CN103370412A - 核糖核酸稳定性增强剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及到添加一种或者多种核糖核酸酶抑制性化合物到裂解液中以提高核糖核酸在样品匀浆中的稳定性的试剂、配方和方法。

Description

核糖核酸稳定性增强剂
技术领域
本发明涉及到使核酸，特别是核糖核酸，在细胞裂解液中的稳定性增加的试剂、配方及相应的方法和试剂盒，以使样品的采集，匀浆，保存和运输及最终的核酸提取过程一体化。
背景技术
提取完整的，原初状态的核酸分子是生物学研究及临床实验中关键的一步。但是，核酸分子在细胞内一直进行着的受到高度调控的生成和代谢，这大大增加了完整提取原初态核酸分子的难度。在生理状态下，核酸分子的丰度是利用细胞壁的隔离及有控制地释放降解剂来调控的。核酸酶是降解核酸的最重要手段。而核糖核酸酶(以下简称RNA酶)含量高，稳定性强，导致核糖核酸(以下简称RNA)尤其容易降解。RNA酶是多种不同特性的酶的总称，在胰脏等器官组织中丰度尤其高。它的稳定性极高，可经得住煮沸20分钟(Berkower，(1973)Isolation and Characterization of an Endonuclease from Escherichia coli Specific forRibonucleic Acid in Ribonucleic Acid·Deoxyribonucleic Acid Hybrid Structures.J.Biol.Chem.248(17)：5914-5921.)。在核酸提取过程中，细胞壁被破坏以释放核酸分子，造成了核酸直接暴露在它们的降解剂面前；RNA和RNA酶的接触，使RNA迅速降解。为了避免这一情况的发生，几乎所有的RNA裂解液中都含有很强的蛋白变性剂用以灭活RNA酶，像苯酚，和高浓度的离液盐(4～5M(4～5摩尔/升)的胍合物)等(Katayanagi K et al.，(1990)Three-dimensional structure of ribonuclease H from E.coli.Nature 347(6290)：306-309)。其它蛋白变性剂如氯化锂(LiCl)和十二烷基硫酸钠(SDS)也经常被用于RNA提取裂解液中。
即使是含有上述强蛋白变性剂，(如4～5M的胍合物)，RNA在裂解液中依然进行着持续性降解，这使得RNA必须从匀浆中快速分离纯化出来，或者将匀浆液保存低温。
由于RNA的持续降解，含胍合物的裂解液只能用来对组织或细胞进行裂解，继而立刻进行RNA的提取，而很少用来保存或者运输RNA样品。为此，专门开发出新的高盐溶液，如高浓度的硫酸胺(RNAlaterTM)或独特去垢剂(PAXgene血液采集管)等，以用于采集，保存和运输RNA样品。
但是，上述RNA保存试剂都与通常的下游提取方法不相容：比如，在加入裂解液以提取RNA前，RNAlaterTM试剂必须用纸巾彻底除去；而PAXgene管中形成的RNA沉淀则必须先进行离心沉降，方可进一步提取其中的RNA。
显然，要形成RNA样品的采集，保存，运输和便捷提取的一体化就必须加强RNA在其裂解液中的稳定性。
普遍认为在4～5M的胍合物溶液中没有活性酶存在。因此，所观察到的RNA的持续降解被认为是自发性的、碱性的或者是二价金属阳离子引起的水解反应导致的，或者是胍合物的副产物和生物材料反应的结果。但是，我们认为这是由于裂解液中的残余的酶活性引起的；并且，这些残余的活性酶是可以被有效抑制的。这一推测是有根据的：Darlix观察到RNA酶在8M的尿素和6M盐酸胍仍然具有活性。(Darlix，J.L.(1975)Simultaneous Purification ofEscherichia coli Termination Factor Rho，RNAase III and RNAase H.Eur.J.Biochem.51(2)，369-376.；Barone G et al.，(1994)RNAase A in the presence of urea and GuHCl.J.Thermal Analysis.41：1357-1370.)。这促使我们开始寻找合适的RNA酶抑制剂，可以有效抑制裂解液中残余的RNA酶活性从而增强RNA的稳定性。
