CN103827322B - 细胞外核酸的稳定化和分离 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用凋亡抑制剂、优选为半胱天冬酶抑制剂、高渗剂和/或如权利要求书中所定义的式1的化合物使含细胞的生物样品中的细胞外核酸群体稳定的方法、组合物和装置。

Description

细胞外核酸的稳定化和分离

产生本发明的工作接受了来自于欧盟第七框架计划（European Community'sSeventh Framework Programme）（FP7/2007-2013）在拨款协议号222916下的资助。

技术领域

本文公开的技术涉及适合于使含细胞的样品、尤其是血液样品中的细胞外核酸群体稳定的方法和组合物，并涉及从相应稳定化的生物样品分离细胞外核酸的方法。

背景技术

已在血液、血浆、血清和其他体液中鉴定到细胞外核酸。在相应样品中发现的细胞外核酸，由于它们受到保护而免受核酸酶影响（例如因为它们以蛋白脂质复合物的形式分泌、与蛋白质结合或被包含在囊泡内）这一事实，因此具有一定程度的抗降解性。许多医学病症、恶性肿瘤和感染过程中存在水平升高的细胞外核酸例如DNA和/或RNA，对于疾病进展的筛选、诊断、预后、监测，对于鉴定潜在的治疗靶点以及对于监测治疗反应等等来说，是令人感兴趣的。此外，母体血液中升高的胎儿DNA/RNA被用于确定例如性别同一性、评估染色体异常和监测妊娠相关的并发症。因此，细胞外核酸在非侵入性诊断和预后中特别有用，并且可以在许多应用领域例如非侵入性产前遗传检测、肿瘤学、移植医学或许多其他疾病中用作例如诊断标志物，并因此具有诊断相关性（例如胎儿来源的核酸或肿瘤来源的核酸）。然而，在健康人类中也发现了细胞外核酸。细胞外核酸的常见应用和分析方法被描述在例如下述文献中：WO97/035589，WO97/34015，Swarup等，FEBS Letters581(2007)795-799，Fleischhacker Ann.N.Y.Acad.Sci.1075:40-49(2006)，Fleischhacker和Schmidt，Biochmica et Biophysica Acta1775(2007)191-232，Hromadnikova等，(2006)DNA andCell biology,Volume25,Number11pp635-640；Fan等，(2010)Clinical Chemistry56:8。

传统上，从含细胞的生物样品例如血液分离细胞外核酸的第一步骤是获得所述样品的基本上无细胞的级分，例如在血液的情况下为血清或血浆。然后从所述无细胞的级分分离细胞外核酸，在处理血液样品时，所述无细胞的级分通常为血浆。然而，获得样品的基本上无细胞的级分可能是有困难的，并且分离常常是繁琐和耗时的多步骤过程，因为重要的是使用仔细控制的条件来防止离心期间细胞破裂，所述细胞破裂可能使细胞外核酸被破裂期间释放的细胞内核酸污染。此外，通常难以去除所有细胞。因此，许多往往且通常被分类为“无细胞”的处理后的样品例如血浆或血清事实上仍含有在分离过程中未被去除的残留量的细胞。另一个重要的考虑因素是：由于离体温育期间的细胞破裂，通常在从抽血事件起相对短的时间段内，细胞内核酸从样品中包含的细胞中释放出来。一旦开始细胞裂解，裂解的细胞就释放出另外的核酸，其与细胞外核酸混合，并且回收用于测试的细胞外核酸变得越来越困难。现有技术中讨论了这些问题（参见例如Chiu等（2001），ClinicalChemistry47:91607-1613；Fan等（2010）和US2010/0184069）。此外，可用的细胞外核酸的量和可回收性可能在一段时间后由于降解而显著降低。

除了例如源自于肿瘤细胞或胎儿的哺乳动物细胞外核酸之外，含细胞的样品还可能包含不被包含在细胞中的其他目标核酸。重要的非限制性实例是病原体核酸例如病毒核酸。在运输和操作期间保持含细胞的样品、尤其是例如血液样本中的病毒核酸的完整性，对于后续分析和病毒载量监测也是至关重要的。

如果样品包含大量细胞，正如在例如使用全血样品的情形中那样，上面讨论的问题尤其成为一个争论点。因此，为了避免或相应地减轻上述问题，通常在获得样品后基本上立即将样品的基本上不含细胞的级分与样品中包含的细胞分离开。例如，推荐的是，在抽取血液后基本上直接从全血获得血浆，和/或将全血和/或得到的血浆或血清冷却，以便保持细胞外核酸的完整性并避免细胞外核酸群体被所包含的细胞释放出的细胞内核酸污染。然而，例如直接从血液分离血浆这一需要是一个主要缺点，因为许多抽取血液的机构（例如医生的诊所）不具有能够有效分离血浆的离心机。此外，如上所述，在常规条件下获得的血浆通常包含残留量的细胞，因此所述细胞在样品操作期间也可能被破坏或可能死亡，从而释放出细胞内核酸、尤其是基因组DNA。这些残留的细胞还造成了下述风险，即，它们在操作期间被破坏，使得它们的核酸内含物、尤其是基因组（核）DNA和细胞质RNA与细胞外循环核酸级分合并，从而污染或相应地稀释所述级分。为了去除这些残留的污染性细胞并避免/减轻上述问题，已知以更高速度进行第二个离心步骤。然而，同样地，这样的大功率离心机在获得血液的机构处通常不可用。另外，即使在抽取血液后直接获得血浆，如果不能直接分离核酸，也推荐将其在-80℃下冷冻以保护其中包含的核酸。这也对样品的处理强加了实际限制，因为例如血浆样品必须被冷冻运输。这提高了成本，并且还造成在冷冻链中断的情况下样品受损的风险。

血液样品目前通常被收集在含有喷雾干燥的EDTA或液体EDTA（例如BDVacutainer K₂EDTA）的血液收集管中。EDTA螯合镁、钙和其他二价金属离子，从而抑制酶促反应，例如血液凝固或由DNA酶造成的DNA降解。然而，尽管EDTA是有效的抗凝剂，但EDTA不能有效地防止细胞外核酸群体被释放的细胞内核酸稀释或相应地污染。因此，样品的无细胞部分中存在的细胞外核酸群体在储存期间发生变化。因此，EDTA不能使细胞外核酸群体充分稳定，尤其是因为它不能避免细胞外核酸群体被例如抽血后在样品运输和储存期间由细胞降解和细胞不稳定性产生的基因组DNA片段污染。

具体地旨在使全血中包含的循环核酸稳定的方法是现有技术中已知的。一种方法使用甲醛使细胞膜稳定，从而减少细胞裂解，此外甲醛抑制核酸酶。相应的方法被描述在例如US7,332,277和US7,442,506中。然而，甲醛或释放甲醛的物质的使用具有缺点，因为它们可能通过诱导核酸分子之间或蛋白质与核酸之间的交联而损害细胞外核酸的分离效率。使血液样品稳定的可选方法被描述在例如US2010/0184069和US2010/0209930中。这些最近才开发的方法证实了对提供用于使含细胞的生物样品稳定以允许有效回收例如这样的样品中包含的细胞外核酸的手段的极大需求。

然而，尽管存在这些最近才有的发展，但对开发下面这样的样品处理技术仍存在持续不断的需求：所述样品处理技术能够使生物样品、尤其是含有细胞的样品、包括怀疑含有细胞的样品、特别是全血、血浆或血清中包含的细胞外核酸群体稳定，从而使这样的样品的操作或相应的处理更加容易（例如通过避免从全血直接分离血浆的需要或避免冷却或甚至冷冻分离的血浆的需要），从而也使这样的样品中包含的细胞外核酸的分离和测试更加可靠，并因此提高细胞外核酸的诊断和预后能力。具体来说，对用于保护全血样品中的细胞外核酸，以例如用于产前检测和/或用于肿瘤、尤其是恶变前疾病或恶性疾病的筛查的解决方案，存在着持续不断的需求。

本发明的目的是克服现有技术的样品稳定化方法的至少一种缺点。因此，本发明的目的之一是提供一种能够使含细胞的样品、特别是全血稳定的方法。具体来说，本发明的目的是使生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定，尤其是避免细胞外核酸群体被基因组DNA、尤其是片段化基因组DNA污染。此外，本发明的目的尤其是提供一种方法，所述方法适合于即使在室温下也使生物样品、优选为全血样品稳定，优选稳定至少两天、优选地至少三天的时间段。此外，本发明的目的是提供能够有效地使生物样品、尤其是样品中包含的细胞外核酸群体稳定的样品收集容器、尤其是血液收集管。

发明内容

本发明是基于以下这一发现：在使包含细胞外核酸的含细胞的生物样品、尤其是全血样品或源自于全血的样品例如血浆稳定方面，某些添加剂是令人吃惊地有效的。已发现，这些添加剂在使细胞外核酸群体稳定方面高度有效，尤其是能够避免或至少显著减少基因组DNA、尤其是片段化基因组DNA的污染。

根据第一方面，提供了一种适用于使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法，其中将样品与下列物质相接触：

a）至少一种凋亡抑制剂，

b）至少一种高渗剂，其使所述样品中包含的细胞稳定，和/或

c）至少一种式1的化合物

其中R1是氢基团或烷基基团、优选为C1-C5烷基基团、更优选为甲基基团，R2和R3是相同或不同的以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基团，并且R4是氧、硫或硒基团。

根据第一子方面，提供了适用于使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法，其中将所述样品与至少一种凋亡抑制剂相接触。优选地，所述含细胞的样品选自全血、血浆或血清。令人吃惊的是，发现凋亡抑制剂减少所述细胞外核酸群体被源自于样品中包含的细胞、例如源自于损伤或死亡的细胞的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA污染。此外，本发明人发现，凋亡抑制剂减少样品中存在的核酸的降解。因此，本发明使用凋亡抑制剂进行的稳定化，具有使样品中包含的细胞外核酸群体基本上保持其在获得或相应地收集生物样品时所显示出的状态的效果。

根据第二子方面，提供了适用于使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法，其中将样品与至少一种能够使样品中包含的细胞稳定的高渗剂相接触。令人吃惊地发现，由轻度高渗效应（渗透作用）诱导的细胞皱缩导致细胞稳定性的大幅提高。通过提高细胞稳定性，高渗剂尤其减少了细胞内核酸、尤其是基因组DNA从包含的细胞释放到样品的细胞外部分或区室中。因此，本发明使用高渗剂进行的稳定化，具有使样品中包含的细胞外核酸群体基本上保持其在获得或相应地收集生物样品时所显示出的状态的效果。

根据本发明的第三子方面，提供了适用于使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法，其中将样品与至少一种式1的化合物相接触

其中R1是氢基团或烷基基团、优选为C1-C5烷基基团、更优选为甲基基团，R2和R3是相同或不同的以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基团，并且R4是氧、硫或硒基团。已发现，添加相应的化合物对细胞外核酸群体具有有利的稳定化效果。

根据第四子方面，提供了适用于使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法，其中将样品与下述物质相接触

a）至少一种凋亡抑制剂，以及

b）至少一种高渗剂，其使所述样品中包含的细胞稳定。

已发现，这些稳定剂（和任选地其他添加剂）的组合，对于抑制细胞内核酸、尤其是基因组DNA从包含的细胞释放到样品的细胞外部分中来说是明显有效的。此外，据显示，高度有效地防止了样品中存在的核酸的降解。具体来说，在相应稳定化的样品中存在更少的片段化基因组DNA。因此，本发明使用稳定添加剂的这种组合进行的稳定化，具有使样品中包含的细胞外核酸群体基本上并有效地保持其在获得或相应地收集（例如在血液的情况下，抽取）生物样品时所显示出的状态的效果，尤其是减少细胞外核酸群体被片段化基因组DNA污染的效果。

为了增强对细胞外核酸的稳定化效果，本发明的目的还包括提供稳定剂的其他组合，以便使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定。相应的组合可以包含如上定义的至少一种凋亡抑制剂、至少一种高渗剂和/或至少一种式1的化合物，例如（1）如上定义的至少一种凋亡抑制剂与至少一种式1的化合物的组合，（2）至少一种高渗剂与至少一种式1的化合物的组合，或（3）所有三种稳定剂，即至少一种凋亡抑制剂、至少一种高渗剂和至少一种式1的化合物的组合。相应的组合还可以包含增强稳定化效果的其他添加剂，例如螯合剂。在样品是血液或源自于血液的样品的情况下，通常还添加抗凝剂。螯合剂例如EDTA适用于这一目的。根据第五子方面，相应的稳定化组合可以被有利地用在本发明的第一方面的适用于使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法中。

根据第二方面，提供了用于从生物样品分离细胞外核酸的方法，其中所述方法包括下列步骤：

a）按照本发明的第一方面中定义的方法使样品中包含的细胞外核酸群体稳定；以及

b）从所述样品分离细胞外核酸。

步骤a）中的稳定化可以例如按照如上所述的本发明的第一方面的五个子方面之一来实现。正如上面讨论的，本发明的稳定化具有使样品中包含的细胞外核酸群体基本上保持其在获得或相应地收集生物样品时所显示出的状态的效果。因此，从相应稳定化的样品获得的细胞外核酸与从未稳定化的样品获得的细胞外核酸相比，包含的由例如样品内包含的衰退细胞产生的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA的污染更少。细胞外核酸群体的显著保护是一个重要的优点，因为这种稳定化/保护提高了任何后续试验的准确性。这允许使细胞外核酸群体的分离和后续分析标准化，从而使基于细胞外核酸级分的诊断或预后应用更加可靠并更加不依赖于所使用的储存/操作条件。因此，提高了相应分离的细胞外核酸的诊断和预后适用性。具体来说，本发明的教导具有下述优点，即，某些细胞外核酸分子的比率与样品被收集时的比率相比，可以保持基本上恒定。稳定化使得细胞内核酸基本上被保持在细胞内并且使细胞外核酸基本上被稳定化。

根据第三方面，提供了适用于使含细胞的生物样品稳定的组合物，所述组合物包含：

a）至少一种凋亡抑制剂，优选为半胱天冬酶（caspase）抑制剂；和/或

b）至少一种适合于使样品中包含的细胞稳定的高渗剂，优选为羟基化有机化合物；和/或

c）如上定义的至少一种式1的化合物；和/或

d）任选地，至少一种抗凝剂，优选为螯合剂。

通过使含细胞的生物样品、尤其是全血、血浆和/或血清中包含的细胞和细胞外核酸群体稳定，相应的稳定化组合物在使所述样品稳定方面特别有效。优选地，稳定化组合物中存在a）至c）中定义的稳定剂中的至少两种，更优选地存在a）至c）中定义的所有稳定剂。相应的稳定化组合物允许样品例如全血在室温下储存和/或操作例如运输至少两天，或优选地至少三天，而基本上不损害所述样品或相应地其中包含的细胞外核酸群体的质量。因此，当使用本发明的稳定化组合物时，样品收集例如血液收集与核酸提取之间的时间可以变化，而对样品中包含的细胞外核酸群体没有显著影响。这是一个重要的优点，因为它降低了由不同操作程序造成的细胞外核酸群体的可变性。

根据第四方面，提供了用于收集含细胞的生物样品、优选为血液样品的容器，其中所述容器包含本发明的第三方面的组合物。提供包含所述稳定化组合物的相应容器例如样品收集管，具有一旦将样品收集在相应容器中后就立即使样品稳定的优点。此外，相应的样品收集容器、尤其是血液收集管，能够使血液样品或源自于血液的样品中包含的血细胞和细胞外核酸以及任选地病毒或相应的病毒核酸稳定。因此，克服了进一步的问题。

根据第五方面，提供了一种方法，所述方法包括将生物样品、优选为血液从患者直接收集、优选地抽取到本发明的第四方面的容器的腔室中的步骤。

根据第六方面，提供了生产本发明的第三方面的组合物的方法，其中将所述组合物的组分混合，优选地在溶液中混合。当在本文中使用时，术语“溶液”具体是指液体组合物，优选为水性组合物。它可以是仅仅一种相的均匀混合物，但是包含固体组分例如沉淀物的溶液也落在本发明的范围之内。

对于本领域技术人员来说，根据下面的描述和权利要求书，本发明的其他目的、特征、优点和方面将变得明显。然而，应该理解，下面的描述、权利要求书和具体实施例，尽管指出了本申请的优选实施方式，但是仅仅是为了说明而给出的。对于本领域技术人员来说，在阅读了下文后，落在所公开的发明的精神和范围之内的各种改变和修改将变得显而易见。

附图说明

图1a示出了从用半胱天冬酶抑制剂处理的样品分离的DNA在芯片电泳后的凝胶图片（实施例1）。

图1b是示出了半胱天冬酶抑制剂对血浆中核糖体18S DNA的增加的影响的图（实施例1）。

图2a示出了从用不同浓度的半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPH组合处理的样品分离的DNA在芯片电泳后的凝胶图片（实施例2）。

图2b是示出了不同浓度的半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPH与葡萄糖的组合对血浆中核糖体18S DNA的增加的影响的图（实施例2）。

