JP2019507588A - 無細胞体液中の核酸消化酵素に対する宿主核酸の到達性の調整 - Google Patents

無細胞体液中の核酸消化酵素に対する宿主核酸の到達性の調整 Download PDF

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Abstract

本発明は、界面活性剤および核酸消化酵素を使用して体液の無細胞分画からの感染病原体の核酸を単離し、増幅し、配列決定するための方法に関する。本発明はさらに、本発明による方法の実施のための、界面活性剤および核酸消化酵素を含むキット・オブ・パーツに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、体液の無細胞分画中の宿主核酸（ＨＮＡ）の到達性を調整するための方法に関する。本発明はさらに、体液の無細胞分画中の感染病原体を検出するための方法に関する。
体液中の病原性感染病原体の検出は、特に、医師が利用可能な広範囲の抗生物質があるにもかかわらず死亡率が依然として高い敗血症の場合、できるだけ早く行うべきである。
患者の体液中の感染病原体レベルは一般に、対象からの宿主構成成分と比較して非常に低い。遠心分離により廃棄された生存または死細胞を欠く、血漿、血清、脳脊髄液のような典型的な生体試料は、依然として大量の細胞不含ＨＮＡを含有する。特定のケースにおいて、循環する遊離細胞（他の細胞と会合しない。）、例えば宿主細胞など、または妊娠の場合、胎児細胞はＨＮＡを放出し得る。
宿主核酸の量を減少させるための方法は、国際公開第２０１０／０６２３５４号パンフレットおよび同第２０１４／１１４８９６号パンフレットに記載されており、細胞膜を破壊するために細胞を含有する体液を界面活性剤で処理すること、および次に、得られた試料をヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅの活性を有する酵素）で処理することからなる。しかし、これらのアプローチは、処理される試料中にヌクレアーゼ耐性のＨＮＡが残留しているため、効果が部分的であった。
出願者は、驚くべきことに、界面活性剤およびヌクレアーゼとともに体液の無細胞分画を温置することによって、試料中の感染病原体の検出が改善されることを今回明らかにする。結果として、出願者は、生体試料の無細胞分画におけるＨＮＡ濃度を大きく低下させ、その結果、前記試料中の感染病原体の検出をより良好にするための新しい方法を提供する。
本発明は、体液の無細胞分画からの感染病原体の核酸を単離し、増幅させ、配列決定するためのインビトロ法に関する。
一実施形態において、本方法は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む。
一実施形態において、本方法は、感染病原体の核酸の抽出および配列決定をさらに含む。
一実施形態において、本発明による方法は、
ａ）体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させるステップと、
ｂ）感染病原体の核酸を抽出するステップと、
ｃ）場合によっては、感染病原体のゲノムＲＮＡを逆転写するステップと、
ｄ）感染病原体のゲノムＤＮＡおよび／または感染病原体のｃＤＮＡを増幅するステップと、
ｅ）増幅した感染病原体のゲノムＤＮＡおよび／または感染病原体のｃＤＮＡを配列決定するステップと、
を含む。
一実施形態において、感染病原体の核酸の配列決定は、次世代配列決定（ＮＧＳ）により行われる。
一実施形態において、感染病原体は、ウイルス、細菌、真菌、原虫および寄生生物を含む群から選択される。
一実施形態において、少なくとも１つの界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤および陰イオン性界面活性剤を含む群から選択される。
一実施形態において、少なくとも１つの界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。
一実施形態において、少なくとも１つの界面活性剤は、サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎおよびそれらの誘導体界面活性剤を含む群から選択される。
一実施形態において、少なくとも１つの界面活性剤はサポニンである。
一実施形態において、少なくとも１つの界面活性剤は、サポゲニン含量が約５％〜約５０％のサポゲニンである。
一実施形態において、少なくとも１つの核酸消化酵素は、ＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅの活性を有するヌクレアーゼである。
一実施形態において、少なくとも１つの核酸消化酵素は、ベースラインゼロＤＮａｓｅ、ベンゾナーゼ、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＤＮａｓｅ ＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＴ、ラムダエキソヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、ヌクレアーゼＰ１、ヌクレアーゼＳ１、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩおよびＴ７エキソヌクレアーゼを含む群から選択される。
一実施形態において、分画内の残留細胞の存在は、分画中の感染病原体の到達性または濃縮に影響を与えない。
本発明はキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）にも関する。
一実施形態において、本発明による方法を行うためのキット・オブ・パーツ。
一実施形態において、本キット・オブ・パーツは、
ａ）少なくとも１つの界面活性剤と、
ｂ）少なくとも１つの核酸消化酵素と、
を含む。
一実施形態において、本キット・オブ・パーツは、
ａ）サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎまたはそれらの誘導体を含む群から選択される少なくとも１つの界面活性剤と、
ｂ）ベースラインゼロＤＮａｓｅ、ベンゾナーゼ、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＤＮａｓｅ ＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＴ、ラムダエキソヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、ヌクレアーゼＰ１、ヌクレアーゼＳ１、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩおよびＴ７エキソヌクレアーゼを含む群から選択される少なくとも１つの核酸消化酵素と、
を含む。
一実施形態において、本キット・オブ・パーツは、試薬を含み得る。一実施形態において、本キット・オブ・パーツは、本発明による方法における使用のための説明書を含み得る。
したがって、一実施形態において、本キット・オブ・パーツは、
ａ）サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎまたはそれらの誘導体を含む群から選択される少なくとも１つの界面活性剤と、
ｂ）ベースラインゼロＤＮａｓｅ、ベンゾナーゼ、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＤＮａｓｅ ＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＴ、ラムダエキソヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、ヌクレアーゼＰ１、ヌクレアーゼＳ１、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩおよびＴ７エキソヌクレアーゼを含む群から選択される少なくとも１つの核酸消化酵素と、
ｃ）場合によっては試薬と、
ｄ）場合によっては、本発明による方法における使用のための説明書と、
を含む。
一実施形態において、本試薬は、核酸抽出試薬、逆転写試薬、核酸増幅試薬、核酸クリーンアップ試薬、核酸サイズ選択試薬、核酸定量試薬、核酸ライブラリ調製試薬、核酸ライブラリ配列決定試薬および内部標準を含む群から選択される。
一実施形態において、本試薬は、核酸抽出試薬、逆転写酵素、ｖｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、配列番号１または３〜１３の何れかとして挙げる配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号２として挙げる配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、エキソヌクレアーゼＩおよび／またはＳＰＲＩビーズを含む。
定義
本発明において、次の用語は次の意味を有する：
「無細胞分画」は、その細胞含量の約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９９％、より好ましくは１００％が失われた体液を指す。体液の無細胞分画は、当技術分野の何らかの周知の技術により得られ得る。例えば、体液が血液である一実施形態において、この無細胞分画は、約１００〜約５００ｇで約５分間〜約２０分間の、好ましくは３００ｇで１０分間の遠心分離段階から得られ得る。
「宿主核酸」または「ＨＮＡ」は、対象から生じる核酸を指す。
「調整すること」は、ＨＮＡの到達性における改善または向上を指す。
「プライマー」は、核酸とハイブリッド形成可能であるかまたはアニーリング可能であり、適切な緩衝液中、および適切な温度での、ヌクレオシド三リン酸および重合のための酵素、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在など、適切な条件下でのヌクレオチド重合に対する開始部位となるオリゴヌクレオチドを指す。
「増幅」は、所望の鋳型配列の複数コピー、すなわち少なくとも２コピーを生成させる過程を指す。核酸を増幅するための技術は、熟練者にとって周知であり、特異的増幅方法ならびにランダム増幅方法を含む。
「逆転写」とは、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の相補鎖を生成させるためのＲＮＡを標的とした、ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素、ＲＴ）を使用するＲＮＡの複製を指す。ＲＮＡの逆転写は、逆転写酵素および４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、すなわちデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）および（デオキシ）チミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の混合物を使用して、熟練者にとって周知の技術により行われ得る。
「対象」は、例えば家畜（すなわち、養殖魚、ペット、反芻動物、ブタ、ウマ）、野生動物およびヒトなど、あらゆる種を指す。一実施形態において、対象は、医学的ケアを受けるために待機しているかまたは医学的ケアを受けているか、または医学的手順の目的であった／ある／となろう、または疾患の発症について監視されている、「患者」、すなわち哺乳動物またはより好ましくはヒトであり得る。
「内部標準」は、分析されている１つ以上の要因の有無またはレベルに関して判断するための評価基準としておよび／または比較としてアッセイで使用される１つ以上の物質を指す。一部の内部標準は、陰性または陽性対照試料を含み得る。陰性対照は、分析されている１つ以上の要素を欠くことが知られる試料である。陽性対照は、分析されている１つ以上の要素を含むことが知られている試料である。一実施形態において、内部標準は、ある時間点でまたは複数のある時間点で、既知濃度で試料中に添加される内部標準核酸配列であり得る。一実施形態において、内部標準は、ある時間点でまたは複数のある時間点で、既知濃度で試料中に添加されるバクテリオファージなどのウイルスであり得る。
数値に先行する「約」は、その数値の値の±１０％を意味する。
本発明のある目的は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む、体液の無細胞分画中の感染病原体を濃縮するためのインビトロ法である。
本発明の別の目的は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む、体液の無細胞分画での核酸消化酵素への宿主核酸（ＨＮＡ）の到達性を調整するための方法である。
本発明の別の目的は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む、体液の無細胞分画中の総核酸に対する感染病原体の核酸の比率を上昇させるためのインビトロ法である。
本発明の別の目的は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む、体液の無細胞分画からのウイルス核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法である。
本発明の別の目的は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む、体液の無細胞分画からの細菌核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法である。
本発明の一実施形態において、感染病原体の構造または完全性は、本発明の方法により影響を受けない。
一実施形態において、体液の無細胞分画中の感染病原体を濃縮するためのインビトロ法は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画中の感染病原体を濃縮するためのインビトロ法は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させ、感染病原体の核酸を抽出し、その抽出した感染病原体の核酸を配列決定することを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画中での核酸消化酵素への宿主核酸（ＨＮＡ）の到達性を調整するための方法は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画中での核酸消化酵素への宿主核酸（ＨＮＡ）の到達性を調整するための方法は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させ、感染病原体の核酸を抽出し、その抽出した感染病原体の核酸を配列決定することを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画中の総核酸に対する感染病原体の核酸の比率を上昇させるためのインビトロ法は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画中の総核酸に対する感染病原体の核酸の比率を上昇させるためのインビトロ法は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させ、感染病原体の核酸を抽出し、その抽出した感染病原体の核酸を配列決定することを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの感染病原体の核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの感染病原体の核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させ、感染病原体の核酸を抽出し、その抽出した感染病原体の核酸を配列決定することを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの感染病原体の核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、
ａ）体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることと、
ｂ）感染病原体の核酸を抽出することと、
ｃ）場合によっては、感染病原体のゲノムＲＮＡを逆転写することと、
ｄ）感染病原体のゲノムＤＮＡおよび／または感染病原体のｃＤＮＡを増幅することと、
ｅ）増幅した感染病原体のゲノムＤＮＡおよび／または感染病原体のｃＤＮＡを配列決定することと、
を含む。
一実施形態において、増幅した感染病原体のゲノムＤＮＡおよび／または感染病原体のｃＤＮＡの配列決定は、ハイスループット配列決定（ＨＴＳ）または次世代配列決定（ＮＧＳ）によるランダム配列決定によって行われる。したがって、一実施形態において、本方法は、ＤＮＡクリーニング、ＤＮＡサイズ分類および／またはＤＮＡライブラリ調製を含むが限定されない、感染病原体のゲノムＤＮＡおよび／または感染病原体のｃＤＮＡライブラリ構築の段階をさらに含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からのウイルス核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させ、ウイルス核酸を抽出し、この抽出したウイルス核酸を配列決定することを含む。
一実施形態において、本方法は、ウイルスＲＮＡ逆転写の段階をさらに含む。一実施形態において、本方法は、ウイルスＤＮＡおよび／またはウイルスｃＤＮＡ増幅の段階をさらに含む。一実施形態において、本方法は、核酸クリーニングの段階をさらに含む。一実施形態において、本方法は、核酸サイズ分類の段階をさらに含む。一実施形態において、本方法は、核酸定量の段階をさらに含む。一実施形態において、本方法は、核酸ライブラリ調製の段階をさらに含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からのウイルス核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、
