小时、30小时和48小时)，掺入肿瘤细胞的样品中的测试均为阳性(见图3A)，而所有无掺入对照测试均为阴性(参见图3B)。因此，该建立的工作流程证明了包含根据本发明的稳定化组合物的PAXgene血液ccfDNA管与用于分离和检测CTC的AdnaTest前列腺癌面板AR-V7的相容性。根据本发明的稳定化溶液本身不会导致任何非特异性的假阳性结果。
目前，如果储存在2-8C(14)，建议分别在抽血后4和30小时内将市售的 AdnaTest与EDTA或ACD-A收集的血液一起使用。据报道，该测定的灵敏度为90％。本文所示的数据表明对收集到包含根据本发明的稳定化组合物的管中的血液在30小时内具有100％的灵敏度，并且在2-8℃下储存48小时后具有 90％的灵敏度。
本发明的稳定化技术与其他市售的用于CTC保存和检测的稳定化技术的比较
评估从储存长达72小时并收集到包含根据本发明的稳定化组合物的管 (PAXgene血液ccfDNA管)和供应商Streck的无细胞DNA BCT(也旨在用于 CTC保存)的管中的样品中检测CTC的下一个效率。
与之前的实验类似，每5ml血液中使用20个LNCaP95细胞作为CTC模型。PAXgene血液ccfDNA-稳定化的样品(n＝11)储存在2-8C，样品收集到无细胞DNA BCT(n＝8)-在室温(根据制造商建议)，然后由AdnaTest前列腺癌面板AR-V7如上所述处理，在掺入后3小时、24小时、48小时和72小时。
储存72小时后，91％的情况可在PAXgene血液ccfDNA稳定化样品中高效地检测到掺入的肿瘤细胞(见图4A)。相比之下，仅在储存3小时内收集到供应商Streck的BCT中的血液中检测掺入肿瘤细胞为阳性(见图4B)。与PAXgene 血液ccfDNA管的非交联血液稳定化化学相比，供应商Streck的无细胞DNA BCT依赖于基于交联剂的细胞保存。因此，RNA检测受到阻碍。获得的数据与其他人对这些BCT的观察结果一致(参见来自血液样品的 CTC-mRNA(AR-V7)分析-采血管和储存时间的影响。Luk等人，Int J Mol Sci. 2017年5月12日；18(5).)。
此外，进一步的实验表明，在室温下储存后也可以富集CTC(参见图4C 和4D)。
2.3 PAXgene血液ccfDNA管与Parsortix装置用于在多合一解决方案的背景下富集CTC的相容性测试。
研究设计
在本实验中测试了PAXgene ccfDNA稳定化血液与Parsortix(Angle plc，英国吉尔福德)富集仪器的一般相容性，以及从(未-)稳定化的血液中捕获掺入细胞的效率。Parsortix技术通过在一次性显微镜级别大小(microscope-sized)的盒中捕获细胞，从血细胞成分中富集更大且不易变形的细胞(例如CTC)。可以在盒中对细胞进行染色和计数，并使用反向流动(reverse flow)系统进行收获。
在本实验中，使用了用于CTC富集的模型系统方法。血液从一名健康供者收集于EDTA和PAXgene血液ccfDNA管中。首先血液被等分成5ml(EDTA) 或6ml(PAXgene)样品，考虑到PAXgene ccfDNA管中的其他液体(所包含的稳定化溶液)。然后所有样品被掺入2000个稳定表达绿色荧光蛋白的细胞(作为 MCF7-GFP细胞购买)。该细胞系的优点是可以在荧光显微镜下的富集盒内检测和计数捕获的细胞，而无需进一步染色或处理。
在收集日(TTP0)用Parsortix仪器处理EDTA和PAXgene稳定化的血液样品，并计算盒中捕获的GFP细胞的数量。EDTA血液作为参照，因为从未储存的EDTA血液中捕获CTC是仪器供应商推荐的工作流程，并且仍然是临床研究中使用的主要样品质量。
在室温下将血液储存三天后，从PAXgene稳定化的全血(PAXgene)中富集细胞或将全血离心一次(15分钟，1900xg)，弃去血浆并用3ml PBS重建血液以恢复Parsortix处理前的粘度(PAXgene重建(PAXgene reconst))。使用荧光显微镜再次计数盒中捕获的GFP细胞的数量。
结果
在收集当天，在PAXgene ccfDNA管中收集的血液中捕获和计数的细胞数量与EDTA对照相似(PAXgene为103％)。储存三天后，可以在盒中捕获和计数相应但略高数量的细胞，但是与血液处理前的离心步骤无关(见图5)。
结论
收集在PAXgene血液ccfDNA管中的血液与Parsortix细胞富集工作流程相容，甚至在室温下储存3天和血浆分离后也可以进行处理。
因此，从使用根据本发明的稳定化技术收集和稳定化的血液样品中获得 ccfDNA和CTC的多合一解决方案有利地是可行的。
3.实施例3：PAXgene血液ccfDNA管可用于分析细胞转录组(细胞的 RNA内容物)
2.2节提供了CTC富集和RNA分析的原理论证实验。AdnaTests依赖于使用RT-PCR的基于RNA的CTC检测。如以上第2.2节所示，成功检测到掺入的肿瘤细胞，表明如果血液被收集到PAXgene血液ccfDNA管中，单个细胞的 RNA内容物至少可以保存72小时。
4.实施例4：PAXgene血液ccfDNA管可用于分析循环转录组(来自胞外囊泡的RNA)
研究设计
在以下研究中证明了用本公开的稳定化技术稳定化的血液与随后的EV分析的相容性。PAXgene血液ccfDNA管再次用于血液稳定化。
将来自4名健康供者的全血分别收集到三个不同的采血管中：10ml K2- 喷雾干燥的EDTA管(BD真空采血管(BD Vacutainer))、10ml Streck cfDNA BCT 和10ml PAXgene血液ccfDNA管。
采集后从每管中处理5ml血液。通过双重离心产生血浆并用0.8μm过滤器过滤。根据exoRNeasy血清/血浆Maxi试剂盒(恰根公司)分离RNA，并用20μ，l 水洗脱。
用RT-qPCRβ-肌动蛋白测定分析纯化的RNA，以扩增294bp片段。使用 Quantitect引物/探针RT PCR主混合物和2μl洗脱液进行分析。
用于确定β-肌动蛋白拷贝相对差异的定量实时PCR测定
为了测量ccfDNA的量，在Rotor-Gene Q仪器上用2μl洗脱液进行RGQ(恰根公司)的实时PCR测定(表3)。在使用QuantiTect多重PCR试剂盒试剂(恰根公司GmbH)的20μl测定体积中，扩增了人β-肌动蛋白基因的294bp的片段。
表3.p肌动蛋白测定的引物和探针序列
结果
胞外囊泡(EV)可以从收集到含有根据本发明的稳定化组合物的采血管中的全血产生的血浆中富集。从纯化的EV中获得的RNA可以通过RT-qPCR进行分析，而不会受到抑制(见图6)。
相比之下，对从收集到Streck cfDNA BCT的全血中的EV分离的RNA进行分析导致Ct值增加，从而产生不利的结果，这很可能是由于基于甲醛释放剂的稳定化技术诱导的RNA分子上的交联导致RT-qPCR受到抑制。
5.实施例5：在PAXgene血液ccfDNA管中稳定化的样品可用于多模测试
本文的实施例证明，对包含在稳定化体液样品中的不同生物靶标进行多模测试是可行的，随后通过实施例进一步证明，使用3合1工作流程分析获取自用根据本发明的稳定化技术收集并稳定化的单个血液样品的(1)CTC、 (2)ccfDNA和(3)白细胞衍生的基因组DNA(gDNA)。