图3示出了用溶解在不同缓冲液中的二羟基丙酮处理的血细胞的由流式细胞术测量到的血细胞完整性（实施例3）。

图4a示出了从用溶解在不同缓冲液中的二羟基丙酮处理的样品分离的DNA在芯片电泳后的凝胶图片（实施例3）。

图4b是示出了二羟基丙酮对核糖体18S DNA的增加的影响的图（实施例3）。

图5示出了用不同浓度的二羟基丙酮处理的血细胞的由流式细胞术测量到的血细胞完整性（实施例4）。

图6a示出了从用不同浓度的二羟基丙酮处理的样品分离的DNA在芯片电泳后的凝胶图片（实施例4）。

图6b是示出了不同浓度的二羟基丙酮对核糖体18S DNA的增加的影响的图（实施例4）。

图7a示出了用升高的K₂EDTA、Q-VD-OPH和DHA的组合处理的血细胞的由流式细胞术测量到的血细胞完整性（实施例5）。

图7b是示出了EDTA、DHA和Q-VD-OPH的组合对18S DNA的增加的影响的图（实施例5）。

图8是示出了EDTA、DHA和Q-VD-OPH的组合对血浆中游离的循环mRNA的转录水平的影响的图（实施例6）。

图9是示出了不同浓度的DMAA对血浆中核糖体18S DNA的增加的影响的图。

图10是示出了不同的糖醇对18S rDNA的增加的影响的图（实施例8）。

图11是示出了物质对18S rDNA的增加的影响的图（实施例9）。

图12是示出了物质对18S rDNA的增加的影响的图（实施例10）。

图13是示出了物质对18S rDNA的增加的影响的图（实施例11）。

图14是示出了物质对18S rDNA的增加的影响的图（实施例11）。

图15是示出了物质对18S rDNA的增加的影响的图。

图16是示出了在37℃下温育长达6天的全血的血浆级分中ccfDNA的增加的图（实施例13）。

图17是示出了在37℃下温育长达6天的全血的血浆级分中ccfDNA的增加的图（实施例13）。

图18是示出了掺入的DNA片段的命中百分数的图（实施例14）。

图19是示出了平均拷贝数的图（实施例14）。

图20是示出了与BD Vacutainer K2E相比的18S百分数的图（实施例14）。

图21是示出了在37℃下在全血中温育的、从血浆纯化的HIV的减少的图（实施例15）。

图22是示出了在37℃下在全血中温育的、从血浆纯化的HCV的减少的图（实施例15）。

图23是示出了丙酰胺对供体1的18S rDNA增加的影响的图（实施例16）。

图24是示出了丙酰胺对供体2的18S rDNA增加的影响的图（实施例16）。

具体实施方式

本发明涉及适用于使含细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法、组合物和装置，并因此涉及适用于使所述细胞外核酸群体稳定的技术。本文公开的稳定化技术降低了细胞外核酸群体被源自于、例如释放自样品中包含的损伤和/或死亡的细胞的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA污染的风险。因此，本发明实现了样品的稳定化并因此实现了其中包含的细胞外核酸群体的稳定化，而没有使包含的细胞裂解。相反，样品中包含的细胞被稳定化，从而基本上防止或减少了细胞内核酸的释放。使用本发明的方法和组合物实现的显著的稳定化，允许在室温下长期储存和/或操作稳定化的样品，而不损害样品或相应地其中包含的细胞外核酸的质量。由于通过使用本发明的教导使获得样品时细胞外核酸群体的组成稳定并因此受到显著保护，因此样品收集与核酸提取之间的时间可以变化，而不显著影响细胞外核酸群体的组成。由于样品操作/储存中的变化性对细胞外核酸群体的质量或相应地组成具有较小影响，因此，这允许使例如诊断或预后性细胞外核酸分析标准化，从而提供了超过现有技术方法的重要优点。因此，样品或相应地从相应稳定化的样品获得的细胞外核酸变得更加可比。此外，本发明的教导消除了将样品中包含的细胞与样品的无细胞部分直接分离开以便避免或相应地减少细胞外核酸被原本从衰退细胞释放的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA污染的必要性。这一优点大幅简化了样品操作，尤其是全血样品的操作。例如，在诊所中获得并按照本发明的教导稳定化的全血样品可以在室温下运输，并且可以在接收的临床实验室中方便地分离含有细胞外核酸的血浆。然而，当处理细胞贫化的生物样品或通常被称为“无细胞的”样品例如血浆或血清时，本发明的教导也是有利的。相应的细胞贫化的生物样品或“无细胞的”生物样品可能仍然（也取决于所使用的分离方法）包含残留的细胞、尤其是包含基因组DNA的白细胞，这因此造成了下述风险：即，如果（潜在）残留的细胞在储存过程的运输期间损伤或死亡，则细胞外核酸群体将变得被细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA越来越多地污染。当使用本发明教导的稳定化方法时，这种风险被大幅降低。由于本发明的技术允许在样品被收集并与稳定剂相接触时有效地保护样品的细胞外核酸群体，因此所述样品可以在接收机构中正确发挥作用，以便从所述样品分离细胞外核酸，同时基本上避免或相应地减少细胞外核酸群体被细胞内核酸污染。接收样品的机构例如实验室通常也具有必需的设备例如高速离心机（或其他手段，也参见下文），以有效地去除样品中包含的细胞，包括细胞贫化的样品例如血浆中可能存在的残留细胞。在获得样品的机构中通常不存在这样的设备。因此，当使包含大量细胞的生物样品例如全血样品稳定时，本发明具有许多优点，但是当使仅包含少量细胞或可能仅仅是怀疑含有细胞的生物样品例如血浆、血清、尿液、唾液、滑液、羊水、泪液、脓液、淋巴液、液剂（liquor）、脑脊液等稳定时，本发明也具有重要优点。

根据第一方面，提供了一种适用于使含细胞的样品、优选为血液样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法，所述方法包括将样品与下列物质相接触：

a）至少一种凋亡抑制剂，和/或

b）至少一种高渗剂，其使所述样品中包含的细胞稳定，和/或

c）至少一种式1的化合物

其中R1是氢基团或烷基基团、优选为C1-C5烷基基团、更优选为甲基基团，R2和R3是相同或不同的以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基团，并且R4是氧、硫或硒基团。

由此，细胞外核酸群体被源自于所包含的细胞、例如源自于损伤或死亡的细胞的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA污染的风险被降低，和/或样品中存在的核酸的降解被减少或相应地抑制。这具有使所述样品中包含的细胞外核酸群体的组成基本上得以保持或相应地稳定化的效果。

当在本文中使用时，术语“细胞外核酸”具体是指未被包含在细胞中的核酸。相应的细胞外核酸通常也被称为无细胞核酸。这些术语在本文中作为同义词使用。因此，细胞外 核酸通常存在于样品内细胞的外部或多个细胞的外部。术语“细胞外核酸”是指例如细胞外RNA以及细胞外DNA。生物样品例如体液如血浆的无细胞级分（相应地部分）中存在的典型的细胞外核酸的实例包括但不限于哺乳动物细胞外核酸例如细胞外肿瘤相关或肿瘤来源的DNA和/或RNA、其他细胞外疾病相关的DNA和/或RNA、表观遗传学修饰的DNA、胎儿DNA和/或RNA、小干扰RNA例如miRNA和siRNA，以及非哺乳动物细胞外核酸例如从例如原核生物（例如细菌）、病毒、真核寄生虫或真菌释放到细胞外核酸群体中的病毒核酸、病原体核酸。根据一种实施方式，细胞外核酸获自或被相应地包含在作为含细胞的生物样品的体液中，例如血液、血浆、血清、唾液、尿液、液剂、脑脊液、痰液、泪液、汗液、羊水或淋巴液。在本文中，我们将从循环体液获得的细胞外核酸称为循环的细胞外核酸或循环的无细胞核酸。根据一种实施方式，术语细胞外核酸具体是指哺乳动物细胞外核酸、优选为疾病相关的细胞外核酸或疾病来源的细胞外核酸，例如肿瘤相关的细胞外核酸或肿瘤来源的细胞外核酸、由于炎症或损伤、尤其是创伤而释放的细胞外核酸、与其他疾病相关和/或由于其他疾病而释放的细胞外核酸、或源自于胎儿的细胞外核酸。本文中描述的术语“细胞外核酸”还指从其他样品、尤其是除了体液之外的生物样品获得的细胞外核酸。通常，样品中包含超过一种的细胞外核酸。通常，样品包含超过一种类型或种类的细胞外核酸。当在本文中使用时，术语“细胞外核酸群体”具体是指含细胞的样品中包含的不同细胞外核酸的集合体。含细胞的样品通常包含特征性并因此独特的细胞外核酸群体。因此，特定样品的细胞外核酸群体中包含的一种或多种细胞外核酸的类型、种类和/或量是重要的样品特征。因此，正如上面讨论的，重要的是使所述细胞外核酸群体稳定并因此基本上保护所述细胞外核酸群体，因为样品的细胞外核酸群体中包含的一种或多种细胞外核酸的组成和/或量可以在医学、预后或诊断领域中提供有价值的信息。具体来说，重要的是在收集样品后，减少细胞外核酸群体被细胞内核酸、尤其是基因组DNA污染和由此产生的稀释。可以使用本发明的稳定化技术实现的细胞外核酸群体的显著保护，允许与样品稳定化那一刻的细胞外核酸群体相比，样品内的细胞外核酸群体在稳定化期间维持基本上不变。至少，与未稳定化的样品或在血液样品或源自于血液的样品的情形中用例如EDTA稳定化的相应样品相比，在所包含的细胞外核酸的数量、质量和/或组成方面，细胞外核酸群体的变化、尤其是由释放的基因组DNA的增加造成的变化在稳定化期间大幅降低（优选地降低至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%）。

根据所述第一方面的第一子方面，使用至少一种凋亡抑制剂来使样品稳定。正如提供的实施例所示，单独的凋亡抑制剂已经能够有效地使含细胞的样品稳定并基本上保护细胞外核酸群体免于尤其是由片段化基因组DNA的污染引起的组成变化。可以将样品与凋亡抑制剂相接触，例如通过向样品加入凋亡抑制剂，反之亦然。得到的混合物中存在的至少一种凋亡抑制剂支持样品中包含的细胞的稳定化并抑制样品中包含的核酸的降解，从而基本上保护细胞外核酸群体。

当在本文中使用时，术语“凋亡抑制剂”具体是指其在含细胞的生物样品中的存在提供了细胞内凋亡过程的减少、防止和/或抑制，和/或使细胞更耐受凋亡刺激的化合物。凋亡抑制剂包括但不限于蛋白质、肽或类似于蛋白质或肽的分子、有机分子和无机分子。凋亡抑制剂包括起到以下作用的化合物：代谢抑制剂，核酸降解的抑制剂或相应地核酸途径的抑制剂，酶抑制剂，尤其是半胱天冬酶抑制剂、钙蛋白酶抑制剂和参与凋亡过程的其他酶的抑制剂。相应的凋亡抑制剂列于表1中。优选地，用于使含细胞的生物样品稳定的至少一种凋亡抑制剂选自代谢抑制剂、半胱天冬酶抑制剂和钙蛋白酶抑制剂。每种类型的适合的实例被列在表1中相应类别中。优选地，凋亡抑制剂是可透过细胞的。

使用来自于相同或不同凋亡抑制剂类型的不同凋亡抑制剂的组合，或相应地使用通过相同或不同的作用机制抑制凋亡的不同凋亡抑制剂的组合，也在本发明的范围之内。

在本发明的有利实施方式中，凋亡抑制剂是半胱天冬酶抑制剂。半胱天冬酶基因家族的成员在凋亡中发挥重要作用。为了开发成功地竞争半胱天冬酶结合的肽，已研究了各个半胱天冬酶的底物偏好性或特异性。通过将半胱天冬酶特异性肽偶联于例如醛、腈或酮化合物，可以产生半胱天冬酶激活的可逆或不可逆抑制剂。例如，氟甲基酮（FMK）衍生的肽例如Z-VAD-FMK起到有效的不可逆抑制剂的作用，并且没有附加的细胞毒性效应。在N-端和O-甲基侧链处具有苯甲氧基羰基（BOC）的合成的抑制剂表现出增强的细胞渗透性。此外，还合成了在C-端处具有苯氧基的适合的半胱天冬酶抑制剂。一个实例是Q-VD-OPh，其是可透过细胞的不可逆广谱半胱天冬酶抑制剂，在防止凋亡方面甚至比Z-VAD-FMK更有效。

根据一种实施方式，半胱天冬酶抑制剂是泛半胱天冬酶（pancaspase）抑制剂，并因此是广谱半胱天冬酶抑制剂。根据一种实施方式，半胱天冬酶抑制剂包含修饰的半胱天冬酶特异性肽。优选地，用醛、腈或酮化合物对所述半胱天冬酶特异性肽进行修饰。根据优选实施方式，半胱天冬酶特异性肽优选地在羧基端用O-苯氧基或氟甲基酮（FMK）基团进行修饰。根据一种实施方式，半胱天冬酶抑制剂选自Q-VD-OPh和Z-VAD(OMe)-FMK。在一种实施方式中，使用泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD(OMe)-FMK，其是竞争性的不可逆肽抑制剂并阻断半胱天冬酶-1家族和半胱天冬酶-3家族的酶。在优选实施方式中，使用Q-VD-OPh，其是半胱天冬酶的广谱抑制剂。Q-VD-OPh是可透过细胞的，并抑制由凋亡引起的细胞死亡。Q-VD-OPh即使在极高浓度下也对细胞无毒，并由结合到氨基酸缬氨酸和天冬氨酸的羧基端苯氧基构成。它在防止由三种主要凋亡途径即半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10以及半胱天冬酶-12介导的凋亡中是同等有效的（Caserta等，2003）。其他的半胱天冬酶抑制剂列于表1中。根据一种实施方式，作为凋亡抑制剂用于使含细胞的样品稳定的半胱天冬酶抑制剂是作用在位于细胞的细胞内细胞死亡途径下游的一种或多种半胱天冬酶例如半胱天冬酶-3上的抑制剂。在本发明的一种实施方式中，半胱天冬酶抑制剂是一种或多种选自以下的半胱天冬酶的抑制剂：半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10和半胱天冬酶-12。使用半胱天冬酶抑制剂的组合也在本发明的范围之内。

将生物样品与至少一种凋亡抑制剂混合后获得的混合物可以包含浓度选自以下的凋亡抑制剂（或凋亡抑制剂的组合）：至少0.01μM、至少0.05μM、至少0.1μM、至少0.5μM、至少1μM、至少2.5μM或至少3.5μM。当然，也可以使用更高的浓度。对于凋亡抑制剂来说，当与含细胞的生物样品混合时，适合的浓度范围包括但不限于0.01μM至100μM、0.05μM至100μM、0.1μM至50μM、0.5μM至50μM、1μM至40μM、更优选地1μM至30μM或2.5μM至25μM。已发现浓度越高越有效，但是在较低浓度也获得了良好的稳定结果。因此，在较低浓度下，例如在选自0.1μM至10μM、0.5μM至7.5μM或1μM至5μM的范围内，也获得了有效的稳定化，尤其是如果将凋亡抑制剂与高渗剂（参见下文）组合使用的话。上述浓度适用于使用单一凋亡抑制剂以及使用半胱天冬酶抑制剂的组合。如果使用半胱天冬酶抑制剂的组合，所述凋亡抑制剂混合物中使用的各个凋亡抑制剂的浓度也可以低于上述浓度，如果凋亡抑制剂的组合的总浓度满足上述特征的话。使用仍然能够有效地使细胞稳定和/或减少样品中存在的核酸的降解的较低浓度，具有可以降低稳定化成本的优点。例如，如果将凋亡抑制剂与本文中所描述的一种或多种稳定剂组合使用，可以使用较低浓度。当使用半胱天冬酶抑制剂、尤其是修饰的半胱天冬酶特异性肽例如Q-VD-OPh和/或Z-VAD(OMe)-FMK作为凋亡抑制剂时，上述浓度是特别适合的。上述浓度非常适合于例如使全血、尤其是10ml血液稳定。对于其他凋亡抑制剂和/或其他含细胞的生物样品来说适合的浓度范围，可以由本领域技术人员使用常规实验来确定，例如通过在实施例中所描述的试验测定法中测试凋亡抑制剂以及相应地不同浓度。

根据一种实施方式，有效量的凋亡抑制剂使含细胞的生物样品中的凋亡与不含相应凋亡抑制剂的对照样品相比减少或降低至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、优选地至少75%、更优选地至少85%。

根据本发明的第一方面的第二子方面，使用至少一种高渗剂来使样品稳定，其中所使用的高渗剂使样品中包含的细胞稳定。正如由提供的实施例所示，单独的高渗剂已经能够有效地使含细胞的样品稳定并基本上保持其中包含的细胞外核酸群体的组成。高渗剂通过轻度高渗效应（渗透作用）诱导细胞皱缩，由此提高细胞稳定性。因此，细胞不太容易发生例如机械诱导的细胞损伤。可以将样品与高渗剂相接触，例如通过向样品加入高渗剂，反之亦然。具体来说，得到的混合物中存在的高渗剂适合于使样品中包含的细胞稳定，由此减少从损伤的细胞释放的细胞内核酸、尤其是基因组DNA的量。由此，细胞外核酸群体基本上得到保护，并且降低了细胞内核酸、尤其是基因组DNA污染或相应地稀释细胞外核酸的风险。

根据一种实施方式，高渗剂具有足够渗透活性以诱导细胞皱缩（细胞释放水），然而不破坏细胞，即不诱导或促进细胞裂解或相应的细胞破碎。因此，高渗剂优选地具有轻度渗透效应。此外，希望高渗剂与样品之间的相互作用主要限于细胞稳定化效应，以便基本上避免不想要的副作用。因此，根据一种实施方式，使用不带电荷的高渗剂。使用不带电荷的高渗剂具有以下优点：尽管由于高渗剂的渗透效应而使细胞皱缩被相应地稳定，但与使用带电荷的高渗剂相比，高渗剂与样品中包含的其他化合物之间的相互作用受到限制。