据我们所知，目前有报道的RNA酶抑制性化合物包括：焦磷酸化合物，(Russo，N.，etal.，(1996)A combined kinetic and modeling study of the catalytic center subsitesof human angiogenin.Proc.Natl.Acad.Sci.93：804-808.；Russo A et a.，(2001)Smallmolecule inhibitors of RNase A and related enzymes.Methods Enzymol.341：629-648.；Leonidas et.al.，(2001)Binding of Phosphate and pyrophosphate ions at the activesite of human angiogenin as revealed by X-ray crystallography.Protein Science 10(8)：1669-1676.)；铜离子(Nishimura et.al.，(1994)Utilization of copper ion as aribonuclease inhibitor in a cell-free protein synthesis system.Journal ofFermentation and Bioengineering 78(2)：130-133.)；3.及一些有机化合物如ChemBridge化合物文库中的C-181431(Kao et.al.，(2002)A small-molecule inhibitor of theribonucleolytic activity of human angiogenin that possesses antitumor activity.Proc.Natl.Acad.Sci.99(15)：10066-10071.)。
本发明提出把一种或者多种特定的RNA酶抑制剂添加到常用的细胞裂解液中以增加RNA在匀浆中的稳定性，这是非常必要的。
发明内容
本发明涉及到在含高浓度的离液剂(chaotropic agent)，(如胍盐等)的组织或细胞裂解液中加入一种或多种(两种，三种，四种等等)特定的RNA酶抑制剂，以提高RNA在匀浆中的稳定性的试剂、步骤和方法及应用。在某些实施方法中，抑制剂预先添加到裂解液中，并存放在室温中至少一个星期再进行匀浆；在另一些实施方法中，抑制剂在组织或细胞匀浆前才加到裂解液中；在另一些实施方法中，抑制剂在组织或细胞匀浆后立刻添加到样品裂解液中。在某些实施方法中，添加的抑制剂为焦磷酸钠；在另一些实施方法中，添加的抑制剂为氯化铜；在另一些实施方法中，添加的抑制剂为特定的有机化合物，如4，4’-羰基双[2-(1-萘酰胺)苯甲酸](4，4’-carbonylbis[2-(1-naphthoylamino)benzoic acid)。
附图说明
图11.2％溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳测试在37℃下，RNA(从小鼠肝脏中提取)在QiagenRNeasy迷你试剂盒的裂解液中的稳定性。结果显示，随着加入10mM(10毫末每升)的各种RNA酶抑制剂，RNA在裂解液中的稳定性得到了显著增强。
图2A、琼脂糖凝胶电泳结果，B、Agilent纳米芯片所测的RNA完整性指数(RIN)来显示在37℃下，RNA(从小鼠肝脏中提取)在GE Illustra RNAspin迷你RNA提取试剂盒的裂解液中的稳定性。结果表明，RNA在含有10mM焦磷酸钠的裂解液中的稳定性得到了显著增强。