ａ）体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることと、
ｂ）ウイルス核酸を抽出することと、
ｃ）場合によってはウイルスゲノムＲＮＡを逆転写することと、
ｄ）ウイルスゲノムＤＮＡおよび／またはウイルスｃＤＮＡを増幅することと、
ｅ）増幅したウイルスゲノムＤＮＡおよび／またはウイルスｃＤＮＡを配列決定することと、
を含む。
一実施形態において、増幅したウイルスゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡの配列決定は、ハイスループット配列決定（ＨＴＳ）または次世代配列決定（ＮＧＳ）によるランダム配列決定によって行われる。したがって、一実施形態において、本方法は、ＤＮＡクリーニング、ＤＮＡサイズ分類および／またはＤＮＡライブラリ調製を含むが限定されない、ウイルスゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡライブラリ構築の段階をさらに含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの細菌核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの細菌核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、この体液の無細胞分画を回収するために体液の細胞分画中の非細菌細胞を選択的に溶解させ、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む。
一実施形態において、本方法は、細菌ＤＮＡ増幅の段階をさらに含む。一実施形態において、本方法は、核酸クリーニングの段階をさらに含む。一実施形態において、本方法は、核酸サイズ分類の段階をさらに含む。一実施形態において、本方法は、核酸定量の段階をさらに含む。一実施形態において、本方法は、核酸ライブラリ調製の段階をさらに含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの細菌核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、この体液の無細胞分画から細菌をペレット化し、ペレットを少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させ、細菌核酸を抽出し、この抽出した細菌核酸を配列決定することを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの細菌核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、この体液の無細胞分画を回収するために体液の細胞分画中の非細菌細胞を選択的に溶解させ、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させ、細菌核酸を抽出し、この抽出した細菌核酸を配列決定することを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの細菌核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、
ａ）体液の無細胞分画から細菌をペレット化することと、
ｂ）体液の無細胞分画からのペレットを少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることと、
ｃ）細菌ゲノムＤＮＡを抽出することと、
ｄ）細菌ゲノムＤＮＡを増幅することと、
ｅ）増幅した細菌ゲノムＤＮＡを配列決定することと、
を含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの細菌核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、
ａ）この体液の無細胞分画を回収するために体液の細胞分画中の非細菌細胞を選択的に溶解させ、
ｂ）この体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させ、
ｃ）細菌ゲノムＤＮＡを抽出し、
ｄ）細菌ゲノムＤＮＡを増幅し、
ｅ）増幅した細菌ゲノムＤＮＡを配列決定すること
を含む。
一実施形態において、増幅した細菌ゲノムＤＮＡの配列決定は、ハイスループット配列決定（ＨＴＳ）または次世代配列決定（ＮＧＳ）によるランダム配列決定によって行われる。したがって、一実施形態において、本方法は、ＤＮＡクリーニング、ＤＮＡサイズ分類および／またはＤＮＡライブラリ調製を含むが限定されない、細菌ゲノムＤＮＡライブラリ構築の段階をさらに含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの真菌核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの真菌核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、この体液の無細胞分画を回収するために体液の細胞分画中の非真菌細胞を選択的に溶解させ、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む。
一実施形態において、本方法は、真菌ＤＮＡ増幅の段階をさらに含む。一実施形態において、本方法は、核酸クリーニングの段階をさらに含む。一実施形態において、本方法は、核酸サイズ分類の段階をさらに含む。一実施形態において、本方法は、核酸定量の段階をさらに含む。一実施形態において、本方法は、核酸ライブラリ調製の段階をさらに含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの真菌核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、この体液の無細胞分画から真菌をペレット化し、ペレットを少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させ、真菌核酸を抽出し、この抽出した真菌核酸を配列決定することを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの真菌核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、この体液の無細胞分画を回収するために体液の細胞分画中の非真菌細胞を選択的に溶解させ、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させ、真菌核酸を抽出し、その抽出した真菌核酸を配列決定することを含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの真菌核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、
ａ）体液の無細胞分画から真菌をペレット化し、
ｂ）体液の無細胞分画からのペレットを少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させ、
ｃ）真菌ゲノムＤＮＡを抽出し、
ｄ）真菌ゲノムＤＮＡを増幅し、
ｅ）増幅した真菌ゲノムＤＮＡを配列決定すること
を含む。
一実施形態において、体液の無細胞分画からの真菌核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法は、
ａ）この体液の無細胞分画を回収するために体液の細胞分画中の非真菌細胞を選択的に溶解させ、
ｂ）この体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させ、
ｃ）真菌ゲノムＤＮＡを抽出し、
ｄ）真菌ゲノムＤＮＡを増幅し、
ｅ）増幅した真菌ゲノムＤＮＡを配列決定すること
を含む。
一実施形態において、増幅した細菌ゲノムＤＮＡの配列決定は、ハイスループット配列決定（ＨＴＳ）または次世代配列決定（ＮＧＳ）によるランダム配列決定によって行われる。したがって、一実施形態において、本方法は、ＤＮＡクリーニング、ＤＮＡサイズ分類および／またはＤＮＡライブラリ調製を含むが限定されない、真菌ゲノムＤＮＡライブラリ構築の段階をさらに含む。
本発明の意味における体液の無細胞分画は、体液中に元来存在する細胞物質の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％未満を含む体液の分画を指す。
一実施形態において、この無細胞分画は、体液から細胞を廃棄するための段階が既に行われている体液から得られ得る。
一実施形態において、この無細胞分画は、体液から細胞を溶解させるための段階が既に行われている体液から得られ得る。
別の実施形態において、この無細胞分画は、感染病原体の濃縮または到達性に影響を与えない残留細胞を含む。
本発明によれば、体液の例としては、血液、羊水、眼房水、胆汁、膀胱洗浄液、乳房浸出液、気管支肺胞洗浄液、乳糜、粥状液、サイトゾル、糞便（半流動体または流動体）、間質液、リンパ液、月経、粘液、胸水、膿汁、唾液、皮脂、精液、血清、痰、汗、滑液、涙、尿および硝子体液が挙げられるが限定されない。
一実施形態において、体液は血液である。別の実施形態において、血液の無細胞分画は血漿である。
本明細書中で使用される場合、「感染病原体」という用語は、一般に、増殖し得る単細胞である微生物を指し、これには、細菌、真菌（酵母またはカビ）、ウイルスおよび原虫が含まれる。「感染病原体」という用語は、増殖し得る、多細胞である微生物も指し、これには寄生虫および寄生生物が含まれる。
細菌の非限定例としては、グラム陽性またはグラム陰性細菌、マイコバクテリアまたはモリキュートが挙げられる。
本発明のグラム陰性細菌の属の非限定例としては、次の属の細菌：アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）、エドワージエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）およびレジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）が挙げられる。
本発明のグラム陽性細菌の属の非限定例としては、次の属の細菌：エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ガルドネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）およびコリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）が挙げられる。
マイコバクテリアの非限定例としては、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が挙げられるが限定されない。
モリキュートの非限定例としては、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられるが限定されない。
感染病原体のリスト内に含まれる細菌のリストは、ＬＰＳＮウェブサイト（原核生物の名前のリストと命名法の提案（ｌｉｓｔ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｎａｍｅｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｎｄｉｎｇ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｓ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｃｔｅｒｉｏ．ｎｅｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で見ることができる。
ウイルスの非限定例としては、次の科のメンバー：ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（例えば水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、単純ヘルペスウイルス）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばロタウイルス）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばパルボウイルスＢ１９）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（ライノウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、ボルナウイルス科（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばエボラウイルス、マールブルグウイルス）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばＢ型肝炎）、ヘペウイルス科（Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ）（Ｅ型肝炎ウイルス）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ＨＩＶ、ヒトＴ−リンパ球向性ウイルス）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばＡ、Ｂ、Ｃ型インフルエンザウイルス）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば風疹ウイルス）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば呼吸器多核体ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、狂犬病ウイルス、ウシ流行熱ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、コイ春ウイルス血症ウイルス、水疱性口内炎ウイルスインディアナ株）、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）（例えば、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス）、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、バクテリオファージ（例えば、ミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ））ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（例えば痘瘡ウイルス、牛痘ウイルス）が挙げられるが限定されない。
本願の意味において感染病原体として考えられ得るウイルスのリストは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ（ＩＣＴＶ−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｔｖｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｖｉｒｕｓｔａｘｏｎｏｍｙ．ａｓｐ）において見ることができる。
酵母またはカビの非限定例としては、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ニューモシスチス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）が挙げられるが限定されない。
原虫の非限定例としては、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）の種、バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）の種、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）の種、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種、ウケレリア属（Ｗｕｃｈｅｒｉａ）の種、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）の種、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）の種が挙げられるが限定されない。
原虫の非限定例としては、鞭毛虫（例えばジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、トロコモナス（Ｔｒｏｃｈｏｍｏｎａｓ）、キロマスティクス（Ｃｈｉｌｏｍａｓｔｉｘ）、エンテロモナス（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、レトルタモイナス（Ｒｅｔｏｒｔａｍｏｉｎａｓ）、ジエントアメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ））、アメーバ（例えばエントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）、マッシステリア（Ｍａｓｓｉｓｔｅｒｉａ）、ネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）、アルセラ（Ａｒｃｅｌｌａ）、アメーバ（Ａｍｏｅｂａ）、カオス（Ｃｈａｏｓ）、ペロキシマ（Ｐｅｌｏｘｙｍａ）、シリンガンミナ（Ｓｙｒｉｎｇａｍｍｉｎａ））、胞子虫類（例えば、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、シクロスポラ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ）、イソスポラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ））および繊毛虫類（例えばバランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）、ジジニウム（Ｄｉｄｉｎｉｕｍ）、コルポーダ（Ｃｏｌｐｏｄａ）、ステントール（Ｓｔｅｎｔｏｒ）、コレプス（Ｃｏｌｅｐｓ）、パラメシウム（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）、ボルチセラ（Ｖｏｒｔｉｃｅｌｌａ）、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）、カリオコスリクス（Ｃａｒｉｏｃｏｔｈｒｉｘ））が挙げられるが限定されない。
