CN117025587B - 一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、试剂盒、提取方法及应用 - Google Patents

一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、试剂盒、提取方法及应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、试剂盒、提取方法及应用。本申请公开了一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、试剂盒、提取方法及应用，所述裂解液包括盐离子、胍盐、金属离子螯合剂、巯基还原剂以及表面活性剂。同时，本申请提供了一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的方法。本申请提供的裂解液与提取方法相互配合能够高效地液化痰液和提取痰液中的分枝杆菌核酸，并具备较好的纯度和扩增性能。

Description

一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、试剂盒、提取方 法及应用
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、试剂盒、提取方法及应用。
背景技术
目前，对于肺结核患者的临床诊断主要根据病史、胸片、痰培养、涂片抗酸染色等结果。但这些传统检测方法存在灵敏度低、耗时长（4-8周）、不能准确区分结核、NTM等缺点，容易对部分患者造成误诊或漏诊。
结核病免疫学检测技术，如PPD和IGRA（γ-干扰素释放试验）虽然快速、简便，但会受卡介苗、非结核分枝杆菌或既往感染影响，不能区分活动性结核病。因此，提高实验室检测能力，促进早诊断、早治疗是有效控制结核病蔓延的必要措施。
随着医学科学技术的不断发展，分子检测技术在对结核病早期诊断方面受到广泛的重视和应用，具有快速、准确、敏感性高、不受抗痨治疗影响等优点，而痰液样本是肺结核病临床诊断不可缺失的样本类型。
目前，对结核病的分子检测，痰液样本仍有三大难点，从而限制自动化、通量化的分子检测。
第一难点：痰液中有大量粘液，使其中细胞不易分离；
第二难点：痰液组成很复杂，成分包含粘液、异物、病原微生物，各种炎症细胞、坏死脱落的粘膜上皮细胞等。故高纯度、高质量的核酸获取有一定的困难；
第三难点：结核分枝杆菌细胞壁较特殊，难以像其它细胞通过去污剂或裂解液裂解，增加了痰液样本中结核分枝杆菌核酸提取的难度。
发明内容
为了解决上述至少一种技术问题，急需开发一种操作简便、成本低廉、能够提取高质量、高纯度的结核分枝杆菌核酸的提取方法，本申请提供一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、试剂盒、提取方法及应用。
第一方面，本申请提供一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液，所述裂解液包括盐离子、胍盐、金属离子螯合剂、巯基还原剂以及表面活性剂；所述盐离子在所述裂解液中的浓度为10~100mmol/L；所述胍盐在所述裂解液中的浓度为1~5mol/L；所述金属离子螯合剂在所述裂解液中的浓度为10~50mmol/L；所述巯基还原剂在所述裂解液中的浓度为5~20mmol/L；所述表面活性剂在所述裂解液中的质量百分数为0.1~2%；所述胍盐包括盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍以及碳酸胍中的至少一种；所述金属离子螯合剂包括EDTA、EGTA中的一种；所述巯基还原剂包括DTT、THPP、N-乙酰半胱氨酸、二硫赤藓糖醇以及β-巯基乙醇中的至少一种；所述表面活性剂包括吐温20、TritonX-100、十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基硫酸锂中的至少一种；所述盐包括NaCl或KCl中的至少一种。
第二方面，本申请提供一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒，所述试剂盒包括本申请提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、漂洗液A、漂洗液B以及玻璃珠；