AdnaTest选择程序能够在回收珠结合的CTC(CTC耗竭的血液)后收集全血残留物(参见图7)。因此，收集了来自所有上述提及的实验的CTC耗竭的血液，以证明对收集到PAXgene血液ccfDNA管中的血液进行多模测试的可行性。 PAXgene血液ccfDNA管允许同时进行ccfDNA和白细胞gDNA分析。随后证明来自第2.2节中列出的实验的CTC耗竭的血液可用于ccfDNA分离，并且产量有利地不受CTC耗竭的影响。从各个供者平行收集的对照样品，分装在5ml 样品中，掺入20个LNCaP95细胞并在2-8C下同时储存，但不用于CTC富集，用作ccfDNA和gDNA产量的参照。
CTC耗竭的血液样品和相应的对照样品共同以1900x g离心15分钟。所得的血液部分(血浆和细胞部分)分别用于ccfDNA提取(在1900x g第二次离心 10分钟后)和gDNA分离。
表4列出了来自CTC-耗竭的血液样品和仅用于血浆生成的血液的 ccfDNA产量。统计分析未显示任何组之间或同一实验组内的第一个和最后一个测试时间点之间的ccfDNA产量有任何显著差异(见图8)。因此，就产量和原位稳定性而言，CTC耗竭对ccfDNA产量没有显着影响。
表4：ccfDNA产量以按1ml使用的血浆标准化的18S rDNA基因的66bp 和500bp片段的浓度(以ng计)确定。
类似地，从CTC耗竭的血液样品(n＝8)离心后获得的细胞部分中提取的 gDNA的产量在PAXgene ccfDNA管中稳定化的血液报告的值范围内。平均而言，可以从来自CTC耗竭样品的200μl细胞部分中分离出10.3μg gDNA(范围 5.31-21.97μg)，与之相比未CTC耗竭的样品则为9.43μg gDNA(范围7.66-11.23 μg)。在掺入和处理后3小时或总计(所有时间点3-72小时)，从CTC耗竭的血液中提取gDNA的产量和单独用于血浆生成的血液的产量之间没有统计学上的显著差异(见图9)。对于CTC耗竭的和对照样品(即生成自全血的)，提取的 gDNA纯度分别为1.86±0.05和1.85±0.06(所有时间点的平均值)，这在预期值范围内(1.7-1.9)。
材料和方法
血浆和细胞部分的生成
来自PAXgene血液ccfDNA管的血浆是根据制造商的说明生成的。简言之，血液以1900x g离心15分钟。分离细胞部分和血浆部分。含有血浆的部分进一步以1900x g离心10分钟，在不干扰相应沉淀的情况下收集血浆并储存在-20℃。第一次沉降后获得的细胞部分立即在-20C下冷冻，直到处理用于 gDNA提取。
ccfDNA工作流程
在QIAsymphony上自动纯化ccfDNA
在QIAsymphony仪器(恰根公司)上使用QIAsymphony PAXgene血液 ccfDNA试剂盒(均为PreAnalytiX)，通过基于磁珠的提取方案从1.6-2.0ml PAXgene血浆中分离ccfDNA。
用于确定18S核糖体DNA拷贝绝对差异的定量实时PCR测定
使用来自CTC耗竭和未掺入的血液样品的ccfDNA样品中的标准曲线，进行人18SrDNA基因的66和500bp片段的绝对定量(参见图8和图11所示的工作流程)。在ABI 7900HT快速实时PCR系统(赛默飞世尔科技公司 (ThermoFisher))上使用QuantiTect多重PCR试剂盒试剂(恰根公司)在20μl测定体积中使用8μl洗脱液进行实时PCR测定。根据使用的血浆体积标准化计算的 66bp和500bp片段的量。
gDNA工作流程
在QIAsymphony上自动纯化gDNA
在QIAsymphony仪器(恰根公司)上使用QIASymphony DSP DNA Mini试剂盒，通过基于磁珠的提取方案从血浆分离后获得的200μl分离的细胞部分中分离基因组DNA。每个样品的洗脱体积为200μl。
gDNA定量和gDNA纯度评估
在NanoDrop8000(赛默飞世尔科技公司)上测量gDNA的吸光度。在 260nm、280nm和320nm处测量吸光度。gDNA浓度(μg/ml)计算为“50x (A260-A320)”和总量-浓度乘以样品体积。提取的gDNA的纯度计算为260nm 处的校正吸光度与280nm处的校正吸光度之比，即(A260-A320)/(A280-A320)。纯DNA特征在于A260/A280比率为1.7-1.9。
总体结论-实施例1-5
细胞(包括CTC和其他稀有细胞)在未稳定化的血液中迅速降解。本公开的方法中使用的稳定化技术(在本文中基于PAXgene血液ccfDNA管证明)允许对 ccfDNA水平、CTC和胞外囊泡进行有效的稳定化和分析，从而能够对可以从稳定化的样品中富集的多种不同的生物靶标进行并行分析。如本文所证明的，根据本发明的稳定化技术允许稳定化细胞抗原组成、基因组和转录组水平以及循环转录组。
因此，根据本发明的工作流程适用于分析单个液体活检分析物(例如CTC 和其他稀有细胞、ccfDNA、ctDNA、EV、白细胞衍生的gDNA、细胞亚群)以及来自同一血样的此类分析物的组合，收集到包含根据本发明的稳定化组合物的单个收集管中(参见图10)。图11还显示了说明性的工作流程。
根据一个实施方式，根据本发明的基于血液样品的工作流程包括：
-在包含根据本发明的稳定化组合物的采集管中采集血液(例如PAXgene 血液ccfDNA管，采血量例如至少5ml，例如10ml；包含稳定化溶液的体积例如11.5ml)，运输到实验室。
-部分稳定化的血液用于CTC富集(例如5ml)。未经处理的血液(例如6.5 ml)和CTC富集后的残余血液(约4.5ml)可用于生成血浆(细胞耗竭部分)。可以使用2步离心方案进行血浆生成。
o细胞部分，例如第一次离心后获得的用于从PBMC中提取总gDNA或用于从目标PBMC亚群中提取DNA的FACS分选。
o生成的血浆在第二个离心步骤中进一步离心。获得的血浆可进一步等分用于ccfDNA和/或EV分离。
-富集的CTC可以被进一步处理。例如，可以裂解富集的CTC，并从中分离胞内核酸(例如RNA，特别是mRNA)用于分析(例如检测CTC转录物)。此外，从富集的CTC获得的胞内核酸可以被测序。
根据一个实施方式，根据本发明的基于血液样品的工作流程包括：
-在包含根据本发明的稳定化组合物的采集管中采集血液(例如PAXgene 血液ccfDNA管，采血量例如至少5ml，例如10ml；包含稳定化溶液的体积例如11.5ml)，运输到实验室。
-通过离心将稳定化的血液样品分离成血浆和细胞部分(例如使用两步离心方案)。
o获得的血浆的等分用于直接纯化ccfDNA。血浆的另一个等分用于浓缩 EV并随后从EV中分离RNA。
-细胞部分的一个等分可以用于分离gDNA。附加或替代性地，细胞部分的等分(优选大部分)用于捕获CTC，并用于随后从耗竭了CTC的残余PBMC 中分离gDNA。
-同样，富集的CTC可以如上所述被进一步处理。
6.实施例6：根据本发明的稳定化技术用于CTC富集和分析的其他用途
6.1.关于稳定化技术与ficoll-密度离心的组合用于CTC富集的进一步实验
上文已经结合实施例2描述了Ficoll-密度离心，为了简洁，此处参考上文。使用与先前描述的相同的方法，进行了进一步的实验，旨在优化从PAXgene 血液ccfDNA管中收集和储存的血液中的单核细胞(MNC)富集。产生的界面包含PBMC部分，包括CTC和其他稀有有核细胞。