一実施形態において、蠕虫類は本発明の方法から排除される。
一実施形態において、プリオン物質は本発明の方法から排除される。
一実施形態において、本発明の方法で使用される少なくとも１つの界面活性剤は、非イオン性界面活性剤および／または双性イオン性界面活性剤および／または陰イオン性界面活性剤を含む。
この界面活性剤は、感染病原体の核酸を保つために、感染病原体の構造または完全性に損傷を与えずに作用する。「感染病原体の構造」という用語は、完全なウイルス粒子、細菌細胞外または細胞内ボディーなどを指す。
一実施形態において、界面活性剤は、サポニン、ジギトニン、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００−Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｂｒｉｊ ９８、Ｂｒｉｊ ５８、Ｂｒｉｊ ３５、Ｇｅｎａｐｏｌ Ｃ−１００、Ｇｅｎａｐｏｌ Ｘ−１００、Ｉｇｅｐａｌ、Ｂｒｉｊ ９６／９７、オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドおよびノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ９）またはそれらの誘導体を含むが限定されない非イオン性界面活性剤であり得る。好ましい実施形態において、非イオン性界面活性剤は、サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎまたはそれらの誘導体である。
「サポニン」という用語は、本明細書中で使用される場合、天然起源で見られる、特に様々な植物、また海洋種においても見られる、化合物、通常は二次代謝産物である。具体的に、サポニンは、それらが水溶液中で振盪される場合に生じる石鹸様の泡立ちにより現象学的に、および脂溶性トリテルペン誘導体と組み合わせられた１つ以上の親水性グリコシド部分のそれらの組成により構造的にグループ化される両親媒性グリコシドである。サポニンのアグリコン（グリコシド不含部分）はサポゲニンと呼ばれる。サポゲニン／アグリコンコアに連結される糖鎖の数は、各鎖の長さが異なり得るので、変動し得る。典型的な鎖長は１〜１１であり、２〜５の数が最も頻度が高く、直鎖状および分岐状糖鎖両方が示される。
Ｄ−グルコースおよびＤ−ガラクトースなどの単糖類は、連結される鎖の最も一般的なものである。脂溶性アグリコンは、Ｃ３０トリテルペン骨格を構成するために１０個の炭素（Ｃ１０）テルペン単位の連続的な付加に由来する多岐にわたる多環式有機構造のうちの何れか１つであり得、Ｃ２７ステロイド骨格を生成させるための続く変更を伴うことが多い。
サポニンの誘導体としては、トリテルペノイドサポニン、サポナリア（Ｓａｐｏｎａｒｉａ）（キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ））からの、カリオフィラセア科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）からの、サピンダセア科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）からの、アセラセアエ科（Ａｃｅｒａｃｅａｅ）（カエデ）およびヒッポカスタナセア科（Ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎａｃｅａｅ）からのサポニン、ジノステンマ・ペンタフィルム（Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌｕｍ）（ククルビタセア科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、ジノステンマ属（Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ））からのジペノシドサポニン、ジンセノサイドサポニン（チョウセンニンジンまたはコウジン（アラリアセア科（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）、パナクス属（Ｐａｎａｘ））における。）、サラポニンとも呼ばれるステロイドサポニン、例えばジオスゲニン、チゴゲニン、サルサポゲニン、コレスタノール、フロスタノールおよびスピロスタノールサポニンが挙げられ得るが限定されない。既知のフロスタノールステロイドサポニンは、新鮮なニンニク中に含有されるサポニン、例えばプロト−イソエルボシド（ｉｓｏｅｒｕｂｏｓｉｄｅ）−Ｂおよびイソエルボシド（ｉｓｏｅｒｕｂｏｓｉｄｅ）−Ｂなどであるが、一方で熟成したニンニク抽出物は、スピロスタノールステロイドサポニンも含有する。スピロスタノールステロイドサポニンの他の例は、ルスクス・アクレアツス（Ｒｕｓｃｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）の地下部分からの、タッカ・カントリエリ（Ｔａｃｃａ ｃｈａｎｔｒｉｅｒｉ）の根茎からの、ソラヌム・ヒスピドゥム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｈｉｓｐｉｄｕｍ）からの、ディオスコレア・ポリゴノイデス（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｐｏｌｙｇｏｎｏｉｄｅｓ）の塊茎からの、収穫されたトリブルス・テレストリス（Ｔｒｉｂｕｌｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）からの、リリウム・カンジドゥム（Ｌｉｌｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）からのサポニンである。
ステロイドサポニンは、市販の石鹸の出現前は石鹸として使用されたサポナリア・オフィシナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の根に含有されるサポニン、石鹸を作るためにアメリカ先住民により使用されたメキシコのバハ・カリフォルニアの乾燥した砂漠地帯で生育するユッカ・シディゲラ（Ｙｕｃｃａ ｓｃｈｉｄｉｇｅｒａ）のサポニン、アメリカ先住民により石鹸として使用された、ソープリリー（ｓｏａｐ ｌｉｌｙ）、クロロガルム・ポメリディアヌム（Ｃｈｌｏｒｏｇａｌｕｍ ｐｏｍｅｒｉｄｉａｎｕｍ）中に含有されるサポニン、ムクロジの木由来のサポニンでもある。
一実施形態において、本発明の方法で使用される少なくとも１つの界面活性剤は、サポナリア（キラヤ樹皮、セッケンボクまたはシャボンノキとしても知られる、キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ））由来のサポニンである。
一実施形態において、本発明の方法で使用される少なくとも１つの界面活性剤は、サポゲニン含量が約５％〜約５０％、好ましくは約１０％〜約４０％、より好ましくは約２０％〜約３５％のサポニンである。
一実施形態において、本発明の方法で使用される少なくとも１つの界面活性剤は、サポゲニン含量が約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０％のサポニンである。
一実施形態において、本発明の方法で使用される少なくとも１つの界面活性剤は、サポゲニン含量が約２０〜３５％であるサポナリア（キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ））からのサポニンである。
別の実施形態において、界面活性剤は、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、アミドスルホベタイン−１４（ＡＳＢ−１４）、アミドスルホベタイン−１６（ＡＳＢ−１６）、スルホベタイン３−１０（ＳＢ３−１０）、スルホベタイン３−１２（ＳＢ３−１２）およびスルホベタイン３−１４（ＳＢ３−１４）を含むが限定されない双性イオン性界面活性剤であり得る。
別の実施形態において、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ−（アルキルＣ１０−Ｃ１６）−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンベタイン（ＥＭＰＩＧＥＮ ＢＢ）、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コハク酸水素コレステリル、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウムを含むが限定されない陰イオン性界面活性剤であり得る。
一実施形態において、本発明の方法で使用される少なくとも１つの界面活性剤の最終濃度は、約０．０１％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ〜約５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ〜約１．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ〜約０．５％ｗ／ｖである。
一実施形態において、本発明の方法で使用される少なくとも１つの界面活性剤の最終濃度は、約０．１％ｗ／ｖ〜約４％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ〜約４％ｗ／ｖである。
一実施形態において、界面活性剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、好ましくはサポニンまたはそれらの誘導体である。別の実施形態において、本発明の方法で使用される少なくとも１つの界面活性剤は、感染病原体の構造に影響を与えない。
別の実施形態において、本発明の方法で使用される少なくとも１つの核酸消化酵素は、ＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅの活性を示す酵素を指す。
核酸消化酵素としては、ヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エキソデオキシリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エンドデオキシリボヌクレアーゼ、エンドリボヌクレアーゼなどが挙げられるが限定されない。
ヌクレアーゼの例としては、ベースラインゼロＤＮａｓｅ、ベンゾナーゼ、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＤＮａｓｅ ＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＴ、ラムダエキソヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、ヌクレアーゼＰ１、ヌクレアーゼＳ１、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、Ｔ７エキソヌクレアーゼが挙げられるが限定されない。
一実施形態において、本発明の方法で使用される少なくとも１つの核酸消化酵素は、ベースラインゼロＤＮａｓｅおよびベンゾナーゼを含むが限定されない群から選択される。一実施形態において、本発明の方法で使用される核酸消化酵素は、ベースラインゼロＤＮａｓｅおよびベンゾナーゼを含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、少なくとも１つの核酸消化酵素の濃度は、約０．１単位／μｇ〜約１０単位／μｇ、好ましくは約０．５単位／μｇ〜約５単位／μｇ、より好ましくは約１単位／μｇタンパク質である。
一実施形態において、約５分間〜約５時間、好ましくは約３０分間〜約２時間、より好ましくは約１時間の時間にわたり、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させる。
別の実施形態において、約５、１０、１５、２０、３０、４０、４５、５０分間、１、２、３、４時間の時間にわたり、体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させる。
別の実施形態において、温置温度は、約３０℃〜約４０℃、好ましくは３７℃である。別の実施形態において、温置温度は約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃である。
別の実施形態において、３０分、２０分、１０分未満の時間にわたり体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤と接触させ、次いで約５、１０、１５、２０、３０、４０、４５、５０分間、１、２、３、４時間の時間にわたり少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させる。
一実施形態において、本発明の方法は、核酸消化酵素活性の阻害の段階をさらに含む。
核酸消化酵素を阻害することは、熟練者にとって周知であり、キレート剤を使用するか、または約６０℃〜約８０℃の範囲、より好ましくは約６５℃〜約８０℃の範囲の温度で試料を加熱することによって行われ得る。一実施形態において、核酸消化酵素に対する阻害は、約６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃で試料を加熱することによって行われ得る。
核酸消化酵素の阻害剤は、最先端で周知であり、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）およびグアニジンが挙げられるが限定されない。
一実施形態において、阻害段階は、少なくとも約５分〜約２０分間行われる。一実施形態において、阻害段階は、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０分間行われる。
一実施形態において、例えばＥＤＴＡなどの核酸消化酵素の阻害剤の濃度は、約１〜約１０ｍＭの範囲である。一実施形態において、例えばＥＤＴＡなどの核酸消化酵素の阻害剤の濃度は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭである。
一実施形態において、本発明の方法は、例えば遠心分離、超遠心分離、塩沈殿またはろ過段階など、感染病原体を濃縮するための濃縮段階をさらに含み得る。当業者は、このような濃縮に対してどの技術が最も効率的であるかを認識する。
一実施形態において、本発明の方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリコーゲンまたは核酸などの沈殿剤を用いた感染病原体の沈殿の段階を含まない。
一実施形態において、本発明の方法は、感染病原体のホモジネートの調製の段階をさらに含み得る。ホモジネートを調製するための技術は最先端で周知であり、機械的な均質化（例えばホモジナイザー、超音波処理）、化学的な均質化（例えばプロテアーゼ消化）が挙げられるが限定されない。
一実施形態において、高度変性条件下、室温（１５〜２５℃）で感染病原体を溶解させる。一実施形態において、プロテイナーゼＫの存在下で感染病原体を溶解させる。一実施形態において、塩化グアニジウムの存在下で感染病原体を溶解させる。
化学物質およびプロテイナーゼＫでの処理は、多くのＧｒａｍ−細菌の場合、完全な溶解のために十分であるが、Ｇｒａｍ＋細菌および一部のＧｒａｍ−細菌の細胞壁は、さらなる方法によって破壊しなければならない。溶解困難な細菌を用いて作業を行う場合、溶解効率を最大にするために、機械的および／または酵素性均質化がさらに、または代わりに行われ得る。
一実施形態において、本発明の方法は、感染病原体の核酸抽出およびこの感染病原体の検出のための段階をさらに含み得る。
一実施形態において、本発明の方法は、約１００００ゲノムコピー／ｍＬより少ない、好ましくは約１０００ゲノムコピー／ｍＬより少ない、最も好ましくは約１００ゲノムコピー／ｍＬより少ない感染病原体の量を検出する。
核酸の抽出／精製は、熟練者にとって周知の技術により行われる。このような技術としては、フェノール−クロロホルム抽出、アルカリ抽出、グアニジンチオシアン酸塩−フェノール−クロロホルム抽出、陰イオン交換樹脂上での結合、シリカマトリクス、ガラス粒子、珪藻土、様々な合成ポリマー、バイオポリマー、多孔質ガラスから作製されるかまたは無機性の磁気性物質に基づく磁気粒子が挙げられるが限定されない。
核酸の抽出／精製は、ＱＩＡａｍｐ ｃａｄｏｒ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＱＩＡａｍｐ ＤＳＰ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ Ｐｒｉｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭａｇＭＡＸ Ｐａｔｈｏｇｅｎ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＺＲ Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ ＭｉｃｒｏＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ＺＲ Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）など、市販のキットを使用して行われ得る。
一実施形態において、本発明の方法は、抽出されたＲＮＡの逆転写のための段階をさらに含み得る。