所述漂洗液A包括缓冲液、胍盐以及异丙醇；其中，所述缓冲液的浓度为10~50mmol/L；所述胍盐在所述漂洗液A中的浓度为1~5mol/L；所述异丙醇在所述漂洗液A中的质量百分数为10~60%；其中，所述胍盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的至少一种；漂洗液B包括缓冲液和乙醇；所述缓冲液的浓度为10~50mmol/L；所述乙醇在所述漂洗液B中的质量百分数为75%；所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液的pH值为7.0~8.5；其中，所述玻璃珠的直径为0.1~5mm。
第三方面，本申请提供一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的方法，所述方法使用本申请提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒，所述方法包括如下步骤：
S1、将痰液样本加入装有直径为0.1~5mm的玻璃珠和裂解液的样本管中；
S2、将所述样本管放入振荡器，设置所述振荡器的振荡频率为2000~4000rpm，振荡3~10min；
S3、将所述样本管静置5min，自所述样本管取1mL液体转移到离心管管中；
S4、加20μL磁珠于所述离心管中，混匀，室温静置10min；
S5、将离心管置于磁力架上，待所述磁珠吸附后去除上清液；
S6、加入漂洗液A，混匀，使所述磁珠悬浮；
S7、 将所述离心管置于所述磁力架上，待所述磁珠吸附后去除上清液；
S8、加入漂洗液B，混匀，使所述磁珠悬浮；
S9、 将所述离心管置于所述磁力架上，待所述磁珠吸附后去除上清液；
S10、将所述离心管置于所述磁力架上，室温晾晒3~5min；
S11、加入100μLddH2O，混匀重悬磁珠，56~60℃孵育5~8min；
S12、将所述离心管置于所述磁力架，待所述磁珠吸附后吸取洗脱的核酸溶液至新的离心管中；
S13、将洗脱的核酸用作模板直接扩增或冻存于-20℃。
第四方面，本申请提供一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液在分枝杆菌检测产品领域中的应用。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
本申请提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液结合合适的核酸提取方法能够有效地液化痰液，并帮助提取分枝杆菌核酸，有助于疾病诊断。
本申请提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒能够实现痰液样品的液化和分枝杆菌核酸的提取。该试剂盒能够高效地破坏结核分枝杆菌细胞壁的特殊结构，使核酸更容易被提取出来，这有助于提高核酸提取的效果和准确性。
通过采用本申请提供的痰液液化及分枝杆菌核酸提取方法，结合本申请提供的试剂盒，可以实现高效的痰液液化和分枝杆菌核酸的提取。这种方法解决了现有技术中操作复杂、耗时长、核酸纯度不高等问题，并具备较好的纯度和扩增性能。该方法适用于后续的实验研究，可以提供高质量的分枝杆菌核酸样本，为进一步的分析和研究提供可靠的基础。
附图说明
图1为实验1中未液化的不同粘度的痰液图；
图2为实验1中本申请提供的裂解液对不同粘度的痰液的液化效果图；
图3为实验1中4% 的NaOH溶液对不同粘度痰液的液化效果图；
图4为实验1提取的痰液核酸的荧光定量扩增曲线图；(注：图中的三条曲线分别代表三种不同粘稠度的痰液扩增曲线)；
图5为对比例5中传统NaOH液化煮沸法提取的，痰液核酸的荧光定量扩增曲线图；(注：图中的三条曲线分别代表三种不同粘稠度的痰液扩增曲线)；
图6为实验2中使用实施例43提取的痰液核酸的荧光定量扩增曲线图；
图7为实验2中使用实施例32提取的痰液核酸的荧光定量扩增曲线图；
图8为对比例6中传统NaOH液化煮沸法提取的痰液核酸的荧光定量扩增曲线图；
图9为实验3提取的痰液核酸的荧光定量扩增曲线图；
图10为对比7中传统NaOH液化煮沸法提取的痰液核酸的荧光定量扩增曲线图。
具体实施方式