根据有利的实施方式，高渗剂是羟基化有机化合物，并因此带有至少一个羟基。根据一种实施方式，羟基化有机化合物包含至少两个羟基。根据一种实施方式，羟基化有机化合物是多元醇。根据一种实施方式，所述多元醇包含2至10个羟基、优选地3至8个羟基。羟基化有机化合物可以包含2至12个碳原子、优选地3至8个碳原子，并且可以是环状分子或者支链或非支链的线性分子；它可以是饱和或不饱和的，芳香族或非芳香族的。根据一种实施方式，羟基化有机化合物是羟基-羰基化合物。羟基-羰基化合物是具有一个或多个羟基（OH）和一个或多个羰基的化合物。羟基化有机化合物可以包括但不限于羟基化酮化合物和糖类或由所述羟基化酮化合物和糖类衍生的化合物。根据一种实施方式，羟基化有机化合物是多元醇、尤其是糖醇。因此，羟基化有机化合物包括但不限于糖类例如葡萄糖、棉籽糖、蔗糖、果糖、α-d-乳糖单水合物、肌醇、麦芽糖醇、甘露糖醇、二羟基丙酮，醇例如甘油、赤藓糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、倭勒米糖醇（volemitol）或糖醇。适合的实例也列于下面的表中。使用相应的羟基化有机化合物的组合也在本发明的范围之内。

根据一种实施方式，上面列出的多元醇和糖醇可以用具有较少羟基的醇（例如己-1,2,3,4,5-五醇、戊-1,2,3,4-四醇）代替。根据一种实施方式，羟基化有机化合物不是具有1至5个碳原子并仅带有一个羟基的醇。根据一种实施方式，排除仅具有一个羟基的醇作为羟基化有机化合物。可以用作本发明的稳定剂的羟基化有机化合物优选地是水溶的，并对待稳定的生物样品中包含的细胞无毒。优选地，羟基化有机化合物不诱导或支持生物样品中包含的细胞的裂解，并且因此优选地不起到去污剂或细胞膜溶解剂的作用。本发明的适合的羟基化有机化合物通过改善对细胞外核酸群体的组成的保护来获得含细胞的样品的稳定化效应，正如可以例如通过实施例部分中描述的测定法所测试的。

向含细胞的生物样品例如全血添加羟基化有机化合物，提高了所述羟基化有机化合物在无细胞部分或相应地级分（例如血浆）中的浓度，从而作为渗透（高渗）效应的结果迫使血细胞将水释放到血浆中。根据一种实施方式，使用与细胞代谢的产物密切相关但是优选地不能被细胞利用的羟基化有机化合物。

根据优选实施方式，生物样品中包含的细胞对用于稳定化的高渗剂是基本上不可透过的。因此，高渗剂，优选为上面详细描述的羟基化有机化合物，是基本上不可透过细胞的。就此而言，基本上不可透过细胞具体来说意味着高渗剂、优选为羟基化有机化合物在样品的细胞外部分中的浓度基本上高于在按照本发明的教导稳定化的生物样品中包含的细胞内的浓度。根据优选实施方式，高渗剂、优选为羟基化有机化合物是无毒的，使得细胞生存性不受损。为了避免对细胞代谢的扰乱性影响，这是优选的。

根据一种实施方式，高渗剂是二羟基丙酮（DHA）。DHA是一种糖，并通常在自晒黑乳液中起到晒黑物质的作用。正如由实施例所证实的，DHA令人吃惊地对含细胞的生物样品、尤其是全血样品和源自于全血的样品例如血浆或血清具有显著的稳定化效果。除了DHA的磷酸酯、即磷酸二羟基丙酮这种糖酵解的中间产物之外，DHA不在哺乳动物细胞中天然存在。因此，据预期，DHA不被主动运输或扩散到血细胞中。根据一种实施方式，高渗剂不是磷酸二羟基丙酮。

当将含细胞的生物样品与至少一种高渗剂相接触时获得的混合物可以包含浓度为至少0.05M、优选地0.1M、优选地至少0.2M、更优选地至少0.25M的高渗剂或高渗剂混合物。当然，也可以使用更高的浓度。高渗剂的适合的浓度范围可以选自0.05M至2M、0.1M至1.5M、0.15M至0.8M、0.2M至0.7M或0.1M至0.6M。当使用羟基化有机化合物例如糖类如二羟基丙酮作为高渗剂时，相应的浓度是特别适合的。上面提到的浓度非常适合于例如使全血、尤其是10ml血液稳定。对于其他高渗剂和/或其他含细胞的生物样品来说适合的浓度范围，也可以由本领域技术人员使用常规实验来确定，例如通过在实施例中所描述的试验测定法中测试高渗剂及其相应的不同浓度。

根据本发明的第一方面的第三子方面，为了使含细胞的样品中的细胞外核酸群体稳定，使用至少一种式1的化合物

其中R1是氢基团或烷基基团、优选为C1-C5烷基基团、更优选为甲基基团，R2和R3是相同或不同的以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基团，并且R4是氧、硫或硒基团。

正如由提供的实施例所示的，上述式1的化合物能有效地获得显著的稳定化效果并基本上保持稳定化的样品中细胞外核酸群体的组成。一种或多种式1的化合物的混合物也可用于稳定化。

烃基团R2和/或R3可以彼此独立地选自包括短链烷基和长链烷基在内的烷基、烯基、烷氧基、长链烷氧基、环烷基、芳基、卤代烷基、烷基甲硅烷基、烷基甲硅烷基氧基、亚烷基、烯二基、亚芳基、羧酸化物和羰基。在说明书和权利要求书中限定并描述了通用基团例如烷基、烷氧基、芳基等。优选地，在本发明的范围内，在一般性描述的基团内使用下列基团：

（1）烷基：优选为短链烷基，尤其是直链和支链C1-C5烷基，或长链烷基：直链和支链C5-C20烷基；

（2）烯基：优选为C2-C6烯基；

（3）环烷基：优选为C3-C8环烷基；

（4）烷氧基：优选为C1-C6烷氧基;

（5）长链烷氧基：优选为直链和支链C5-C20烷氧基；

（6）亚烷基：优选为具有2至18个碳原子并任选地含有杂原子的二价直链或支链脂族、环脂族或芳香族烃基团，例如选自：亚甲基；1,1-亚乙基；1,1-亚丙基；1,2-亚丙基；1,3-亚丙基；2,2-亚丙基；丁-2-醇-1,4-二基；丙-2-醇-1,3-二基；1,4-亚丁基；1,4-亚戊基；1,6-亚己基；1,7-亚庚基；1,8-亚辛基；1,9-亚壬基；1,10-亚癸基；1,11-亚十一基；1,12-亚十二基；环己-1,1-二基；环己-1,2-二基；环己-1,3-二基；环己-1,4-二基；环戊-1,1-二基；环戊-1,2-二基；和环戊-1,3-二基；

（7）烯二基：优选地选自：1,2-丙烯二基；1,2-丁烯二基；2,3-丁烯二基；1,2-戊烯二基；2,3-戊烯二基；1,2-己烯二基；2,3-己烯二基；和3,4-己烯二基；

（8）炔二基：等于-C≡C-|；

（9）芳基：优选地选自分子量低于300Da的芳香族化合物；

（10）亚芳基：优选地选自：1,2-亚苯基；1,3-亚苯基；1,4-亚苯基；1,2-亚萘基；1,3-亚萘基；1,4-亚萘基；2,3-亚萘基；1-羟基-2,3-亚苯基；1-羟基-2,4-亚苯基；1-羟基-2,5-亚苯基；1-羟基-2,6-亚苯基；

（11）羧酸化物：优选为–C(O)OR基团，其中R选自：氢；C1-C6烷基；苯基；C1-C6烷基-C6H5；Li；Na；K；Cs；Mg；Ca；

（12）羰基：优选为–C(O)R基团，其中R选自：氢；C1-C6烷基；苯基；C1-C6烷基-C6H5和选自-NR’2的胺（产生酰胺），其中每个R’独立地选自：氢；C1-C6烷基；C1-C6烷基-C6H5和苯基，其中如果两个R表示C1-C6烷基，则它们可以形成NC3至NC5杂环，其中环的烷基取代基形成其他烷基链；

（13）烷基甲硅烷基：优选为–SiR1R2R3基团，其中R1、R2和R3彼此独立地选自：氢；烷基；长链烷基；苯基；环烷基；卤代烷基；烷氧基；长链烷氧基；

（14）烷基甲硅烷基氧基：优选为–O-SiR1R2R3基团，其中R1、R2和R3彼此独立地选自：氢；烷基；长链烷基；苯基；环烷基；卤代烷基；烷氧基；长链烷氧基。

R2和/或R3的链长n具体来说可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的值。优选地，R2和R3具有1-10的碳链长度。在这种情况下，链长n具体来说可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的值。优选地，R2和R3具有1-5的碳链长度，并且在这种情况下，链长具体来说可以具有1、2、3、4和5的值。对于R2和R3来说，特别优选的是1或2的链长。

R1的链长n优选地具有1、2、3、4或5的值。对于R1来说，特别优选的是1或2的链长。

R4优选地是氧。

根据优选实施方式，式1的化合物是N,N-二烷基-羧酸酰胺。优选的R1、R2、R3和R4基团如上所述。根据一种实施方式，化合物选自N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二乙基甲酰胺。还适合的是N,N-二烷基丙酰胺例如N,N-二甲基丙酰胺，正如在实施例中示出的。优选地，式1的物质是N,N-二甲基乙酰胺（DMAA）。优选化合物的结构式如下：

包含硫而不是氧作为R4的相应的硫代类似物也是适合的。

当将含细胞的生物样品与式1的化合物或相应化合物的混合物相接触时获得的混合物可以包含终浓度为至少0.1%、至少0.5%、至少0.75%、至少1%、至少1.25%或至少1.5%的所述化合物或化合物的混合物。适合的浓度范围包括但不限于0.1%直至50%。优选的浓度范围可以选自0.1%至30%、0.1%至20%、0.1%至15%、0.1%至10%、0.1%至7.5%、0.1%至5%、1%至30%、1%至20%、1%至15%、1%至10%、1%至7.5%、1%至5%、1.25%至30%、1.25%至20%、1.25%至15%、1.25%至10%、1.25%至7.5%、1.25%至5%、1.5%至30%、1.5%至20%、1.5%至15%、1.5%至10%、1.5%至7.5%和1.5%至5%。当使用N,N-二烷基-羧酸酰胺例如N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、N,N-二乙基甲酰胺或N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基丙酰胺作为稳定剂时，相应的浓度是特别适合的。上面提到的浓度非常适合于例如使全血或血液制品例如血浆稳定。对于其他式1的化合物和/或其他含细胞的生物样品来说适合的浓度范围，也可以由本领域技术人员使用常规实验来确定，例如通过在实施例中所描述的试验测定法中测试所述化合物及其相应的不同浓度。

优选地，将式1的化合物与用于使含细胞的样品稳定的螯合剂组合使用。具体来说，在使血液样品或源自于血液的样品例如血浆或血清稳定时，螯合剂可以被用作抗凝剂。下面提供了适合的螯合剂和浓度范围。

根据优选的第四子方面，提供了适用于使含细胞的样品、优选为血液样品稳定的方法，其中所述方法包括将样品与下列物质相接触：

a）至少一种凋亡抑制剂，和

b）至少一种高渗剂，其使样品中包含的细胞稳定。

因此，根据该优选实施方式，将单独使用时已经在使含细胞的样品稳定方面有效的凋亡抑制剂和高渗剂（参见上文和实施例）组合使用。由此，可以提高稳定化效果和/或也可以降低各个组分（凋亡抑制剂和/或高渗剂）的浓度，同时仍有效地保护样品中的细胞外核酸群体，尤其是避免或相应地减少从样品中包含的损伤或衰退的细胞释放的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA的污染。正如在实施例中示出的，使用相应的组合在使含细胞的样品、甚至是非常复杂的样品例如全血样品稳定方面都特别有效。使用与不同高渗剂组合的不同凋亡抑制剂的混合物也在本发明的范围之内。凋亡抑制剂和高渗剂的适合和优选的实施方式以及适用于实现样品的有效稳定化的相应试剂的适合和优选的浓度已在上面结合使用凋亡抑制剂或高渗剂来使含细胞的生物样品稳定的实施方式进行了详细描述。请参考也适用于将凋亡抑制剂与高渗剂组合使用的实施方式的上述公开内容。优选地，至少一种半胱天冬酶抑制剂、优选为修饰的半胱天冬酶特异性肽与至少一种作为高渗剂的羟基化有机化合物例如糖类如二羟基丙酮或多元醇组合使用，所述修饰的半胱天冬酶特异性肽优选地在C-端用O-苯氧基进行修饰，例如Q-VD-OPh。正如由实施例所证实的，相应的组合在使含细胞的生物样品、尤其是全血样品在室温下稳定超过3天以及甚至6天方面显著有效。

根据一种实施方式，使用稳定剂的组合，其包含如上定义的至少一种凋亡抑制剂、至少一种高渗剂和/或至少一种式1的化合物。相应组合的实例包括：（1）如上定义的至少一种凋亡抑制剂与至少一种式1的化合物的组合，（2）如上定义的至少一种高渗剂与至少一种式1的化合物的组合，或（3）所有三种稳定剂，即如上定义的至少一种凋亡抑制剂、至少一种高渗剂与至少一种式1的化合物的组合。相应的组合还可以包含增强稳定化效果的其他添加剂例如抗凝剂和螯合剂。根据一种实施方式，稳定剂的组合包含半胱天冬酶抑制剂和抗凝剂，优选为螯合剂例如EDTA。根据第五子方面，相应的组合可以被有利地用在本发明的第一方面的适用于使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法中。使用稳定剂的组合观察到的稳定化效果强于任何单个稳定剂在单独使用时观察到的效果，和/或允许使用较低浓度，从而使稳定剂的组合使用成为有吸引力的选择方案。如上定义的凋亡抑制剂、高渗剂和式1的化合物的适合和优选的实施方式以及适用于实现样品的有效稳定化的相应试剂的适合和优选的浓度已在上面结合使用凋亡抑制剂、高渗剂或式1的化合物来使含细胞的生物样品稳定的实施方式进行了详细描述。

正如在发明背景中讨论的，细胞外核酸通常不以“裸露的”形式存在于样品中，而是例如通过被释放或保护在复合物中或通过被包含在囊泡等中而在一定程度上被稳定化。这具有以下效果：细胞外核酸已在一定程度上被天然稳定化，并且因此通常不被含细胞的样品例如全血、血浆或血清中的核酸酶快速降解。因此，当打算使生物样品中包含的细胞外核酸稳定时，主要问题之一是细胞外核酸群体被源自于样品中包含的损伤和/或死亡的细胞的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA稀释或相应地污染。这在处理细胞贫化的样品例如血浆或血清（其有时也被描述为“无细胞的”，尽管它们可能包含少量细胞）时产生问题。就此而言，本发明的稳定化技术是特别有利的，因为它不仅基本上保护样品中存在的细胞外核酸并例如抑制所包含的细胞外核酸的降解（在稳定化期间与未稳定化的样品或EDTA稳定化的样品相比，优选地抑制至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或最优选地至少95%），而且进一步有效地减少从样品中包含的细胞释放基因组DNA和/或减少相应基因组DNA的片段化。根据一种实施方式，按照本发明的教导使用凋亡抑制剂、高渗剂和/或式1的化合物以使含细胞的样品稳定，具有以下效果：与未稳定化的样品相比，由样品中包含的细胞释放DNA引起的DNA增加减少。根据一种实施方式，在稳定化期间，与未稳定化的样品或用EDTA稳定化的相应样品（尤其是在血液样品或源自于血液的样品例如血浆或血清的情况下）相比，所述基因组DNA的释放减少至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少17倍或至少20倍。根据一种实施方式，在稳定化期间，与未稳定化的样品或用EDTA稳定化的相应样品（尤其是在血液样品或源自于血液的样品例如血浆或血清的情况下）相比，所述基因组DNA的释放减少至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。DNA的释放例如可以通过对核糖体18S DNA进行定量来确定，如实施例部分中所描述的。例如，在相应的测定法中，标准的EDTA稳定化血液样品在例如室温下储存的第6天显示出测定的DNA增加40倍（参见图2b）。可以使用本发明的教导实现的稳定化，将这种DNA的释放显著降低甚至最多例如4倍。因此，与在标准的EDTA管中稳定化的样品相比，样品中包含的细胞外核酸群体被大幅地稳定。因此，根据一种实施方式，如本发明所教导的使用凋亡抑制剂、高渗剂和/或式1的化合物实现的稳定化效应导致从样品中包含的细胞释放的DNA至少减少最多10倍、优选地7倍、更优选地5倍，并且最优选地至少减少至最多4倍，正如可以在例如实施例所描述的18S DNA测定法中测定的。正如实施例所示，可以在至少长达6天的时间段内获得细胞外核酸群体的有效稳定化。在样品的较短储存例如最长3天期间，DNA释放可以被至少减少至最多2倍，正如可以在例如实施例所描述的18SDNA测定法中测定的。因此，当使用本发明的稳定化方法时，DNA释放可以在长达3天的储存期内减少到2倍或更少。与现有技术方法相比，这在使细胞外核酸群体稳定方面是显著的改进。这显著提高了任何后续试验的准确性。在某些情况下，例如如果样品材料必须进行长距离运输或例如在室温下储存较长时间段（例如可以是在某些国家中的情况），本发明的方法首次使得这些试验可以在这样的时间段后进行。但是，如果需要，样品当然也可以更早地进行进一步处理。没有必要利用整个可获得的稳定化时间段。使用本发明实现的稳定化，减少了可能由样品收集后样品的不同操作/处理（例如储存条件和时间段）引起的细胞外核酸群体的变化。这极大地改善了操作和分子分析的标准化。