いくつかの実施形態において、感染病原体はＲＮＡウイルスを含み得る。このようなウイルスは、その遺伝物質としてＲＮＡを有する。この核酸は通常１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）であるが、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり得る。ＲＮＡウイルスにより引き起こされる注目すべきヒト疾患としては、エボラ出血熱、ＳＡＲＳ、普通感冒、インフルエンザ、Ｃ型肝炎、ウエストナイル熱、ポリオおよび麻疹が挙げられる。
一実施形態において、抽出されたウイルスＲＮＡ由来のほぼ全長のゲノム配列を得るために、抽出されたＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡコピーを生じさせることがまず必要である。
ＲＮＡの逆転写は、熟練者にとって周知の技術によって、逆転写酵素および４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、すなわちデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）および（デオキシ）チミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、の混合物を用いて行われる。
一実施形態において、ゲノムＲＮＡの逆転写は、ファーストストランドｃＤＮＡ合成の第１の段階を含む。ファーストストランドｃＤＮＡ合成のための方法は当業者にとって周知である。
ファーストストランドｃＤＮＡ合成反応は、配列特異的なプライマー、オリゴ（ｄＴ）またはランダムプライマーの組み合わせを使用し得る。一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成反応は、配列特異的なプライマーを使用する。一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成反応はランダムプライマーを使用する。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、固定５’末端配列および縮重３’末端配列を含む。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、固定３’末端配列および縮重５’末端配列を含む。
一実施形態において、固定配列は２０〜４０個のヌクレオチドを含む。一実施形態において、固定配列は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個のヌクレオチドを含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、縮重配列は５〜１０個のヌクレオチドを含む。一実施形態において、縮重配列は、５、６、７、８、９、１０個のヌクレオチドを含むかまたはそれらからなる。
本明細書中で使用される場合、「縮重配列」という用語は、ヌクレオチドの混合物、すなわちＡ、Ｔ、Ｃおよび／またはＧの混合物を有する配列を指す。一実施形態において、縮重配列は、ＧおよびＴ（本明細書中でＫと呼ぶ。）の混合物を有する。一実施形態において、縮重配列は、ＣおよびＴ（本明細書中でＹと呼ぶ。）の混合物を有する。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、プライマー−Ｋ８：ＧＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＡＧＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号１）であり、Ｋ＝ＴまたはＧである。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、プライマー−Ｋ９：ＧＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＡＧＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号３）であり、Ｋ＝ＴまたはＧである。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、プライマー−Ｋ１０：ＧＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＡＧＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号４）であり、Ｋ＝ＴまたはＧである。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、プライマー−Ｋ７：ＧＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＡＧＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号５）であり、Ｋ＝ＴまたはＧである。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、プライマー−Ｋ６：ＧＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＡＧＫＫＫＫＫＫ（配列番号６）であり、Ｋ＝ＴまたはＧである。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、プライマー−Ｋ５：ＧＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＡＧＫＫＫＫＫ（配列番号７）であり、Ｋ＝ＴまたはＧである。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、プライマー−Ｙ８：ＣＴＣＡＣＴＣＡＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＣＣＡＣＹＹＹＹＹＹＹＹ（配列番号８）であり、Ｙ＝ＴまたはＣである。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、プライマー−Ｙ９：ＣＴＣＡＣＴＣＡＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＣＣＡＣＹＹＹＹＹＹＹＹＹ（配列番号９）であり、Ｙ＝ＴまたはＣである。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、プライマー−Ｙ１０：ＣＴＣＡＣＴＣＡＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＣＣＡＣＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹ（配列番号１０）であり、Ｙ＝ＴまたはＣである。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、プライマー−Ｙ７：ＣＴＣＡＣＴＣＡＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＣＣＡＣＹＹＹＹＹＹＹ（配列番号１１）であり、Ｙ＝ＴまたはＣである。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、プライマー−Ｙ６：ＣＴＣＡＣＴＣＡＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＣＣＡＣＹＹＹＹＹＹ（配列番号１２）であり、Ｙ＝ＴまたはＣである。
一実施形態において、ファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用されるランダムプライマーは、プライマー−Ｙ５：ＣＴＣＡＣＴＣＡＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＣＣＡＣＹＹＹＹＹ（配列番号１３）であり、Ｙ＝ＴまたはＣである。
一実施形態において、ゲノムＲＮＡの逆転写は、セカンドストランドｃＤＮＡ合成の第２段階を含む。セカンドストランドｃＤＮＡ合成のための方法は当業者にとって周知であり、これには、ヘアピン−プライムド（ｈａｉｒｐｉｎ−ｐｒｉｍｅｄ）合成、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇの手順、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎの手順が含まれるが限定されない。
一実施形態において、ゲノムＲＮＡの逆転写は、ファーストストランドｃＤＮＡの増幅の段階を含む。一実施形態において、ゲノムＲＮＡの逆転写は、セカンドストランドｃＤＮＡの増幅の段階を含む。
ゲノムＲＮＡの逆転写は、市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して行われ得る。
感染病原体の検出は、感染病原体の細胞性、生理学的、表現型的活性を判断するために、感染病原体の核酸を増幅し、配列決定するための技術によって行われ得る。好ましくは、使用される検出方法は、核酸を増幅し、配列決定するための方法である。
核酸を増幅し、配列決定するための技術は熟練者にとって周知である。核酸を増幅するための技術には、特異的増幅方法ならびにランダム増幅法が含まれ得る。特異的増幅技術としては、温度サイクル（ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、転写に基づく増幅など）および／または等温増幅系（自律的配列複製、レプリカ−ゼ系、ヘリカーゼ系、鎖置換増幅、ローリング・サークルに基づく増幅およびＮＡＳＢＡなど）を必要とする方法が挙げられるが限定されない。一実施形態において、感染病原体の核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応および／または、アレル特異的ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、インターシークエンス（ｉｎｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ）特異的ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、ミニプライマーＰＣＲ、マルチプレックスライゲーション依存的プローブ増幅、マルチプレックス−ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ１定量的ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲおよび／またはタッチダウンＰＣＲを含むが限定されない、その何らかの変形法により行われ得る。増幅は、少なくとも１つの感染病原体の核酸に特異的結合可能なものから選択され得るプライマーおよび／またはプライマーの集まりを使用して行われ得る。
ランダム増幅技術としては、多重置換増幅（ＭＤＡ）、ランダムＰＣＲ、多型ＤＮＡのランダム増幅（ＲＡＰＤ）または多重アニーリングおよびループ形成に基づく増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）が挙げられるが限定されない。
核酸を増幅するために適切なＤＮＡポリメラーゼには、ＴａｑポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌ断片、Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼｔｕｒｂｏ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−ポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、９ Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ−ＥＸＴポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、ｐｈｉ−２９ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＢｅｔａまたはそれらの改変型が含まれるが限定されない。
一実施形態において、感染病原体の核酸の増幅は、ループ形成の第１段階を含む。配列番号１および３〜１３として挙げるプライマーの利用によって、アンプリコンのループ形成が可能になり、それによって、次に、続くサイクルでのそれらのさらなる増幅が妨げられ、したがって核酸が直線状に増幅される。これらのプライマーの縮重配列は、ゲノムＤＮＡ分子および／またはｃＤＮＡ分子と無作為にアニーリングする。１回の伸長後、セミ−アンプリコンが作製され、すなわちアンプリコンは、５’末端にのみ固定配列を含有する。第２ラウンドの伸長中、セミ−アンプリコンが鋳型として使用され、その結果、フル−アンプリコン、すなわち、３’末端が５’末端の配列と相補的であるアンプリコンが得られる。
一実施形態において、ループ形成段階は、４〜１０回の伸長サイクルを含む。一実施形態において、ループ形成段階は、４、５、６、７、８、９、１０回の伸長サイクルを含むかまたはそれからなる。好ましい実施形態において、ループ形成段階は、６回の伸長サイクルを含むかまたはそれからなる。
一実施形態において、ループ形成段階は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われる。一実施形態において、ループ段階は、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われる。
一実施形態において、各伸長サイクルの前に、約５秒〜５分間の範囲の時間にわたり約８０℃〜約１００℃の範囲の温度で、好ましくは約１０秒〜約４分間の範囲の時間にわたり約９４℃で試料を温置する。
一実施形態において、各伸長サイクルは、数回の段階的加熱段階を含む。一実施形態において、各伸長サイクルは、約４℃〜約１００℃、好ましくは約１０℃〜約６５℃の数回の段階的加熱段階を含む。一実施形態において、各伸長サイクルは、約１５秒〜約１８０秒、好ましくは約３０秒〜約１２０秒、より好ましくは約４５秒〜約１２０秒の範囲の時間にわたり保持される段階的加熱段階を含む。
一実施形態において、感染病原体の核酸の増幅は、規則的増幅の段階を含む。一実施形態において、感染病原体の核酸の増幅は、ＰＣＲによる規則的増幅の段階を含む。固定配列（配列番号２）のみを含有するプライマーの利用によって、さらに完全なループ形成アンプリコンのみを増幅させ、核酸を指数関数的に増幅させることが可能になる。
ＧＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＡＧ（配列番号２）。
一実施形態において、規則的増幅の段階は、１５〜３０回の伸長サイクル、好ましくは１８〜２５回の伸長サイクル、より好ましくは２１回の伸長サイクルを含む。
一実施形態において、規則的増幅の段階は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われる。一実施形態において、規則的増幅の段階は、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われる。
一実施形態において、増幅した感染病原体の核酸は、少なくとも１つの感染病原体の増幅核酸に対して特異的な結合が可能なプローブおよび／またはプローブの集まりをハイブリッド形成させることによって検出され得る。
一実施形態において、本発明の方法は、核酸をクリーニングする段階をさらに含み得る。
配列決定のために核酸ライブラリを調製する前に、１本鎖プライマーおよび酵素などの反応生成物を除去することが望ましいものであり得る。
核酸のクリーンアップのための技術は熟練者にとって周知である。一実施形態において、核酸をクリーニングするための段階は、１本鎖特異的なヌクレアーゼを使用する。１本鎖特異的なヌクレアーゼとしては、エキソヌクレアーゼＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢｈ１、ヌクレアーゼＰ１、ヌクレアーゼＳ１、ＢＡＬ ３１ヌクレアーゼが挙げられるが限定されない。一実施形態において、核酸をクリーニングするための段階はエキソヌクレアーゼＩを使用する。一実施形態において、核酸をクリーニングするための段階は、約１０分〜約３０分の範囲の時間にわたる、好ましくは約１５分間にわたる、約３０〜約４５℃の範囲の温度、好ましくは約３７℃での温置段階を含む。
一実施形態において、核酸をクリーニングするための段階は、核酸のリン酸化末端の脱リン酸化を含む。一実施形態において、核酸の脱リン酸化は、アルカリホスファターゼ、好ましくはエビアルカリホスファターゼを使用する。一実施形態において、エビアルカリホスファターゼは、約１０分〜約３０分間の範囲の時間、好ましくは約１５分間にわたり約６０℃〜約８０℃の範囲の温度、好ましくは約６５℃で加熱することによって完全かつ不可逆的に不活性化され得る。
核酸をクリーニングするための段階は、市販のキット、例えばｉｌｌｕｓｔｒａ ＥｘｏＰｒｏＳｔａｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＧｅｎＵＰ Ｅｘｏ ＳＡＰ Ｋｉｔ（ＢｉｏｔｅｃｈＲａｂｂｉｔ）を使用して行われ得る。
一実施形態において、本発明の方法は、核酸をサイズ分類するための段階をさらに含み得る。
ショートリードシークエンサー、例えばＩｌｌｕｍｉｎａまたはＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔなどは、製造者の推奨によれば、同様のサイズの断片を含有するＤＮＡライブラリが与えられる場合に最良に機能する。ライブラリが正しくサイズ選択されない場合、これらのシークエンサーの効率は低下し得る。
ＤＮＡサイズ選択のための技術は熟練者にとって周知であり、核酸ゲル電気泳動、ビーズに基づくプロトコール、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）、自動サイズ選択が挙げられるが限定されない。