申请人在对结核分枝杆菌进行检测时发现，现有技术中的存在的检测方法虽有很多，但各存在优缺点。目前针对肺结核患者的临床诊断主要依靠病史、胸片、痰培养和涂片抗酸染色等传统检测方法。然而，这些方法存在一些缺点，包括灵敏度低、耗时长和不能准确区分结核和非结核等。首先，传统的病史和胸片检查方法不能提供准确的诊断结果。病史只能提供患者的症状和病情描述，但不能直接确定是否患有结核。胸片可以显示肺部异常阴影，但无法确定这些阴影是否由结核引起。因此，这些方法往往需要结合其他检测方法进行诊断。其次，痰培养和涂片抗酸染色是目前最常用的结核检测方法。痰培养可以检测分枝杆菌的生长，但需要较长的培养时间，通常需要数周或数月。涂片抗酸染色可以快速检测分枝杆菌的存在，但其灵敏度较低，可能会导致漏诊。此外，传统方法也无法准确区分结核和非结核病原体。有些非结核分枝杆菌也可以引起肺部疾病，但它们的治疗方法和预后可能与结核不同。虽然，PPD试验作为诊断MTB感染的传统方法，具有操作简便、成本低廉的特点，至今仍广泛使用，但该方法使用的PPD抗原成分复杂，易受卡介苗接种和非结核分枝杆菌的影响，特异性较低，且对人免疫缺陷病毒（HIV)感染及重症疾病患者等免疫功能受损人群的敏感度不足。研究结果提示，IGRA（γ-干扰素释放试验）诊断结核分枝杆菌感染的特异度高于PPD试验，但也有文献报道，特别是在中、低收入国家，IGRA（γ-干扰素释放试验）与PPD试验相比并没有足够的优势。IGRA（γ-干扰素释放试验）技术要求高，操作程序复杂，样本检测时限短，难以实现高通量，价格昂贵。由于缺乏严谨、大规模和前瞻性的人群研究数据，故IGRA（γ-干扰素释放试验）的应用范围及结果解读存在较大争议。总之，目前的结核检测方法存在一些局限性，包括灵敏度低、耗时长和不能准确区分结核和非结核等缺点。
因此，分子检测技术在对结核病早期诊断方面受到广泛的重视和应用，虽然分子检测技术具有快速、准确、敏感性高、不受抗痨治疗影响等优点，但是对结核病患者的痰液样本进行分子检测时，仍有三大方面难点。第一方面，痰液中有大量粘液，使其中细胞不易分离；第二方面，痰液组成很复杂，成分包含粘液、异物、病原微生物，各种炎症细胞、坏死脱落的粘膜上皮细胞等，故高纯度、高质量的核酸获取有一定的困难；第三方面，结核分枝杆菌细胞壁较特殊，难以像其它细胞通过去污剂或裂解液裂解，增加了痰液样本中结核分枝杆菌核酸提取的难度。
申请人通过大量研究和实验，针对结核病患者的痰液样本进行分子检测时出现的问题，研发了一种特殊的痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液，所述裂解液包括盐离子、胍盐、金属离子螯合剂、巯基还原剂以及表面活性剂；所述盐离子在所述裂解液中的浓度为10~100mmol/L；所述胍盐在所述裂解液中的浓度为1~5mol/L；所述金属离子螯合剂在所述裂解液中的浓度为10~50mmol/L；所述巯基还原剂在所述裂解液中的浓度为5~20mmol/L；所述表面活性剂在所述裂解液中的质量百分数为0.1~2%；所述胍盐包括盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍以及碳酸胍中的至少一种；所述金属离子螯合剂包括EDTA、EGTA中的一种；所述巯基还原剂包括DTT、THPP、N-乙酰半胱氨酸、二硫赤藓糖醇以及β-巯基乙醇中的至少一种；所述表面活性剂包括吐温20、TritonX-100、十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基硫酸锂中的至少一种；所述盐包括NaCl或KCl中的至少一种。
这种裂解液具有以下特点：第一方面，能够有效液化痰液样本中的粘液，使其中的细胞易于分离。通过使用这种裂解液，可以降低痰液样本中粘液的浓度，从而方便后续的细胞分离和核酸提取过程。第二方面，能够高效地提取痰液样本中的结核分枝杆菌核酸。这种裂解液可以有效地破坏结核分枝杆菌细胞壁的特殊结构，从而使核酸更容易被提取出来。第三方面，能够保证提取的核酸的高纯度和高质量。该裂解液能够去除痰液样本中其他成分的干扰，从而提取出高纯度、高质量的结核分枝杆菌核酸。通过使用这种特殊的痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液，申请人希望能够克服现有技术中存在的困难，提高结核病的早期诊断的准确性和效率。这将有助于减少结核病的误诊和漏诊，并为患者提供更及时的治疗。