为了使含细胞的样品进一步稳定，除了上面定义的凋亡抑制剂、高渗剂和/或式1的化合物之外，可以使用其他添加剂。可能也有助于稳定化效应的适合的添加剂的选择，可能也取决于待稳定的含细胞的样品的类型。例如，当处理作为含细胞的生物样品的全血时，包含抗凝剂是有利的并且也是常见的，所述抗凝剂选自例如肝素、乙二胺四乙酸、柠檬酸盐、草酸盐及其任何组合。在有利的实施方式中，抗凝剂是螯合剂。螯合剂是能够通过有机化合物的两个或更多个原子与金属形成配位键的有机化合物。本发明的螯合剂包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）、亚乙基二氮基四乙酸（EDTA）,乙二醇四乙酸（EGTA）和N,N-双(羧甲基)甘氨酸（NTA）。根据优选实施方式，使用EDTA。当在本文中使用时，术语“EDTA”具体是指EDTA化合物例如K₂EDTA、K3EDTA或Na2EDTA的EDTA部分。使用螯合剂例如EDTA还具有以下有利的效果：抑制核酸酶例如DNase，从而例如防止细胞外DNA被DNase降解。此外，本发明人发现，以较高浓度使用/添加的EDTA能够减少细胞释放细胞内核酸、尤其是基因组DNA，从而支持由凋亡抑制剂、高渗剂和/或至少一种式1的化合物实现的稳定化效果。然而，单独的EDTA不能有效地抑制例如从样品中包含的细胞释放的基因组DNA的片段化。因此，EDTA不获得足够的稳定化效果。但是与本发明的教导组合使用时，尤其是与凋亡抑制剂、特别是半胱天冬酶抑制剂组合使用时，由于上面讨论的原因，它可以进一步提高稳定化。此外，它还似乎提高RNA的化学稳定性。根据一种实施方式，在接触步骤后，生物样品中与一种或多种上述稳定化合物混合的螯合剂、优选为EDTA的浓度在选自以下的范围内：0.05mM至100mM、0.05mM至50mM、0.1mM至30mM、1mM至20mM和2mM至15mM。当使血液、血浆和/或血清样品、尤其是10ml血液样品稳定时，相应的浓度是特别有效的。

为了进一步支持含细胞的样品的稳定化或相应地支持细胞外核酸群体的保护，也可以使用其他添加剂。相应添加剂的实例包括但不限于核酸酶抑制剂，尤其是RNase和DNase抑制性化合物。RNase抑制剂的实例包括但不限于抗核酸酶抗体或核糖核苷-氧钒-复合物。当选择相应的其他添加剂时，应当注意不损害和/或抵消凋亡抑制剂、高渗剂和/或式1的化合物的稳定化效果。因此，使用的添加剂的浓度不应该引起或支持生物样品中包含的细胞的裂解和/或降解，和/或支持生物样品的无细胞级分中包含的核酸的降解。

在本发明的有利实施方式中，将含细胞的生物样品、优选为血液样品或源自于血液的样品例如血浆或血清与下列物质相接触：

a）至少一种作为凋亡抑制剂的半胱天冬酶抑制剂，优选为Q-VD-OPh，优选地在1μM至30μM的浓度范围内；

b）任选地，至少一种作为高渗剂的羟基化有机化合物例如二羟基丙酮，优选地在0.1M至0.6M的浓度范围内；以及

c）任选地，至少一种上面定义的式1的化合物（优选实施方式和浓度如上文所描述的），和/或

d）其他添加剂，优选为螯合剂，其优选地在4mM至50mM、优选地4mM至20mM的范围内，最优选为EDTA。

可以将稳定化组合物的组分包含或相应地溶解在缓冲液例如生物缓冲液如MOPS、TRIS、PBS等中。

如上定义的凋亡抑制剂、高渗剂和/或式1的化合物以及任选地存在的其他添加剂可以例如存在于用于收集样品的装置、优选为容器中，或者可以在即将收集生物样品之前被添加到相应的收集装置中，或者可以在将样品收集到收集装置中后被立即添加到所述收集装置中。将稳定剂和任选的其他添加剂分开地添加到含细胞的生物样品中，也在本发明的范围之内。然而，为了易于操作，优选地将一种或多种稳定剂和任选的其他添加剂提供在一种组合物中。此外，在有利的实施方式中，上述凋亡抑制剂、高渗剂和/或式1的化合物和任选地其他添加剂在加入样品之前存在于收集装置中。这确保含细胞的生物样品在与稳定剂相接触后立即被稳定化。容器中存在的稳定剂的量有效地提供了待收集或相应地包含在所述容器中的一定量的含细胞的样品的稳定化。正如所描述的，可以在收集样品之后和/或收集样品期间将样品直接与稳定剂混合，由此提供稳定化的样品。

优选地，在收集样品之后和/或收集样品期间将样品与稳定剂直接混合。因此，优选地，上述稳定剂和添加剂以稳定化组合物的形式提供。优选地，所述稳定化组合物以液体形式提供。它可以被例如预装填在样品收集装置中，以便在收集期间将样品立即稳定化。根据一种实施方式，将稳定化组合物与含细胞的样品以选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5的体积比相接触。本发明的教导的一个具体优点在于可以使用小体积的稳定化组合物实现大样品体积的稳定化。因此，优选地，稳定化组合物与样品的比率在1:2至1:7、更优选地1:3至1:5的范围内。

当在本文中使用时，术语“含细胞的样品”具体是指包含至少一个细胞的样品。含细胞的样品可以包含至少2个、至少10个、至少50个、至少100个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少1500个、至少2000个或至少5000个细胞。此外，包含显著更多细胞的含细胞的样品也被该术语涵盖，并且可以使用本发明的教导来稳定化。然而，术语“含细胞的样品”还指称并因此涵盖细胞贫化的样品，包括通常被称为“无细胞”的细胞贫化的样品例如血浆，因为相应的样品通常包括残留的细胞。至少，通常不能完全排除即使是所谓的“无细胞”样品例如血浆仍包含残留量的细胞，所述残留量的细胞因此造成细胞外核酸群体被从所述残留的细胞释放的细胞内核酸污染的风险。因此，根据一种实施方式，相应的细胞贫化的样品和“无细胞”样品也被术语“含细胞的样品”涵盖。因此，“含细胞的样品”可以包含大量细胞，正如例如使用全血的情形，但是也可以仅含有少量细胞。因此，术语“含细胞的样品”还涵盖仅被怀疑含有细胞或具有含细胞的风险的样品。正如上面讨论的，对于仅包含少量、相应地残留量的细胞的生物样品例如血浆（取决于制备方法，血浆通常含有少量残留量的细胞，尽管它通常被称为无细胞的）来说，本发明的方法也具有显著的优点，因为这些残留的细胞也可能引起所包含的细胞外核酸的不希望的污染。使用本发明的稳定化技术还确保了仅包含残留量细胞或仅仅被怀疑含有残留量细胞或具有含残留量细胞的风险的相应样品被有效地稳定化，正如也在上面详细描述的。使用本发明的稳定化方法具有以下优点：不论样品的组成和其中包含的细胞数量如何，其中包含的细胞外核酸群体被基本上保护或相应地稳定化，由此允许使所包含的细胞外核酸的后续分离和/或分析标准化。

根据一种实施方式，含细胞的生物样品选自全血、源自于血液的样品、血浆、血清、痰液、泪液、淋巴液、尿液、汗液、液剂、脑脊液、腹水、乳液、粪、支气管灌洗液、唾液、羊水、鼻分泌物、阴道分泌物、精液、伤口分泌物和细胞培养上清液以及从其他拭子样品获得的上清液。根据一种实施方式，含细胞的生物样品是体液、身体分泌物或身体排泄物，优选为体液，最优选为全血、血浆或血清。含细胞的生物样品包含细胞外核酸。根据另一种实施方式，含细胞的生物样品是源自于人类或动物的非流体样品例如粪、组织或活检样品。可以用本发明的方法稳定化的含细胞的生物样品的其他实例包括但不限于生物样品细胞悬液、细胞培养物、细胞培养物上清液等，其包含细胞外核酸。

正如上面描述的和由实施例所证实的，使用本发明的方法允许在无需冷藏或冷冻的条件下使含细胞的样品稳定较长的时间段。因此，可以将样品保持在室温或甚至升高的温度例如高达30℃或高达40℃下。根据一种实施方式，在室温下获得至少2天、优选地至少3天、更优选地至少1天至6天、最优选地至少1天至至少7天的稳定化效果。正如实施例中所示，按照本发明的方法稳定化的样品在室温下储存3天时基本上不受损。即使在室温下长达6天或甚至7天的更长储存期间，与未稳定化的样品相比或例如与使用标准方法例如EDTA处理稳定化的样品相比，细胞外核酸群体明显更加稳定。尽管稳定化效果可能随时间降低，但仍足以保持细胞外核酸群体的组成以允许分析和/或进一步处理。因此，按照本发明的方法稳定化的样品，即使在室温下储存较长时间后，也仍适用于分离和任选地分析其中包含的细胞外核酸。因此，由于样品是不受损的，尤其是在使用稳定剂的优选组合时，因此可以设想甚至更长的储存/运输时间。然而，更长的时间段通常不是必需的，因为常规储存和例如运输到进行核酸分离和任选地分析的实验室的时间通常不超过6或7天，而是通常甚至在2或3天后完成。正如实施例中所示，在该时间段内，稳定化效率是特别良好的。然而，使用本发明的方法可以获得的非常长的稳定化时间和稳定化效率，提供了重要的安全因素。

本发明的方法以及随后描述的组合物还允许使用小体积的添加物质来使大体积的生物样品稳定，因为根据本发明的教导使用的添加剂具有高活性。这是重要的优点，因为样品的大小/体积对后续分离程序造成相当大的限制，尤其是在打算使用自动化过程分离样品中包含的细胞外核酸时。此外，人们必须考虑到细胞外核酸通常仅仅以少量包含在所包含的样品中。因此，处理较大体积的含细胞的样品例如血液样品，具有可以从样品分离更多的循环核酸并因此可用于后续分析的优点。

在生物样品的稳定化之后可以直接跟随着用于分析核酸的技术，或者可以从样品纯化核酸。因此，按照本发明的方法稳定化的样品可以在核酸分析和/或检测方法中进行分析，和/或可以进行进一步处理。例如，可以从稳定化的样品分离细胞外核酸，然后可以将所述细胞外核酸在核酸分析和/或检测方法中进行分析，或者可以进行进一步处理。

此外，根据第二方面，提供了用于从含细胞的生物样品分离细胞外核酸的方法，其中所述方法包括下列步骤：

a）按照本发明的第一方面中定义的方法使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定；

b）分离细胞外核酸。

正如上面讨论的，本发明的稳定化具有使样品中包含的细胞外核酸群体基本上保持其在获得或相应地抽取生物样品时所显示出的状态的效果。具体来说，有效地减少了通常观察到的由从损伤或死亡的细胞释放的细胞内核酸、尤其是基因组DNA、更具体地为片段化基因组DNA造成的核酸大量增加，正如在实施例中证实的。因此，与未稳定化的样品相比，从相应地稳定化的样品获得的细胞外核酸包含源自于样品中包含的衰退或死亡细胞的细胞内核酸的更少污染，尤其是包含更少量的片段化基因组DNA。此外，独特的稳定化步骤允许提高可回收的细胞外核酸的量。本发明的稳定化方法可以在不使样品交联的条件下进行。与使用交联剂例如甲醛或甲醛释放剂相比，这是重要的优点，因为这些试剂由于交联而可能降低细胞外核酸的可回收量。因此，本发明的方法提高了细胞外核酸的诊断和预后能力。此外，所述稳定化允许在分离样品中包含的细胞之前和/或在步骤b）中分离其中包含的细胞外核酸之前，将样品在甚至室温下储存和/或操作例如运输长时间段。对于稳定化的详细情况来说，请参考也适用于这里的上述公开内容。

根据一种实施方式，如上面详细描述的，使用如上所述的至少一种凋亡抑制剂、至少一种高渗剂和/或至少一种式1的化合物，优选地使用这些稳定剂中的至少两种和任选地其他添加剂，在步骤a）中使含细胞的生物样品例如全血样品稳定。上面描述了适合和优选的实施方式。特别优选的是使用半胱天冬酶抑制剂与如上描述的抗凝剂、优选为螯合剂的组合，用于使全血样品稳定。

如果样品包含大量细胞，正如在例如使用全血的情形那样，则将细胞与其余样品分离开，以便获得样品的包含细胞外核酸的无细胞、相应地细胞减少或细胞贫化的级分。因此，根据一种实施方式，在步骤a）与步骤b）之间从含细胞的样品去除细胞。该中间步骤仅仅是任选的，并且例如如果处理仅包含少量残留细胞的样品例如血浆或血清的话，可以不使用该步骤。然而，为了改善结果，优选地也去除相应的残留细胞（或潜在的残留细胞），因为它们在分离期间可能污染细胞外核酸群体。取决于样品类型，例如可以通过离心、优选地高速离心来分离并去除细胞（包括残留细胞），或者如果要避免离心步骤，可以通过使用除了离心以外的其它手段例如过滤、沉降或结合于（任选地磁性）粒子上的表面来分离并去除细胞（包括残留细胞）。相应的细胞去除步骤也可以被容易地包含在自动化样品制备流程中。相应地去除的细胞也可以进行进一步处理。例如可以储存所述细胞，和/或可以从去除的细胞分离生物分子例如核酸或蛋白质。

此外，包括准备样品的其他中间步骤也在本发明的范围之内。

然后在步骤b）中，例如从无细胞或相应地细胞贫化的级分，例如从上清液、血浆和/或血清分离细胞外核酸。为了分离细胞外核酸，可以使用适合于从相应的样品或相应地细胞贫化的样品分离核酸的任何已知的核酸分离方法。相应的纯化方法的实例包括但不限于提取、固相提取、基于二氧化硅的纯化、基于磁性粒子的纯化、酚-氯仿提取、层析、阴离子交换层析（使用阴离子交换表面）、电泳、过滤、沉淀、染色质免疫沉淀及其组合。通过例如使用能够提供序列特异性结合并偶联于固相支持物的适合的探针来特异性分离特定的目标细胞外核酸，也在本发明的范围之内。还可以使用本领域技术人员已知的任何其他核酸分离技术。根据一种实施方式，使用离液剂和/或醇来分离核酸。优选地，通过将核酸结合于固相、优选为包含二氧化硅或阴离子交换官能团的固相，来分离核酸。适合的方法和试剂盒也是可商购的，例如循环核酸试剂盒（Circulating Nucleic AcidKit）（QIAGEN）、Chemagic循环NA试剂盒（Chemagic Circulating NA Kit）（Chemagen）、NucleoSpin血浆XS试剂盒（NucleoSpin Plasma XS Kit）（Macherey-Nagel）、血浆/血清循环DNA纯化试剂盒（Plasma/Serum Circulating DNA Purification Kit）（NorgenBiotek）、血浆/血清循环RNA纯化试剂盒（Plasma/Serum Circulating RNA PurificationKit）（Norgen Biotek）、高纯度病毒核酸大体积试剂盒（High Pure Viral Nucleic AcidLarge Volume Kit）（Roche）和适用于提取和纯化循环核酸的其他可商购试剂盒。

根据一种实施方式，分离在步骤a）后获得的样品中包含的所有核酸或分离任选地在中间步骤中去除细胞后获得的样品中包含的所有核酸，例如从无细胞或相应地细胞贫化的级分中分离所述核酸。例如，可以从血浆或血清分离总核酸，并且细胞外核酸作为一部分被包含在这些提取的核酸中。如果细胞被有效地去除，则分离的总核酸主要包含细胞外核酸或甚至由细胞外核酸构成。至少主要分离特定的靶核酸，也在本发明的范围之内。靶核酸可以是例如某种类型的核酸例如RNA或DNA，包括mRNA、microRNA、其他非编码核酸、表观遗传学修饰的核酸和其他核酸。例如在分离后使用核酸酶消化非靶核酸，也在本发明的范围之内。术语靶核酸还指特定种类的核酸，例如已知是某种疾病标志物的特定的细胞外核酸。正如上面讨论的，细胞外核酸的分离也可以包含相应靶核酸的特异性分离，例如通过使用适合的捕获探针。术语靶核酸还指具有一定长度的核酸，例如长度为2000nt以下、1000nt以下或500nt以下的核酸。分离相应的较小靶核酸可能是有利的，因为已知细胞外核酸通常具有小于2000nt、通常小于1000nt、甚至通常小于500nt的较小尺寸。本文中所指的尺寸或相应地尺寸范围是指链长。即，在DNA的情况下，它是指bp。将分离或相应地纯化聚焦于相应的小核酸，能够增加在分离的核酸中获得的细胞外核酸的部分。具体来说，由于对细胞内基因组DNA的片段化的抑制，本发明的稳定化方法允许在例如核酸提取程序期间更有效地将这种高分子量的基因组DNA与片段化的细胞外核酸群体分离开。由于使用本发明的稳定化技术使基因组核酸与循环核酸之间的显著的尺寸差异基本上得以保持，因此与没有相应稳定化的情况相比，可以通过DNA的尺寸选择性回收来更有效地去除基因组DNA。通过例如使高分子量的基因组DNA贫化来实现细胞外核酸群体的相应选择性分离的适合方法是现有技术中公知的，因此不需要在这里进行进一步描述。例如，使用使样品中大于1,000-10,000核苷酸或碱基对的任何核酸贫化的尺寸选择性方法，将是足够的。由于本发明的稳定化的样品中基因组核酸（通常>10,000bp）与细胞外核酸（通常<1000bp）之间的尺寸差异由于有效的稳定化而通常相对较大（差异可以例如在1000-10,000bp的范围内），因此可以使用用于从生物样品选择性分离细胞外核酸的已知方法。这也为减少分离的细胞外核酸群体中细胞内核酸的量提供了进一步的机会。例如，在核酸提取流程期间去除基因组DNA，也可以补充或甚至代替在核酸提取开始之前为去除残留细胞而进行的血浆样品的单独的高离心力离心。由于本发明的稳定化，防止了从所述残留细胞释放的基因组DNA被大量降解，并因此可以通过尺寸选择性分离流程来去除所述基因组DNA。这种选择方案是特别有利的，因为许多临床实验室不具有能够执行这样的高离心力离心的离心机或用于去除尤其是痕量的残留细胞的其他手段。

