CN116083422A - 一种核酸释放剂以及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸释放剂以及试剂盒，属于DNA/RNA检测领域；其技术要点在于：a.体积百分含量为1~12%的表面活性剂；b.摩尔浓度范围为10‑150mM的Tris‑HCl；c.摩尔浓度范围为0.05‑1mM的EDTA；d.摩尔浓度范围为150‑400mM的强碱；f.摩尔浓度范围为5‑50mM的尿素；g.摩尔浓度范围为0.01‑5mM mM的CuCl2；h.体积百分含量为0.1%的DEPC。本发明旨在提供一种核酸释放剂以及试剂盒，方便进行PCR检测，操作方便，快捷。
Description
技术领域
本发明涉及一种DNA/RNA检测领域，更具体地说，尤其涉及一种核酸释放剂以及试剂盒。
背景技术
呼吸道感染（Respiratory tract infection，RTI）是人类最常见的一类疾病，感染人群在任何性别、年龄和地域中发生，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。
呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似，其临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。
目前已证明，大部分呼吸道疾病是由病毒引起，其次是细菌、支原体、衣原体感染。
用于诊断呼吸道感染的实验室方法包括病原体的分离培养、免疫组化分析、血清学和 PCR核酸检测，后两者是最常用的方法。诊断呼吸道感染的金标准是分离培养方法；但由于需要特殊培养基、耗时长、实验条件繁琐、检出率相对较低、对呼吸道感染的确诊较慢；免疫组化分析操作较为复杂，耗时较长，且价格不菲；因此临床上一般不用分离培养和免疫组化分析进行呼吸道感染病原体的诊断。血清学检测诊断结果会滞后，因为检测通常在疾病发作后 1-2 周或更长时间呈阳性，因此很难将此类检测结果应用于实际治疗决策。
目前针对病原体核酸检测的荧光PCR技术已经比较成熟。基于PCR的方法灵敏度高，检测时间短，检测可在一个工作日内完成，而且还可以在同一反应中同时扩增多个靶标（多重 PCR），因此荧光PCR核酸检测方法正在成为诊断实验室中一种快速、经济和方便的手段。
但是，检测过程中核酸的提取和纯化是整个实验中比较耗时和繁琐的步骤，严重影响样本检测的速度以及现场应用。
迄今为止，核酸提取方法主要有煮沸法、离心柱法以及磁珠法。煮沸法和离心柱法，均存在操作步骤繁琐，核酸容易污染的不足；磁珠法提取步骤相对简单，易于自动化提取，但产品价格贵，且仪器密闭舱内提取存在交叉污染的风险。
因此，开发一种能快速释放核酸、不易造成交叉污染并且对后续核酸检测实验无影响的核酸快速释放方法成为目前亟待解决的问题。
对于上述问题，核心的问题之一是：如何设计一款适宜的核酸释放剂。
对于一款核酸释放剂而言，一般均含有：强碱（使细胞或病毒裂解从而释放核酸）、Tris-HCl（pH值缓冲液、避免核酸的降解，提高核酸的浓度和纯度）、表面活性剂（提取可溶性蛋白）、金属离子螯合剂（能够与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等金属离子结合，可防止金属离子激活蛋白酶，从而减少金属离子对核酸质量的影响）等。
然而，现今核酸释放剂的应用性难题在于：人员在采取拭子后，拭子放入核酸释放剂中，此时，溶液需要等待若干时间，才会进入PCR试验。这一时间中必然会造成核酸的降解，从而导致PCR试验结果错误。
针对上述难题，现今的做法有两种方法：
1）拭子放入核酸释放剂后，低温保存。