核酸のサイズ分類を行うための段階は、市販のキット、例えばＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＭａｇＪＥＴ ＮＧＳ Ｃｌｅａｎｕｐ ａｎｄ Ｓｉｚｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｅｌｅｃｔ−ａ−Ｓｉｚｅ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ＮｕｃｌｅｏＭａｇ ＮＧＳ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ ａｎｄ Ｓｉｚｅ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）などを使用して行われ得る。
一実施形態において、本発明の方法は、増幅核酸を定量するための段階をさらに含み得る。
増幅核酸を定量するための技術は熟練者にとって周知であり、ＵＶ吸収、挿入色素、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）と組み合わせられた５’加水分解プローブ、ドロップレット・デジタル・エマルジョン（ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）ＰＣＲが挙げられるが限定されない。
核酸をサイズ分類するための段階は、市販のキット、例えばＱｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＢＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｑｕａｎｔ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＡｃｃｕＣｌｅａｒ Ｕｌｔｒａ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＡｃｃｕＢｌｕｅ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＡｃｃｕＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を使用して行われ得る。
核酸配列決定ライブラリを調製するための技術は熟練者にとって周知である。
核酸配列決定ライブラリを調製するための段階は、市販のキット、例えばＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＮＥＢＮｅｘｔ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＴｒｕＳｅｑ Ｎａｎｏ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＪｅｔＳｅｑ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）などを使用して行われ得る。
一実施形態において、核酸の検出は、ハイスループット配列決定（ＨＴＳ）または次世代配列決定（ＮＧＳ）によるランダム配列決定によって行われ得る。
核酸ライブラリのＮＧＳのための方法は当業者にとって公知であり、ペアエンド配列決定、合成による配列決定、シングルリード配列決定が含まれるが限定されない。
ＮＧＳのためのプラットフォームが利用可能であり、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰａｃＢｉｏ ＲＳ（ＰａｃＢｉｏ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡＩＩｘ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）が挙げられるが限定されない。
核酸ライブラリ配列決定するための段階は、市販のキット、例えばＭｉＳｅｑ試薬キットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）などを使用して行われ得る。
一実施形態において、本発明の方法の信頼性を評価するために本発明の方法全体を通して内部標準が使用される。
一実施形態において、体液の細胞分画中に内部標準を添加する。一実施形態において、内部標準を体液の無細胞分画中に添加する。一実施形態において、少なくとも１つの界面活性剤の前に、その後に、またはそれと同時に内部標準を添加する。一実施形態において、少なくとも１つの核酸消化酵素の前に、その後に、またはそれと同時に内部標準を添加する。一実施形態において、核酸消化酵素活性の阻害の段階の前に、その後に、またはそれと同時に内部標準を添加する。一実施形態において、感染病原体を濃縮するための濃縮段階の前に、その後に、またはそれと同時に内部標準を添加する。一実施形態において、感染病原体のホモジネートの調製段階の前に、その後に、またはそれと同時に内部標準を添加する。一実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡ抽出段階の前に、その後に、またはそれと同時に内部標準を添加する。一実施形態において、感染病原体の核酸の増幅および配列決定段階の前に、その後に、またはそれと同時に内部標準を添加する。
一実施形態において、内部標準は核酸配列である。一実施形態において、内部標準はＤＮＡ配列である。一実施形態において、内部標準はＲＮＡ配列である。
本発明の方法における内部標準として適切なＤＮＡ配列には、バクテリオファージ、例えばポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、アンプラウイルス科（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ）、ビコウダウイルス科（Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科（Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グロビュロウイルス科（Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グッタウイルス科（Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）またはテクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）からのバクテリオファージなどのゲノムＤＮＡおよび／またはその断片が含まれるが限定されない。
本発明の方法における内部標準として適切なＤＮＡ配列には、バクテリオファージ、例えばＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｍ１１、λ（ラムダ）、Φ（ファイ）、Φ２９、Ｐ２２、Ｐ３７、μ（ミュー）、ＰＢＳＸ、Ｐ１Ｐｕｎａ−様、Ｐ２、Ｉ３、Ｂｃｅｐ １、Ｂｃｅｐ ４３、Ｂｃｅｐ ７８、Ｃ２、Ｌ５、ＨＫ９７、Ｎ１５、アシディアヌス・フィラメンタス（Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）ウイルス１、スルホロブス・イスランディクス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ）桿状ウイルス１などのゲノムＤＮＡおよび／またはその断片が含まれるが限定されない。
本発明の方法における内部標準として適切なＲＮＡ配列には、バクテリオファージ、例えばシストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）またはレビウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）からのバクテリオファージなどのゲノムＲＮＡおよび／またはそれらの断片が含まれるが限定されない。
本発明の方法における内部標準として適切なＲＮＡ配列には、ＭＳ２、ＱβなどのバクテリオファージのゲノムＲＮＡおよび／またはそれらの断片が含まれるが限定されない。
一実施形態において、内部標準はウイルスストック物である。一実施形態において、内部標準はバクテリオファージストック物である。一実施形態において、内部標準はウイルスナノ粒子キャプシド形成核酸配列である。
本発明の方法での内部標準として適切なバクテリオファージには、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、アンプラウイルス科（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ）、ビコウダウイルス科（Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科（Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グロビュロウイルス科（Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グッタウイルス科（Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）またはテクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）からのバクテリオファージが含まれるが限定されない。
本発明の方法での内部標準として適切なバクテリオファージには、バクテリオファージＴ３、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ４が含まれるが限定されない。
一実施形態において、内部標準は、バクテリオファージＴ３のストック溶液である。一実施形態において、内部標準は、バクテリオファージＴ３のストック溶液由来のゲノムＤＮＡの抽出物である。
一実施形態において、内部標準は、バクテリオファージＭＳ２のストック溶液である。一実施形態において、内部標準は、バクテリオファージＭＳ２のストック溶液由来のゲノムＲＮＡの抽出物である。
本発明の別の目的は、少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素を含むキット・オブ・パーツである。
一実施形態において、本キットは、
ａ）少なくとも１つの界面活性剤と、
ｂ）少なくとも１つの核酸消化酵素と、
ｃ）場合によっては試薬と、
ｄ）場合によっては本発明による方法における使用のための説明書と、
を含む。
「キット」とは、少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素を一緒に（例えば、サポニンおよびヌクレアーゼなど）を含むかまたは少なくとも１つの界面活性剤の容器および少なくとも１つの核酸消化酵素の容器を含む、何らかの製品（例えばパッケージまたは少なくとも１つの容器）を指す。本キットは、本発明の方法を行うためのユニットとして販売促進され、配布され、または販売され得る。さらに、あらゆるまたは全てのキット試薬は、密封および滅菌容器など、外的環境からそれらを保護する容器内で提供され得る。本キットは、その使用のためのキットおよび方法を記載する添付文書も含有し得る。
一実施形態において、本発明のキットは、
ａ）サポニン、ジギトニン、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００−Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｂｒｉｊ ９８、Ｂｒｉｊ ５８、Ｂｒｉｊ ３５、Ｇｅｎａｐｏｌ Ｃ−１００、Ｇｅｎａｐｏｌ Ｘ−１００、Ｉｇｅｐａｌ、Ｂｒｉｊ ９６／９７、オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドおよびノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ９）またはそれらの誘導体を含むが限定されない群から選択される少なくとも１つの界面活性剤と、
ｂ）ベースラインゼロＤＮａｓｅ、ベンゾナーゼ、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＤＮａｓｅ ＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＴ、ラムダエキソヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、ヌクレアーゼＰ１、ヌクレアーゼＳ１、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、Ｔ７エキソヌクレアーゼを含むが限定されない群から選択される少なくとも１つの核酸消化酵素と、
ｃ）場合によっては、核酸抽出試薬、逆転写試薬、核酸増幅試薬、核酸クリーンアップ試薬、核酸サイズ選択試薬、核酸定量試薬、核酸ライブラリ調製試薬、核酸ライブラリ配列決定試薬、内部標準を含むが限定されない群から選択される試薬と、
ｄ）場合によっては、本発明による方法における使用のための説明書と、
を含む。
一実施形態において、本発明のキットは、
ａ）サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎまたはそれらの誘導体を含むが限定されない群から選択される少なくとも１つの界面活性剤と、
ｂ）ベースラインゼロＤＮａｓｅ、ベンゾナーゼを含むが限定されない群から選択される少なくとも１つの核酸消化酵素と、
ｃ）場合によっては、核酸抽出試薬、逆転写試薬、核酸増幅試薬、核酸クリーンアップ試薬、核酸サイズ選択試薬、核酸定量試薬、核酸ライブラリ調製試薬、核酸ライブラリ配列決定試薬、内部標準を含むが限定されない群から選択される試薬と、
ｄ）場合によっては、本発明による方法における使用のための説明書と、
を含む。
一実施形態において、本発明のキットは、
ａ）サポニン、好ましくはサポニン（２０〜３５％サポゲニン）と、
ｂ）ベースラインゼロＤＮａｓｅおよび／またはベンゾナーゼヌクレアーゼと、
ｃ）場合によっては、核酸抽出試薬、逆転写試薬、核酸増幅試薬、核酸クリーンアップ試薬、核酸サイズ選択試薬、核酸定量試薬、核酸ライブラリ調製試薬、核酸ライブラリ配列決定試薬、内部標準を含むが限定されない群から選択される試薬と、
ｄ）場合によっては、本発明による方法における使用のための説明書と、
を含む。
一実施形態において、核酸抽出試薬は、ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅキット、ＱＩＡａｍｐ Ｃａｄｏｒ Ｐａｔｈｏｇｅｎキット、直鎖状ポリアクリルアミドを含むが限定されない群から選択される。
一実施形態において、逆転写試薬は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩファーストストランド合成系、プライマーオリゴヌクレオチド、ｄＮＴＰを含むが限定されない群から選択される。一実施形態において、逆転写のためのプライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号１および３〜１３として挙げる核酸配列を有するプライマーを含むが限定されない群から選択される。
一実施形態において、核酸増幅試薬は、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーオリゴヌクレオチド、Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液、ｄＮＴＰｓを含むが限定されない群から選択される。一実施形態において、核酸増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１３として挙げる核酸配列を有するプライマーを含むが限定されない群から選択される。
一実施形態において、核酸クリーンアップ試薬は、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩ緩衝液を含むが限定されない群から選択される。
一実施形態において、核酸サイズ選択試薬は、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ試薬キットを含むが限定されない群から選択される。
一実施形態において、核酸定量試薬は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＢＲアッセイキットを含むが限定されない群から選択される。
一実施形態において、核酸ライブラリ調製試薬は、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキットを含むが限定されない群から選択される。
一実施形態において、核酸ライブラリ配列決定試薬は、ＭｉＳｅｑ試薬キットｖ２を含むが限定されない群から選択される。
一実施形態において、内部標準は、バクテリオファージＴ３のストック溶液、バクテリオファージＴ３のストック溶液由来のゲノムＤＮＡの抽出物、バクテリオファージＭＳ２のストック溶液、バクテリオファージＭＳ２のストック溶液由来のゲノムＲＮＡの抽出物を含むが限定されない群から選択される。一実施形態において、全ての対照は、バクテリオファージＴ３のストック溶液および／またはバクテリオファージＭＳ２のストック溶液由来のゲノムＲＮＡの抽出物を含むが限定されない群から選択される。
実施例
次の実施例によって本発明をさらに説明するが、これらは限定するものではない。説明のための例となる適用を参照しながら、いくつかの態様を以下に記載する。多くの具体的な詳細、関係および方法は、本明細書中に記載の特性の完全な理解のために提供するものであることを理解されたい。しかし、当業者は、１つ以上の具体的な詳細なく、または他の方法により、本明細書中に記載の特性が実施され得ることを容易に認識するであろう。本明細書中に記載の特性は、行為または事象の例示的な順序により限定されず、一部の行為は、異なる順序でおよび／または他の行為または事象と同時に起こり得る。さらに、本明細書中に記載の特性に従い方法を実行するために例示される行為または事象の全てが必要とされるわけではない。
実施例１：血漿試料から得られた無細胞分画におけるＨＮＡ濃度の低下
１６００ｒｐｍ（３００ｇ）で１０分間遠心分離し、次いでさらに１３０００ｒｐｍ（１５０００ｇ）で１０分間（小胞または凝集体の完全な排出を確実にするため）遠心分離した血液の上清から得た無細胞分画を０．０１％〜１％ｗ／ｖサポニンの非存在下または存在下でヌクレアーゼ（条件：３７℃で１時間）により処理した（表１）。