在实施例2中观察到，PAXccfDNA-稳定化的血液不会形成血浆/PBMC/ 红细胞层，如EDTA-保存的血液中通常观察到的那些(作为参照)。因此，在与EDTA样品的MNC回收率相对比较中，PAX-储存的血液样品通常证明EDTA 样品仅可实现MNC回收率的75％(图12)。
为了在处理用本发明的技术稳定化的样品时改进MNC回收率，进一步评估了旨在恢复细胞密度的不同溶剂。
结果
除了实施例2，还测试了其他浓度以及其他补充剂。对仅用PBS稀释的 PAX样品进行了比较。结果见下表5。
表5：与PAX+PBS相比，不同补充剂(均用PBS稀释)的MNC回收率结果——表示MNC回收率(相对于PBS+EDTA的百分比)。
| 溶液 | 孵育时间，分钟 | 平均MNC回收率，％ |
| 3％葡萄糖 | 0 | 92 |
| 5％葡萄糖 | 0 | ＞150 |
| 5％葡萄糖 | 5 | ＞150 |
| 0.8％NaCl | 0 | ＞150 |
| 0.8％NaCl+0.1M甘油 | 0 | ＞150 |
| 0.9％NaCl | 0 | 126 |
| 0.9％NaCl | 5 | 91 |
| 1.0％NaCl | 5 | 95 |
| 1％DMSO | 0 | 102 |
| 2％DMSO | 0 | 94 |
| 3％DMSO | 0 | 108 |
| 0.9％NaCl+0.1M甘油 | 0 | 109 |
| 1.0％NaCl+0.1M甘油 | 0 | ＞150 |
| 1.0％NaCl+0.1M甘油 | 5 | ＞150 |
| 1.0％NaCl+0.15M甘油 | 0 | 123 |
| 1.1％NaCl+0.15M甘油 | 0 | 111 |
基于这些观察，测试了不同的高渗和等渗稀释溶液以恢复PAXccfDNA- 稳定化的血细胞的密度。对于经过测试的溶液，观察到足够且出色的回收率，证明了该方法的成功。
也可以使用具有与表5中鉴定的范例稀释溶液相似渗透压(如+/-20％、 +/-15％或+/-10％)的不同稀释溶液，它们对实现所需层图案和至少50％、至少 60％、优选至少65％的WBC回收率的积极作用可以通过常规实验确定。
6.2.关于PAXgene血液ccfDNA管与AdnaTest前列腺癌面板组合用于 CTC检测的进一步实验。
AdnaTest CTC富集和相关材料和方法已在上文结合实施例2进行了描述，为了简洁，此处参考上文。富集细胞的检测依赖于肿瘤细胞特异性转录物的检测。根据制造商的建议，可以使用新鲜采集的EDTA血液(抽血后4小时内)或采集到ACD-A管中并在+4℃下储存长达30小时的血液。
在多重实验中，评估了收集和储存在PAXgene血液ccfDNA管中的血液与三种不同的AdnaTest是否以及在何种程度上相容：血液储存时间、储存条件(室温RT与2-8C)和LOD(20个肿瘤细胞/5ml血液比5个细胞/5ml血液)。
A.PACgene血液ccfDNA管与AdnaTest前列腺癌面板AR-V7的组合
在这组实验中，进一步评估并确证了使用根据本发明的稳定化技术收集和稳定化的血液与用于检测掺入的肿瘤细胞的AdnaTest前列腺癌面板AR-V7的相容性。因此，在使用Adnatest前列腺癌面板AR-V7进行的多重实验中显示，模拟样品(20个LNCaP95细胞/5ml血液)中的肿瘤细胞检测率在2-8C下储存30 小时内为100％，72小时后降至93％(见图13)。即使在120小时后，仍然检测到67％。同样，这证实了根据本发明的稳定化溶液本身不会导致任何非特异性的假阳性结果，因此可以很好地集成到本文所述的工作流程中。
当根据储存条件(RT与2-8C)评估测试性能时，观察到测试性能略有下降 (RT储存样品的测试阳性率为75％，而2-8C储存的样品测试阳性率为84％)(参见图14A和14B)。然而，在室温下储存后，也可以富集总体CTC。
接下来，评估测试的检测限(LOD)。收集到PAX ccfDNA管中的样品被掺入5个或20个细胞/5ml血液。结果表明，掺入20个细胞/5ml血液的样品(参见图15B)被更好地检测到，这表明5个细胞/5ml血液(参见图15A)仅足够用于较短的储存时间。优选使用更高的细胞数，例如20个细胞/5ml，以实现整个工作流程的高灵敏度(＞90％)(参见图15A和15B)。
最后，测试了不同的血浆生成方案。在贯穿本发明的实施例使用的工作流程中，首先血液样品被用于CTC富集，CTC-耗竭的血液被用于血浆生成，以进行进一步的多模测试(参见图16A)。在替代性的血浆生成方法中，首先生成血浆(以1900g持续15分钟)，然后细胞部分被用PBS重建达到初始体积并用于CTC富集(图16B)。检测到的肿瘤细胞的结果如图16所示。特别地，在两种血浆生成方法中，100％的掺入肿瘤细胞在长达72小时的存储时间点都被检测到，这表明根据本发明的方法稳定化的样品可用于两种类型的血浆生成方法，而不会对CTC富集和检测产生负面影响。
与此一致，当在EZ1仪器(自动化解决方案)上使用EZ1的原型AdnaTest 进行关于血浆生成方法比较的相同实验时，观察到类似的结果(见图17A和 17B)。
本实施例的结果表明，任何一种血浆生成方式(即多模使用)都是适用的。
B.PAXgene血液ccfDNA管与AdnaTest前列腺癌的组合
在此实施例中，将AdnaTest前列腺癌(也称为“ProstateDirect”)与AdnaTest 前列腺癌面板AR-V7进行了比较。AdnaTest前列腺癌的敏感性低于AdnaTest 前列腺癌面板AR-V7，并且依赖于终点PCR评估(而AR-V7测试是RT-PCR 测试)。
在此比较中，上述实验中使用的样品也用于AdnaTest前列腺癌评估。因此，为了简洁，参考上文。
比较结果如图18所示，确证了AdnaTest前列腺癌面板AR-V7的发现。
具体而言，获得了以下结果：
-结果表明，模拟样品(20个LNCaP95细胞/5ml血液)中的肿瘤细胞检测率在2-8C下储存30小时内为100％，72小时后降至93％(AdnaTest前列腺癌面板AR-V7见图18A，AdnaTest前列腺癌见图18B)。
-当根据储存条件(RT与2-8℃)评估测试性能时，观察到测试性能略有下降(AdnaTest前列腺癌面板AR-V7：RT储存样品的测试阳性率为75％，而2-8C 储存的样品测试阳性率为84％；AdnaTest前列腺癌：RT储存样品的测试阳性率为50％，而2-8C储存的样品测试阳性率为80％；分别参见图18C和18D)。同样在此处，在室温下储存后，也可以富集总体CTC。
-如上所述，检测限(LOD)通过掺入5个细胞/5ml血液并使用AdnaTest 前列腺癌面板(参见图18E)或AdnaTest前列腺癌(参见图18F)进行测试来评估。结果证实，掺入20个细胞/5ml血液的样品(见上文)导致更好的检测，这表明5 个细胞/5ml血液仅足够用于非常短的储存时间。优选地，对于两种测试都检测到更高的细胞数，例如20个细胞/5m1。