2）增加PCR仪器的投入，尽量减少拭子排队的时间。
但是上述两种方法均要投入大量的资金，而且对于一些检测地点，无法提供上述低温保存环境。
对于上述问题而言，研发团队在“HIMMPAT、EPO、CNKI、Elservier”等数据库中进行了检索，得到了如下文献：
文献1：CN112980831A,其优点在于：采集的样本可常温保存14 天核酸不降解。但是该文献并未区别RNA、DNA的保存效果。而且，按照研发团队的试验知识，酶抑制剂的含量越高，保存时间越高，但是PCR试验则无法取得结果（本质上是检测时间会非常长）。因此，CN112980831A并未对比14天进行检测时的PCR检测时间。另外，在实际场景中，也很少会有拭子采集后14天才去进行检测的场景；对于许多病毒而言，14天之后人体可能已经康复，此时才去检测缺乏意义。
文献2：CN114181932A，其优点在于：能够在常温下进行保存且保存期可超过一年，便于常温运输及储存。但是该文献不涉及采集的样本可常温保存多长时间。
文献3：EP3910067A1，其优点在于：可以使含有RNA的样品在室温下直接释放出RNA，避免因加热产生气溶胶导致的样品污染问题，并有效防止RNA在碱性环境中的降解。但是该文献不涉及采集的样本可常温保存多长时间。
文献4：EP3943612A1，其优点在于：可以集取样保存-灭活-核酸提取三步为一步。但是该文献不涉及采集的样本可常温保存多长时间。
因此，本申请就上述问题继续进行研究。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种核酸释放剂以及试剂盒。
本发明的技术方案是：
一种核酸释放剂，包括：
a. 体积百分含量为1~12%的表面活性剂；
b. 摩尔浓度范围为10-150mM的Tris-HCl；
c. 摩尔浓度范围为0.05-1mM的EDTA；
d. 摩尔浓度范围为150-400mM的强碱；
f. 摩尔浓度范围为5-50mM的尿素；
g. 摩尔浓度范围为0.01-5mM的CuCl2；
h. 体积百分含量为0.1%的DEPC。
优选地，所述核酸释放剂中CuCl2的摩尔浓度范围为0.02-0.05mM。
优选地，所述核酸释放剂中表面活性剂采用NP40、Triton X-100、IGEPAL CA-630的任意一种。
优选地，所述核酸释放剂中NP40体积百分比含量为8%-12%。
优选地，所述核酸释放剂中Triton X-100体积百分比含量为5%-10%。
优选地，所述核酸释放剂中IGEPAL CA-630体积百分比含量为1%-5%。
优选地，所述核酸释放剂中强碱不限于氢氧化钠、氢氧化钾。
优选地，所述核酸释放剂中氢氧化钠浓度为300 mM。
优选地，所述核酸释放剂中氢氧化钾浓度为200 mM。
优选地，所述核酸释放剂中尿素浓度为10 mM。
优选地，所述核酸释放剂中EDTA浓度为0.5 mM。
优选地，所述核酸释放剂中Tris浓度为100mM。
优选地，所述采样拭子包括口咽拭子、鼻咽拭子。
优选地，释放的核酸可用于荧光定量PCR。
一种PCR扩增方法，其不是以疾病的诊断和治疗为目的，其包括如下步骤：
取 90μL 样品，在样品中加入 10μL前述的核酸释放剂，震荡混匀，然后取 5μL 混匀液与 20μL的PCR 反应液混合进行实时荧光定量 PCR 扩增。
优选地，对所述样品中的腺病毒或肺炎链球菌进行PCR扩增的条件为：
（1）UDG酶反应：55℃反应5min。
（2）热变性反应：95℃反应30s。
（3）扩增反应：95℃反应10s，60℃反应 30s，40 个循环。
（4）冷却：25℃反应10s。
优选地，对所述样品中的乙型流感病毒进行PCR扩增的条件为：