具体而言，于第一方面，本申请提供一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液，所述裂解液包括盐离子、胍盐、金属离子螯合剂、巯基还原剂以及表面活性剂；所述盐离子在所述裂解液中的浓度为10~100mmol/L；所述胍盐在所述裂解液中的浓度为1~5mol/L；所述金属离子螯合剂在所述裂解液中的浓度为10~50mmol/L；所述巯基还原剂在所述裂解液中的浓度为5~20mmol/L；所述表面活性剂在所述裂解液中的质量百分数为0.1~2%；所述胍盐包括盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍以及碳酸胍中的至少一种；所述金属离子螯合剂包括EDTA、EGTA中的一种；所述巯基还原剂包括DTT、THPP、N-乙酰半胱氨酸、二硫赤藓糖醇以及β-巯基乙醇中的至少一种；所述表面活性剂包括吐温20、TritonX-100、十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基硫酸锂中的至少一种；所述盐包括NaCl或KCl中的至少一种。
该种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液结合合适的核酸提取方法能够有效地液化痰液，并帮助提取分枝杆菌核酸，有助于疾病诊断。其中，胍盐的作用是消化痰液中的蛋白质，从而促进痰液的液化。此外，胍盐还可以裂解细胞，并灭活核酸酶，保护核酸不被降解。裂解液中的金属离子螯合剂可以与细胞内的金属离子结合，保护核酸不被降解。巯基还原剂可以还原细胞内的二硫键，有助于核酸的释放和提取。裂解液中的表面活性剂具有较强的渗透能力，可以破坏细菌细胞膜，促进细胞的裂解和核酸的释放。表面活性剂与胍盐协同作用，可以消化痰液中的粘性蛋白质，进一步促进痰液的液化。此外，表面活性剂还可以与胍盐协同裂解细胞，并保护核酸不被降解。综上所述，这种裂解液中的各成分协同作用，可以消化痰液中的蛋白质、液化痰液、裂解细胞、灭活核酸酶，并降低痰液的粘度，能够有效地液化痰液，并帮助提取分枝杆菌核酸，有助于疾病诊断。
可选的，所述胍盐为所述异硫氰酸胍；其中，所述异硫氰酸胍在所述裂解液中的浓度为4mol/L。该种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液提取核酸的效果更佳。其中，异硫氰酸胍用于核酸提取和纯化过程中的裂解剂。异硫氰酸胍可破坏细胞的壁膜和蛋白质结构，使得核酸能够被有效地提取出来。
可选的，所述巯基还原剂包括DTT和N-乙酰半胱氨酸。这种包括DTT和N-乙酰半胱氨酸的巯基还原剂，其效果主要是将蛋白质中的二硫键还原为巯基。巯基还原剂可以改变蛋白质的构象和功能，同时也可以解除蛋白质的空间结构限制。
可选的，所述表面活性剂包括吐温20和TritonX-100；其中，所述吐温20和所述TritonX-100的重量比为1：1。该种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液的提取核酸的效果更佳。其中吐温20是一种非离子表面活性剂，用于实验中作为洗涤剂和稳定剂。可用于提高蛋白质溶解、抗体结合和细胞膜通透性等。TritonX-100是一种非离子表面活性剂，常用于细胞裂解、溶解膜蛋白和提取细胞内组分等。TritonX-100具有良好的渗透性，可破坏细胞膜，使细胞内的分子可与其相互作用。
第二方面，本申请提供一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒，所述试剂盒包括本申请提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、漂洗液A、漂洗液B以及玻璃珠；
所述试剂盒包括本申请提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、漂洗液A、漂洗液B以及玻璃珠；所述漂洗液A包括缓冲液、胍盐以及异丙醇；其中，所述缓冲液的浓度为10~50mmol/L；
所述胍盐在所述漂洗液A中的浓度为1~5mol/L；所述异丙醇在所述漂洗液A中的质量百分数为10~60%；其中，所述胍盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的至少一种；漂洗液B包括缓冲液和乙醇；所述缓冲液的浓度为10~50mmol/L；所述乙醇在所述漂洗液B中的质量百分数为75%；所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液的pH值为7.0~8.5；其中，所述玻璃珠的直径为0.1~5mm。