然后可以使用适合的测定法和/或分析方法在步骤c）中对分离的核酸进行分析和/或进一步处理。例如，可以将它们鉴定、修饰、与至少一种酶相接触、扩增、反转录、克隆、测序、与探针相接触、检测（它们的存在或不存在）和/或定量。相应的方法是现有技术中公知的，并通常应用于医学、诊断和/或预后领域，以便分析细胞外核酸（也参见本发明的背景中的详细描述）。因此，在将细胞外核酸任选地作为总核酸、总RNA和/或总DNA的一部分分离（参见上文）后，可以对它们进行分析以鉴定疾病状态的存在、不存在或严重性，包括但不限于多种肿瘤性疾病、尤其是恶变前疾病和恶性疾病，例如不同形式的癌症。例如，可以对分离的细胞外核酸进行分析以便检测许多应用领域中的诊断和/或预后标志物（例如胎儿或肿瘤来源的细胞外核酸），所述应用领域包括但不限于非侵入性产前遗传检测或相应地筛查、疾病筛查、病原体筛查、肿瘤学、癌症筛查、早期癌症筛查、癌症疗法监测、遗传检测（基因分型）、传染病测试、损伤诊断、创伤诊断、移植医学或许多其他疾病，因此所述分离的细胞外核酸具有诊断和/或预后相关性。根据一种实施方式，对分离的细胞外核酸进行分析，以鉴定和/或表征疾病或胎儿的特征。因此，正如上面讨论的，本文描述的分离方法还可以包含核酸分析和/或处理的步骤c）。因此，根据一种实施方式，在步骤c）中对分离的细胞外核酸进行分析，以鉴定、检测、筛选、监测或排除疾病和/或至少一种胎儿特征。可以使用任何核酸分析/处理方法来进行核酸的分析/进一步处理，所述方法包括但不限于扩增技术、聚合酶链反应（PCR）、等温扩增、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、定量实时聚合酶链反应（Q-PCR）、数字PCR、凝胶电泳、毛细管电泳、质谱术、荧光检测、紫外光谱术、杂交测定法、DNA或RNA测序、限制性分析、反转录、NASBA、等位基因特异性聚合酶链反应、聚合酶循环组装（PCA）、不对称聚合酶链反应、指数后线性聚合酶链反应（LATE-PCR）、解旋酶依赖性扩增（HDA）、热启动聚合酶链反应、序列间特异性聚合酶链反应（ISSR）、反向聚合酶链反应、连接介导的聚合酶链反应、甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）、多重聚合酶链反应、巢式聚合酶链反应、固相聚合酶链反应或其任何组合。相应的技术对于本领域技术人员来说是公知的，因此不需要在这里进行进一步描述。

根据一种实施方式，在按照本发明的教导收集样品或相应地使所述样品稳定后至少一天至7天，进行分离或分析步骤b）和c）中的任一种或两者。可以使用本发明的方法使样品、尤其是血液样品或相应地其中包含的细胞外核酸群体稳定化的适合时间段，也被描述在上面并且也适用于此处。根据一种实施方式，在按照本发明的方法收集样品并使所述样品稳定后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天或至少6天进行分离步骤。根据一种实施方式，在不冷冻样品和/或不使用甲醛来保护含细胞的生物样品的条件下进行分离或分析步骤中的任一种或两者。在与如上定义的凋亡抑制剂、高渗剂和/或式1的化合物相接触后，生物样品被稳定化，所述凋亡抑制剂、高渗剂和/或式1的化合物优选地与其他添加剂例如抗凝剂如EDTA相组合。当使血液或源自于血液的样品稳定时，优选地使用抗凝剂。相应地稳定化的样品可以在室温下操作，例如储存和/或运输。

此外，根据本发明的第三方面，提供了适用于使生物样品中的细胞外核酸群体稳定的组合物，所述组合物包含：

a）至少一种凋亡抑制剂，优选为半胱天冬酶抑制剂，和/或

b）至少一种使样品中包含的细胞稳定的高渗剂，优选为二羟基丙酮；和/或

c）至少一种如上定义的式1的化合物；和

d）任选地，至少一种抗凝剂，优选为螯合剂。

正如上面讨论的，通过使包含的细胞和所包含的细胞外核酸稳定，由此显著地保护细胞外核酸群体或相应地使所述细胞外核酸群体稳定，相应的稳定化组合物在使含细胞的生物样品、尤其是全血、血浆和/或血清稳定方面特别有效。相应的稳定化组合物允许样品、优选为全血在室温下储存和/或操作例如运输至少2天、优选地至少3天，而基本上不损害样品或相应地其中包含的细胞外核酸群体的质量。当然，不强制使用整个可能的稳定化时间段；如果需要，样品也可以更早地进行处理。将生物样品与稳定化组合物相接触，允许在分离和任选地分析和/或处理包含的循环核酸之前，将样品甚至在室温下储存和/或操作例如运输。因此，样品的收集或稳定化与核酸提取之间的时间可以变化，而基本上不影响其中包含的细胞外核酸群体的总数或相应地组成。具体来说，减少了细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA的稀释或相应地污染。优选地，在收集样品后立即将稳定化组合物与样品相接触，或在收集样品期间将稳定化组合物与样品相接触。优选地，当使血液样品稳定时，组合物包含如上所述的至少一种半胱天冬酶抑制剂和至少一种抗凝剂，优选为螯合剂。它还可以包含本文中描述的其他稳定剂。

上面结合稳定化方法详细描述了凋亡抑制剂、高渗剂和/或式1的化合物的适合和优选的实施方式以及相应化合物的适合和优选的浓度。请参考也适用于稳定化组合物的上述公开内容。优选地，将至少一种半胱天冬酶抑制剂、优选为修饰的半胱天冬酶特异性肽与至少一种高渗剂、优选为羟基化有机化合物例如二羟基丙酮组合使用，所述修饰的半胱天冬酶特异性肽优选地在C-端用O-苯氧基修饰，例如Q-VD-OPh。上面也描述了其他适合的羟基化有机化合物，请参考相应的公开内容。正如由实施例证实的，相应的组合在使含细胞的生物样品、尤其是血液样品稳定方面显著有效。

优选地，至少一种式1的化合物是N,N-二烷基-羧酸酰胺。优选的R1、R2、R3和R4基团如上所述。根据一种实施方式，所述化合物选自N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺和N,N-二甲基丙酰胺。所述化合物也可以与凋亡抑制剂、优选为半胱天冬酶抑制剂（上面描述了优选实施方式，请参考上面的公开内容）和/或高渗剂、优选为羟基碳化合物（上面描述了优选实施方式，请参考上面的公开内容）组合使用。

此外，优选的是，稳定化组合物包含其他添加剂例如抗凝剂如螯合剂，尤其是如果组合物被用于使全血、血浆或血清稳定的话。

根据一种实施方式，稳定化组合物基本上由提到的稳定剂和任选的添加剂以及任选地缓冲剂构成。稳定化组合物使样品稳定，因此不促进样品中包含的细胞的裂解和/或破坏。稳定化组合物可以减少样品中包含的细胞的损伤，正如可以例如通过实施例部分中描述的测定方法所确定的。

组合物可以以固体形式提供。如果待稳定的生物样品含有液体以溶解固体（例如含细胞的体液、介质中的细胞、尿液）或者如果向其加入液体例如水以溶解固体的话，这是例如适合的选择方案。使用固体稳定化组合物的优点在于固体通常在化学上更稳定。然而，也可以使用液体组合物。液体组合物通常具有以下优点：可以快速获得与待稳定的样品的混合物，从而在样品一与液体稳定化组合物发生接触后就基本上提供立即的稳定化效果。优选地，液体稳定化组合物中存在的稳定剂在溶液中保持稳定，并且不需要由用户进行预处理，例如使溶解度有限的沉淀物溶解，因为这种类型的预处理引起稳定化效率变化的风险。

还提供了包含与生物样品混合的本发明的稳定化组合物的混合物。上面结合稳定化方法描述了生物样品的适合和优选的实例以及稳定剂在与生物样品混合时的适合的浓度。请参考也适用于此的上述公开内容。优选地，将稳定化组合物预装填在样品收集装置中，使得样品在收集期间立即被稳定化。根据一种实施方式，将稳定化组合物与生物样品以选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5的体积比相接触。本发明的稳定化组合物的一个具体优点是可以使用小体积的稳定化组合物获得大样品体积的稳定化。因此，优选地，稳定化组合物与样品的比率在1:2至1:7、更优选地1:3至1:5的范围内。

本发明的第三方面的稳定化组合物可用于使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定。此外，本发明的第三方面的稳定化组合物也可用于使样品中包含的细胞稳定。正如上面描述的，稳定化组合物尤其减少由衰退的细胞引起的来自于细胞的基因组DNA的释放。因此，相应的使用也是有利的，并由本发明的教导所提供。

还提供了制造本发明的第三方面的组合物的方法，其中将组合物的组分优选地在水性溶液中混合。

本发明的组合物也可以被包含到样品收集装置、尤其是血液收集组件中，由此提供这样的装置的有用的新版本。这样的装置通常包括具有开口端和封闭端的容器。容器优选地是血液收集管。容器类型也取决于待收集的样品，下面描述了其他适合的形式。

此外，本发明提供了用于收集含细胞的生物样品、优选为血液样品的容器，其中容器包含本发明的稳定化组合物。提供包含本发明的稳定化组合物的相应容器例如样品收集管，具有将样品收集在相应容器中时使样品快速稳定的优点。上面描述了关于稳定化组合物的详细情况，请参考也适用于此的上述公开内容。

根据一种实施方式，提供了用于接收和收集生物样品的收集容器，其中所述容器包含：

a）至少一种凋亡抑制剂，使得在收集样品时，得到的混合物中凋亡抑制剂的浓度或两种或更多种凋亡抑制剂的组合的浓度选自至少0.01μM、至少0.05μM、至少0.1μM、至少0.5μM、至少1μM、至少2.5μM或至少3.5μM，并且优选地以选自0.01μM至100μM、0.05μM至100μM、0.1μM至50μM、1μM至40μM、1.0μM至30μM或2.5μM至25μM的浓度范围存在，和/或

b）至少一种高渗剂，使得在收集样品时，得到的混合物中高渗剂的浓度或两种或更多种凋亡抑制剂的组合的浓度为至少0.05M、至少0.1M、优选地至少0.25M，并且优选地以0.05M至2M、0.1M至1.5M、0.15M至0.8M、0.2M至0.7M或0.1M至0.6M的浓度范围存在；和/或

c）至少一种如上定义的式1的化合物，使得在收集样品时，包含的式1的化合物的浓度为至少0.1%、至少0.5%、至少0.75%、至少1%、至少1.25%或至少1.5%，或者其中包含的所述化合物的浓度范围选自0.1%至50%、0.1%至30%、1%至20%、1%至10%、1%至7.5%和1%至5%；和/或

d）任选地，至少一种其他添加剂，优选为抗凝剂例如螯合剂、优选为EDTA，如果容器被用于收集血液或血液制品的话。适合的浓度被描述在上面，并优选地在4mM至50mM、更优选4mM至20mM的范围内。

预装填的组分a）、b）、c）和/或d）可以以液体或干燥形式提供。为了使全血稳定，优选地至少使用组分a）和d）。优选地，稳定化组分被提供为稳定化组合物。如果待稳定的生物样品含有液体以溶解固体（例如含细胞的体液、介质中的细胞、尿液）或者如果向其加入液体例如水以溶解固体的话，则例如干燥形式是适合的选择方案。使用固体稳定化组合物的优点在于固体与液体相比通常在化学上更稳定。根据一种实施方式，用本发明的稳定化组合物处理/覆盖容器的内壁。可以使用例如喷雾干燥方法将所述组合物施加到内壁。可以在稳定化组合物上执行液体去除技术，以便获得基本上固体状态的保护性组合物。液体去除条件可以使得它们导致去除分配的液体稳定化组合物的原始量的至少约50重量%、至少约75重量%或至少约85重量%。液体去除条件可以使得它们导致去除足够的液体，以便得到的组合物为膜、凝胶或其他基本上固体或高度粘稠的层的形式。例如，它可以产生基本上不能移动的涂层（优选为在与含细胞的样品、优选为血液制品样品相接触后，可以重新溶解或以其他方式分散的涂层）。冷冻干燥或其他技术可能可以用于获得保护剂的基本上固体的形式（例如为一个或多个球粒的形式）。因此，液体去除条件可以使得它们产生这样一种材料，即，在与所考虑的样品（例如全血样品）相接触后，保护剂将分散在样品中并显著保护样品中的组分（例如细胞外核酸）。液体去除条件可以使得它们产生基本上没有结晶性并具有足够高的粘度的剩余组合物或在室温下基本上不能移动的剩余组合物，或两者。

然而，也可以使用液体组合物。液体组合物通常具有以下优点：可以快速获得与待稳定的样品的混合物，从而在样品一与液体稳定化组合物发生接触后就基本上提供立即的稳定化效果。优选地，液体稳定化组合物中存在的稳定剂在溶液中保持稳定，并且不需要由用户进行预处理，例如使溶解度有限的沉淀物溶解，因为这种类型的预处理引起稳定化效率变化的风险。

容器中包含的稳定化组合物的量有效地提供了待收集在所述容器中的量的样品的稳定化。根据一种实施方式，将液体稳定化组合物与生物样品以选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5的体积比相接触。本发明的稳定化组合物的一个具体优点在于可以使用小体积的稳定化组合物获得大样品体积的稳定化。因此，优选地，稳定化组合物与样品的比率在1:2至1:7、更优选地1:3至1:5的范围内。

根据一种实施方式，将容器抽空。优选地，抽空对于将特定体积的流体样品抽取到内部是有效的。由此，确保了正确量的样品与容器中包含的预装量的稳定化组合物相接触，并因此确保了有效的稳定化。根据一种实施方式，容器包含具有用隔膜密封的开口端的管。例如，容器预装填有确定量的固体或液体形式的稳定化组合物，并提供有确定的真空并用隔膜密封。隔膜被构造成使其与标准的取样配件（例如插管等）相容。当与例如插管相接触时，由真空预先确定的样品量被收集在容器中。相应的实施方式对于收集血液来说是特别有利的。适合的容器被例如公开在US6,776,959中。

本发明的容器可以由玻璃、塑料或其他适合的材料制成。塑料材料可以是不透氧气的材料，或者可以含有不透氧气的层。或者，容器可以由可透过水和空气的塑料材料制成。本发明的容器优选地由透明材料制成。适合的透明热塑性材料的实例包括聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二酯。容器可以具有适合的尺寸，所述尺寸根据待收集的生物样品的所需体积进行选择。如上所述，优选地，将容器抽空至内部压力低于大气压。这样的实施方式对于收集体液例如全血来说特别适合。压力优选地被选择成将预定体积的生物样品抽取到容器中。除了这样的真空管之外，非真空管、机械分离管或凝胶阻挡管（gel-barrier tube）也可以用作样品容器，尤其是用于血液样品的收集。适合的容器和封盖装置的实例被公开在US5,860,397和US2004/0043505中。作为用于收集含细胞的样品的容器，也可以使用其他收集装置，例如注射器、尿液收集装置或其他收集装置。容器的类型也可以取决于待收集的样品类型，并且适合的容器对于本领域技术人员来说也是可获得的。

在有利的实施方式中，容器或相应的装置装填有或预装填有至少一种凋亡抑制剂，优选为半胱天冬酶抑制剂；至少一种高渗剂，优选为至少一种上面详细描述的羟基化有机化合物例如二羟基丙酮；以及任选地，其他添加剂例如抗凝剂，优选为螯合剂，更优选为EDTA。至少一种高渗剂与至少一种半胱天冬酶抑制剂的混合物出人意料地使全血、血浆或血清中的细胞外核酸稳定，并且具体来说，防止这种样品中包含的白细胞释放细胞内核酸，所述高渗剂优选地为羟基化有机化合物例如糖类如二羟基丙酮，所述半胱天冬酶抑制剂优选为Q-VD-OPH。因此，细胞外核酸群体被保持在抽血时所显示出的状态下。当容器或相应地装置装填有或预装填有至少一种如上定义的式1的化合物作为稳定剂时，也获得有益的结果。优选地，除了式1的化合物之外还包含抗凝剂。抗凝剂优选地是螯合剂例如EDTA。此外，容器中包含的稳定化组合物还可以包含凋亡抑制剂、优选为半胱天冬酶抑制剂，和/或至少一种高渗剂、优选为至少一种上面详细描述的羟基化有机化合物例如二羟基丙酮，以及任选地其他添加剂。根据一种实施方式，容器中包含的稳定化组合物包含半胱天冬酶抑制剂和抗凝剂。