高感度のＡｌｕ反復配列ｑＰＣＲによって、得られたＨＮＡ濃度を試験した。サポニン存在下での無細胞分画の温置は、０．０１〜１％の範囲で効率的であった。この実験において、ＨＮＡ量が、０．３〜１％サポニン＋ヌクレアーゼの至適濃度では、ヌクレアーゼのみの場合と比較して（すなわちヌクレアーゼ耐性率）、少なく見積もって１８分の１になった。実際に、サポニン＋ヌクレアーゼによる処理は通常、ＨＮＡ濃度をｑＰＣＲミックスにより示されるバックグラウンドレベルに低下させるので、ＨＮＡがより豊富な無細胞分画に対する、ＨＮＡのより大幅な負荷低下（２５ｃｔ以下、すなわち１０６超）も明らかになり得る。
Figure 2019507588
結論として、発明者らは、サポニンが血漿試料のような無細胞分画において遊離（非細胞会合）ＨＮＡのヌクレアーゼのような核酸消化酵素への到達性を向上させることを示す。
実施例２：生体試料における感染病原体の全ゲノム次世代配列決定（ＮＧＳ）（この場合、ｎＨＮＡ＝微生物ＮＡ（ＭＮＡ））
生体試料からの直接的な感染病原体（細菌、ウイルス、真菌、原虫）検出のための新しいツールが出現している：これらには、ハイスループット配列決定（ＨＴＳ）による生体試料のランダム配列決定が含まれる。生体試料における感染病原体の同定に対する主な障壁は、ＨＮＡレベルが比較的高いことと合わせて、ＭＮＡが極めて少量しか存在しないことである。技術の初期の発展期では、試料からの全核酸を抽出し、ランダムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＣＡ（ローリング・サークル増幅）、ＭＤＡ（多置換増幅）によってランダム増幅を行った。この方法の欠点は、ＭＮＡおよびＨＮＡの両方の同時増幅である。これにより下流ＭＮＡ検出の感度が限定され：例えばマイクロアレイでの検出の感度が低下し、的確な感度レベルに到達するために、ＨＴＳはより深い配列決定を必要とする。単一の分子配列決定を使用しようとする場合でも、ＨＮＡに対するＭＮＡの比率を上昇させることは、ある一定の読み取り数に対する感度を上昇させるために極めて重要である。この欠点を回避するために、ヌクレアーゼによる宿主ＤＮＡの加水分解が提案された。
発明者らは、ここで、血漿中に添加された感染病原体からの感染病原体（ウイルスおよび細菌）読み取りデータの相対的増加を示す。読み出し情報は、ＨＮＡに対する読み取りデータ数に対する、感染病原体に標的化される読み取りデータの割合であった。ヌクレアーゼによる処理は、０．１〜１％の範囲のサポニン存在下において非常に強く改善される。これらの濃度でのサポニンは、ウイルスおよび／または細菌構造内のＭＮＡを保ち、それと同時にヌクレアーゼにとって以前には到達可能でなかったＨＮＡへ到達できるようになる。
ＮＧＳによる血漿試料中のウイルスの検出に対する有効性：実験１
この実験において、血液試料に３種類のウイルス：２種類のＤＮＡウイルス（ＶＺＶおよびＢ１９）および１種類のＲＮＡウイルス（ロタウイルス）を添加した。次いで、１６００ｒｐｍ（３００ｇ）で１０分間にわたり血液細胞をペレット化することによって、生物医学実験室において通常の手順に従い、血漿試料を得た。「ウイルス分画」と呼ばれる得られる上清中に血液細胞が完全にないことを確実にするために、「無細胞分画」と呼ばれる上清を１３０００ｒｐｍ（１５０００ｇ）でさらに遠心分離した。このウイルス分画をサポニン０．３％ｗ／ｖ＋ヌクレアーゼで処理し、ランダム増幅し、Ｐｒｏｔｏｎシークエンサー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で配列決定した。
この結果から、ウイルス標的に対する読み取りデータ数の強い（４．１〜６．４）促進が示される。並行して、ヒト読み取りデータの割合は低下した（ｘ０．６８）（表２）。これは、サポニン存在下でのウイルス／ヒト読み取りデータ比率の７．１倍上昇につながり、配列決定の深度がより低いことが、ウイルス標的に対して同じ読み取りデータ数を得るために必要であることを意味する。
Figure 2019507588
ＮＧＳによる血漿試料中のウイルスの検出に対する有効性：実験２
この実験において、ドナー（ｉｄ：０７６）から得られた生物医学実験室で通常の手順により得られた血漿試料に３種類のＤＮＡウイルス（ＶＺＶ、ネコヘルペスウイルス、イヌパルボウイルス）および２種類のＲＮＡウイルス（ロタウイルス、ネコカリシウイルス）を添加した。血漿をさらに１３０００ｒｐｍ（１５０００ｇ）で遠心分離し、サポニン１％ｗ／ｖ＋ヌクレアーゼで上清（または「ウイルス分画」）を処理し、ランダム増幅し、Ｐｒｏｔｏｎシークエンサー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で配列決定した。
この結果から、ウイルス標的に対する読み取りデータ数の強い（１．３〜１９．２）促進が示される。並行して、ヒト読み取りデータの割合は低下した（ｘ０．５０）（表３）。これは、サポニン存在下でのウイルス／ヒト読み取りデータ比率の１３．６倍上昇につながり、配列決定の深度がより低いことが、ウイルス標的に対して同じ読み取りデータ数を得るために必要であることを意味する。
Figure 2019507588
血漿試料中の細菌検出に対する有効性
この実験において、血液試料にＧｒａｍ−細菌（アシネトバクター・バウマンニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ））およびＧｒａｍ＋細菌（エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ））を添加した。次いで、１６００ｒｐｍ（３００ｇ）で血液細胞をペレット化することによって、生物医学実験室において通常使用される手順に従い、血漿試料を得た。上清（または「無細胞分画」）をさらに１３０００ｒｐｍ（１５０００ｇ）で１０分間遠心分離して、血漿から細菌をペレット化した。本明細書中で「細菌分画」とも呼ばれるこのペレットをサポニン１％ｗ／ｖ＋ヌクレアーゼありまたはなしで処理し、ランダム増幅し、Ｐｒｏｔｏｎシークエンサー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で配列決定した。
この結果から、細菌標的からの読み取りデータ数の強い（２１．５〜４３．５）促進が示される。並行して、ヒト読み取りデータの割合は強く低下した（ｘ０．８０）（表４）。これは、サポニン存在下での細菌／ヒト読み取りデータ比率の１１２倍上昇につながる。ゲノムカバー度（すなわち配列決定された細菌ゲノムの割合）は、サポニン非存在下で１．３〜７．８％であり、サポニン存在下で３２．２〜８２．３％であった。
Figure 2019507588
したがって、段階の優先順序は：
１）ＨＮＡを消化するためのサポニンおよびヌクレアーゼでの無細胞分画の処理、
２）ヌクレアーゼの不活性化、
３）無細胞分画からのＮＡの抽出、
４）ＰＣＲ、ランダム増幅後のＮＧＳまたは単一分子におけるＮＧＳ、ＤＮＡアレイ上でのハイブリッド形成であり得る読み出し情報
となる。
実施例３：ウイルス核酸単離、増幅、ライブラリ構築および配列決定
本明細書中で上に記載の実験に基づき、血漿試料中のウイルスの検出のための完全で標準化されたプロトコールが開発された。
抽出
１μＬのバクテリオファージＴ３ストック物をＰＢＳ中で１０５個バクテリオファージゲノムコピー／ｍＬの最終濃度に即時希釈した。同時に、１ｍＬの新鮮混合血液試料を１．５ｍＬマイクロチューブ中に移し、３００ｇで室温にて１０分間遠心分離した。
２９７μＬの血漿（すなわち上清相）を１．５ｍＬマイクロチューブに移し、１０５個ゲノムコピー／ｍＬで希釈した３μＬのＴ３バクテリオファージを供給した。１２０００ｇで室温にて１０分間、試料をさらに遠心し、１５０μＬの上清を新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。残存上清を廃棄した。
１ｍＬの超高純度ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ不含蒸留水（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｆ．：１０９７７０３５）中で０．１ｇのサポニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのサポニン（２０〜３５％サポゲニン）、Ｒｅｆ．：Ｓ４５２１）を溶解させることによって、１０％ｗ／ｖのサポニン溶液を調製した。４μＬのベンゾナーゼヌクレアーゼ（ＶＷＲ，Ｒｅｆ．：７０６６４−３）、４μＬのベースラインゼロＤＮａｓｅ（Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ，Ｒｅｆ．：ＤＢ０７１１Ｋ）、１８μＬのベースラインゼロＤＮａｓｅ緩衝液および１．８μＬの１０％ｗ／ｖのサポニンを添加した（酵素を予め混合しない。）。振盪およびパルススピン後、試料を温置のために３７℃で１時間置いた。
次いで、試料をパルススピンし、２０μＬの３０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｒｅｆ．：０３６９０）を添加した。次いで、ヌクレアーゼを不活性化するために、試験管を加熱ブロックまたは水浴中で６５℃にて１０分間置いた。
核酸抽出それ自体は、製造者の説明書に従い、ＱＩＡａｍｐ Ｃａｄｏｒ Ｐａｔｈｏｇｅｎ ｍｉｎｉ−キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｒｅｆ．：５４１０４）を用いて行った。
簡潔に述べると、２０μＬのプロテイナーゼＫ、次いで１０μｇの直鎖状ポリアクリルアミド（９８μＬの「ＶＸＬ」緩衝液＋２μＬの直鎖状ポリアクリルアミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｆ．：ＡＭ９５２０）、５ｍｇ／ｍＬ）を含有する１００μＬの「ＶＸＬ」緩衝液（２５〜５０％塩化グアニジウム、２．５〜１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を添加した。断続的ボルテックスによって試料を混合し、室温にて（２０〜２５℃）１５分間温置した。
次いで、３５０μＬの「ＡＣＢ」緩衝液（３０〜５０％グアニジンチオシアン酸塩、イソプロパノール）を添加し、断続的ボルテックスによって試料を混合した。
回収用試験管上に設置されたＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラム上に溶解液を載せ、６０００ｇで１分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。カラムを新しい回収用試験管上に設置し、６００μＬの「ＡＷ１」緩衝液（５０〜７０％塩化グアニジウム、エタノール）を添加することによって洗浄し、６０００ｇで１分間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、新しい回収用試験管上にカラムを設置し、６００μＬの「ＡＷ２」緩衝液（７０％エタノール）を添加することによって洗浄し、６０００ｇで１分間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、新しい回収用試験管上にカラムを設置し、膜を乾燥させるために１２０００ｇで２分間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、新しい１．５ｍＬ ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ不含試験管上にカラムを設置した。５０μＬの「ＡＶＥ」緩衝液（ＲＮａｓｅ不含水、０．０４％アジ化ナトリウム）を膜の中央に添加し、１〜２分間ベンチ上で温置し、次いで１２０００ｇで１分間遠心分離した。カラムを最終的に廃棄した。
回収した溶出物に１μＬのＭＳ２バクテリオファージＲＮＡ溶液を添加した。試料を氷上に置くか、またはすぐに使用する場合は＋４℃に置いた。そうでない場合、これは−２０℃（１カ月以内）または−８０℃（５年以内）で保管すべきである。
ライブラリ増幅のための連続タグ（ＳＴＬＡ）
抽出した核酸の集団内で、一部のウイルスＲＮＡが存在する可能性がある。したがって、ｃＤＮＡにこれらのＲＮＡを変換するために逆転写を最初に進めることは必須である。ファーストストランドｃＤＮＡ合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｆ．：１８０８０−０５１）および固定５’末端配列（２５ｂｐ〜３５ｂｐ）および３’末端の８個の連続したＧ／Ｔヌクレオチドを含有する単一プライマーを用いて行い得る。本実験において、「プライマー−Ｋ８」（Ｋ＝ＧまたはＴ）を使用した（配列番号１）。
予め回収した４μＬの核酸試料を０．２ｍＬ ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ不含マイクロチューブに移し、０．５μＬの１０ｍＭの各ｄＮＴＰｓ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｒｅｆ．：Ｎ０４４７Ｓ）を含有する１μＬの混合液および０．５μＬの２０μＭプライマー−Ｋ８オリゴヌクレオチド（配列番号１）を補給した。混合後、試料を７５℃で５分間加熱し、次いで２５℃で２分間冷却した。
５μＬの混合物を試料に添加したが、これは、
− １μＬの１０Ｘ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴｉｏｎ緩衝液、
− ２μＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、
− １μＬの１００ｍＭ ＤＴＴ、
− ０．５μＬの４０Ｕ／μＬ ＲＮＡｓｅＯＵＴ、
− ０．５μＬの２００Ｕ／μＬ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴＡｓｅ
を含有する。
０．２ｍＬマイクロチューブをサーモサイクラーに入れ、プライマーのアニーリングおよび伸長のために２５℃にて１０分間温置し、次いでファーストストランドｃＤＮＡ合成のために４５℃にて６０分間温置した。回収した核酸をすぐに使用したか、または後の使用のために−２０℃で保管した。
ライブラリ増幅のための連続タグ（ＳＴＬＡ）法は、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼを使用する。６回のランダム増幅サイクルのために単一プライマーを使用する（プライマー−Ｋ８、逆転写のために既に使用（配列番号１））。２回目のサイクルから、既にタグ付加された断片上の全プライミングによって、両末端にアダプター配列（すなわち配列番号１として挙げられるプライマー−Ｋ８配列）を有するパンハンドル様構造がもたらされる。この手順のためにＶｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼを使用する。開始前、全緩衝液を使用前に慎重にボルテックスする。
既に得られた１０μＬの試料（４μＬの核酸＋１μＬのｄＮＴＰ／プライマーミックス＋５μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴｉｏｎ ｍｉｘ）に、
− ３μＬの１０Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液、
− ３μＬの１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、
− １．２μＬの５ｍＭ各ｄＮＴＰｓ、
− １２．３μＬの超高純度ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ不含蒸留水
を含有する１９．５μＬの混合液を添加した。
混合後、９５℃にて３分間試料を温置し、次いですぐに２分間氷上に置いた。次に、試料をパルススピンし、０．５μＬ（２Ｕ／μＬ）のＶｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｒｅｆ．：Ｍ０２５７Ｓ）を補給した。次に、試料を混合し、サーモサイクラー中で温置した：
− １０℃で４５秒、
− ２０℃で４５秒、
− ３０℃で４５秒、
− ４０℃で４５秒、
− ５０℃で４５秒、
− ６５℃で２分、
− ９４℃で２０秒。
このプログラムを５回反復（全て合わせて６サイクル）し、最終的に＋４℃で保持した。次に、核酸をすぐに使用したか、または後の使用のために−２０℃で保管した。
増幅段階は、ファーストストランドｃＤＮＡ合成中に使用するプライマーの固定部に対応するプライマー（配列番号２）を使用して行い、変更点は、３’末端ランダム配列の欠失からなる。この段階により、パンハンドル様構造が指数関数的に増幅される。この手順のためにＶｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼを使用する。開始前、全緩衝液を使用前に慎重にボルテックスする。
既に得られた３０μＬの試料に、
− ３μＬの１０Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液、
− ３μＬの１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、
− ３μＬの１０μＭプライマー（配列番号２）、
− １．２μＬの５ｍＭ各ｄＮＴＰｓ、
− １μＬの２Ｕ／μＬ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼ、
− １８．８μＬの超高純度ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ不含蒸留水
を含有する３０μＬの混合物を添加した。
次に、試料を混合し、サーモサイクラー中で温置した：
− サイクル１ ９５℃で３分、６５℃で３０秒、７２℃で１分、
− サイクル２〜２１ ９５℃で２０秒、６５℃で３０秒、７２℃で１分。
次いで、１週間以内に使用する場合は＋４℃で、またはより長期間の場合は−２０℃で核酸を維持した。
配列決定ライブラリ構築前の試料クリーニング
配列決定ライブラリ構築前に、１本鎖プライマーおよび反応生成物を除去するために、試料をクリーニングすべきである。
前の反応混合物由来の１本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを分解するために、エキソヌクレアーゼＩを使用して１本鎖プライマーの除去を行い得る。