该种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒能够实现痰液样品的液化和分枝杆菌核酸的提取。该试剂盒能够用于高效地破坏结核分枝杆菌细胞壁的特殊结构，使核酸更容易被提取出来，这有助于提高核酸提取的效果和准确性。其中，裂解液用于破坏细胞膜和核膜，以释放细胞内的核酸。漂洗液A用于去除细胞裂解后的杂质，净化核酸。漂洗液B用于进一步净化核酸。
第三方面，本申请提供一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的方法，所述方法使用本申请提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒，包括如下步骤：
S1、将痰液样本加入装有直径为0.1~5mm的玻璃珠和裂解液的样本管中；
S2、将样本管放入振荡器，设置该振荡器的振荡频率为2000~4000rpm，振荡3~10min；
S3、振荡结束后，静置5min，自该样本管取1mL液体转移到新离心管中；
S4、加20μL磁珠于离心管中，混匀，室温静置10min；
S5、将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；
S6、加入漂洗液A，混匀，使磁珠充分悬浮；
S7、将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；
S8、加入漂洗液B，混匀，使磁珠充分悬浮；
S9、将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；
S10、将离心管置于磁力架上，室温晾晒3~5min；
S11、加入100μLddH2O，混匀重悬磁珠，56~60℃孵育5~8min；
S12、将离心管置于磁力架，待磁珠完全吸附后吸取洗脱的核酸溶液至新的离心管中；
S13、洗脱的核酸用作模板直接扩增或冻存于-20℃用作后续的实验。
通过采用上述技术方案，本申请提供的痰液液化及分枝杆菌核酸提取方法，结合本申请提供的试剂盒，可以实现高效的痰液液化和分枝杆菌核酸的提取。这种方法解决了现有技术中操作复杂、耗时长、核酸纯度不高等问题，并具备较好的纯度和扩增性能。该方法适用于后续的实验研究，可以提供高质量的分枝杆菌核酸样本，为进一步的分析和研究提供可靠的基础。其中，通过将痰液样本与玻璃珠和裂解液混合，可以有效地液化痰液样本，方便后续处理。通过振荡器的振荡作用，可以使样本中的细菌和细胞充分裂解，释放出核酸。通过加入磁珠和漂洗液的方式，可以将核酸与其他杂质分离，提高核酸的纯度。通过磁力架的使用，可以方便地去除上清液和洗脱核酸，提高操作的方便性和快捷性。通过加入ddH2O和孵育的方式，可以有效地洗脱核酸。总的来说，本申请提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的方法能够高效地液化痰液和提取痰液中的分枝杆菌核酸，并具备较好的纯度和扩增性能，适用于后续的实验研究。
第四方面，本申请提供一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液在核酸检测产品领域中的应用。
具体实施例
制备例1~36分别提供了一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液，裂解液中所选用的原料均为市售产品。
制备例1~4
制备例1~4提供一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液，裂解液的成分以及各成分在裂解液中的浓度参见表1。
表1-制备例1~4提供的裂解液的成分以及各成分在裂解液中的浓度汇总表
制备例5~6
制备例5
本制备例与制备例3的区别在于，本制备例中的盐离子为KCl。
制备例6
本制备例与制备例3的区别在于，本制备例中的盐离子为NaCl和KCl的混合物，其中，NaCl的摩尔浓度为80mmol/L，KCl的摩尔浓度为80mmol/L。
制备例7~13
制备例7
本制备例与制备例6的区别在于，本制备例中的胍盐为异硫氰酸胍。
制备例8
本制备例与制备例6的区别在于，本制备例中的胍盐为硫酸胍。
制备例9
本制备例与制备例6的区别在于，本制备例中的胍盐为碳酸胍。
制备例10
本制备例与制备例6的区别在于，本制备例中的胍盐为硫酸胍和碳酸胍的组合物。其中，硫酸胍的摩尔浓度为4mol/L；碳酸胍的摩尔浓度为4mol/L。
制备例11
本制备例与制备例6的区别在于，本制备例中的胍盐为盐酸胍和异硫氰酸胍的组合物。其中，盐酸胍的摩尔浓度为4mol/L；异硫氰酸胍的摩尔浓度为4mol/L。