根据一种实施方式，容器具有开放的顶部、底部和在其间延伸的侧壁以限定腔室，其中本发明的稳定化组合物被包含在所述腔室中。它可以以液体或固体形式被包含在其中。根据一种实施方式，容器是管，底部是封闭的底部，容器还在开放的顶部包含封闭物，并且腔室处于降低的压力下。腔室中降低的压力的优点如上所述。优选地，封闭物能够被针或插管刺穿，并且降低的压力被选择成将特定体积的液体样品抽取到腔室中。根据一种实施方式，腔室处于降低的压力下，所述降低的压力被选择成将特定体积的液体样品抽取到腔室中，并且稳定化组合物是液体并被配置在所述腔室中，使得稳定化组合物与特定体积的含细胞的样品的体积比选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5。相关的优点如上所述。

优选地，容器用于从患者抽取血液。

根据第五方面，提供了一种方法，所述方法包括将样品从患者直接收集到本发明的第四方面的容器的腔室中的步骤。上面描述了关于容器和样品的详细情况。请参考相应的公开内容。根据一种实施方式，收集血液样品，优选地从患者抽取血液样品。

本文公开的方法和组合物允许有效地保护和分离细胞外核酸，同时减少与核酸、尤其是片段化基因组DNA的可能的混合，所述核酸、尤其是片段化基因组DNA源自于生物样品中包含的细胞并可能由于细胞损伤或相应地细胞裂解而进入生物样品。本发明的方法以及组合物和公开的装置（例如收集容器）减少细胞外核酸的降解并且也减少细胞裂解和/或基因组核酸、尤其是片段化基因组DNA的释放，使得样品中包含的细胞外核酸不被细胞内核酸污染，相应地，通过本发明的教导减少了相应的污染。正如上面讨论的，细胞外核酸与细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA的混合，可能降低生物样品中细胞外核酸量的任何测量的准确性。正如上面讨论的，本发明的重要优点是基本上同时使样品中包含的细胞（在全血、血浆或血清的情况下尤其是白细胞）和细胞外核酸两者稳定的可能性。这有助于防止细胞内核酸例如基因组DNA被释放到样品的无细胞部分中，并进一步稀释包含的目标细胞外核酸（和相关的生物标志物），同时还维持细胞外核酸的结构完整性。正如本文中讨论的，将含细胞的生物样品例如全血或血浆与稳定剂相接触，允许在分离细胞外核酸之前将样品储存一段时间。更优选地，可以在一个地点（例如卫生护理机构）抽取含细胞的生物样品例如血液或血浆，将所述样品与稳定剂相接触，并在晚些时候运输到不同的远处地点（例如实验室）进行核酸分离和测试过程。

此外，与涉及使用交联试剂例如甲醛、甲醛释放剂等的已知现有技术稳定化试剂相比，本文中公开的稳定化试剂提供了优势，因为本发明的样品稳定化不涉及使用这样的交联试剂。交联试剂在核酸分子之间或核酸与蛋白质之间产生分子间或分子内共价键。这种效应可以导致在从复杂的生物样品纯化或提取后，这种稳定化和部分交联的核酸的回收率降低。由于例如全血样品中循环核酸的浓度已经相对较低，进一步降低这种核酸的收率的任何措施都应该避免。当检测和分析源自于恶性肿瘤或妊娠期的前三个月中的发育胎儿的非常稀少的核酸分子时，这可能是特别重要的。因此，根据一种实施方式，在稳定化组合物中不包含甲醛释放剂，相应地，甲醛释放剂也不另外用于稳定化。根据一种实施方式，本发明的方法和/或组合物中使用的凋亡抑制剂不选自金精三羧酸、苯甲基磺酰氟（PMSF）、亮抑酶肽（leupeptin）和Nα-对甲苯磺酰基-Lys氯甲基酮盐酸盐（TLCK）。根据一种实施方式，凋亡抑制剂不选自上述物质，尤其是如果凋亡抑制剂不与作为附加的稳定剂的高渗剂组合使用时。

本发明不受本文中公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以被用在本发明实施方式的实践或测试中。数值范围包括限定该范围的数字。本文中提供的标题不是本发明的各个方面或实施方式的限制，本发明可以参考整个说明书进行理解。

当在本文中使用时，术语“溶液”具体是指液体组合物，优选为水性组合物。它可以是仅仅一个相的均匀混合物，但是，溶液包含固体添加剂例如沉淀物也在本发明的范围之内。

本文中对于核苷酸所指出的尺寸或相应地尺寸范围nt是指链长，并因此用于描述单链以及双链分子的长度。在双链分子中，所述核苷酸是成对的。

根据一种实施方式，本文描述的主题，当在方法的情况下包含某些步骤或在组合物、溶液和/或缓冲液的情况下包含某些成分时，是指由相应的步骤或成分构成的主题。优选地选择并组合本文描述的优选实施方式，并且由优选实施方式的相应组合产生的特定主题也属于本发明的公开内容。

表1：凋亡抑制剂的概述

实施例

在下面的实施例中，提供了本发明的材料和方法。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明。

I.材料和方法

设计了一种测试系统，其中将含细胞的生物样品、在这里是全血样品在室温（RT）下温育最长6或7天。其中，在第0天、第3天和第6/7天的样品上测试本发明的添加剂的样品稳定化性质。在适用时，样品按照下面的流程进行处理（详细情况也参见结果部分中的具体实施例）：

1.通过荧光活化细胞分选（FACS）测量血细胞完整性

1.1.红细胞的裂解

-将2ml血液样品转移到新鲜的15ml Falcon管中

-加入5倍缓冲液EL（QIAGEN）

-将样品颠倒（10X）

-在冰上温育（10min.）

-在400x g和4℃离心10min.

-丢弃上清液

-向白细胞团块加入2倍缓冲液EL（QIAGEN）

-通过轻微涡旋振荡将该团块重新溶解在缓冲液EL（QIAGEN）中

-以400x g离心10min

-丢弃上清液

-向白细胞团块加入500μl FACS Flow（Becton,Dickinson Plymouth,UK）

-通过轻微涡旋振荡将该团块重新溶解在FACS Flow中

-将1ml FACS Flow转移到新鲜FACS管中

-将100μl重新溶解的团块转移到FACS管中

将红细胞裂解是因为不这么做的话，在FACS分析中由于存在大量红细胞而不能区分出决定性细胞群体（其可以释放例如基因组DNA）。

1.2.通过流式细胞术测量细胞完整性

按照制造商的说明书进行测量（FACSCalibur；Becton,Dickinson Plymouth,UK）。

2.血浆的分离

为了从全血分离血浆，将血液样品以5000rpm离心15min，并将得到的血浆样品在4℃下以16.000x g再次离心10min。

得到的血浆用于分离其中包含的核酸。

3.核酸纯化

使用循环NA试剂盒（Circulating NA Kit）（按照手册），从得到的血浆样品纯化循环的细胞外核酸。简单来说：

-输入10ml样品；

-裂解：1ml蛋白酶K和8ml缓冲液ACL（QIAGEN）

-结合：18ml缓冲液ACB（QIAGEN）

-洗涤步骤：未改变的并按照手册

-在60μl缓冲液AVE（QIAGEN）中洗脱

4.洗脱液的分析

将按照3得到的洗脱液储存在-20℃下，直至所有样品（包括第6/7天的样品）都被纯化。随后，将相同条件的洗脱液合并并如下处理：

4.1.使用芯片凝胶电泳（2100Bioanalyzer；Agilent Technologies;Inc.,USA），按照制造商的说明书（参见Agilent DNA7500和DNA12000试剂盒指南手册），通过测定DNA尺寸分布来测量血细胞稳定性/DNA释放，区别在于将1.5μl而不是1μl样品转移到孔中。

4.2.使用对DNA降解敏感的实时PCR测定法进行DNA定量（靶：500和66bp长的核糖体18S DNA编码序列）。

DNA双重测定法按照多重PCR手册（Qiagen）来进行，其中进行了下面的修改：

-引物浓度从8μM放大到16μM。

-退火/延伸步骤从1min延长到2min。

（在扩增之前将样品1:10稀释）

4.3.使用对循环的无细胞RNA水平的变化敏感的实时PCR测定法来检测RNA（靶：18S rRNA，IL8，c-fos和p53）。RNA测定法按照表2至4中描述的条件来进行。

表2：示出了p53mRNA一步实时PCR的PCR试剂组成和循环条件

循环：

30min50℃

15min95℃

40个循环

15秒95℃

表3:示出了IL8mRNA一步实时PCR的PCR试剂组成和循环条件

循环：

30min50℃

15min95℃

40个循环

15秒95℃

1min.60℃

表4:示出了c-fos mRNA/18S rRNA双重实时PCR的PCR试剂组成和循环条件

循环：

30min50℃

15min95℃

40个循环

15秒95℃

1.30min.60℃

表5：概述了在4.2和4.3中检测的所使用的DNA靶序列的信息

II.进行的实验和结果

随后，解释进行的实验的详细情况。在上面的I中描述了实施例中使用的方法的详细情况。

实施例1：由添加半胱天冬酶抑制剂引起的稳定化

测试了用作广谱半胱天冬酶抑制剂的两种不同的寡肽Q-VD-OPh和Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK：

表6：测试的半胱天冬酶抑制剂

向全血样品加入每种测试的半胱天冬酶抑制剂（在10ml血液中20μM终浓度；血液被收集在BD的Vacutainer K2E管中）。全血样品按照部分I中所述进行处理，参见2（血浆制备）和3（核酸分离）。

芯片凝胶电泳的结果

使用芯片凝胶电泳将洗脱的循环的无细胞DNA按照尺寸进行分离（方法的详细情况参见上面I，4.1）。图1a示出了得到的结果。DMSO对照和K2E血液（没有按照本发明的教导进行处理）显示出同样的梯状条带图案。这种图案出现在发生凋亡的样品中。在凋亡期间，核酸内切酶在核小体间连接区处降解基因组DNA，并产生约180bp或180bp的倍数的DNA片段。因此，在显示出清楚的梯状图案的样品中，发生了凋亡。此外，图案的强度（暗度）是决定性的。条带越暗，从细胞释放并因此污染细胞外核酸群体的基因组DNA越多。

图1a）显示，DMSO对照和K2E血液样品在第3天已经显示出强的梯状图案，其在第7天变得甚至更强。因此，基因组DNA从样品中包含的细胞释放出来并且还被降解。这种释放和降解的DNA污染了样品中包含的无细胞核酸。因此，对于这些样品来说，没有获得可接受的稳定化。

相反，与对照相比，用Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK处理的全血样品显示出减少的梯状图案，尤其是在第7天，这表明了对由凋亡引起的基因组DNA释放或相应的基因组DNA片段化的抑制。这种效果得到了图1b）中示出的结果的证实（参见下文）。在用Q-VD-Oph处理的血液样品中，该效果甚至更加显著，所述样品在第3天和第7天已经显示出显著减少的梯状图案。因此，通过添加半胱天冬酶抑制剂Q-VD-Oph，有效地防止或相应地减少了基因组DNA的释放和降解。

DNA定量的结果

还使用对DNA降解敏感的实时PCR测定法来定量洗脱的循环的无细胞DNA（方法的详细情况参见上面I，4.2）。图1b）显示了在RT下储存7天内，测试的半胱天冬酶抑制剂对细胞外核酸群体的稳定化的影响（18S DNA双重测定法），所述细胞外核酸群体的稳定化在这里是指DNA的增加。

通过定量实时PCR检测核糖体18S DNA，能够计算从第0天至第3天或7天的DNA增加倍数（计算：用第3天（或第7天）的拷贝数除以第0天的拷贝数）。令人吃惊的是，图1b）中示出的结果证实了当向全血样品添加半胱天冬酶抑制剂特别是Q-VD-OPh时，DNA的增加减少。与标准样品相比，Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK的稳定化效果在第7天更加显著，从而证实了图1a）中示出的结果。

概述

总结实时PCR和凝胶电泳的结果，证实了添加Q-VD-OPh或Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK抑制了DNA片段化，并且此外还减少基因组DNA释放到血浆中。因此，向全血添加半胱天冬酶抑制剂，即使在室温下也有效地使样品、尤其是细胞外核酸群体稳定。因此，使用本发明的稳定化方法允许甚至在室温下运输全血样品而不损害样品的质量。为了在更长的储存时间段中也完全防止基因组DNA的释放，也可以提高Q-VD-OPh的浓度。

实施例2：较低浓度的半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPh对血液稳定性的影响

在本实施例中，测试了较低浓度的半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPh与葡萄糖的组合，其中加入作为组合配偶体的葡萄糖是为了支持血细胞保持存活（通过防止细胞损伤）。向抽取到BD Vacutainer管中的10ml血液加入21.4mM葡萄糖和4μM、1μM或0μM的Q-VD-OPh，并在室温下储存长达7天。将全血样品按照部分I中的描述进行处理，参见2（血浆制备）和3（核酸分离）。

芯片凝胶电泳的结果

使用芯片凝胶电泳将洗脱的DNA按照尺寸进行分离（方法的详细情况参见上面I，4.1）。图2a显示，与未添加半胱天冬酶抑制剂的对照样品相比，1μM半胱天冬酶抑制剂在第7天已经显著减少基因组DNA的释放/片段化。如果使用4μM半胱天冬酶抑制剂，则效果得到提高。因此，非常低浓度的半胱天冬酶抑制剂已经有效地使血液样品稳定，尤其是在与糖类组合时。

DNA定量的结果

图2b示出了在RT下储存7天内，所测试浓度的半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPh与21mM葡萄糖的组合对血浆中基因组DNA的增加的影响（18S DNA双重测定法）。添加Q-VD-OPh与葡萄糖的组合显著减少了基因组DNA释放到血浆中。图2b显示，即使仅仅向全血样品加入1μMQ-VD-OPH用于稳定化，在7天的储存中基因组DNA也仅有少量增加。添加4μM Q-VD-OPh将基因组DNA向血浆的释放抑制到最多4倍的增加。相反，将全血抽取到K2E管中而不按照本发明进行稳定化，导致血浆中DNA增加约40倍。

因此，图2b）也证实了半胱天冬酶抑制剂即使在低浓度下也对全血具有稳定化效果。

实施例3：通过渗透效应使血细胞稳定

本发明人还令人吃惊地发现，通过在全血中添加用作高渗介质的试剂，可以使血细胞稳定。通过向全血加入例如羟基化有机化合物产生高渗介质，导致水从包含的血细胞的轻微释放并通过细胞收缩而导致稳定性提高。据推测，所述细胞皱缩使细胞稳定以对抗机械力。

二羟基丙酮（DHA）是果糖代谢的中间产物，其磷酸酯形式磷酸二羟基丙酮（DHAP）是糖酵解的一部分。将DHA作为高渗剂进行测试。添加这种试剂灵敏地迫使血细胞皱缩而不损伤它们。首先将DHA溶解在PBS（购自SIGMA-Aldrich，目录号：D8537）或3x MOPS（稀释自1升10x MOPS：200mM MOPS，50mM NaAc，10mM EDTA，pH5；据推测，酸性介质也使ccf RNA稳定）中，获得4.2M溶解的DHA。然后向10ml血液加入2ml溶解在PBS缓冲液或3x MOPS缓冲液中的4.2M DHA，以在全血中获得0.7M DHA的终浓度。将两种不同的DHA溶剂与现有技术的用于DNA稳定化的血液收集管血液DNA管（QIAGEN）进行比较。

FACS分析的结果

使用FACS分析血细胞完整性（方法的详细情况参见上面的I，1）。

图3示出了通过流式细胞术测量到的血细胞完整性。点图显示了三种不同的细胞群体：粒细胞（1）、单核细胞（2）和淋巴细胞（3）。图的左下区域中的云状物（4）表示主要由红细胞的裂解产生的碎片。

图3中的结果显示，在储存的第6天时，被收集并储存在血液DNA管中的血细胞不能彼此区分开并与碎片区分开。添加DHA能够在储存的第6天区分血细胞的子群体，尽管这些细胞由于细胞皱缩而变得更小。这表明，通过添加DHA使样品中包含的细胞稳定。

芯片凝胶电泳的结果

图4a中示出的结果还显示出由添加DHA引起的血液样品稳定化，因为与储存在血液DNA管中的样品相比，在DHA处理的样品中，基因组DNA的释放显著减少。此外，正如从图4a明显看出的，DHA-稳定化的样品不显示出梯状降解图案，表明有效地防止了凋亡或相应地DNA降解。

DNA定量的结果

图4b显示出在RT下储存6天中，DHA对DNA的增加的影响（18SDNA双重测定法）。溶解在3x MOPS中的DHA提供了最好的结果，因为核糖体18S DNA的水平看起来保持恒定，直至储存的第3天。

用短扩增子拷贝数除以长扩增子拷贝数（66bp/500bp），指示了检测到的短或长扩增子的量是否以相似的方式随时间变化。该比率的降低暗示较长的DNA分子的释放而不是较短的DNA分子的释放更强，并且可以被解释为从血细胞释放出高分子量的基因组DNA。图4b中示出的图指示了所有3种条件下基因组DNA的释放。结果显示，DHA的存在减缓了这一过程。因此，本实验还显示，向EDTA全血添加DHA使血细胞稳定，并因此保护无细胞血浆级分中的ccfDNA群体，并避免了例如由于机械破坏造成的从样品中包含的细胞释放的DNA的污染。