-最后，测试了不同的血浆生成方法。特别地，使用了替代性的血浆产生方法，其中在第一步生成血浆，且细胞部分用于CTC富集。富集的CTC部分用于AdnaTest前列腺癌面板AR-V7(参见图18G)或AdnaTest前列腺癌(参见图 18H)。替代性血浆生成方法允许在持续长达48小时存储的时间点检测100％的掺入肿瘤细胞，这表明根据本发明的方法稳定化的样品可用于两种类型的血浆生成方法，而不会对CTC富集和检测产生负面影响。因此，可以提供有利的工作流程。
6.3.PAXgene血液ccfDNA管与AdnaTest结肠癌的组合
AdnaTest结肠癌的性能在与AdnaTest前列腺癌和AdnaTest前列腺癌面板 AR-V7在上文结合讨论的类似掺入(spike-in)系统上进行了测试。具体地，每5 m1健康供者血液中掺入了20个T84细胞。使用PAXgene血液ccfDNA管将样品储存在2-8C，与将样品收集到ACD-A BCT中并进行类似掺入的测试性能进行比较。分别在掺入后3h、24h、48h、72h时间点测试性能。
结果表明，优选用于本文所述工作流程的PAXgene血液ccfDNA管与 AdnaTest结肠癌(AdnaTest ColonCancer)相容且允许在样品储存后72小时内时检测肿瘤细胞(100％灵敏度)(参见图19A)。此外，在3小时和24小时获得了与 ACD-A BCT相当的结果(见图19B)。
7.实施例7：PAXgene血液ccfDNA管与Parsortix装置用于在多合一解决方案的背景下富集CTC的相容性测试。
在实施例2中已经测试过的基于Parsortix的CTC(作为掺入模型的掺入肿瘤细胞)检测的背景下，我们进一步评估了以下选项：
A.基于肿瘤细胞免疫荧光检测的肿瘤细胞检测-上皮肿瘤特异性抗原染色。
B.基于它们的转录组特征检测掺入的肿瘤细胞(通过AdnaTest AR-V7面板的RT-PCR)。
有关Parsonix装置和相关材料和方法的更多信息，为了简洁，参考实施例 2。
A.基于肿瘤细胞免疫荧光(IF)检测-上皮肿瘤特异性抗原染色的肿瘤细胞检测
Parsortix仪器(Angle PLC)为肿瘤细胞的定量(基于IF)检测提供了两种模式。在CTC富集程序完成后，可以收获CTC富集部分并提供大约100μl浓缩物。该浓缩物被置于在显微镜载玻片上，用于进一步的IF染色和显微镜评估。或者，可以直接在分离盒中进行抗体染色。后一种方法更高效，因为减少了由于收获、离心和染色步骤导致的CTC潜在损失。在收获富含CTC的部分或盒内染色后，通过泛细胞角蛋白的免疫荧光染色检测掺入的肿瘤细胞(50个MCF7 细胞)(分别参见图20A和20B)。掺入的血液的储存对细胞的可染色性没有影响 (无论是用于盒内染色还是用于收获的细胞)。掺入的肿瘤细胞似乎是可染色的，没有任何限制(见图21)。因此，细胞可以很容易地富集和染色，因此可用于本文所述的多模式工作流程。
B.基于它们的转录组特征检测掺入的肿瘤细胞(通过AdnaTest AR-V7面板的RT-PCR)
作为IF染色的替代，可以根据其转录组特征检测富集的肿瘤细胞。因此，在Parsortix运行后收获富集的CTC，并使用上文所述(此处参考)的AdnaTest 前列腺癌面板AR-V7(仅检测部分)进行检测。如图22所示，细胞掺入PAX ccfDNA-收集的血液样品并储存长达3天(TTP表示天数)，能够像掺入EDTA- 收集的样品一样高效地检测到。这些数据强调了PAXgene血液ccfDNA管与 Parsortix仪器的相容性，可通过基于RT-PCR的IF染色的测定用于富集CTC。
8.实施例8：来自PAXgene血液ccfDNA管中采集的血液样品的循环无细胞RNA(ecfRNA)、循环无细胞DNA(ccfDNA)和基因组DNA(gDNA)的多模式分析
除了来自血液的循环无细胞DNA(ccfDNA)外，循环无细胞RNA(ccfRNA) 也与生物标志物研究相关。两种分析物的结合观点有望增加对潜在分子过程的理解。实施例8证明了从使用
血液ccfDNA管收集的一个血液样品中对ccfRNA、ccfDNA和gDNA的多模式提取和分析，其提供了根据本发明的有利的稳定化组合物。
从健康的知情同意的供者收集全血样品到PAXgene血液ccfDNA管(PreAnalytiX)、BD真空采血管
管(BD)、无细胞DNA
RNA完全BCTTM(Streck)和
血液管(Biomatrica)中。在采血后立即通过双重离心或在储存长达三天后生成血浆。如图23所示，提取无细胞核酸。
结果
血液储存在EDTA和PAXgene血液ccfDNA管中后血浆中的ccfRNA产量显示在图24A(TTP0的比较)和图24B(全血储存时的相对倍数变化)中。定量 PCR分析揭示了来自PAXgene血液ccfDNA管和EDTA管中收集的血液的血浆中miRNA、mRNA和ccfDNA靶标的相当的产量。在PAXgene血液ccfDNA 管中储存长达三天后的血液，仍然可以检测到RNA靶标(分别用exoRNeasy和 miRNeasy提取的囊内和囊外的)，其稳定化优于ETDA。
血液储存在稳定化管中后血浆中的miRNA产量示于图25A(TTP0的比较) 和图25B(全血储存时的相对倍数变化)。RNA提取和检测灵敏度受到含有甲醛释放制剂(Streck和Biomatrica)的采血管的影响，如TTP0(第0天)时CT值较高和储存3天后RNA稳定化效率较低所示。
基因组DNA产量和完整性如图26所示。PAXgene血液ccfDNA管在全血储存3天后血浆分离后还能够从残余血细胞中高效提取gDNA，完整DNA 如稳定的DNA完整性指数所示。相比之下，在Streck RNA和Biomatrica管中收集和储存会降低gDNA产量和完整性。
由实施例8的多模式分析提供的结果进一步证明，本发明的稳定化组合物的非交联技术非常有利地能够从单个样品中分离和分析无细胞miRNA、 mRNA、ccfDNA以及基因组细胞gDNA。此外，正如其他实施例所证明的，可以富集和检测其他稀有细胞群，例如CTC。数据总体证明本发明提供了在液体活检研究中非常有用的有利的多模式工作流程。
如本文包含的多个实施例所证明的，其他稳定化技术在全血储存后显示出对感兴趣的测试靶标受损的分析效率。
序列表
<110> 恰根有限公司(QIAGEN GmbH)
<120> 稳定化的含细胞体液样品的多模式分析
<130> 61 836 K
<150> EP 19 199 283.3
<151> 2019-09-24
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人β-肌动蛋白DNA正向引物
<400> 1
tcacccacac tgtgcccatc tacga 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人β-肌动蛋白DNA反向引物
<400> 2
cagcggaacc gctcattgcc aatgg 25
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人β-肌动蛋白DNA探针
<220>
<221> FAM
<222> (1)..(1)
<220>
<221> BHQ
<222> (26)..(26)
<400> 3
atgccctccc ccatgccatc ctgcgt 26
Claims (27)