ＰＣＲ完了後、試料をパルススピンし、６．７μＬの１０ＸエキソヌクレアーゼＩ緩衝液および１μＬのエキソヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｒｅｆ．：Ｍ０２９３Ｓ）を補給し、３７℃で１５分間温置した。
増幅核酸をさらに精製するために、ＳＰＲＩビーズ（ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ試薬キット，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｒｅｆ．：Ｂ２３３１７）を用いて２つの連続的なサイズ選択段階を行い得る。連続的に使用される２つの比率は０．８Ｘおよび０．６Ｘであった。
最初に、色が均一に見えるようになるまでＳＰＲＩビーズ懸濁液をボルテックスした。既に得た６５μＬの核酸を５２μＬのＳＰＲＩビーズ懸濁液が入った１．５ｍＬ ＬｏＢｉｎｄ試験管（Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ Ｄｕｔｓｃｈｅｒ，Ｒｅｆ．：０３３８７１）に移した。１０回ピペッティングすることによって総反応体積を混合し、室温で１分間温置した。磁気ラックに試験管を３分間、または溶液が透明になるまで置いた。次いで、上清を除去し、廃棄した。
試験管をマグネット上に置いたままにし、１８０μＬの新鮮調製８５％エタノールを試料に添加し、３０秒間温置した。次に、ペレットを乱さずに、エタノール上清を除去し、廃棄した。残存エタノールを除去するために、試験管をパルススピンし、磁気ラックに戻し、ペレットを乱さずに、２０μＬピペッターを用いて上清を慎重に除去した。
試験管をマグネット上に保ちながら、１分間を超えない時間、ビーズを室温で風乾させた。次に、試験管を磁気ラックから取り出し、試料に５０μＬのヌクレアーゼ不含水を添加した。混合物をピペットに５回出し入れし、完全に混合するために１０秒間ボルテックスした。
試験管をさらにパルススピンし、少なくとも１分間磁気ラックに戻した。溶液が透明になった後、ペレットを乱さずに、溶出ＤＮＡを含有する上清を新しい１．５ｍＬ ＬｏＢｉｎｄ試験管に移した。
第二に、既に回収した５０μＬの試料に、３０μＬのＳＰＲＩビーズ懸濁液を添加した。１０回ピペッティングすることによって総反応体積を混合し、室温で１分間温置した。試験管を磁気ラックに３分間または溶液が透明になるまで置いた。次いで上清を除去し、廃棄した。
試験管をマグネット上に置いたままにし、１８０μＬの新鮮調製８５％エタノールを試料に添加し、３０秒間温置した。次いで、ペレットを乱さずに、エタノール上清を除去し、廃棄した。残存エタノールを除去するために、試験管をパルススピンし、磁気ラックに戻し、ペレットを乱さずに、２０μＬピペッターで上清を慎重に除去した。
試験管をマグネット上に保ちながら、１分間を超えない時間、ビーズを室温で風乾させた。次に、磁気ラックから試験管を取り出し、２０μＬのヌクレアーゼ不含水を試料に添加した。混合物をピペット中に５回出し入れし、完全に混合するために１０秒間ボルテックスした。
試験管をさらにパルススピンし、少なくとも１分間磁気ラックに戻した。溶液が透明になった後、ペレットを乱さずに、溶出ＤＮＡを含有する上清を新しい１．５ｍＬ ＬｏＢｉｎｄ試験管に移した。
増幅ＤＮＡの定量
１μＬのＱｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲ試薬および１９９μＬのＱｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲ緩衝液（１：２００希釈）（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲアッセイキット，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｆ．：Ｑ３２８５１／Ｑ３２８５３）を混合することによって、２００μＬのＱｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲ希釈標準溶液を調製した。
キットとともに提供される２つのバクテリオファージλＤＮＡ標準物質の各１０μＬに、１９０μＬのＱｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲ希釈標準溶液を添加し、試験管を室温で２分間温置した。
既に回収し、２回希釈した５μＬの増幅ＤＮＡ試料に、１９５μＬのＱｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲ希釈標準溶液を添加し、試験管を室温で２分間温置した。
Ｑｕｂｉｔ２．０蛍光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｆ．：Ｑ３２８６６）を使用して、「ＤＮＡ」、次に「ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲ」を選択することによって、２つの標準物質を用いて、較正プログラムを作動させた。
最後に、核酸試料を読み取った。Ｑｕｂｉｔ２．０蛍光光度計により与えられる値は、アッセイ試験管中の希釈試料の濃度に対応する。クリーニング段階後に増幅ＤＮＡ濃度を得るために、この値を希釈係数によって補正すべきである。
ここで、ＮＧＳ配列決定用の配列決定ライブラリの構築のために増幅核酸を使用し得る。
配列決定ライブラリ構築および実行
この段階は、１ｎｇのインプットＤＮＡを必要とし、製造者の説明書（Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＃１５０３１９４２ ｖ０１，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１６）に従い、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｒｅｆ．：ＦＣ−１３１−１０９６）を使用して行われ得る。
ライブラリ定量は、ベースライン減算なく、２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｆ．：Ｇ２９３９ＡＡ）上で行う。得られたライブラリは、ＭｉＳｅｑ配列決定システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）と適合性がある。
次に、製造者の説明書に従い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシステムおよびＭｉＳｅｑ試薬キットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｒｅｆ．：ＭＳ−１０２−２００２）を使用して１５０塩基のシングルリード配列決定実行においてこれらのライブラリを処理する。
最後に、得られた配列または「配列決定読み取りデータ」は、データバンク、好ましくは臨床で重要な感染病原体のゲノムを含有する多重病原体データバンクに対してアライメントさせ得る。
実施例４：細菌核酸単離、増幅、ライブラリ構築および配列決定
本明細書中、上に記載の実験に基づいて、血漿試料中での細菌検出のための完全および標準化プロトコールを開発した。
抽出
核酸抽出それ自体は、製造者の説明書に従い、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｒｅｆ．：５１７０４）を用いて行った。
簡潔に述べると、３００μＬの新鮮混合血液試料を２ｍＬマイクロチューブ中に移し、体積を１ｍＬに調整するために７００μＬのＰＢＳおよび５００μＬの「ＡＨＬ」緩衝液（３〜１０％サポニン、１０〜２０％スクロース）を補給し、次いで、転倒回転で、または、代替的に、６００ｒｐｍのサーモミキサー中で、室温にて３０分間温置した。次いで、試料を室温にて１００００ｇで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
１ｍＬの超高純度ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ不含蒸留水（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｆ．：１０９７７０３５）中で０．１ｇのサポニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからの、サポニン（２０〜３５％サポゲニン）、Ｒｅｆ．：Ｓ４５２１）を溶解させることによって、１０％ｗ／ｖのサポニン溶液を調製した。回収したペレットを１８４．２μＬの「ＲＤＤ」緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ所有組成物）で再懸濁し、２．５μＬのベンゾナーゼヌクレアーゼ（ＶＷＲ，Ｒｅｆ．：７０６６４−３）および５．８μＬの１０％ｗ／ｖのサポニン（酵素を予め混合しない。）を補給した。振盪およびパルススピン後、温置のために試料を６００ｒｐｍのサーモミキサー上に３７℃にて３０分間置いた。
２０μＬのプロテイナーゼＫをさらに添加し、温置のために試料を６００ｒｐｍのサーモミキサー上に５６℃にて３０分間置いた。
凝縮物を除去するために試験管を短時間スピンした後、試薬ＤＸ（消泡試薬）を含有する２００μＬの「ＡＴＬ」緩衝液（１〜３％ドデシル硫酸ナトリウム−ＳＤＳ）を添加した（１４９０μＬの「ＡＴＬ」緩衝液＋１０μＬの試薬ＤＸ）。
次いでガラスビーズを含有するＰａｔｈｏｇｅｎ Ｌｙｓｉｓ Ｔｕｂｅ Ｌ（キットとともに提供）に試料の体積全体を移した。試験管をマイクロチューブ用のＶｏｒｔｅｘアダプター上に置き、細菌を溶解させるためにフル速度で１０分間ボルテックスした。溶解後の泡の量を減少させるために、試験管を１００００ｇで１分間さらに遠心分離した。
１９８μＬの上清を１．５ｍＬマイクロチューブに移した。同時に、１μＬのバクテリオファージＴ３ストック物を１０６個バクテリオファージゲノムコピー／ｍＬの最終濃度にＰＢＳ中で即時希釈した。２μＬのこの希釈標準溶液を試料に添加した。
４０μＬのプロテイナーゼＫをさらに添加し、試料をボルテックスし、６００ｒｐｍのサーモミキサー上で５６℃にて３０分間温置のために置いたままにした。次に、２００μＬの「ＡＰＬ２」緩衝液（３０〜５０％グアニジンチオシアン酸塩）を添加した。３０秒間、断続的ボルテックスによって試料を混合し、７０℃で１０分間温置した。
次に、回収用試験管上に設置されたＱＩＡａｍｐ ＵＣＰ Ｍｉｎｉカラム（キットとともに提供）上に溶解液を載せる前に、２００μＬのエタノールを添加し、１５〜３０秒間、断続的ボルテックスを行うことによって、試料を混合した。カラムを６０００ｇで１分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。カラムを新しい回収用試験管上に設置し、５００μＬの「ＡＷ１」緩衝液（５０〜７０％塩化グアニジウム、エタノール）を添加することによって洗浄し、６０００ｇで１分間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、新しい回収用試験管上にカラムを設置し、５００μＬの「ＡＷ２」緩衝液（７０％エタノール）添加することによって洗浄し、１２０００ｇで３分間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、新しい回収用試験管上にカラムを設置し、膜を乾燥させるためにさらに１分間、１２０００ｇで遠心分離した。フロースルーを廃棄し、新しい１．５ｍＬ ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ不含試験管上にカラムを設置した。５０μＬの「ＡＶＥ」緩衝液（ＲＮａｓｅ不含水、０．０４％アジ化ナトリウム）を膜の中央に添加し、ベンチ上で５分間温置し、次いで６０００ｇで１分間遠心分離した。カラムを最終的に廃棄した。
試料を氷上に置くか、または、すぐに使用する場合は＋４℃に置いた。そうでない場合、これは−２０℃（１カ月以内）または−８０℃（５年以内）で保管すべきである。
ライブラリ増幅のための連続タグ（ＳＴＬＡ）
ライブラリ増幅のための連続タグ（ＳＴＬＡ）法はＶｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼを使用する。６回のランダム増幅サイクルのために単一プライマーを使用する（プライマー−Ｋ８、逆転写のために既に使用（配列番号１））。２回目のサイクルから、既にタグ付加された断片上の全プライミングにより、両末端にアダプター配列を有するパンハンドル様構造がもたらされる。この手順のためにＶｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼを使用する。開始前、全緩衝液を使用前に慎重にボルテックスする。
既に得られた４μＬの試料を０．２ｍＬ ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ不含試験管中に移し、
− ３μＬの１０ＸＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液、
− ３μＬの１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、
− １．２μＬの５ｍＭ各ｄＮＴＰｓ、
− ０．５μＬの２０μＭプライマー−Ｋ８オリゴヌクレオチド（配列番号１）、
− １７．８μＬの超高純度ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ不含蒸留水
を含有する２５．５μＬの混合物を補給した。
混合後、試料を９５℃で３分間温置し、次いですぐに氷上に２分間置いた。次に、試料をパルススピンし、０．５μＬ（２Ｕ／μＬ）のＶｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｒｅｆ．：Ｍ０２５７Ｓ）を補給した。次に、試料を混合し、サーモサイクラー中で温置した：
− １０℃で４５秒、
− ２０℃で４５秒、
− ３０℃で４５秒、
− ４０℃で４５秒、
− ５０℃で４５秒、
− ６５℃で２分、
− ９４℃で２０秒。
このプログラムを５回反復（全て合わせて６サイクル）し、最終的に＋４℃で保持した。次に、核酸をすぐに使用したか、または後の使用のために−２０℃で保管した。
増幅段階は、ファーストストランドｃＤＮＡ合成中に使用するプライマーの固定部に対応するプライマー（配列番号２）を使用して行い、変更点は、３’末端ランダム配列の欠失からなる。この段階によって、パンハンドル様構造が指数関数的に増幅される。この手順のためにＶｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼを使用する。開始前、全緩衝液を使用前に慎重にボルテックスする。
既に得られた３０μＬの試料に、
− ３μＬの１０ＸＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液、
− ３μＬの１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、
− ３μＬの１０μＭプライマー（配列番号２）、
− １．２μＬの５ｍＭ各ｄＮＴＰｓ、
− １μＬの２Ｕ／μＬ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼ、
− １８．８μＬの超高純度ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ不含蒸留水
を含有する３０μＬの混合物を添加した。
次に、試料を混合し、サーモサイクラー中で温置した：
− サイクル１ ９５℃で３分間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間、
− サイクル２〜２１ ９５℃で２０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間。
次に、１週間以内に使用する場合は＋４℃で、またはより長期の場合は−２０℃で核酸を維持した。
配列決定ライブラリ構築前の試料クリーニング
配列決定ライブラリ構築前に、１本鎖プライマーおよび反応生成物を除去するために、試料をクリーニングすべきである。
前の反応混合物からの１本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを分解するために、エキソヌクレアーゼＩを使用して１本鎖プライマーの除去を行い得る。
ＰＣＲ完了後、試料をパルススピンし、６．７μＬの１０ＸエキソヌクレアーゼＩ緩衝液および１μＬのエキソヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｒｅｆ．：Ｍ０２９３Ｓ）を補給し、３７℃で１５分間温置した。
増幅核酸をさらに精製するために、ＳＰＲＩビーズ（ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ試薬キット，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｒｅｆ．：Ｂ２３３１７）を用いて２つの連続的なサイズ選択段階を行い得る。連続的に使用される２つの比率は０．８Ｘおよび０．６Ｘであった。
最初に、色が均一に見えるようになるまでＳＰＲＩビーズ懸濁液をボルテックスした。既に得た６５μＬの核酸を５２μＬのＳＰＲＩビーズ懸濁液が入った１．５ｍＬ ＬｏＢｉｎｄ試験管（Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ Ｄｕｔｓｃｈｅｒ，Ｒｅｆ．：０３３８７１）に移した。１０回ピペッティングすることによって総反応体積を混合し、室温で１分間温置した。磁気ラックに試験管を３分間、または溶液が透明になるまで置いた。次いで、上清を除去し、廃棄した。
試験管をマグネット上に置いたままにし、１８０μＬの新鮮調製８５％エタノールを試料に添加し、３０秒間温置した。次いで、ペレットを乱さずにエタノール上清を除去し、廃棄した。残存エタノールを除去するために、試験管をパルススピンし、磁気ラックに戻し、ペレットを乱さずに、２０μＬピペッターで上清を慎重に除去した。
試験管をマグネット上に保ちながら、１分間を超えない時間、ビーズを室温で風乾させた。次に、磁気ラックから試験管を取り出し、５０μＬのヌクレアーゼ不含水を試料に添加した。混合物をピペット中に５回出し入れし、完全に混合するために１０秒間ボルテックスした。
試験管をさらにパルススピンし、少なくとも１分間、試験管を磁気ラックに戻した。溶液が透明になった後、ペレットを乱さずに、溶出ＤＮＡを含有する上清を新しい１．５ｍＬ ＬｏＢｉｎｄ試験管に移した。
第二に、既に回収した５０μＬの試料に、３０μＬのＳＰＲＩビーズ懸濁液を添加した。１０回ピペッティングすることによって総反応体積を混合し、室温で１分間温置した。試験管を磁気ラックに３分間または溶液が透明になるまで置いた。次いで上清を除去し、廃棄した。
試験管をマグネット上に置いたまま、１８０μＬの新鮮調製８５％エタノールを試料に添加し、３０秒間温置した。次いで、ペレットを乱さずにエタノール上清を除去し、廃棄した。残存エタノールを除去するために、試験管をパルススピンし、磁気ラックに戻し、ペレットを乱さずに、２０μＬピペッターで上清を慎重に除去した。
試験管をマグネット上に保ちながら、１分間を超えない時間、ビーズを室温で風乾させた。次に、磁気ラックから試験管を取り出し、２０μＬのヌクレアーゼ不含水を試料に添加した。混合物をピペットに５回出し入れし、完全に混合するために１０秒間ボルテックスした。
試験管をさらにパルススピンし、少なくとも１分間、試験管を磁気ラックに戻した。溶液が透明になった後、ペレットを乱さずに、溶出ＤＮＡを含有する上清を新しい１．５ｍＬ ＬｏＢｉｎｄ試験管に移した。
増幅ＤＮＡの定量
１μＬのＱｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲ試薬および１９９μＬのＱｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲ緩衝液（１：２００希釈）（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲアッセイキット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｆ．：Ｑ３２８５１／Ｑ３２８５３）を混合することによって、２００μＬのＱｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲ希釈標準溶液を調製した。
キットとともに提供される２つのバクテリオファージλＤＮＡ標準物質のそれぞれの１０μＬに、１９０μＬのＱｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲ希釈標準溶液を添加し、試験管を室温で２分間温置した。
既に回収し、２回希釈した５μＬの増幅ＤＮＡ試料に、１９５μＬのＱｕａｎｔ−ｉＴ ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲ希釈標準溶液を添加し、試験管を室温で２分間温置した。
Ｑｕｂｉｔ２．０蛍光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｆ．：Ｑ３２８６６）を使用して、「ＤＮＡ」、次に「ｄｓＤＮＡ ＨＳ／ＢＲ」を選択することによって、２つの標準物質を用いて、較正プログラムを実行させた。
最後に、核酸試料の読み取りを行った。Ｑｕｂｉｔ２．０蛍光光度計により与えられた値は、アッセイ試験管中の希釈試料の濃度に対応する。クリーニング段階後に増幅ＤＮＡ濃度を得るために、この値を希釈係数によって補正すべきである。
ここで、ＮＧＳ配列決定用の配列決定ライブラリの構築のために増幅核酸を使用し得る。
配列決定ライブラリ構築および実行
この段階は、１ｎｇのインプットＤＮＡを必要とし、製造者の説明書（Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＃１５０３１９４２ ｖ０１，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１６）に従い、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｒｅｆ．：ＦＣ−１３１−１０９６）を使用して行われ得る。
ライブラリ定量は、ベースライン減算なく、２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｆ．：Ｇ２９３９ＡＡ）上で行う。得られるライブラリは、ＭｉＳｅｑ配列決定システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）と適合性がある。
次に、製造者の説明書に従い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシステムおよびＭｉＳｅｑ試薬キットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｒｅｆ．：ＭＳ−１０２−２００２）を使用して１５０塩基のシングルリード配列決定実行においてこれらのライブラリを処理する。
最後に、得られた配列または「配列決定読み取りデータ」は、データバンク、好ましくは臨床で重要な感染病原体のゲノムを含有する多重病原体データバンクに対してアライメントさせ得る。
実施例５：分析性能の特徴
この実験において、血液試料に９種類の感染病原体を添加した（表５）。
Figure 2019507588
 ｇｃ／ｍＬ：ゲノムコピー／ｍＬ
検出限界
８検体の独立した血液試料から９種類の感染病原体に対する検出限界（ＬｏＤ）を決定し、そのうち５試料については反復し（核酸抽出物から開始）、つまり全て合わせて１３試料について決定した。
５種類のウイルスのうち、３種類が全ての状況で検出された（１３／１３）：ＶＺＶ、パルボウイルスＢ１９およびロタウイルスＡ。全てにおいてＢＫポリオーマウイルスが検出されたが、５試料のうち１つの２つ組は２回処理した（１２／１３陽性）。
１０４ｇｃ／ｍＬの濃度で添加した場合、いくつかの試料において、僅か数十〜数百の配列決定読み取りデータでしかパラインフルエンザ−３ウイルスが検出されず、一方で、他の試料では検出されなかった。このデータは、パラインフルエンザ−３ウイルスに対する添加濃度がＬｏＤの極限に対応することを意味する。
したがって、ウイルスに対して計算されるＬｏＤは、
− ＶＺＶ １０４ｇｃ／ｍＬ、
− ロタウイルスＡ １０３ｇｃ／ｍＬ、
− パルボウイルスＢ１９ ２．５ｘ１０３ｇｃ／ｍＬ、
− ＢＫポリオーマウイルス １０４ｇｃ／ｍＬ、
− パラインフルエンザ−３ウイルス １０４ｇｃ／ｍＬである。
３種類のＧｒａｍ＋細菌の中でも、全ての状況（１３／１３）でエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）が検出され、１３試料のうち１２試料でエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）およびスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）が検出された。これら後の２つの細菌は１３番目の試料中で中程度の信頼度で検出され、このことから、１０４ｇｃ／ｍＬで添加した上述のＧｒａｍ＋細菌の全てがこの濃度で容易に検出可能であることが示される。
全１３試料中で１０４ｇｃ／ｍＬで添加されたＧｒａｍ−細菌クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が検出され、９例で高い信頼度であり、残りの４例で信頼度が低かった。クレブシエラ・ニューモニエが検出されなかった試料はなかった。
したがって、細菌について計算されるＬｏＤは、
− エンテロコッカス・フェカリス １０４ｇｃ／ｍＬ、
− エンテロコッカス・フェシウム １０４ｇｃ／ｍＬ、
− スタフィロコッカス・アウレウス １０４ｇｃ／ｍＬ、
− クレブシエラ・ニューモニエ １０４ｇｃ／ｍＬである。
再現性
異なるＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑフローセル上に載せた同一のＮＧＳライブラリを試験することによって、２つの異なるレベルで再現性を評価し、独立に分析した。このアプローチによって、データ出力上にＮＧＳ配列決定確率的段階によって導入される可変性を評価することが可能となる。
２つの異なるＮＧＳライブラリを２回のＮＧＳ実行に載せた。１８種類の条件（９種類の感染病原体および２つの異なるライブラリ）の中で、１つの条件のみが異なる結果をもたらした。同じライブラリの２つの複製物について、ロタウイルスＡは検出されなかったか、または中程度の信頼度で検出された。より重要なことに、試料のある点で感染病原体が検出された場合、これは２つ組でも検出され、このことから、検出された病原体に対する一貫性のある再現性が示される。
次いで、同じウイルスおよび細菌抽出物から出発するが、ＮＧＳ配列決定まで独立に処理する実験を行った。核酸増幅、ＮＧＳライブラリ構築および配列決定段階により導入される可変性を監視するために、これを使用した。
それぞれがウイルスおよび細菌抽出物を与える５つの異なる血液試料においてこのようなタイプの実験を行った。各ウイルスおよび細菌抽出物に対して、２つの異なるＭｉＳｅｑフローセル上への、２つ組の核酸増幅、ＮＧＳライブラリ構築および配列決定を行った。５検体の血液試料由来の１０個のＮＧＳライブラリ上で分析を行った。
４５組の２つ組のうち（５検体の異なる血液試料に９種類の感染病原体を添加）、７つのみが不調和であった。検出に関して７例を次のように分類し得る：
− 陽性から中程度の信頼度レベル：
４例（２ｘパラインフルエンザ−３ウイルス；エンテロコッカス・フェシウム；スタフィロコッカス・アウレウス）、
− 陽性から陰性検出：
１例（ＢＫポリオーマウイルス）、
− 陽性から低信頼度レベル：
１例（クレブシエラ・ニューモニエ）、
− 低信頼度レベルから陰性レベル：
１例（クレブシエラ・ニューモニエ）。
７例の不調和のケースの中で、再現性が低いデータを示す病原体である、パラインフルエンザ−３ウイルスおよびクレブシエラ・ニューモニエは、４例に相当する。より重要なこととして、単一の２つ組内での陽性検出および非検出により示される著しい変動性が見られるのは、試験した４５例のうち１例のみである。
要するに、このデータから、単一の核酸抽出物から出発した場合の、感染病原体の検出に対する非常に良好な再現性が示される。
実施例６：内部標準
内部標準１
ウイルス分画および細菌分画の調製中、本明細書中で「内部標準１」と呼ばれる第１の内部標準は、本発明の方法の信頼性を評価するために使用される。内部標準１は、バクテリオファージＴ３の超高純度ストック溶液である。
ウイルス分画において、内部標準１は、サポニンおよびヌクレアーゼ処理前に血漿に添加され、その手順の続く段階全てを監視するために役立つ。
細菌分画において、サポニンおよびヌクレアーゼ処理後であるが、細菌ＤＮＡの抽出前に内部標準１を添加する。これは、細菌ＤＮＡ精製およびこの手順の続く段階を監視するために使用する。
ウイルス分画調製と細菌分画調製との間の差は、内部標準１の添加によるこれらの手順の監視において関係がある。実際に、ウイルス粒子からのウイルス核酸の抽出は、特にＧｒａｍ＋細菌に対する細菌細胞壁を破壊するために必要とされる強い機械的溶解と比べた場合、「ソフトな」処理（一般的にはカオトロピック塩使用）によって達成される。このような強力な処理は、内部標準１の核酸を必然的に分解し、本手順のさらなる監視を妨げる。結果として、細菌分画中の内部標準１の添加は、機械的溶解後および細菌核酸の精製前、すぐに行われる。
内部標準２
ウイルス分画の調製中に、本発明の方法の信頼度を評価するために、本明細書中で「内部標準２」と呼ぶ第２の内部標準を使用し得る。内部標準２は、バクテリオファージＭＳ２の超高純度ストック溶液由来のゲノムＲＮＡの抽出物である。
ウイルス分画において、ウイルス核酸精製直後に内部標準２をウイルス核酸抽出物に添加し得る。この場合、これは、ＲＮＡウイルスの検出および配列決定に必要とされる逆転写段階を監視するため、ならびに内部標準１と一緒に本手順の続く段階を監視するために使用される。
本発明の方法は、内部標準１および２に対する十分な配列決定読み取りデータが回収される場合、すなわちゲノムの約１０％超がカバーされる場合、信頼性があるとみなされる。

Claims (14)

  1. 体液の無細胞分画からの感染病原体の核酸を単離し、増幅し、配列決定するためのインビトロ法であって、前記体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させることを含む、インビトロ法。
  2. 前記感染病原体の核酸の抽出および配列決定をさらに含む、請求項１に記載のインビトロ法。
  3. （ａ）前記体液の無細胞分画を少なくとも１つの界面活性剤および少なくとも１つの核酸消化酵素と接触させるステップと、
    （ｂ）感染病原体の核酸を抽出するステップと、
    （ｃ）場合によっては感染病原体のゲノムＲＮＡを逆転写するステップと、
    （ｄ）感染病原体のゲノムＤＮＡおよび／または感染病原体のｃＤＮＡを増幅するステップと、
    （ｅ）増幅した感染病原体のゲノムＤＮＡおよび／または感染病原体のｃＤＮＡを配列決定するステップと、
    を含む、請求項１または２に記載のインビトロ法。
  4. 前記感染病原体の核酸の配列決定が次世代配列決定により行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインビトロ法。
  5. 前記感染病原体が、ウイルス、細菌、真菌、原虫および寄生生物を含む群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のインビトロ法。
  6. 前記少なくとも１つの界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤および陰イオン性界面活性剤を含む群から選択され、好ましくは、前記少なくとも１つの界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のインビトロ法。
  7. 前記少なくとも１つの界面活性剤が、サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎおよびそれらの誘導体界面活性剤を含む群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のインビトロ法。
  8. 前記少なくとも１つの界面活性剤が、約５％〜約５０％のサポゲニン含量を有するサポニンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のインビトロ法。
  9. 前記少なくとも１つの核酸消化酵素が、ＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅの活性を有するヌクレアーゼである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のインビトロ法。
  10. 前記少なくとも１つの核酸消化酵素が、ベースラインゼロＤＮａｓｅ、ベンゾナーゼ、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＤＮａｓｅ ＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＴ、ラムダエキソヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、ヌクレアーゼＰ１、ヌクレアーゼＳ１、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩおよびＴ７エキソヌクレアーゼを含む群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のインビトロ法。
  11. 前記分画内の残留細胞の存在が、前記分画中の感染病原体の到達性または濃縮に影響を及ぼさない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のインビトロ法。
  12. ａ．サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎまたはそれらの誘導体を含む群から選択される少なくとも１つの界面活性剤と、
    ｂ．ベースラインゼロＤＮａｓｅ、ベンゾナーゼ、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＤＮａｓｅ ＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＴ、ラムダエキソヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、ヌクレアーゼＰ１、ヌクレアーゼＳ１、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩおよびＴ７エキソヌクレアーゼを含む群から選択される少なくとも１つの核酸消化酵素と、
    ｃ．場合によっては試薬と、
    ｄ．場合によっては本発明による方法での使用のための説明書と、
    を含む、キット・オブ・パーツ。
  13. 試薬が、核酸抽出試薬、逆転写試薬、核酸増幅試薬、核酸クリーンアップ試薬、核酸サイズ選択試薬、核酸定量試薬、核酸ライブラリ調製試薬、核酸ライブラリ配列決定試薬および内部標準を含む群から選択される、請求項１２に記載のキット・オブ・パーツ。
  14. 試薬が、核酸抽出試薬、逆転写酵素、ｖｅｎｔ ｅｘｏ− ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、配列番号１または３〜１３の何れかとして記載される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号２として記載される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、エキソヌクレアーゼＩおよび／またはＳＰＲＩビーズを含む、請求項１２または１３に記載のキット・オブ・パーツ。
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