（1）逆转录反应：55℃反应15min。
（2）热变性反应：95℃反应30s。
（3）扩增反应：95℃反应10s，60℃反应 30s，40 个循环。
（4）冷却：25℃反应10s。
一种试剂盒，其包含有前述的核酸释放剂。
本申请的有益效果在于：
第一，本申请克服的第一个技术偏见如下：
拭子放入核酸释放剂后，之所以无法长期保存，是因为其中的核酸酶会降解核酸。低温保存的本质是抑制酶的活性。
基于上述认识，研发团队的初始想法是提高酶抑制剂的含量。DEPC作为常用的酶抑制剂，研发团队重点研究不同的DEPC的体积百分比含量下的反应。经过若干试验对比，发现：对于某些病毒而言，提升DEPC的含量低于缓解核酸的降解没有太大的意义。而且DEPC的含量也不能太大，超过一定含量，导致后期PCR反应结果。
经过对试验种类的对比，发现：DEPC对于DNA酶的抑制效果不佳。
因此，本申请克服的第一个技术偏见在于：并不是简单的提升酶抑制剂的含量，就能完成背景技术提出的问题。其认识在于：酶抑制剂应当分为DNA、RNA。
第二，本申请克服的第二个技术偏见如下：
在前述研发认识的基础上，研发团队重点研发对DNA酶抑制效果较好的物质。
CN112980831B已经公开了：核酸释放剂中使用了：MgCl2。对于氯化镁的作用，其是DNA酶活性剂。而氯化铜与氯化镁，表面上看起来都是二价金属离子，本能的会认为两者的作用相似。然而，事实上，两者的作用完全相反，氯化铜是作为DNA酶抑制剂。而氯化镁则是DNA酶活性剂。
因此，本申请必须要克服现有技术CN112980831B带来的技术偏见。
第三，本申请需要克服的研究难题如下：
氯化铜的含量如何确定是一个极难的技术问题。首先，现有技术并未提出过“核酸释放剂使用氯化铜作为DNA酶抑制剂”的知识；而更进一步的，研究氯化铜的含量则更未研究过。
研发团队经过若干试验发现：CuCl2的摩尔浓度范围为0.01-5mM是适宜的。其原因在于：
a．CuCl2的下限阈值由背景技术中的样本保存时间来决定。当CuCl2的摩尔浓度范围小于0.01mM时，在室温下，其样本保存时间无法满足4小时的要求。
b．CuCl2的上限阈值是由PCR试验来决定的。当摩尔浓度范围大于5mM会导致PCR检测Ct值后延，进而PCR检测无扩增峰。
上述上限、下限阈值是本申请的创新之处。通过本申请提出的核酸释放剂的各组分的协同作用，本发明的核酸释放剂可在室温直接、快速释放出病毒或细菌的DNA/RNA，更重要的是能够与 PCR 反应液直接混合进行PCR 扩增，无需进行复杂的核酸提取和纯化过程即可完成扩增，且检测灵敏度高，重复性好。
第四，本发明提供的核酸释放剂具有使用安全，操作简便，制造成本低廉的优点。本发明所述的核酸释放剂可以直接对口咽拭子、鼻咽拭子标本中DNA或RNA进行释放，无需离心，无需静置等待，无需加热，只需一步加样，即可完成核酸的释放。本发明能够实现核酸提取与荧光PCR配合使用，从根本上解决了多步核酸提取法带来的核酸丢失和污染问题以及无法真正实现核酸现场检测的问题。
附图说明
下面结合附图中的实施例对本发明作进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制。
图1是腺病毒梯度稀释参考品的扩增曲线。
图2是乙型流感病毒梯度稀释参考品的扩增曲线。
图3是氯化铜浓度测试结果图。
图4是释放剂处理腺病毒参考品后37℃存放有效期的结果图。
具体实施方法
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
本申请提出的核酸释放剂为：
a. 体积百分含量为1~12%的表面活性剂；
b. 摩尔浓度范围为10-150mM的Tris-HCl；