1.一种用于稳定化和富集含细胞体液中包含的多种生物靶标的方法，所述方法包括
(A)将含细胞体液与包含一种或多种以下稳定化剂的稳定化组合物接触：
(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，
(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，和/或
(c)至少一种凋亡抑制剂，
从而提供稳定化的含细胞体液样品；
(B)将所述稳定化的含细胞体液样品保持稳定化期；和
(C)处理所述稳定化的含细胞体液样品以从所述稳定化的含细胞体液中富集三种或更多种选自下组的生物靶标
-至少一个细胞亚群，
-胞外核酸，
-胞外囊泡，和
-胞内核酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述富集的细胞亚群包含目标稀有细胞，任选地其中所述目标稀有细胞选自下组：肿瘤细胞，特别是循环肿瘤细胞(CTC)、胎儿细胞、干细胞、被病毒或寄生虫感染的细胞、循环内皮细胞(CEC)和循环内皮祖细胞(EPC)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤(C)包括从所述稳定化的体液样品中获得至少一个含细胞部分和至少一个细胞-耗竭部分，且其中在(C)中的处理包括
由变体A
(aa)将所述稳定化的含细胞体液样品分离成至少一个含细胞部分和至少一个细胞-耗竭部分；
(bb)进一步处理所述含细胞部分，其中进一步处理所述含细胞部分包括
(i)从所述含细胞部分中富集细胞亚群，优选包含目标稀有细胞的；和/或
(ii)从所述含细胞部分富集胞内核酸(任选地，基因组DNA)；
(cc)进一步处理所述细胞-耗竭部分，其中进一步处理所述细胞-耗竭部分包括
(i)从所述细胞-耗竭部分富集胞外核酸，任选地，胞外DNA；和/或
(ii)从所述细胞-耗竭部分富集胞外囊泡；
或由变体B
(aa)从所述稳定化的含细胞体液样品中富集细胞亚群，优选包含目标稀有细胞；
(bb)将所述稳定化的含细胞体液样品分离为含细胞部分和细胞-耗竭部分，从中去除所述目标细胞亚群；
(cc)进一步处理所述细胞-耗竭部分，其中进一步处理所述细胞-耗竭部分包括
(i)从所述细胞-耗竭部分富集胞外核酸，任选地，胞外DNA；和/或
(ii)从所述细胞-耗竭部分富集胞外囊泡；和
(dd)任选地，从所述含细胞部分富集胞内核酸，优选基因组DNA；
或由变体C
(aa)将所述稳定化的含细胞体液样品分为至少两个等分并从所提供的等分中的至少一个富集细胞亚群，优选包含稀有细胞；
(bb)提供至少一个含细胞部分和至少一个细胞-耗竭部分；
(cc)进一步处理所述细胞-耗竭部分，其中进一步处理所述细胞-耗竭部分包括
(i)从所述细胞-耗竭部分富集胞外核酸，任选地，胞外DNA；和/或
(ii)从所述细胞-耗竭部分富集胞外囊泡；和
(dd)任选地，从所述含细胞部分富集胞内核酸，优选基因组DNA。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法还包括
(D)处理所述富集的三种或更多种生物靶标用于分析。
5.如权利要求4所述的方法，其具有以下一个或多个特征：
(i)步骤(C)包括富集目标稀有细胞，随后的步骤(D)包括在细胞水平上分析所述富集的目标稀有细胞和/或通过从所述富集的目标稀有细胞中分离胞内核酸并在所述分离的胞内核酸中检测一种或多种目标分子，任选地，其中所述胞内核酸包括mRNA；
(ii)步骤(C)包括从所述稳定化的含细胞体液样品中获得细胞-耗竭部分并从所述获得的细胞-耗竭部分分离胞外核酸，任选地其中所述胞外核酸包括或基本上由胞外DNA组成，且后续步骤(D)包括在所述分离的胞外核酸中检测一种或多种目标分子；
(iii)步骤(C)包括从所述稳定化的含细胞体液样品中获得的细胞-耗竭部分富集胞外囊泡，且后续步骤(D)包括从所述富集的胞外囊泡中分离RNA并在所述分离的RNA中检测一种或多种目标分子；和/或
(iv)步骤(C)包括作为生物靶标分离至少(i)循环肿瘤细胞，(ii)基因组DNA和(iii)循环无细胞DNA，且其中步骤(D)包括(i)从所述循环肿瘤细胞中分离RNA并在所述分离的RNA中检测生物标志物RNA分子；(ii)检测，例如扩增和/或测序，基因组DNA和(iii)在所述分离的循环无细胞DNA中检测生物标志物分子。
6.如权利要求1-5中一项或多项所述的方法，包括通过亲和捕获富集目标稀有细胞和/或胞外囊泡。
7.如权利要求1-6中一项或多项所述的方法，其中所述含细胞体液具有以下一个或多个特征：
-它是循环体液；
-它选自血液、尿液、唾液、滑液、羊水、泪液、淋巴液、母液、脑脊液、汗液、腹水、乳汁、支气管灌洗液、腹腔积液和胸腔积液、骨髓抽吸物和乳头抽吸物、精浆/精液、身体分泌物或身体排泄物；
-它选自血液和尿液；和/或
-它是血液。
8.如权利要求1-7中一项或多项所述的方法，其中所述稳定化组合物包含至少一种伯、仲或叔酰胺且其中所述稳定化组合物包含至少一种根据式1的伯、仲或叔酰胺
其中R1是氢残基或烷基残基，优选C1-C5烷基残基、C1-C4烷基残基或C1-C3烷基残基，更优选C1-C2烷基残基，R2和R3相同或不同，并且选自氢残基和烃残基，优选烷基残基，碳链长度为1-20个原子，以直链或支链方式排列，R4为氧、硫或硒残基，优选R4为氧，
任选其中所述至少一种根据式1的化合物是伯、仲或叔羧酸酰胺，任选地，N，N-二烷基丙酰胺，例如N，N-二甲基丙酰胺和/或丁酰胺。
9.如权利要求1-8中一项或多项所述的方法，其中所述稳定化组合物包含至少一种聚(氧乙烯)聚合物，任选地，其中所述聚(氧乙烯)聚合物是聚乙二醇。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述稳定化组合物具有以下一个或多个特征：
a)所述包含的聚(氧乙烯)聚合物为未取代的聚乙二醇；
b)所述组合物包含聚(氧乙烯)聚合物，其是具有至少1500的分子量的高分子量聚(氧乙烯)聚合物；
c)所述组合物包含至少一种具有低于1500的分子量的聚(氧乙烯)聚合物，优选具有1000或更低的分子量的低分子量聚(氧乙烯)聚合物，任选地，其中所述分子量范围选自100至1000、200至800、200至600和200至500；
d)所述组合物包含具有至少1500的分子量的高分子量聚(氧乙烯)聚合物的聚(氧乙烯)聚合物且包含具有1000或更小的分子量的低分子量聚(氧乙烯)聚合物；和/或
e)所述组合物包含为高分子量聚(氧乙烯)聚合物的聚(氧乙烯)聚合物和具有1000或更低分子量的低分子量聚(氧乙烯)聚合物的聚(氧乙烯)聚合物，其中所述高分子量聚(氧乙烯)聚合物的分子量在选自1500至50000、2000至40000、3000至30000、3000至25000、3000至20000和4000至15000的范围内，和/或其中所述低分子量聚(氧乙烯)聚合物具有分子量在选自100至1000、200至800、200至600和200至500的范围内。
11.如权利要求1-10中一项或多项所述的方法，其中所述稳定化组合物包含至少一种胱天蛋白酶抑制剂作为凋亡抑制剂，任选地，其中所述胱天蛋白酶抑制剂具有以下一个或多个特征：