制备例12
本制备例与制备例6的区别在于，本制备例中的胍盐为盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍以及碳酸胍的组合物，其中，盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍以及碳酸胍的摩尔浓度均为4mol/L。
制备例13
本制备例与制备例7的区别在于，本制备例中的金属离子螯合剂为EGTA。
制备例14~20
制备例14
本制备例与制备例7的区别在于，本制备例中的表面活性剂为TritonX-100。
制备例15
本制备例与制备例7的区别在于，本制备例中的表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
制备例16
本制备例与制备例7的区别在于，本制备例中的表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠。
制备例17
本制备例与制备例7的区别在于，本制备例中的表面活性剂为十二烷基硫酸锂。
制备例18
本制备例与制备例7的区别在于，本制备例中的表面活性剂为吐温20和TritonX-100的组合物。吐温20和TritonX-100的重量比为1：1。
制备例19
本制备例与制备例7的区别在于，本制备例中的表面活性剂为吐温20和TritonX-100以及十二烷基硫酸钠的组合物。各表面活性剂的重量比为1：1：1。
制备例20
本制备例与制备例7的区别在于，本制备例中的表面活性剂为吐温20、TritonX-100、十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠以及十二烷基硫酸锂的组合物。吐温20、TritonX-100、十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠以及十二烷基硫酸锂的重量比为1：1：1：1：1。
制备例21~25
制备例21
本制备例与制备例18的区别在于，本制备例中的巯基还原剂为N-乙酰半胱氨酸。
制备例22
本制备例与制备例18的区别在于，本制备例中的巯基还原剂为THPP。
制备例23
本制备例与制备例18的区别在于，本制备例中的巯基还原剂为β-巯基乙醇。
制备例24
本制备例与制备例18的区别在于，本制备例中的巯基还原剂为二硫赤藓糖醇，二硫赤藓糖醇的摩尔质量浓度为15mmol/L。
制备例25
本制备例与制备例18的区别在于，本制备例中的巯基还原剂为DTT、N-乙酰半胱氨酸的组合物。DTT和N-乙酰半胱氨酸的摩尔浓度均为15mmol/L。
制备例26~28
制备例26
本制备例与制备例25的区别在于，本制备例中的裂解液还包括缓冲液，缓冲液的摩尔浓度为10mmol/L，本制备例中的缓冲液为磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液的pH值为7.0。
制备例27
本制备例与制备例25的区别在于，本制备例中的磷酸盐缓冲液在裂解液中的摩尔浓度为30mmol/L。磷酸盐缓冲液的pH值为8.5。
制备例28
本制备例与制备例25的区别在于，本制备例中的磷酸盐缓冲液在裂解液中的摩尔浓度为50mmol/L。磷酸盐缓冲液的pH值为8.0。
制备例29~30
制备例29
本制备例与制备例28的区别在于，本制备例中的缓冲液为Tris-HCl。
制备例30
本制备例与制备例28的区别在于，本制备例中的缓冲液为MOPS缓冲液。
制备例31~34
制备例31
本制备例与制备例29的区别在于，本制备例中的裂解液还包括醇类，醇类在裂解液中的质量百分数为10%，本实施例中醇类为异丙醇。
制备例32
本制备例与制备例29的区别在于，本制备例中的异丙醇在裂解液中的质量分数为30%。
制备例33
本制备例与制备例29的区别在于，本制备例中的异丙醇在裂解液中的质量百分数为50%。
制备例34
本制备例与制备例29的区别在于，本制备例中的异丙醇在裂解液中的质量分数为60%。
制备例35~36
制备例35
本制备例与制备例32的区别在于，本制备例中的醇类由异丙醇、乙醇以及正丁醇的组成，其中，异丙醇、乙醇以及正丁醇之间的重量份数之比为1：1：1。
制备例36
本制备例与制备例32的区别在于，本制备例中的醇类由异丙醇、乙醇、正丁醇以及正丙醇的组成，其中，异丙醇、乙醇以及正丁醇之间的重量份数之比为1：1：1：1。