实施例4：测试不同浓度的二羟基丙酮

在本实施例中，测试了不同浓度（0.7M、0.5M和0.2M）的DHA的稳定化效果。

FACS分析的结果

图5示出了通过流式细胞术测量到的血细胞完整性。点图显示了三种不同的细胞群体：粒细胞（1）、单核细胞（2）和淋巴细胞（3）。图的左下区域中的云状物表示主要由红细胞的裂解产生的碎片。

由于向全血添加DHA，不论DHA浓度如何，即使在储存的第6天，也可以区分出不同的细胞群体。尽管流式细胞术分析的结果（图5）没有显示出不同浓度DHA之间的细胞完整性差异

芯片凝胶电泳的结果

图6a中示出的结果还显示出由添加不同浓度的DHA引起的血液样品稳定化，因为有效地防止了基因组DNA的释放和DNA的降解。

DNA定量的结果

图6b示出了在RT下储存6天内，不同DHA浓度对DNA的增加的影响（18S DNA双重测定法）。正如在图6b中所示，全血中的0.5MDHA最有效地防止基因组DNA的释放。此外，短扩增子拷贝数与长扩增子拷贝数之比在长达3天内保持恒定，直至第6天才仅仅略微降低。这些结果证实了高渗剂DHA对全血的稳定化的显著效果。

实施例5：凋亡抑制剂、渗透活性化合物和抗凝剂的组合

血液收集管中EDTA的增加抑制微小和巨大的凝血，正如对血液DNA管所知的。因此，较高浓度的EDTA可以支持血浆中血细胞和细胞外核酸的稳定化。此外，上面所示的实验显示了半胱天冬酶抑制剂、尤其是Q-VD-OPh和渗透活性化合物DHA对血细胞损伤的抑制性效应，尤其显示了细胞外核酸群体中基因组DNA、尤其是片段化基因组DNA的增加被有效地降低。令人吃惊的是，测试的半胱天冬酶抑制剂还防止/抑制基因组DNA泄漏到无细胞（血浆）级分中。因此，这些试剂的组合导致全血中细胞外核酸、尤其是细胞外DNA的至少持续6天的改进的稳定化，此外还导致血细胞的有效稳定化，从而防止基因组DNA的释放，所述基因组DNA的释放原本会引起血浆中天然的细胞外核酸水平的稀释。

在本实施例中，将DHA溶解在2ml3x MOPS（3M DHA在2ml3x MOPS中）中，加入50mgK₂EDTA和2.4μl5nM Q-VD-OPh，然后转移到被收集在K2E管中的10ml全血中。将血浆样品在4℃下以16.000x g离心10min，然后使用循环NA试剂盒（Qiagen）进行纯化（上面在部分I中描述了详细情况）。

FACS分析的结果

图7a显示了通过流式细胞术测量到的血细胞完整性。点图显示了三种不同的细胞群体：粒细胞（1）、单核细胞（2）和淋巴细胞（3）。图的左下部分中的云状物表示主要由残留的红细胞的裂解产生的碎片。

向全血添加半胱天冬酶抑制剂、高渗剂和络合剂，在储存6天后产生血细胞群体的可区分的图案。因此，血液样品中包含的细胞被有效地稳定化。

DNA定量的结果

图7b示出了在RT下储存6天内，EDTA、DHA和半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPH的组合对DNA的增加的影响（18S DNA双重测定法）。结果表明，EDTA、DHA和Q-VD-OPH的组合导致血浆中细胞外DNA的相当强的稳定化（测量到的18S rDNA水平保持恒定直至第6天），并且强烈防止基因组DNA从血细胞释放（短扩增子拷贝数与长扩增子拷贝数之比保持恒定）直至储存的第3天。在储存的第3天与第6天之间，仅仅观察到血浆中基因组DNA的略微增加。

因此，所测试的稳定剂组合在使全血样品稳定方面中特别有效。

实施例6：凋亡抑制剂、渗透活性化合物和预防剂对全血中游离的循环RNA的影响

由于K₂EDTA、Q-VD-OPh和DHA的组合对全血中游离的循环DNA和血细胞完整性显示出显著的稳定化效果，因此还分析了这些试剂对游离的循环RNA的稳定化能力。为了保持血浆中游离的循环RNA的恒定水平（如收集血液时所存在的），稳定化试剂不应仅保护RNA免于降解和防止RNA从衰退的血细胞释放，而且还应该抑制代谢途径，或相应地具有代谢途径的变化不影响细胞外RNA的血浆水平的效果，或相应地应该减少相应的效果。因此，重复了实验5并通过实时RT-PCR测量mRNA水平。

图8示出了在储存的6天内，EDTA、DHA和所测试的半胱天冬酶抑制剂的组合对血浆中转录水平的影响。为了测量RNA水平的变化，通过计算p53、IL8或c-fos与内部标准（18SrRNA）之间的ΔCt，将靶mRNA参比于参考靶（18S rRNA）。第3天或第6天样品的ΔCt减去第0天样品的ΔCt，得到ΔΔCt，其显示出mRNA转录水平的相对减少（-值）或增加（+值）。IL8和c-fos是在抽血后诱导其转录的基因。因此，当细胞释放出其内含物时，这些靶的转录水平将急剧升高；添加本发明的优选实施方式的稳定化溶液（升高的EDTA、二羟基丙酮、半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPh的组合）强烈防止核酸从血细胞释放，直至储存的第3天。但是，上图中的数据令人吃惊地显示，直至储存的第6天，c-fos和IL8仍没有显著增加。因此，显然，稳定化防止了RNA的降解（p53）和mRNA的释放（IL8/c-fos）。

在抽血后，在连续代谢期间p53的转录被抑制，因此p53mRNA的降解或下调将导致（-）ΔΔct的降低。然而，结果显示，所测试的QGN稳定化溶液在长达6天的全血储存期间防止p53mRNA水平被降低。

这个实验证实，向新鲜抽取的全血添加升高的EDTA、二羟基丙酮、半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPh的组合，起到保护抽血时存在的循环血浆mRNA群体，减少mRNA浓度的mRNA特异性变化的作用。这对于血浆中循环mRNA的分析，例如潜在的肿瘤特异性mRNA物质的鉴定和表征来说，是特别重要的。这样的研究要求在抽血与核酸提取和分析之间血浆中的mRNA群体保持基本上不变。

实施例7：由添加二甲基乙酰胺（DMAA）引起的稳定化

测试了与K₂EDTA合在一起的两种不同浓度的DMAA，并与单独的EDTA（K2E BD；18mgK₂EDTA）进行比较。

向全血样品的平行样加入DMAA（在10ml血液中0.75%和1.5%的终浓度；血液被收集在BD的Vacutainer K2E管中）。

将血液样品在室温下温育长达6天。在第0、3和6天，将全血样品在室温下以1912xg离心15min，然后将血浆样品在4℃下以16.000x g离心10min。使用1ml样品输入量，按照材料和方法部分中描述的流程进行DNA分离。将DNA洗脱在80μl EB缓冲液中，并使用I，4.2中描述的RT PCR测定法进行定量。

DNA定量的结果

图11显示了测试浓度的DMAA对血浆中基因组DNA的增加的影响。添加DMAA显著减少了基因组DNA释放到血浆中。向全血添加的DMAA越多，释放的DNA越少。如果向全血样品加入1.5%DMAA，则在储存的6天内仅观察到无细胞DNA的少量增加。此外，由于与添加0.75%DMAA相比，添加1.5%DMAA更有效地使全血样品中的无细胞DNA水平稳定，并且从第0天到第6天，测量到的短与长18S DNA拷贝之比降低，因此高于1.5%的DMAA浓度可以产生更有效的稳定化效果。

概括来说，添加DMAA减少了基因组DNA释放到血浆中。因此，向血液样品添加DMAA即使在室温下也有效地使样品稳定。

实施例8：糖醇对保持全血中ccfDNA状态的影响

首先将两位供体的10ml全血样品收集在BD VacutainerK2E-EDTA（4.45mM EDTA=参比）中。然后加入2ml下列稳定化溶液（给出的浓度表示稳定化的血液溶液中的终浓度）：

将相应稳定化的样品在室温下温育长达6天。在第0天、第3天和第6天，将平行样如下进行处理。将样品在室温下以3.000rpm离心10分钟以便收集血浆。将收集的血浆在4℃下以16,000x g离心10分钟。收集澄清的血浆级分，并使用QIAamp循环核酸试剂盒分离细胞外核酸（1ml输入材料，60μl洗脱体积）。结果以与第0天测试时间点相比的相对变化（第X天拷贝数/第0天拷贝数）显示在图10中。接近于1的值暗示ccfDNA水平得以保持。所述值越高，获得的稳定化越小。在测试的糖醇中，使用DHA（0.5M）获得非常好的结果。此时，观察到血浆级分中ccfDNA水平的最低增加。其他适合的可选物是浓度为例如0.05M的肌醇和浓度≤0.01M的麦芽糖醇。此外，使用甘露糖醇时也观察到超过3天的稳定化效果。

实施例9：DMAA、DHA和甘氨酸对ccfDNA水平的影响

首先将三位供体的10ml全血样品收集在BD VacutainerK2E-EDTA（4.45mM EDTA=参比）中。然后加入2ml下列溶液（给出的浓度表示稳定化的血液溶液中的终浓度）：

样品如实施例8中所述进行处理。结果以及测试条件被示出在图11中。正如可以看到的，单独的DHA使ccfDNA水平稳定长达三天（参见供体1）。当使用QGN混合物时，获得特别稳定的ccfDNA水平。当向样品添加DMAA并与例如增加EDTA浓度和添加半胱天冬酶抑制剂组合时，可以获得与QGN混合物相当的结果。

实施例10：糖醇与半胱天冬酶抑制剂和提高的EDTA浓度的组合对ccfDNA水平的影响

首先将两位供体的10ml全血样品收集在BD VacutainerK2E-EDTA（4.45mM EDTA=参比）中。然后加入2ml下列溶液（给出的浓度表示稳定化的血液溶液中的终浓度）：

1：0.5M DHA，1μM OPH，14mM EDTA（QGN混合物）；

2：0.5M肌醇在QGN混合物中（无DHA）；

3：0.01M麦芽糖醇在QGN混合物中（无DHA）。

然后将样品如实施例8中所述进行处理。结果示出在图12中。使用QGN混合物时获得最好结果。与EDTA稳定化的样品相比，糖醇与QGN混合物的组合也显示出稳定化效果。

实施例11：DMAA与OPH（半胱天冬酶抑制剂）浓度的组合对ccfDNA水平的影响

首先将10ml全血样品收集在BD Vacutainer K2E-EDTA（4.45mMEDTA=参比）中。然后加入2ml下列溶液（给出的浓度表示稳定化的血液溶液中的终浓度）。每种条件使用来自于不同供体的6个管进行测试。

1：EDTA参比（BD Vacutainer K2E）；

2：QGN混合物；

3：50mg EDTA，1μM OPH；

4：50mg EDTA，2μM OPH；

5：50mg EDTA，1μM OPH，5%DMAA；

6：50mg EDTA，1μM OPH，10%DMAA；

7：50mg EDTA，2μM OPH，5%DMAA；

8：50mg EDTA，2μM OPH和10%DMAA。

如实施例8中所述进行样品温育、血浆分离和从澄清的血浆级分分离核酸。然而，在3.000rpm的第一离心步骤后，将稳定化条件一致的血浆样品合并，然后进行用于血浆澄清的第二离心步骤（16.000x g）。结果显示在图13中。正如可以看到的，不同DMAA浓度与不同OPH浓度的组合显示出与QGN混合物相当的结果。图14示出了DMAA与OPH浓度的组合对ccfDNA水平的影响（由于参比数据的范围产生的不同标度）。

实施例12：QGN混合物与糖醇的组合对ccfDNA水平的影响

首先将10ml全血样品收集在BD Vacutainer K2E-EDTA（4.45mMEDTA=参比）中。然后加入2ml下列溶液（给出的浓度表示稳定化的血液溶液中的终浓度）。每种条件使用6个管并因此6个不同供体进行测试。

1：EDTA参比（BD Vacutainer K2E）；

2：QGN混合物（0.01M DHA，14mM EDTA，1μM OPH）；

3：0.01M DHA；

4：5%DMAA，14mM EDTA，1μM OPH；

5：0.01M DHA，3%DMAA，1μM OPH，14mM EDTA；

6：1μM OPH，14mM EDTA，0.01M DHA，0.01M麦芽糖醇；

7：1μM OPH，14mM EDTA，0.01M DHA，0.05M肌醇；

8：1μM OPH，14mM EDTA，0.01M DHA，0.05M肌醇，0.01M麦芽糖醇。

将样品如实施例11中所述进行处理。然而，样品不被储存在室温，而是储存在37℃下。结果显示在表15中。正如可以看到的，获得了稳定的ccfDNA水平，特别是当加入5%DMAA与14mM EDTA和1μMOPH的组合时。因此，出人意料地，即使在升高的温度（37℃）下也可以获得全血中ccfDNA的非常良好的稳定化。

实施例13：在37℃下温育-单个供体样品的分析

将来自于6个不同供体的全血样品收集在BD Vacutainers K2E中，然后每10ml全血中加入2ml下列稳定化溶液（给出的浓度表示稳定化的血液溶液中的终浓度）：

1：2μM OPH，14mM EDTA，5%DMAA；

2：1μM OPH，14mM EDTA，3%DMAA；

3：1μM OPH，14mM EDTA，0.01M DHA，3%DMAA。

将样品在37℃下温育长达6天。其他方面遵从与实施例8中相同的程序。结果显示在图16和17中。正如可以看到的，对于所有6位供体来说，当向血液样品加入不同浓度的DMAA与OPH和EDTA的组合时，ccfDNA的水平得以保持。因此，使用本发明的方法可以获得有效的稳定化。

实施例14：检测限（LoD）

细胞外核酸通常以非常小的量包含在样品中。因此，获得不仅有效地保护稳定化的样品中的细胞外核酸，而且还允许随后从稳定化的样品以高得率分离细胞外核酸的稳定化程序，是重要的。实施例14证实，本发明的稳定化方法优于现有技术的稳定化方法，因为可以以更高的得率从稳定化的样品分离细胞外核酸。这有利地降低了检测限，并且也因此允许可靠地测定细胞外核酸群体中稀有的靶核酸。

比较了下列稳定化溶液/管：

1.无细胞RNA BCT（Streck Inc，目录号：218976-包含甲醛释放剂作为稳定剂）

2.BD Vacutainer K2E（BD，目录号：367525-包含EDTA）=参比

3.QGN稳定化（5%DMAA，14mM EDTA，2μM OPH（半胱天冬酶抑制剂））

将全血样品收集在无细胞RNA BCT和BD Vacutainer K2E管中。向收集在BD管中的一半血液加入QGN稳定化溶液。因此，按照本发明稳定化的样品包含由BD Vacutainer稳定化管提供的附加量的EDTA。将样品以3.000x rpm离心10分钟，并将得到的血浆等分成1.5ml平行样。随后，向每个样品加入下列量的DNA掺入对照（1.000bp）：1.000个拷贝，5000个拷贝，100个拷贝，50个拷贝和10个拷贝。

制备500至10个拷贝/样品的8个平行样，1.000个拷贝/样品和5个拷贝/样品的4个平行样。将样品在室温下温育3天。在QIAsymphonySP自动化系统上，使用允许从血浆样品分离细胞外核酸的QIAsymphony病毒/细菌无细胞1000应用，来进行样品制备。将核酸洗脱在60μl中；随后以一式三份进行PCR。

结果显示在图18中。正如可以看到的，当使用BD EDTA管或本发明的稳定化溶液时，获得≥1.000个拷贝/样品的100%命中。这显示，当使用本发明的稳定化溶液时，核酸的分离不受损害。相反，基于使用甲醛释放剂（Streck）的稳定化显示出核酸分离的强烈抑制。正如可以看到的，可以从相应样品分离的核酸显著更少，即使是那些其中掺入500或甚至1.000个拷贝的样品。此外，图18显示，使用按照本发明稳定化的样品时获得最佳灵敏度。即使对于那些其中仅掺入10个拷贝/样品的实施方式来说，仍获得13%的阳性PCR命中。因此，本发明的方法不仅有效地使样品例如血液样品稳定，而且还允许随后回收甚至非常低丰度的细胞外核酸。这是重要的优点，因为它使这种方法特别适用于诊断应用和例如稀有的目标细胞外核酸例如肿瘤来源的细胞外核酸或胎儿核酸的检测。特别是，在较低的拷贝数下，基于使用甲醛释放剂的稳定化溶液具有非常低的性能，并显示出最高的检测限。

这也通过下表得到证实：

正如可以从所述表看出的，对于1.000bp片段来说，使用EDTA样品和本发明的稳定化溶液获得的结果是可比的。因此，本发明的稳定化不损害随后的核酸分离。使用甲醛释放剂实现的稳定化显示出最高的检测限，因此表明随后的核酸分离是严重受损的。因此，本发明的稳定化适用于稀有ccfDNA靶的灵敏检测，这通过使用现有技术的方法不能实现。

这也通过图19和20中示出的结果得到证实。正如可以看到的，对于EDTA稳定化的样品和使用本发明的方法稳定化的样品来说，获得了可比的ccfDNA得率（由18S rDNA qPCR测量到）。然而，对于涉及使用甲醛释放剂（Streck管）的稳定化来说，获得降低的ccfDNA得率。与EDTA稳定化的样品相比，甲醛稳定化的样品的得率降低约50%。相反，当使用常规核酸分离方法时，本发明的稳定化试剂对ccfDNA得率没有不利影响。这是重要的优点，因为它允许将本发明的稳定化方法整合到现有的核酸分离程序和工作流程中。