a)所述胱天蛋白酶抑制剂是泛胱天蛋白酶抑制剂；
b)所述胱天蛋白酶抑制剂包含胱天蛋白酶-特异性肽；
c)所述胱天蛋白酶抑制剂包含修饰的胱天蛋白酶-特异性肽，其为，优选在羧基末端，用O-苯氧基(OPh)基团修饰的；
d)所述胱天蛋白酶抑制剂包含修饰的胱天蛋白酶-特异性肽，其为，优选在N-末端，用谷氨酰胺(Q)基团修饰的；
e)所述胱天蛋白酶抑制剂选自下组：Q-VD-OPh、Boc-D-(OMe)-FMK和Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK；
f)所述胱天蛋白酶抑制剂选自下组：Q-VD-OPh和Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK；和/或
g)所述胱天蛋白酶抑制剂是Q-VD-OPh。
12.如权利要求1-11中一项或多项所述的方法，其中所述稳定化组合物包括：
(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，优选如权利要求8所定义的，
(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，优选如权利要求9或10所定义的，和
(c)至少一种胱天蛋白酶抑制剂，优选如权利要求11所定义的；和
(d)任选地，螯合剂，例如EDTA。
13.如权利要求1-12中一项或多项所述的方法，其中所述含细胞体液是血液且所述血液接触：
a)一种或多种根据上述式1的化合物；
b)至少一种具有分子量范围为3000-40000，例如范围为3000至30000或3500至25000的高分子量聚(氧乙烯)聚合物，以及至少一种具有分子量为1000或更小，例如范围为100至800，200至800或200至500的低分子量聚(氧乙烯)聚合物；
c)至少一种胱天蛋白酶抑制剂，优选泛胱天蛋白酶抑制剂，任选地，Q-VD-OPh；和
d)抗凝剂，其任选地为螯合剂，例如EDTA，
其中在血液样品已经与所述添加剂和任选地用于稳定化的其他添加剂接触之后，所得的混合物/稳定化的血液样品包含
-浓度范围为0.3％至4％，例如0.5至3％、0.5至2％或0.75至1.5％的根据式1的一种或多种化合物，
-高分子量聚(氧乙烯)聚合物，浓度范围为0.2％至1.5％(w/v)，例如0.25％至1.25％(w/v)、0.3％至1％(w/v)或0.4％至0.75％(w/v)，
-低分子量聚(氧乙烯)聚合物，浓度范围为1.5％至10％，例如2％至6％，和
-胱天蛋白酶抑制剂，浓度范围为1μM至10μM，例如3μM至7.5μM。
14.如权利要求1-13中一项或多项所述的方法，其具有以下一个或多个特征：
(i)所述含细胞体液样品的稳定化不涉及一定浓度添加剂的使用，其中所述添加剂会诱导或促进有核细胞的裂解；
(ii)所述稳定化不诱导蛋白质-核酸或蛋白质-蛋白质交联；
(iii)所述稳定化不涉及诱导蛋白质-核酸和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂的使用，例如甲醛、福尔马林、多聚甲醛或甲醛释放剂；
(iv)所述稳定化不涉及毒性试剂的使用；和/或
(v)所述稳定化剂被包含在含有水的稳定化组合物中。
15.如权利要求1-14中一项或多项所述的方法，其中步骤(A)中使用的所述稳定化不在所述稳定化的样品中诱导蛋白质-核酸或蛋白质-蛋白质交联，任选地，其中步骤(C)包括从获取自所述稳定化的含细胞体液样品的细胞-耗竭部分富集胞外囊泡，且后续步骤(D)包括从所述富集的胞外囊泡中分离RNA并在所述分离的RNA中检测一种或多种目标分子。
16.如权利要求14或15中所述的方法，其中所述含细胞体液，优选血液，接触：
a)一种或多种根据上述式1的化合物；
b)至少一种具有至少3000的分子量的高分子量聚(氧乙烯)聚合物和任选地至少一种具有1000或更小的分子量的低分子量聚(氧乙烯)聚合物；
c)至少一种胱天蛋白酶抑制剂；和
d)任选地，螯合剂，优选EDTA。
17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中步骤(C)包括处理所述稳定化的含细胞体液样品以从所述稳定化的含细胞体液中富集三种或更多种选自下组的生物靶标
-稀有细胞，优选循环肿瘤细胞，
-胞外核酸，
-胞外囊泡和
-胞内核酸。
18.如权利要求14-17中一项或多项所述的方法，其中步骤(C)包括从所述稳定化的体液样品中获得至少一个含细胞部分和至少一个细胞-耗竭部分，且其中步骤(C)进一步包括从获取自所述稳定化的含细胞体液样品的所述细胞-耗竭部分富集胞外囊泡，且后续步骤(D)包括从所述富集的胞外囊泡分离RNA。
19.如权利要求18所述的方法，其中步骤(D)包括检测分离的RNA中的一种或多种目标分子。
20.如权利要求18或19所述的方法，包括从所述含细胞部分中分离基因组DNA。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中处理步骤(C)包括将所述稳定化的含细胞体液样品或获取自所述稳定化的含细胞体液样品的含细胞部分经历密度梯度离心步骤，任选地，其中所述含细胞体液样品是血液。
22.如权利要求21所述的方法，其中稳定化的血液样品或获取自所述稳定化的血液样品的含细胞部分用稀释溶液稀释，然后进行所述密度梯度离心步骤。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述稀释溶液具有以下一个或多个特征：
(a)它是低渗溶液或等渗溶液；
(b)它包含张性调节剂；
(c)它包含多元醇，任选地，糖或糖醇；
(d)它包含糖，任选地，葡萄糖；
(e)它包含糖醇，任选地，甘油；和/或
(f)它包含盐，任选地，碱金属盐，任选地，氯化物盐，
其中，密度梯度离心后，形成不同的层，其中所述形成的层包括PBMC层。
24.如权利要求23所述的方法，其中
(a)所述稀释溶液包含还原糖，任选地，葡萄糖，浓度在2-10％、3-7％或4-6％(w/v)范围内；
(b)所述稀释溶液包含糖醇和盐，任选地，其中所述稀释溶液包含至多0.5M甘油和至多2％氯化钠，
(c)所述稀释溶液包含0.7-1.2％氯化钠和0.075-0.15M甘油，和/或
(d)其中所述稀释溶液选自
(i)5％(w/v)葡萄糖，
(ii)0.9％NaCl+0.1M甘油，和
(iii)稀释溶液，其包含至少一种张性调节剂且具有对应于在(i)或(ii)中所定义的所述稀释溶液的渗透压的渗透压，或其中所述渗透压在(i)或(ii)中所定义的所述溶液渗透压的+/-20％、+/-15％或+/-10％的范围内。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述稀释溶液包括DMSO。
26.如权利要求22-25中任一项所定义的稀释溶液用于处理稳定化的血液样品或其含细胞部分的用途，其中所述血液样品用稳定化组合物稳定化，其包含(a)至少一种伯、仲或叔酰胺，(b)至少一种聚(氧乙烯)聚合物，和/或至少一种凋亡抑制剂，任选地，稳定化组合物如权利要求8-13或14中任一项所定义。