以下为本申请实施例
实施例1
本实施例提供一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒，试剂盒包括制备例1提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液，漂洗液A、漂洗液B以及玻璃珠；
漂洗液A包括缓冲液、胍盐以及异丙醇；
其中，缓冲液的浓度为10mmol/L；
胍盐在漂洗液A中的浓度为1mol/L；
异丙醇的质量分数为10%；
本实施例中使用的胍盐为盐酸胍；
漂洗液B包括缓冲液和乙醇；缓冲液的浓度为10mmol/L；
乙醇在漂洗液B中的质量百分数为75%；
本实施例中使用的缓冲液是pH值为7.0的磷酸盐缓冲液；
本实施例使用直径为0.5mm的玻璃珠。
实施例2~36
实施例2~36与实施例1的区别在于，各实施例中裂解液的选择与实施例1不同，区别部分参见表2。
表2实施例2~36与实施例1的区别部分汇总表
实施例37~38
实施例37
本实施例与实施例32的区别在于，本实施例中，漂洗液A中所添加的磷酸盐缓冲液的pH值为8.0，磷酸盐缓冲液的浓度为30mmol/L；
盐酸胍在漂洗液A中的浓度为3mol/L；异丙醇在漂洗液A中的质量百分数为30%。
在漂洗液B中的磷酸盐缓冲液的pH值为8.0，并且磷酸盐缓冲液的浓度为30mmol/L。
实施例38
本实施例与实施例32的区别在于，漂洗液A中所添加的磷酸盐缓冲液的pH值为8.5，并且磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L；
盐酸胍在漂洗液A中的浓度为5mol/L；异丙醇在漂洗液A中的质量百分数为60%。
在漂洗液B中添加的磷酸盐缓冲液的pH值为8.0，并且磷酸盐缓冲液的浓度为30mmol/L。
实施例39~40
实施例39
本实施例与实施例38的区别在于，本实施例中漂洗液A中的缓冲液为Tris-HCl缓冲液；漂洗液A中的胍盐为异硫氰酸胍。
漂洗液B中的缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
实施例40
本实施例与实施例38的区别在于，本实施例中漂洗液A中的缓冲液由磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液以及MOPS缓冲液组成，其中，磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液以及MOPS缓冲液的浓度均为50mmol/L。
漂洗液B中的缓冲液由磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液以及MOPS缓冲液组成，其中磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液以及MOPS缓冲液浓度均为30mmol/L。
实施例41~44
实施例41
本实施例与实施例39的区别在于，本实施例中的玻璃珠的粒径为3mm。
实施例42
本实施例与实施例39的区别在于，本实施例中的玻璃珠的粒径为1mm。
实施例43
本实施例与实施例39的区别在于，本实施例中的玻璃珠的粒径为0.1mm。
实施列44
本实施例与实施例39的区别在于，本实施例中的玻璃珠的粒径为5mm。
对比例1~4
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例提供的裂解液中没有添加胍盐。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例提供的裂解液中没有添加巯基还原剂。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例提供的裂解液中没有添加巯基还原剂和胍盐。
对比例4
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒没有玻璃珠。
检测实验、核酸提取实验
本实验依次使用由实施例1~44以及对比例1~4提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒分别对同一种模拟胞内分枝杆菌阳性痰液样本进行核酸提取实验。实施例1~44以及对比例1~4检测的模拟胞内分枝杆菌阳性痰液样本是采用以下方法制备的：
取10μL灭活的胞内分枝杆菌加入1mL阴性分枝杆菌痰液基质中，制备模拟胞内分枝杆菌阳性痰液样本。