实施例15：向3位供体的全血样品掺入10^4IU/ml HIV、HCV

将全血样品收集在BD Vacutainers K2E管中。然后加入2ml下列稳定化溶液（给出的浓度表示稳定化的血液溶液中的终浓度）。然后，以10^4IU/ml向全血样品加入HIV和HCV。

1：5%DMAA，50mg EDTA，1μM OPH，0.05M肌醇；

2：5%DMAA，50mg EDTA，1μM OPH，0.01M麦芽糖醇；

3：5%DMAA，50mg EDTA，1μM OPH，0.05M肌醇；0.01M麦芽糖醇；

4：2%肌醇，4%山梨糖醇。

再次使用BD Vacutainer K2E稳定化的样品作为参比。

将样品在37℃下温育长达6天。在第0天和第6天，将平行样进行如下处理：将样品在室温下以3.000rpm离心15分钟以收集血浆。然后将得到的血浆在4℃下以16.000x g再次离心10分钟。使用QIAsymphony病毒/细菌无细胞1000流程，对从澄清的血浆上清液获得的细胞外核酸进行纯化。使用1ml血浆作为输入材料，使用60μl体积进行洗脱。结果显示在图21中。正如可以看到的，将DMAA、EDTA和OPH与糖醇组合允许使病毒核酸水平在37℃下稳定长达3天。因此，本发明的方法特别适用于诊断应用，并且也适用于在可能没有冷藏设施可用的情况下使环境中的样品稳定。与EDTA血液参比相比，第0天与第3天之间的ΔCt减小（约2.5的ΔCt到约1的ΔCt）。此外，使用山梨糖醇与肌醇的组合时，观察到稳定化效果（ΔCt为约1到1.4）。

图22示出了在37℃下温育的全血中HCV的减少。同样地，它显示出当将DMAA、EDTA和OPH与糖醇组合时，使HCV核酸水平在37℃下稳定3天，如由病毒RNA水平的缓慢降低所指示的。与EDTA血液参比（ΔCt为约2-3）相比，第0天与第3天之间的ΔCt减小（ΔCt为约1）。此外，对于山梨糖醇与肌醇的组合来说，获得良好的稳定化效果。

实施例16：使用N,N-二甲基丙酰胺和半胱天冬酶抑制剂实现的稳定化

将来自于2位不同供体的血液收集在10ml K2EDTA管（BD）中。将4.5ml相应地收集的血液与0.9ml稳定化溶液混合，所述稳定化溶液分别含有（每ml稳定化溶液）：34.2mgK2EDTA，1.2ml喹啉-Val-Asp-CH2-OPH（半胱天冬酶抑制剂）溶液（1mg溶解在388μl DMSO中），以及0.15g或0.3g或0.45g N,N-二甲基丙酰胺或0.3ml DMAA。由此，在血液/稳定化混合物中获得如下的终浓度：

分别为5.7mg K2EDTA，1μM喹啉-Val-Asp-CH2-OPH（半胱天冬酶抑制剂），以及2.5、5或7.5%（w/v）的N,N-二甲基丙酰胺或5%（v/v）DMAA。

所有稳定化的血液样品在每种条件和测试时间点下设置3份平行样。在0时间点时（参比），在将稳定化溶液与血液混合之后，立即产生血浆并提取ccfDNA。将剩余的血液样品在室温下储存3天和6天。作为对照，将EDTA稳定化的血液样品也储存3和6天。通过将含有血液的管颠倒4次，从稳定化和未稳定化的（EDTA）血液样品产生血浆。然后将管以3.000rpm/1912x g离心15分钟。将2.5ml血浆级分转移到新鲜的15ml falcon管中，并以16.000x g离心10分钟。将2ml相应的澄清血浆用于通过使用QIAamp循环核酸试剂盒分离细胞外核酸。

结果显示在图23和24中。使用18SrRNA基因的不同扩增子长度，示出了使用2.5%、5%和7.5%N,N-二甲基丙酰胺或5%DMAA时相对于0时间点的DNA增加（倍数变化）。条指示每种条件和测试时间点下三份平行样的平均值。与未稳定化的EDTA血液相比，本发明的所有溶液均显示出，在室温下储存3和6天后，释放的DNA的量显著降低。

Claims (42)

1.一种用于使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法，所述方法包括将样品与半胱天冬酶抑制剂相接触。

2.权利要求1的方法，其包括将所述样品与下列物质相接触：

至少一种半胱天冬酶抑制剂以及至少一种式1的化合物，

其中R1是氢基团或烷基基团，R2和R3是相同或不同的以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基团，并且R4是氧、硫或硒基团。

3.权利要求2的方法，其中R1是C1-C5烷基基团。

4.权利要求2的方法，其中R1是甲基基团。

5.权利要求1至4任一项的方法，其中还将所述样品与抗凝剂相接触。

6.权利要求1至4任一项的方法，其中由于稳定化，基因组DNA从所述样品中包含的细胞向所述样品的无细胞部分的释放减少，和/或所述样品中存在的核酸的降解减少。

7.权利要求1的方法，其中

a)所述半胱天冬酶抑制剂具有一个或多个下述特征：

i)它是泛半胱天冬酶抑制剂；和

ii)它选自Q-VD-OPh和Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK。

8.权利要求2至4任一项的方法，其中

a)所述半胱天冬酶抑制剂具有一个或多个下述特征：

i)它是泛半胱天冬酶抑制剂；和

ii)它选自Q-VD-OPh和Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK

和/或

b)其中所述式1的化合物具有一个或多个下述特征：

i)R1、R2和R3包含1至5个碳原子；

ii)R4是氧；

iii)它是N,N-二烷基-羧酸酰胺；

iv)它选自N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二乙基甲酰胺；和

vi)它是N,N-二甲基丙酰胺。

9.权利要求8的方法，其中所述式1的化合物具有下述特征：R1、R2和R3包含1或2个碳原子。

10.权利要求5的方法，其中所述抗凝剂为螯合剂。

11.权利要求1的方法，其中在将所述样品与所述半胱天冬酶抑制剂相接触之后，得到的混合物具有一个或多个下述特征：

a)它包含所述半胱天冬酶抑制剂，所述半胱天冬酶抑制剂的浓度为至少0.01μM；和

b)它包含所述半胱天冬酶抑制剂，所述半胱天冬酶抑制剂的浓度范围为0.01μM至100μM。

12.权利要求2至4任一项的方法，其中在将所述样品与所述半胱天冬酶抑制剂和/或所述式1的化合物相接触之后，得到的混合物具有一个或多个下述特征：

a)它包含所述半胱天冬酶抑制剂，所述半胱天冬酶抑制剂的浓度为至少0.01μM；

b)它包含所述半胱天冬酶抑制剂，所述半胱天冬酶抑制剂的浓度范围为0.01μM至100μM；

c)它包含所述式1的化合物，所述式1的化合物的浓度为至少0.1％；和

d)它包含所述式1的化合物，所述式1的化合物的浓度范围为0.1％至50％。

13.权利要求11的方法，其中所述得到的混合物具有一个或多个下述特征：

a)它包含所述半胱天冬酶抑制剂，所述半胱天冬酶抑制剂的浓度为至少3.5μM；和

b)它包含所述半胱天冬酶抑制剂，所述半胱天冬酶抑制剂的浓度范围为2.5μM至25μM。

14.权利要求12的方法，其中所述得到的混合物具有一个或多个下述特征：

a)它包含所述半胱天冬酶抑制剂，所述半胱天冬酶抑制剂的浓度为至少3.5μM；

b)它包含所述半胱天冬酶抑制剂，所述半胱天冬酶抑制剂的浓度范围为2.5μM至25μM；

c)它包含所述式1的化合物，所述式1的化合物的浓度为至少1％；和

d)它包含所述式1的化合物，所述式1的化合物的浓度范围为1％至10％。

15.权利要求1至4任一项的方法，其中为了稳定化将所述样品与下列物质相接触：

a)至少一种作为半胱天冬酶抑制剂的泛半胱天冬酶抑制剂，

b)至少一种高渗剂，以及

c)至少一种式1的化合物，

其中a)至c)的化合物被包含在稳定化组合物中，并且

其中所述高渗剂具有一个或多个下述特征：

i)它是不带电荷的；

ii)它通过诱导细胞皱缩使所述样品中包含的细胞稳定；

iii)它是不能透过细胞的；

iv)它是水溶性的；

v)它是羟基化有机化合物；

vi)它是多元醇；

vii)它是羟基-羰基化合物；

viii)它是糖或糖醇；和

ix)它是二羟基丙酮。

16.权利要求15的方法，其中为了稳定化将所述样品还与下列物质相接触：

d)抗凝剂，

其中所述抗凝剂被包含在稳定化组合物中。

17.权利要求1至4任一项的方法，其中所述样品具有一个或多个下述特征：

a)它包含细胞外核酸；

b)它选自全血、源自于血液的样品、拭子/涂片、体液、身体分泌物、排泄物以及细胞培养上清液；

c)它是细胞贫化的体液或含细胞的体液；

d)它选自全血、血浆和/或血清；

e)它是全血；和

f)它选自血浆、血清、淋巴液、尿液、脑脊液、腹水、乳液、粪、支气管灌洗液、唾液、羊水、精液、鼻分泌物、阴道分泌物和伤口分泌物。

18.权利要求1至4任一项的方法，其中在无需冷藏的条件下，在至少两天的时间段内能够实现所述细胞外核酸群体的稳定化。

19.权利要求1至4任一项的方法，其中所述方法具有一个或多个下述特征：

a)还将一种或多种稳定剂包含在稳定化组合物中，并且其中所述稳定化组合物与特定体积的含细胞的样品的体积比选自10:1至1:20；

b)使稳定化的样品经受核酸分析；

c)使稳定化的样品经受核酸检测方法；

d)从稳定化的样品分离细胞外核酸；

e)从稳定化的样品分离细胞外核酸，并对分离的核酸进行分析；

f)从稳定化的样品分离细胞外核酸，并对分离的核酸进行检测；

g)去除稳定化的样品中包含的细胞；

h)在进行分离、分析或检测步骤之前去除稳定化的样品中包含的细胞；

i)在如权利要求18中所定义的稳定化时间段后进行核酸分离步骤；

j)储存(i)稳定化的样品，(ii)其中细胞已被去除的稳定化的样品或(iii)从所述稳定化的样品去除的细胞；

k)丢弃从稳定化的样品去除的细胞；和

l)从细胞分离核酸，所述细胞是从稳定化的样品去除的细胞。

20.权利要求19的方法，其中还将一种或多种稳定剂包含在稳定化组合物中，并且其中所述稳定化组合物与特定体积的含细胞的样品的体积比选自1:1至1:10。

21.权利要求1至4任一项的方法，其中储存稳定化的样品，或者其中储存细胞已被去除的稳定化的样品和从所述稳定化的样品去除的细胞。

22.权利要求1至4任一项的方法，其用于使血液样品中包含的细胞外核酸群体稳定，所述方法包括将所述血液样品与半胱天冬酶抑制剂和抗凝剂相接触，其中由于稳定化，基因组DNA从所述血液样品中包含的细胞向所述血液样品的无细胞部分的释放减少，并且所述样品中存在的核酸的降解减少。

23.权利要求1至4任一项的方法，其包括将所述样品再与高渗剂相接触，其中所述高渗剂具有一个或多个下述特征：

i)它是不带电荷的；

ii)它通过诱导细胞皱缩使所述样品中包含的细胞稳定；

iii)它是不能透过细胞的；

iv)它是水溶性的；

v)它是羟基化有机化合物；

vi)它是多元醇；

vii)它是羟基-羰基化合物；

viii)它是糖或糖醇；和

ix)它是二羟基丙酮。

24.权利要求23的方法，其中在将所述样品与所述高渗剂相接触之后，得到的混合物包含所述高渗剂，所述高渗剂的浓度为至少0.05M。

25.权利要求5或10的方法，其中在将所述样品与所述抗凝剂相接触之后，得到的混合物包含所述抗凝剂，所述抗凝剂的浓度范围为0.05mM至100mM。

26.一种从生物样品分离细胞外核酸的方法，所述方法包括下列步骤：

a)按照权利要求1至25中任一项的方法使所述样品中的细胞外核酸群体稳定；以及

b)分离细胞外核酸。

27.权利要求26的方法，其包括一个或多个下列步骤：

i)在步骤a)与步骤b)之间从含细胞的样品去除细胞；

ii)进行如权利要求19中所定义的步骤b)至l)中的一个或多个步骤；

iii)在权利要求26的步骤b)中，使用分离方法从样品分离细胞外核酸，所述分离方法选自提取、使用核酸结合性固相的分离方法、层析、电泳、过滤、沉淀、靶核酸特异性分离方法及其组合；和

iv)在权利要求26的步骤b)中，通过基于磁性粒子的纯化从样品分离细胞外核酸。

28.权利要求26的方法，其包括在权利要求26的步骤b)中，使用分离方法从样品分离细胞外核酸，所述分离方法选自使用二氧化硅材料的分离方法和基于使用包含阴离子交换基团的固相的分离方法。

29.权利要求26至28中任一项的方法，其中分离的核酸在另一个步骤c)中进行处理和/或分析。

30.权利要求29的方法，其中所述方法具有一个或多个下述特征：

i)对分离的核酸进行修饰；

ii)使分离的核酸与至少一种酶相接触；

iii)对分离的核酸进行扩增；

iv)对分离的核酸进行反转录；

v)对分离的核酸进行克隆；

vi)对分离的核酸进行测序；

vii)使分离的核酸进行与探针相接触；

viii)对分离的核酸进行检测；

ix)对分离的核酸进行定量；和

ix)对分离的核酸进行鉴定。

31.权利要求26或27的方法，其中

从所述样品的无细胞部分分离的细胞外核酸群体和/或在权利要求26的步骤b)中分离之后获得的细胞外核酸群体具有一个或多个下述特征：

i)它作为一部分被包含在分离到的总核酸中；

ii)它主要包含DNA；

iii)它主要包含RNA；

iv)它包含循环的细胞外核酸；

v)它包含疾病相关的核酸；

vi)它包含肿瘤相关的核酸或肿瘤来源的核酸；

vii)它包含炎症相关的核酸；

viii)它包含胎儿核酸；

ix)它包含病毒核酸；

x)它包含病原体核酸；

xi)它包含哺乳动物细胞外核酸；和

xii)它是DNA和RNA的混合物。

32.权利要求29的方法，其中

在步骤c)中进行分析和/或进一步处理的细胞外核酸具有一个或多个下述特征：

i)它是DNA；

ii)它是RNA；

iii)它是循环的细胞外核酸；

iv)它包含疾病相关的核酸；

v)它包含肿瘤相关的核酸或肿瘤来源的核酸；

vi)它包含炎症相关的核酸；

vii)它是胎儿核酸；

viii)它是病毒核酸；

ix)它是病原体核酸；

x)它是哺乳动物细胞外核酸；和

xi)它是DNA和RNA的混合物。

33.一种适用于使生物样品中的细胞外核酸群体稳定的组合物，其包含：

a)至少一种半胱天冬酶抑制剂，和

b)至少一种式1的化合物，

其中R1是氢基团或烷基基团，R2和R3是相同或不同的以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基团，并且R4是氧、硫或硒基团。

34.权利要求33的组合物，其中其中R1是C1-C5烷基基团。

35.权利要求33的组合物，其中R1是甲基基团。

36.权利要求33的组合物，其包含至少一种半胱天冬酶抑制剂和至少一种抗凝剂。

37.权利要求33至36任一项的组合物，其具有一个或多个下述特征：

a)它能够减少基因组DNA从所述样品中包含的细胞向所述样品的无细胞部分的释放；

b)它能够减少所述样品中存在的核酸、尤其是基因组DNA的降解；

c)所述半胱天冬酶抑制剂具有如权利要求7中所定义的一个或多个特征；

d)它包含至少一种如权利要求23中所定义的高渗剂；

e)它包含至少一种如权利要求8或9中所定义的式1的化合物；

f)当与生物样品混合时，得到的混合物包含浓度如权利要求12或14中所定义的半胱天冬酶抑制剂和/或式1的化合物；

g)它以固体形式提供；

h)它以液体形式提供；和

i)它能够在室温下使所述样品中包含的细胞外核酸群体稳定至少3天。

38.权利要求33至36任一项的组合物，其包含高渗剂，其中所述高渗剂具有一个或多个下述特征：

i)它是不带电荷的；

ii)它通过诱导细胞皱缩使所述样品中包含的细胞稳定；

iii)它是不能透过细胞的；

iv)它是水溶性的；

v)它是羟基化有机化合物；

vi)它是多元醇；

vii)它是羟基-羰基化合物；

viii)它是糖或糖醇；和

ix)它是二羟基丙酮。

39.权利要求37的组合物，其中所述生物样品为血液、血浆或血清。

40.权利要求33至36任一项的组合物，其中所述稳定化组合物作为与生物样品的混合物被提供，并且其中所述样品具有一个或多个下述特征：

a)它包含细胞外核酸；

b)它选自全血、源自于血液的样品、拭子/涂片、体液、身体分泌物、排泄物以及细胞培养上清液；

c)它是细胞贫化的体液或含细胞的体液；

d)它选自全血、血浆和/或血清；

e)它是全血，和

f)它选自血浆、血清、淋巴液、尿液、脑脊液、腹水、乳液、粪、支气管灌洗液、唾液、羊水、精液、鼻分泌物、阴道分泌物和伤口分泌物。

41.权利要求40的组合物，其中所述稳定化组合物与特定体积的含细胞的样品的体积比选自10:1至1:20。

42.权利要求41的组合物，其中所述稳定化组合物与特定体积的含细胞的样品的体积比选自1:1至1:10。