27.如权利要求26所述用途，用于恢复所包含的单核细胞的密度，优选用于密度梯度离心，且其中所述稀释溶液与所述稳定化血液样品或其含细胞部分接触，然后与所述密度梯度介质接触。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP19199283 | 2019-09-24 | ||
| EP19199283.3 | 2019-09-24 | ||
| PCT/EP2020/076801 WO2021058692A1 (en) | 2019-09-24 | 2020-09-24 | Multimodal analysis of stabilized cell-containing bodily fluid samples |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114450402A true CN114450402A (zh) | 2022-05-06 |
Family
ID=68210700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202080067088.2A Pending CN114450402A (zh) | 2019-09-24 | 2020-09-24 | 稳定化的含细胞体液样品的多模式分析 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220349014A1 (zh) |
| EP (1) | EP4034653A1 (zh) |
| JP (1) | JP2022548752A (zh) |
| CN (1) | CN114450402A (zh) |
| AU (1) | AU2020353273A1 (zh) |
| CA (1) | CA3148731A1 (zh) |
| WO (1) | WO2021058692A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023150760A2 (en) * | 2022-02-04 | 2023-08-10 | Cornell University | Enrichment and characterization of rare circulating cells, including progenitor cells, from peripheral blood, and uses thereof |
| CN114700186B (zh) * | 2022-03-17 | 2023-04-18 | 中国科学院海洋研究所 | 一种刺参体液样品外泌体分离的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102112626A (zh) * | 2008-04-09 | 2011-06-29 | 加州理工学院 | 用于检测和/或分类靶标的捕获剂以及相关方法和系统 |
| CN103827303A (zh) * | 2011-09-26 | 2014-05-28 | 普瑞阿那利提克斯有限公司 | 细胞外核酸的稳定化和分离 |
| WO2014146780A1 (en) * | 2013-03-18 | 2014-09-25 | Qiagen Gmbh | Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids |
| CN106480017A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-03-08 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 同时提取循环肿瘤细胞dna和肿瘤游离dna的试剂盒 |
| WO2017085321A1 (en) * | 2015-11-20 | 2017-05-26 | Qiagen Gmbh | Method of preparing sterilized compositions for stabilization of extracellular nucleic acids |
| WO2019079743A1 (en) * | 2017-10-19 | 2019-04-25 | Streck, Inc. | COMPOSITIONS FOR HEMOLYSIS AND REGULATION OF COAGULATION AND STABILIZATION OF EXTRACELLULAR VESICLES |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103930546A (zh) | 2011-09-26 | 2014-07-16 | 凯杰有限公司 | 用于分离细胞外核酸的快速方法 |
| CN103827322B (zh) | 2011-09-26 | 2017-05-31 | 凯杰有限公司 | 细胞外核酸的稳定化和分离 |
| CN104755628B (zh) | 2012-09-25 | 2019-03-01 | 凯杰有限公司 | 生物样品的稳定化 |
| WO2014146781A1 (en) | 2013-03-18 | 2014-09-25 | Qiagen Gmbh | Stabilisation of biological samples |
| WO2015140218A1 (en) | 2014-03-18 | 2015-09-24 | Qiagen Gmbh | Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids |
| EP3307886B1 (en) | 2015-06-10 | 2021-03-24 | Qiagen GmbH | Method for isolating extracellular nucleic acids using anion exchange particles |
| EP4397771A3 (en) * | 2019-01-04 | 2024-10-16 | PreAnalytiX GmbH | Urine stabilization |
-
2020
- 2020-09-24 JP JP2022517916A patent/JP2022548752A/ja active Pending
- 2020-09-24 EP EP20781466.6A patent/EP4034653A1/en active Pending
- 2020-09-24 CA CA3148731A patent/CA3148731A1/en active Pending
- 2020-09-24 AU AU2020353273A patent/AU2020353273A1/en active Pending
- 2020-09-24 CN CN202080067088.2A patent/CN114450402A/zh active Pending
- 2020-09-24 WO PCT/EP2020/076801 patent/WO2021058692A1/en unknown