c. 摩尔浓度范围为0.05-1mM的EDTA；
d. 摩尔浓度范围为150-400mM的强碱；
f. 摩尔浓度范围为5-50mM的尿素；
g. 摩尔浓度范围为0.01-5mM的CuCl2；
h. 体积百分含量为0.1%的DEPC。
在实际使用中，本发明提供的核酸释放剂能快速破坏病毒/细菌的外壳结构，释放核酸，同时能够保护核酸不被降解。
其中，本发明的核酸释放剂中强碱（氢氧化钠或氢氧化钾）可以快速裂解病毒或细菌，释放核酸。
Tris-HCl 是常用缓冲液，与后续扩增时的PCR 反应液兼容。
表面活性剂，能够在一定程度上辅助裂解。
尿素能够辅助裂解蛋白外壳（Patrick H. O'Farrell. High Resolution Two-Dimensional Electrophoresis fo Proteins[J]. The Journal of BiologicalChemistry, 1975, 250:4007-4021.），尿素能够破坏氢键有助于蛋白质展开和变性，能够裂解病原体蛋白外壳。
EDTA能够螯合Ca2+、Mg2+等，抑制蛋白酶活性，一定程度上可以保护核酸不被降解。
DEPC能够抑制RNA酶活性，保护RNA不被降解或降低RNA的降解速率。
CuCl2是DNA酶的化学抑制剂，核酸释放剂中添加CuCl2，能够抑制DNA活性，保护样本中释放出来的DNA。
<实施例1: 腺病毒企业参考品的检测下限、精密度和线性分析>
<1.1：试验品准备>
准备灭活腺病毒参考品，使用生理盐水稀释为106拷贝数/ml，105拷贝数/ml，104拷贝数/ml，103拷贝数/ml，500拷贝数/ml。
105拷贝数/ml作为精密度参考品1；104拷贝数/ml作为精密度参考品2；检测下限为500拷贝数/ml。
梯度样本分别检测3孔，精密度参考品检测10孔，下限检测20孔。
参考品处理方式如下：取 90μL 样品于加入 10μL 核酸释放剂，震荡混匀； 取 5μL 混匀液与 20μL的PCR 反应液混合进行实时荧光定量 PCR 扩增。
所用核酸释放剂包括Tris-HCl、NP40、EDTA、尿素、CuCl2，氢氧化钠，DEPC。其中，Tris-HCl 的摩尔浓度为 100mM，EDTA的摩尔浓度为1mM，CuCl2的摩尔浓度为0.05mM，尿素的摩尔浓度为10mM，氢氧化钠的摩尔浓度为300mM，NP-40的体积百分比为10%，DEPC的体积百分比为0.1%。对照组为磁珠提取试剂盒处理参考品。
<1.2，PCR的扩增条件>
PCR 扩增的条件为：
（1）UDG酶反应：55℃反应5min。
（2）热变性反应：95℃反应30s。
（3）扩增反应：95℃反应10s，60℃反应 30s，40 个循环。
（4）冷却：25℃反应10s。
<1.3: 检测结果>
腺病毒梯度稀释参考品的扩增曲线如附图1所示，其Ct值如表1-1所示。
表1-1：腺病毒梯度稀释参考品的Ct值
表1-2：腺病毒精密度参考品的Ct值
表1-3：腺病毒下限参考品的Ct值
根据检测结果可知，检测梯度稀释样本，磁珠提取线性R2为0.9971，核酸释放剂R2为0.9935，均大于0.96，线性较好。检测精密度参考品1和精密度参考品2，磁珠提取的CV%值分别为0.71%和1.11%，核酸释放剂的CV%值分别为0.64%和0.68%，均低于5%，满足试剂开发相关要求。检测低浓度样本500拷贝数/ml，磁珠提取和核酸释放剂检测20孔均扩增。整体结果显示针对腺病毒（DNA病毒）灭活核酸释放剂处理生理盐水保存的样本与磁珠提取性能相当。
<实施例2: 乙型流感病毒企业参考品的检测下限、精密度和线性分析>
<2.1：试验品准备>
准备灭活腺病毒参考品，使用生理盐水稀释为106拷贝数/ml，105拷贝数/ml，104拷贝数/ml，103拷贝数/ml，500拷贝数/ml。
105拷贝数/ml作为精密度参考品1；104拷贝数/ml作为精密度参考品2；检测下限为500拷贝数/ml。
梯度样本分别检测3孔，精密度参考品检测10孔，下限检测20孔。
参考品处理方式如下：取 90μL 样品于加入 10μL 核酸释放剂，震荡混匀，然后取5μL 混匀液与 20μL的PCR 反应液混合进行实时荧光定量 PCR 扩增。
所用核酸释放剂包括Tris-HCl、IGEPAL-CA630、EDTA、CuCl2、尿素、氢氧化钾，DEPC。其中，Tris-HCl 的摩尔浓度为 100mM，EDTA的摩尔浓度为1mM，CuCl2的摩尔浓度为0.02mM，尿素的摩尔浓度为10mM，氢氧化钾的摩尔浓度为150mM，IGEPAL-CA630的体积百分比为5%，DEPC的体积百分比为0.1%。对照组为磁珠提取试剂盒处理参考品。
<2.2，PCR的扩增条件>
PCR 扩增的条件为：
（1）逆转录反应：55℃反应15min。
（2）热变性反应：95℃反应30s。
（3）扩增反应：95℃反应10s，60℃反应 30s，40 个循环。
（4）冷却：25℃反应10s。
<2.3: 检测结果>
乙型流感病毒梯度稀释参考品的扩增曲线如附图2所示。其Ct值如表2-1、表2-2和表2-3所示。
表2-1：乙型流感病毒梯度稀释参考品的Ct值
表2-2：乙型流感病毒精密度参考品的Ct值
表2-3：乙型流感病毒下限参考品的Ct值
根据检测结果可知，检测梯度稀释样本，磁珠提取线性R2为0.9992，核酸释放剂R2为0.9984，均大于0.96，线性较好。检测精密度参考品1和精密度参考品2，磁珠提取的CV%值分别为0.77%和0.39%，核酸释放剂的CV%值分别为0.91%和0.87%，均低于5%，满足试剂开发相关要求。检测低浓度样本500拷贝数/ml，磁珠提取和核酸释放剂检测20孔均扩增。整体结果显示针对乙型流感病毒（RNA病毒）灭活核酸释放剂处理生理盐水保存的样本与磁珠提取性能相当。
<实施例3: 检测乙型流感样本>
<3.1：试验品准备>
准备 15 份乙型流感病毒咽拭子样品(生理盐水保存液)，分别使用磁珠提取和核酸释放剂处理。磁珠提取需要200μL 样品按照磁珠提取试剂盒说明书操作。核酸释放剂处理方式如下：取 90μL 样品于加入 10μL 核酸释放剂，震荡混匀，然后取 5μL混匀液 与 20μL的PCR 反应液混合进行实时荧光定量 PCR 扩增。
所用核酸释放剂包括Tris-HCl、IGEPAL-CA630、EDTA、CuCl2、尿素、氢氧化钾，DEPC。其中，Tris-HCl 的摩尔浓度为 100mM，EDTA的摩尔浓度为1mM，CuCl2的摩尔浓度为0.02mM，尿素的摩尔浓度为10mM，氢氧化钾的摩尔浓度为150mM，IGEPAL-CA630的体积百分比为5%，DEPC的体积百分比为0.1%。对照组为磁珠提取试剂盒处理参考品。
<3.2，PCR的扩增条件>
PCR 扩增的条件为：
（1）逆转录反应：55℃反应15min。
（2）热变性反应：95℃反应30s。
（3）扩增反应：95℃反应10s，60℃反应 30s，40 个循环。
（4）冷却：25℃反应10s。
<3.3: 检测结果>
检测结果如表3-1所示。
表3-1 乙型流感病毒临床样本检测
根据检测结果可知，磁珠提取和核酸释放剂对15例临床样本检测均能检出乙型流感的阳性样本，结果一致率达100%。对比 Ct 值可知采用本发明核酸释放剂在RNA 样品扩增检测中的灵敏度与磁珠法的灵敏度相当。
<实施例4: 检测肺炎衣原体临床样本>
<4.1：试验品准备>
准备 15 份肺炎衣原体咽拭子样品(生理盐水保存液)，分别使用磁珠提取和核酸释放剂处理。磁珠提取需要200μL 样品按照磁珠提取试剂盒说明书操作。核酸释放剂处理方式如下：取 90μL 样品于加入 10μL 核酸释放剂，震荡混匀，然后取 5μL混匀液 与 20μL的PCR 反应液混合进行实时荧光定量 PCR 扩增。
所用核酸释放剂包括Tris-HCl、NP40、EDTA、尿素、CuCl2，氢氧化钾，DEPC。其中，Tris-HCl 的摩尔浓度为 50mM，EDTA的摩尔浓度为1mM，CuCl2的摩尔浓度为0.05mM，尿素的摩尔浓度为5mM，氢氧化钾的摩尔浓度为200mM，Triton X-100的体积百分比为5%，DEPC的体积百分比为0.1%。对照组为磁珠提取试剂盒处理参考品。
<4.2，PCR的扩增条件>
PCR 扩增的条件为：
（1）UDG反应：55℃反应5min。
（2）热变性反应：95℃反应30s。
（3）扩增反应：95℃反应10s，60℃反应 30s，40 个循环。
（4）冷却：25℃反应10s。
<4.3: 检测结果>
检测结果如表4-1所示。
表4-1 肺炎衣原体临床样本检测
根据检测结果可知，磁珠提取和核酸释放剂对15例临床样本检测均能检出肺炎衣原体的阳性样本，结果一致率达100%。对比 Ct 值可知采用本发明核酸释放剂在肺炎衣原体样品扩增检测中的灵敏度与磁珠法的灵敏度相当。
<实施例5: 检测腺病毒临床样本>
<5.1：试验品准备>
准备 15 份腺病毒鼻咽拭子样品(生理盐水保存液)，分别使用磁珠提取和核酸释放剂处理。磁珠提取需要200μL 样品按照磁珠提取试剂盒说明书操作。核酸释放剂处理方式如下：取 90μL 样品于加入 10μL 核酸释放剂，震荡混匀，然后取 5μL 混匀液与 20μL的PCR 反应液混合进行实时荧光定量 PCR 扩增。
所用核酸释放剂包括Tris-HCl、NP40、EDTA、尿素、CuCl2，氢氧化钠，DEPC。其中，Tris-HCl 的摩尔浓度为 100mM，EDTA的摩尔浓度为1mM，CuCl2的摩尔浓度为0.05mM，尿素的摩尔浓度为10mM，氢氧化钠的摩尔浓度为300mM，NP-40的体积百分比为10%，DEPC的体积百分比为0.1%。对照组为磁珠提取试剂盒处理参考品。
<5.2，PCR的扩增条件>
PCR 扩增的条件为：
（1）UDG反应：55℃反应5min。
（2）热变性反应：95℃反应30s。
（3）扩增反应：95℃反应10s，60℃反应 30s，40 个循环。
（4）冷却：25℃反应10s。
<5.3: 检测结果>
表5-1 腺病毒临床样本检测
根据检测结果可知，磁珠提取和核酸释放剂对15例临床样本检测均能检出腺病毒的阳性样本，结果一致率达100%。对比 Ct 值可知采用本发明核酸释放剂在腺病毒样品扩增检测中的灵敏度与磁珠法的灵敏度相当。
<实施例6: 检测肺炎链球菌临床样本>
<6.1：试验品准备>
准备 15 份肺炎链球菌鼻咽拭子样品(生理盐水保存液)，分别使用磁珠提取和核酸释放剂处理。磁珠提取需要200μL 样品按照磁珠提取试剂盒说明书操作。核酸释放剂处理方式如下：取 90μL 样品于加入 10μL 核酸释放剂，震荡混匀，然后取 5μL 混匀液与 20μL的PCR 反应液混合进行实时荧光定量 PCR 扩增。
所用核酸释放剂包括Tris-HCl、NP40、EDTA、尿素、CuCl2，氢氧化钠，DEPC。其中，Tris-HCl 的摩尔浓度为50mM，EDTA的摩尔浓度为1mM，CuCl2的摩尔浓度为0.05mM，尿素的摩尔浓度为5mM，氢氧化钠的摩尔浓度为300mM，NP-40的体积百分比为10%，DEPC的体积百分比为0.1%。对照组为磁珠提取试剂盒处理参考品。
<6.2，PCR的扩增条件>
PCR 扩增的条件为：
（1）UDG反应：55℃反应5min。
（2）热变性反应：95℃反应30s。
（3）扩增反应：95℃反应10s，60℃反应 30s，40 个循环。
（4）冷却：25℃反应10s。
<6.3: 检测结果>
根据检测结果可知，磁珠提取和核酸释放剂对15例临床样本检测均能检出肺炎链球菌的阳性样本，结果一致率达100%。对比 Ct 值可知采用本发明核酸释放剂在肺炎链球菌样品扩增检测中的灵敏度与磁珠法的灵敏度相当。
表6-1：肺炎链球菌临床样本检测
需要说明的是：本发明所述核酸释放剂的使用方法分为：正常采取口咽拭子样本或者鼻咽拭子样本，将拭子头浸入生理盐水中，震荡混匀以后，取混匀后的液体，按照生理盐水混匀液：核酸释放剂=9:1比例，混匀后即可加样进行PCR检测，无需静置，无需加热，操作方便，快捷。
因此，所述核酸释放剂在制备拭子核酸样本释放试剂盒中的应用，以及所开发的含有所述核酸释放剂的拭子核酸样本释放试剂盒，均应在本发明的保护范围之内。
<实施例7: 氯化铜浓度测试>
<7.1：试验品准备>
准备灭活腺病毒参考品，使用生理盐水稀释为104拷贝数/ml，103拷贝数/ml。
梯度样本分别检测3孔，精密度参考品检测10孔，下限检测20孔。
参考品处理方式如下：取 90μL 样品于加入 10μL 核酸释放剂，震荡混匀，然后取5μL 混匀液与 20μL的PCR 反应液混合进行实时荧光定量 PCR 扩增。
所用核酸释放剂包括Tris-HCl、NP40、EDTA、尿素、CuCl2，氢氧化钠，DEPC。其中，Tris-HCl 的摩尔浓度为 100mM，EDTA的摩尔浓度为1mM，尿素的摩尔浓度为10mM，氢氧化钠的摩尔浓度为300mM，NP-40的体积百分比为10%，DEPC的体积百分比为0.1%。另外对CuCl2的浓度进行梯度测试，浓度分别为0.01mM，0.05mM，0.1mM，0.5mM，1,5mM，10mM，20mM。
<7.2，PCR的扩增条件>
PCR 扩增的条件为：
（1）UDG酶反应：55℃反应5min。
（2）热变性反应：95℃反应30s。
（3）扩增反应：95℃反应10s，60℃反应 30s，40 个循环。
（4）冷却：25℃反应10s。
<7.3: 检测结果>
腺病毒梯度稀释参考品的扩增曲线如附图1所示，其Ct值如图3、表7-1所示，当PCR无扩增峰时，将其Ct值设置为40进行柱状图绘制。
表7-1：不同氯化铜浓度下的检测结果
根据检测结果可知，在样本浓度为104拷贝数/ml浓度情况下，氯化铜浓度0.01mM-5mM检测Ct值一致，当氯化铜浓度增加到10mM，会导致PCR检测Ct值后延。当样本浓度接近检测下限为1000拷贝数/ml时，氯化铜浓度0.01mM-5mM均能检出Ct值，且Ct值一致，当氯化铜浓度增加到10mM，会导致PCR检测无扩增峰。
<实施例8: 释放剂处理腺病毒参考品后37℃存放有效期>
<8.1：试验品准备>
准备灭活腺病毒（DNA病毒）参考品，使用生理盐水稀释为105拷贝数/ml，104拷贝数/ml和500拷贝数/ml。
参考品处理方式如下：取 90μL 样品于加入 10μL 核酸释放剂，震荡混匀后，在37℃金属浴中存放0小时，6小时，1天，2天，3天后检测，检测时取 5μL 混匀液与 20μL的PCR反应液混合进行实时荧光定量 PCR 扩增。
所用核酸释放剂包括Tris-HCl、NP40、EDTA、尿素、CuCl2，氢氧化钠，DEPC。其中，Tris-HCl 的摩尔浓度为 100mM，EDTA的摩尔浓度为1mM，尿素的摩尔浓度为10mM，氢氧化钠的摩尔浓度为300mM，NP-40的体积百分比为10%，CuCl2的浓度为0.05mM，DEPC的体积百分比为0.1%。
<8.2，PCR的扩增条件>
PCR 扩增的条件为：
（1）UDG酶反应：55℃反应5min。
（2）热变性反应：95℃反应30s。
（3）扩增反应：95℃反应10s，60℃反应 30s，40 个循环。
（4）冷却：25℃反应10s。
<8.3: 检测结果>
释放剂处理腺病毒参考品后37℃存放，连续跟踪3天，其Ct值如图4、表8-1所示，当PCR无扩增峰时，将其Ct值设置为40进行柱状图绘制。
表8-1：样本释放剂处理腺病毒参考品后37℃保存不同时间的检测结果
根据检测结果可知，腺病毒参考品用释放剂处理以后，在37℃环境下保存6小时稳定，高浓度样本和低浓度样本检测的Ct值均与对照组一致；保存1天后，开始出现后延趋势，但是在低浓度样本500拷贝数/ml下仍然能够检测到；保存2天以后检测Ct值明显后延，且检测500拷贝数/ml样本已经没有扩增峰。
以上所举实施例为本发明的较佳实施方式，仅用来方便说明本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，任何所属技术领域中具有通常知识者，若在不脱离本发明所提技术特征的范围内，利用本发明所揭示技术内容所作出局部更动或修饰的等效实施例，并且未脱离本发明的技术特征内容，均仍属于本发明技术特征的范围内。
Claims (8)
1.一种核酸释放剂，其特征在于，包括：
a. 体积百分含量为1~12%的表面活性剂；
b. 摩尔浓度范围为10-150mM的Tris-HCl；
c. 摩尔浓度范围为0.05-1mM的EDTA；
d. 摩尔浓度范围为150-400mM的强碱；
f. 摩尔浓度范围为5-50mM的尿素；
g. 摩尔浓度范围为0.01-5mM的CuCl2；
h. 体积百分含量为0.1%的DEPC。
2.根据权利要求1所述的一种核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂中CuCl2的摩尔浓度范围为0.02-0.05mM。
3. 根据权利要求1所述的一种核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂中表面活性剂采用NP40、Triton X-100、IGEPAL CA-630的任意一种。
4.根据权利要求3所述的一种核酸释放剂，其特征在于：
所述核酸释放剂中NP40体积百分比含量为8%-12%；
或，
所述核酸释放剂中Triton X-100体积百分比含量为5%-10%；
或，
所述核酸释放剂中IGEPAL CA-630体积百分比含量为1%-5%。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的一种核酸释放剂，其特征在于：所述核酸释放剂中强碱采用氢氧化钠或氢氧化钾；
其中，所述核酸释放剂中氢氧化钠浓度为300 mM；
或
所述核酸释放剂中氢氧化钾浓度为200 mM。
6. 根据权利要求1至4任意一项所述的一种核酸释放剂，其特征在于：所述核酸释放剂中尿素浓度为10 mM。
7. 根据权利要求1至4任意一项所述的一种核酸释放剂，其特征在于： 所述核酸释放剂中Tris浓度为100mM。
8.一种试剂盒，其特征在，其包含有如权利要求1所述的核酸释放剂。
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2023
- 2023-04-11 CN CN202310375608.1A patent/CN116083422B/zh active Active
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