图3Agilent凝胶电泳照片显示了从海拉(HeLa)细胞中的提取的RNA在滤纸上于37℃下热处理4小时后的完整性。滤纸预先在添加了不同浓度的焦磷酸钠的裂解液(GE公司Illustra RNA提取试剂盒)中浸泡；干燥后，滴加HeLa细胞悬浊液。结果表明当滤纸经过含10mM或更高浓度的焦磷酸钠盐的细胞裂解液浸泡后，滴加在上面的HeLa细胞中RNA的稳定性得到了显著提高。
具体实施方法
本发明实施方法的一个方面在于添加RNA酶抑制剂所涉及到的试剂、配方和方法。选择合适的RNA酶抑制剂的标准：增强RNA在裂解液中的稳定性；维持甚至提高下游RNA提取的产率，(无论是用玻璃纤维素离子柱，还是磁性小珠等方法提取)；不造成RNA提取的优选性，即既不使某一部分RNA被优先提取，也不使另一些的提取遭到抑制；不干扰包括反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和核糖核酸印记杂交(Northern blot)等在内的下游应用；不引入RNA的化学修饰，如脱嘌呤等；不增加提取纯化后RNA中含有的杂质，如脱氧核糖核酸(DNA)，蛋白质及脂质等；在裂解液中有足够的溶解度以达到所需要的浓度(如20mM，15mM，10mM，或更低)，并且在裂解液中能够稳定存在；在加入裂解液时及保存过程中，不引起裂解液成份的析出；无毒；价格低；在RNA洗涤过程中易除去。
新的更多的RNA酶抑制化合物将不断地被发现及制造出来。具有相关技能和知识的人，可以进行RNA酶抑制剂的筛选。化合物的RNA酶抑制性可以很容易地被检测到，例如RNaseAlert试剂盒(Ambion公司)就可以用来检测化合物对RNA酶的抑制性。RNaseAlert试剂盒提供一种RNA，其一端标记有荧光基团，另一端标记有荧光抑制基团；当其被共存的RNA酶降解时，荧光抑制被解除，因而通过荧光分析仪可以检测到荧光强度的增加；而当反应体系中RNA酶抑制剂起作用时，就可观察到荧光强度的减弱。此外，也可以将反应产物(未标记的RNA)经琼脂糖凝胶电泳或者RNA芯片(Agilent Bioanalyzer 2100)来观察RNA的完整性，或者通过定量测定反转录RT-PCR的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数(Ct)来判断。
RNA酶抑制性化合物并不局限于本发明提到的化合物，其它已知的和新发现的RNA酶抑制剂并可以加入到裂解液中以提高RNA的稳定性的试剂，都属于本发明涵盖的范围。对于一个具有相关知识和技能的人来说，测试不同的RNA酶抑制化合物是否适用本发明是很容易做到的，即把待测的抑制剂加入到匀浆中，分析所得的RNA的完整性和产率。只需将动物组织，如小鼠肝脏等，在常用的含有离液盐的裂解液(如Qiagen公司的RNeasy试剂盒中的提取缓冲液RLT)中匀浆；然后，将所得匀浆液分成两份，一份加入待测试化合物，另一半不加待测化合物，两者同时在放置在相同温度下一段时间，如在65℃保持几个小时，或在37℃下放置一天或更长时间，或在室温放置一天或更长时间；接着，根据所用试剂盒的操作协议来提取匀浆中的RNA；再经琼脂糖凝胶电泳或在Bionanalyzer 2100(Agilent)的芯片上，来测定RNA的完整性和产率。RNA的完整性还可以通过定量RT-PCR来分析，用Ct值来判定。RNA产率则可以通过紫外吸收光谱仪OD260的读数或者Bioananlyzer 2100来确定。
实施例一，在Qiagen公司的RNeasy试剂盒裂解液中加入的焦磷酸化合物对小鼠肝的组织匀浆中的RNA稳定性的影响
一直保存在-80℃的小鼠肝脏组织20毫克，用匀浆器在350微升RLT裂解液(Qiagen公司的RNeasy试剂盒，产品号：74106)中匀浆。裂解液含有1％的14.3M的二巯基乙醇，测试组里加了7微升0.5M的焦磷酸钠试剂(Sigma-Aldrich产品号：P8135)，对照组则不加焦磷酸钠试剂。焦磷酸钠试剂可以是在匀浆前加在裂解液中，并在室温保存至少一周；也可以在组织匀浆前加入裂解液中；或者在匀浆后即刻加到匀浆中。上述匀浆分别在37℃放置指定时间后，立即冷冻在-20℃直至完成所有样品的测试时间点。接着，所有样品室温熔解后，采用厂商提供的操作协议进行RNA提取。所得的RNA与等体积的乙二醛凝胶电泳上样液(Ambion，产品号：AM8551)混合，并在50℃下放置30分钟。最后，用1.2％琼脂糖电泳进行分离(图1)。
实施例二，在Qiagen公司的RNeasy试剂盒裂解液中加入的铜离子对小鼠肝的组织匀浆中的RNA稳定性的影响
一直保存在-80℃的小鼠肝脏组织20毫克，用匀浆器在350微升RLT裂解液(Qiagen公司的RNeasy试剂盒，产品号：74106)中匀浆。裂解液含有1％的14.3M的二巯基乙醇，测试组里加了7微升0.5M的氯化铜试剂(Sigma-Aldrich产品号：203149)，对照组则不加氯化铜试剂。氯化铜试剂可以是在匀浆前加在裂解液中，并在室温保存至少一周；也可以在组织匀浆前加入裂解液中；或者在匀浆后即刻加到匀浆中。上述匀浆分别在37℃放置指定时间后，立即冷冻在-20℃直至完成所有样品的测试时间点。接着，所有样品室温熔解后，采用厂商提供的操作协议进行RNA提取。所得的RNA与等体积的乙二醛凝胶电泳上样液(Ambion，产品号：AM8551)混合，并在50℃下放置30分钟。最后，用1.2％琼脂糖电泳进行分离(图1)。
实施例三，在Qiagen公司的RNeasy试剂盒裂解液中加入的4，4’-羰基双[2-(1-萘酰胺)苯甲酸](4，4’-carbonylbis[2-(1-naphthoylamino)benzoic acid)对小鼠肝的组织匀浆中的RNA稳定性的影响
一直保存在-80℃的小鼠肝脏组织20毫克，用匀浆器在350微升RLT裂解液(Qiagen公司的RNeasy试剂盒，产品号：74106)中匀浆。裂解液含有1％的14.3M的二巯基乙醇，测试组里加了7微升0.5M 4，4’-羰基双[2-(1-萘酰胺)苯甲酸](4，4’-carbonylbis[2-(1-naphthoylamino)benzoic acid])的DMSO溶液(ChemBridge，产品号：5181431 P8135)，对照组则不加有4，4’-羰基双[2-(1-萘酰胺)苯甲酸]。4，4’-羰基双[2-(1-萘酰胺)苯甲酸]可以是在匀浆前加在裂解液中，并在室温保存至少一周；也可以在组织匀浆前加入裂解液中；或者在匀浆后即刻加到匀浆中。上述匀浆分别在37℃放置指定时间后，立即冷冻在-20℃直至完成所有样品的测试时间点。接着，所有样品室温熔解后，采用厂商提供的操作协议进行RNA提取。所得的RNA与等体积的乙二醛凝胶电泳上样液(Ambion，产品号：AM8551)混合，并在50℃下放置30分钟。最后，用1.2％琼脂糖电泳进行分离(图1)。
实施例四，在GE公司的Illustra RNAspin Mini RNA试剂盒裂解液中加入的焦磷酸化合物对小鼠肝的组织匀浆中的RNA稳定性的影响
一直保存在-80℃的小鼠肝脏组织20毫克，用匀浆器在350微升RA1裂解液(GE公司的Illustra RNAspin Mini RNA试剂盒，产品号：25-0500-71)中匀浆。裂解液含有1％的14.3M的二巯基乙醇，测试组里加了7微升0.5M的焦磷酸钠试剂(Sigma-Aldrich产品号：P8135)，对照组则不加焦磷酸钠试剂。焦磷酸试剂可以是在匀浆前加在裂解液中，并在室温保存至少一周；也可以在组织匀浆前加入到裂解液中；或者在匀浆后即刻加到匀浆中。上述匀浆分别在37℃放置指定时间后，即冷冻在-20℃直至完成所有样品的的测试时间点。接着，所有样品室温熔解后，采用厂商提供的操作协议进行RNA提取。所得的RNA与等体积的乙二醛凝胶电泳上样液(Ambion，产品号：AM8551)混合，并在50℃下放置30分钟。最后用1.2％琼脂糖电泳进行分离(图2，A)。所得的RNA在70℃加热2分钟后加到Agilent RNA纳米芯片(Agilent，#5067-1512)上，按照生产商的操作协议，得到RIN指数以确认RNA的完整性(图2，B)。
实施例五，细胞匀浆中的RNA在经过添加了RNA酶抑制化合物的裂解液处理并干燥后的固体介质上的稳定性
普通
Figure BPA00001718996400061
滤纸预先用水，或含0、5、10、20、25、50或100mM焦磷酸钠(NaPPI，Sigma-Aldrich产品号：P8135)的RA1裂解液(GE公司的Illustra RNAspin Mini RNA试剂盒，产品号：25-0500-71)浸泡并在室温中过夜以干燥。50微升5×105每微升的HeLa细胞滴加到上述干燥好的滤纸和
Figure BPA00001718996400062
卡(Whatman，产品号：WB120310)上，并在37℃恒温4个小时。每个纸片加样区内剪取3个直径为3mm的小圆片，分别经过
Figure BPA00001718996400063
RNAspin迷你提取试剂盒(GEHealthcare，产品号：25-0500-71)按照厂商提供的操作协议提取RNA。所获得的RNA在70℃加热2分钟后，经Agilent Pico RNA Chip(Agilent，#5067-1514)按照操作协议进行分离，来显示RNA条带，并给出RIN指数以反映RNA完整性(图3)。
显而易见地，试剂盒使用指南所推荐的其它适用组织或培养细胞也可以用同样方法处理，而不局限于在上述实施例所提到小鼠肝组织。并且，随着裂解液对RNA稳定性的增加，一些本来不适合该试剂盒处理的RNA样品也能被很好地被处理。
显而易见地，熟悉本领域知识和技术的人应该知道，RNA酶抑制化合物的浓度并不局限于上述实施例中所提到的浓度。
显而易见地，熟悉本领域知识和技术的人应该知道，用作添加了RNA酶增强剂的裂解液的固体支持介质可以是任何合适的固体材料，并不局限于上述实施例中提到的
Figure BPA00001718996400064
滤纸。

Claims (16)

1.一种在裂解液中添加RNA酶抑制剂而增加生物样品匀浆中的RNA稳定性的方法。
2.如权利要求1，裂解液中含有高浓度的离液盐。
3.如权利要求1，裂解液中含有的离液盐浓度高于2M而低于8M。
4.如权利要求2，离液盐可以是异硫氰酸胍。
5.如权利要求2，离液盐可以是盐酸胍。
6.如权利要求1，RNA酶抑制剂包括已知的和新发现的具有RNA酶抑制性的化合物。
7.如权利要求1，RNA酶抑制剂可以是焦磷酸化合物。
8.如权利要求1，RNA酶抑制剂可以是铜离子化合物。
9.如权利要求1，RNA酶抑制剂可以是4，4’-羰基双[2-(1-萘酰胺)苯甲酸](4，4’-carbonylbis[2-(1-naphthoylamino)benzoic acid])。
10.如权利要求1，添加了RNA酶抑制剂的裂解液经干燥后固定在支持介质上。
11.如权利要求1，RNA可以是信使核糖核酸(mRNA)，转运RNA(tRNA)，核糖体RNA(rRNA)，非编码RNA，小分子RNA，小干扰性RNA(siRNA)，微RNA(miRNA)，动物RNA，植物RNA，病毒RNA，细菌RNA.
12.一种用于从生物样品中提取RNA的试剂盒，该试剂盒中的裂解液含有胍盐及额外的RNA酶抑制剂；而该RNA酶抑制性化合物是已知的和新发现的具有RNA酶抑制性的化合物。
13.如权利要求12，RNA酶抑制剂可以是焦磷酸化合物，铜离子化合物或4，4’-羰基双[2-(1-萘酰胺)苯甲酸](4，4’-carbonylbis[2-(1-naphthoylamino)benzoic acid])。
14.如权利要求12，RNA酶抑制剂可以被事先添加到试剂盒的胍盐裂解液中。
15.如权利要求12，RNA酶抑制剂可以作为试剂液独立存放在试剂盒中以备添加到胍盐裂解液中。
16.一种利用胍盐和RNA酶抑制化合物的协同作用来增加RNA在生物样品匀浆中稳定性的方法。
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