- 2020-09-24 US US17/762,565 patent/US20220349014A1/en active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102112626A (zh) * | 2008-04-09 | 2011-06-29 | 加州理工学院 | 用于检测和/或分类靶标的捕获剂以及相关方法和系统 |
| CN103827303A (zh) * | 2011-09-26 | 2014-05-28 | 普瑞阿那利提克斯有限公司 | 细胞外核酸的稳定化和分离 |
| WO2014146780A1 (en) * | 2013-03-18 | 2014-09-25 | Qiagen Gmbh | Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids |
| WO2017085321A1 (en) * | 2015-11-20 | 2017-05-26 | Qiagen Gmbh | Method of preparing sterilized compositions for stabilization of extracellular nucleic acids |
| CN106480017A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-03-08 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 同时提取循环肿瘤细胞dna和肿瘤游离dna的试剂盒 |
| WO2019079743A1 (en) * | 2017-10-19 | 2019-04-25 | Streck, Inc. | COMPOSITIONS FOR HEMOLYSIS AND REGULATION OF COAGULATION AND STABILIZATION OF EXTRACELLULAR VESICLES |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2022548752A (ja) | 2022-11-21 |
| AU2020353273A1 (en) | 2022-03-17 |
| CA3148731A1 (en) | 2021-04-01 |
| EP4034653A1 (en) | 2022-08-03 |
| WO2021058692A1 (en) | 2021-04-01 |
| US20220349014A1 (en) | 2022-11-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sadik et al. | Extracellular RNAs: a new awareness of old perspectives | |
| JP7037504B2 (ja) | 生体液からの細胞外小胞の単離及びセルフリーｄｎａの同時単離のための自動及び手動方法 | |
| CN110106229B (zh) | 用于分离微囊泡的方法 | |
| US10876105B2 (en) | Methods for extracellular vesicle isolation and selective removal | |
| Gámez-Valero et al. | Urinary extracellular vesicles as source of biomarkers in kidney diseases | |
| JP6750178B2 (ja) | 生物試料の安定化 | |
| EP3327440B1 (en) | Methods for exosome isolation | |
| US9829483B2 (en) | Methods of isolating extracellular vesicles | |
| Lässer | Identification and analysis of circulating exosomal microRNA in human body fluids | |
| CN110456034B (zh) | 一种循环肿瘤细胞的检测方法 | |
| EP2972359B1 (en) | Enrichment of circulating tumor cells by depleting white blood cells | |
| CN114450402A (zh) | 稳定化的含细胞体液样品的多模式分析 | |
| Pallares-Rusiñol et al. | Advances in exosome analysis | |
| CN114959046A (zh) | 检测胃癌外泌体中lncRNA-NEAT1的试剂盒及其在胃癌诊断中的应用 | |
| JP5754013B2 (ja) | ヒト肝臓がん細胞ＨｅｐＧ２に特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー | |
| KR102380529B1 (ko) | 전이성 전립선 암의 진단 및 예후 예측을 위한 혈중종양세포 기반 바이오 마커 조성물 | |
| Semaan et al. | Isolating Circulating Exosomes as Biomarkers: Challenges and Opportunities | |
| Liu et al. | Vault particles are common contaminants of extracellular vesicle preparations | |
| Stafim da Cunha et al. | Endothelial Extracellular Vesicles as Biomarkers of Toxic Molecules | |
| Ofori et al. | Exosomes as Liquid Biopsy Biomarkers in Diffuse Large B-cell Lymphoma (DLBCL)-Current State-of-the-Art and Unmet Clinical Needs | |
| Mussack | The role of microRNAs and extracellular vesicles in the detection of autologous blood doping | |
| US11840734B2 (en) | Method for analyzing aurka expression | |
| CN117778293A (zh) | 基于SEC的sEV分离纯化试剂、试剂盒和方法 | |
| CN117007796A (zh) | 红细胞脱核的分子标记物及其用途 | |
| Balaj et al. | Dakai Mu |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |