CN113444771A - 适合dna或rna病毒直接扩增的裂解剂、试剂盒及其在病毒pcr检测中的应用 - Google Patents

适合dna或rna病毒直接扩增的裂解剂、试剂盒及其在病毒pcr检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，包括：Tris‑HCl、离液盐、表面活性剂、还原剂、EDTA及RNA酶抑制剂Rnasin。使用本发明的裂解剂处理血清、血浆、鼻拭子、咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等样本，能在室温条件下快速、有效释放病毒核酸，裂解物可直接用于qPCR扩增，无需核酸提取步骤，大大提高了检测效率，使整个时间从3小时缩短到1.5h。

Description

适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂、试剂盒及其在病毒PCR 检测中的应用
技术领域
本发明涉及一种适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂及其在病毒PCR检测中的应用，以及相应的DNA或RNA病毒PCR检测试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
核酸检测具有灵敏度高、特异性强、耗时短、能监控病毒活跃度等特点，已广泛应用于临床检验。然而，临床样本中含有大量的核酸扩增干扰物质，所以在核酸扩增前必须对样本进行核酸提取和纯化。
目前主要的核酸提取方法包括硅胶膜吸附柱法和磁珠法。柱法提取能获得高纯度核酸，但是提取步骤繁琐，需多次离心，整个流程耗时长。磁珠法提取结合自动化提取仪器，相较于柱法提取，能大幅缩短提取时间，但是多样本同时操作存在交叉污染的风险，提取仪器及试剂的成本也比较高。
病毒裂解剂成本低廉，且能在室温条件下快速、有效释放样本中病毒核酸，裂解物可直接用于qPCR扩增，无需核酸提取步骤，大大提高了检测效率，使整个时间从3小时缩短到1.5h。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，裂解物可直接用于qPCR扩增，无需核酸提取步骤。
本发明采用的技术方案为：
一种适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，包括：Tris-HCl、离液盐、表面活性剂、还原剂、EDTA及RNA酶抑制剂Rnasin。
优选的，所述离液盐为盐酸胍、异硫氰酸胍或硫氰酸胍中的一种，浓度为50-200mM。
优选的，所述离液盐为盐酸胍，浓度为100mM。
优选的，所述表面活性剂为Triton X-100、NP40或Tween20，浓度为0.5-2%体积比，即每100ml裂解剂中含有0.5-2ml的表面活性剂。
优选的，所述表面活性剂为Tween20，浓度为0.5%体积比。
优选的，所述还原剂为DTT、乙酰半胱氨酸，浓度为0.5-2%质量体积比，即每100ml裂解剂中含有0.5-2mg还原剂；巯基乙醇，浓度为0.5-2%体积比，即每100ml裂解剂中含有0.5-2ml还原剂。
优选的，所述还原剂为乙酰半胱氨酸，浓度为0.5%质量体积比。
优选的，所述Tris-HCl的pH为7.0-8.5，浓度为10-100mM。
优选的，所述Tris-HCl的pH为8.0，浓度为20mM。
优选的，所述EDTA的浓度为1-10mM。
优选的，所述EDTA的浓度为2.5mM。
优选的，所述Rnasin的浓度为100-2000U/ml。
优选的，所述Rnasin的浓度为500U/ml。
本发明还公开了上述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂在病毒PCR检测中的应用。
本发明还公开了一种DNA或RNA病毒PCR检测试剂盒，包括上述的裂解剂。
本发明的有益效果：
使用本发明的裂解剂处理血清、血浆、鼻拭子、咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等样本，能在室温条件下快速、有效释放病毒核酸，裂解物可直接用于qPCR扩增，无需核酸提取步骤，大大提高了检测效率，使整个时间从3小时缩短到1.5h。
附图说明
图1为本发明裂解剂用于检测HBV病毒梯度浓度血清模拟样本的荧光定量PCR扩增曲线。
图2为本发明裂解剂用于检测HBV病毒梯度浓度血清模拟样本所作的标准曲线。
图3 为本发明裂解剂检测柯萨奇A16型病毒咽拭子模拟样本与采用QiagenRNeasy Mini kit的扩增对比图。
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
实施例1：
本实施例中的裂解剂由20mM Tris-HCL pH8.0、150mM盐酸胍、0.5% Tween 20、0.5% 乙酰半胱氨酸、2.5mM EDTA、500U/ml RNasin组成。
将高浓度HBV病毒新鲜培养物(由罗氏公司的 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqManHBV Test，version 2.0 试剂盒进行定量)，用市售阴性且外观澄清的血清进行系列稀释，获得106、105、104、103 IU/ ml浓度的样本，将裂解剂和稀释样本1：1混合，室温处理5min后，取5μl用于后续的qPCR扩增。
HBV引物探针：
HBV-F: 5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA- 3’
HBV-R: 5’-GACAAACGGGCAACATACCTT- 3’
HBV-P: 5’- CCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATC - 3’（标记：5’FAM，3’BHQ1）
qPCR反应体系：
组分 体积（μl）/反应
5XPCR buffer 5
dNTP(10mM) 0.5
Taq DNA 酶（5U/μl） 0.6
引物HBV-F（10μM） 1
引物HBV-R（10μM） 1
探针HBV-P（10μM） 0.5
ddH2O 11.4
DNA模板 5
扩增程序：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
荧光定量PCR扩增曲线如图1所示，根据图1所作的标准曲线如图2所示。可以看出，本裂解剂处理HBV梯度浓度血清模拟样本，标准曲线显示扩增效率为99.5%。一致性系数达到0.999，表明核酸释放剂处理样本直接用于qPCR扩增，不会影响扩增效率。
实施例2：
本实施例中的裂解剂由20mM Tris-HCL pH8.0、100mM异硫氰酸胍、0.5% Tween20、0.5% 乙酰半胱氨酸、2.5mM EDTA、500U/ml RNasin组成。
将柯萨奇A16型病毒（手足口病主要病原体之一）用阴性咽拭子样本稀释至105、103Copies/ml，分别用裂解剂处理和Qiagen RNeasy Mini Kit提取，105Copies/ml设置3个复孔，103Copies/ml设置20个复孔，后续取5μl为模板进行RT-qPCR检测。
柯萨奇A16型病毒引物探针：
Cox A16-F：5’-GAACCATCACTCCACACAGGAG- 3’
Cox A16-R：5’-GTACCTGTGGTGGGCATTG- 3’
Cox A16-P：5’-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG- 3’（标记：5’FAM，3’BHQ1）
RT-qPCR反应体系：
组分 体积（μl）/反应
5XPCR buffer 5
dNTP(10mM) 0.5
Taq DNA 酶（5U/μl） 0.6
MMLV酶（200U/μl） 0.1
Rnasin（200U/μl） 0.1
引物H1N1-F（10μM） 1
引物H1N1-R（10μM） 1
探针H1N1-P（10μM） 0.5
Rnase free H2O 11.2
RNA模板 5
扩增程序：
Figure 445034DEST_PATH_IMAGE002
结果如图3所示。经裂解剂处理的105Copies/ml柯萨奇A16型病毒咽拭子模拟样本，直接进行RT-qPCR扩增，Ct值和Qiagen提取后基本一致，差值在0.5Ct以内，结果表明本发明裂解剂有很强RNA病毒核酸释放能力，并能有效去除咽拭子中的抑制物对扩增的影响。103 Copies/ml咽拭子模拟样本提取，Qiagen 20个重复均检出，裂解剂处理共检出19个，两者检出率基本一致。
实施例3：
本实施例中的裂解剂由20mM Tris-HCL pH8.0、100mM盐酸胍、0.5% Tween 20、0.5% 乙酰半胱氨酸、2.5mM EDTA、500U/ml RNasin组成。
准备15例甲型H1N1型流感病毒咽拭子阳性样本，平行用裂解剂处理和QiagenRNeasy Mini Kit提取，裂解剂和样本混合比例为1：1，震荡混匀1min后，室温处理5min，后续取5μl为模板进行RT-qPCR检测。
甲型H1N1型流感病毒引物探针：
H1N1-F:5’-GGACTGCAGCGTAGACGCTT- 3’
H1N1-R:5’-CATCCTGTTGTATATGAGGCCCAT- 3’
H1N1-P:5’-CTCAGTTATTCTGCTGGTGCACTTGCCA- 3’（标记：5’FAM，3’BHQ1）
RT-qPCR反应体系和程序同实施例2。
检测结果如下表所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
检测结果显示15例甲型H1N1型流感病毒咽拭子阳性样本两种方法均100%检出，Ct值表明本发明裂解剂处理甲型H1N1型流感病毒咽拭子样本检测能力和Qiagen提取相当。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (15)

1.一种适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，包括：Tris-HCl、离液盐、表面活性剂、还原剂、EDTA及RNA酶抑制剂Rnasin。
2.根据权利要求1所述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，其特征在于：所述离液盐为盐酸胍、异硫氰酸胍或硫氰酸胍中的一种，浓度为50-200mM。
3.根据权利要求2所述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，其特征在于：所述离液盐为盐酸胍，浓度为100mM。
4.根据权利要求1所述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，其特征在于：所述表面活性剂为Triton X-100、NP40或Tween20，浓度为0.5-2%体积比。
5.根据权利要求4所述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，其特征在于：所述表面活性剂为Tween20，浓度为0.5%体积比。
6.根据权利要求1所述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，其特征在于：所述还原剂为DTT、乙酰半胱氨酸，浓度为0.5-2%质量体积比，巯基乙醇，浓度为0.5-2%体积比。
7.根据权利要求6所述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，其特征在于：所述还原剂为乙酰半胱氨酸，浓度为0.5%质量体积比。
8.根据权利要求1所述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，其特征在于：所述Tris-HCl的pH为7.0-8.5，浓度为10-100mM。
9.根据权利要求8所述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，其特征在于：所述Tris-HCl的pH为8.0，浓度为20mM。
10.根据权利要求1所述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，其特征在于：所述EDTA的浓度为1-10mM。
11.根据权利要求10所述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，其特征在于：所述EDTA的浓度为2.5mM。
12.根据权利要求1所述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，其特征在于：所述Rnasin的浓度为100-2000U/ml。
13.根据权利要求12所述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂，其特征在于：所述Rnasin的浓度为500U/ml。
14.权利要求1-13中任一项所述的适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂在病毒PCR检测中的应用。
15.一种DNA或RNA病毒PCR检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-13中任一项所述的裂解剂。
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CN116083422A (zh) * 2023-04-11 2023-05-09 苏州雅睿生物技术股份有限公司 一种核酸释放剂以及试剂盒

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