实施例1~44以及对比例1~4中，采用本申请痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒来提取核酸的方法包括如下步骤：
S1、将上述痰液样本加入装有直径为0.5mm的玻璃珠和裂解液的样本管中；
S2、将样本管放入振荡器，振荡频率为2000rpm，振荡10min；
S3、振荡结束后，静置5min，取1mL液体转移到新离心管中；
S4、加20μL磁珠于离心管中，混匀，室温静置10min；
S5、将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；
S6、加入漂洗液A，混匀，使磁珠充分悬浮；
S7、将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；
S8、加入漂洗液B，混匀，使磁珠充分悬浮；
S9、将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；
S10、将离心管置于磁力架上，室温晾晒3min；
S11、加入100μLddH2O，混匀重悬磁珠，56℃孵育5min；
S12、将离心管置于磁力架，待磁珠完全吸附后吸取洗脱的核酸溶液至新的离心管中；
S13、洗脱的核酸用作模板直接扩增或冻存于-20℃用作后续的荧光PCR检测实验。
实施例1~44的核酸提取方法中不同之处仅在于：所使用的裂解液、玻璃珠、漂洗液A以及漂洗液B。
实施例1~44所提取的核酸浓度及纯度参见表3。
核酸浓度的检测方法为如下：在本申请的实施例中，核酸浓度的检测由qPCR法进行检测。
核酸纯度的检测方法为如下：在本申请的实施例中，通过比值法检测核酸的纯度，它是通过测量核酸在260nm和280nm处的吸光度比值(A260/A280)来判断核酸的纯度，纯度较高的核酸样品A260/A280值在1.8-2.0之间，如果A260/A280值小于1.8说明可能存在蛋白质或其他杂质；如果A260/A280值大于2.0，则说明可能存在RNA或其他杂质。
表3-核酸提取实验所提取的核酸浓度及纯度
结果分析：
参见表3结果可知，采用本申请提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒所提取的核酸的A260/A280值均高于1.80，纯度都较高。
实施例2~4与实施例1的区别在于，各实施例所提供的试剂盒中，裂解液的各组分浓度不同，从表3提供的结果可知，随着裂解液浓度的变化，所提取的核酸浓度也随着变化。
实施例5~6与实施例3的区别在于，各实施例提供的裂解液中，所使用的盐离子不同，从表3提供的检测结果可知，当盐离子为NaCl和KCl的组合物时有利于提高核酸的纯度。
实施例7~12与实施例6的区别在于，各实施例中所使用的胍盐不同。从表3提供的检测结果可知，当胍盐为异硫氰酸胍时，有利于提高所提取的核酸的浓度以及纯度。
实施例13与实施例7的区别在于，所使用的金属离子螯合剂不同，从表3提供的检测结果可知，当金属离子螯合剂为EDTA时，所提取的核酸的纯度比EGTA的高。
实施例14~20与实施例7的区别在于，各实施例提供的裂解液中所使用的表面活性剂的选择不同。从表3提供的检测结果可知，当表面活性剂为吐温20和TritonX-100的组合物时所提取的核酸的纯度最高。
实施例21~25与实施例18的区别在于，巯基还原剂的类型不同。从表3提供的检测结果可知，当巯基还原剂为DTT和N-乙酰半胱氨酸的组合物时，所提取的核酸的纯度相对与其他实施例较高。
实施例26~28与实施例25的区别在于，裂解液还包括缓冲液，从表3提供的检测结果可知，在裂解液中缓冲液的添加有利于提高核酸的纯度及浓度。其原因可能在于，缓冲液在本申请中主要起到为盐等提供一种pH缓冲体系的作用，从而提高对痰液样本进行杂质处理的效率，同时，为细胞的裂解过程提供了比较稳定的缓冲体系。
实施例29~30与实施例28的区别在于，缓冲液的选择与实施例28不同，从表3提供的检测结果可知，当缓冲液为Tris-HCl时更有利于提高核酸的纯度。
实施例31~34与实施例29的区别在于，实施例31~34的裂解液还包括醇类，从表3提供的检测结果可知，当本申请提供的裂解液包括醇类时能够提高所提取的核酸的浓度以及纯度，其原因在于，醇类能够进一步提高核酸与磁珠的吸附效率。
实施例35~36与实施例32的区别在于，醇类的选择不同。在本申请中当醇类为异丙醇时所提取的核酸的纯度较高。
实施例37~38与实施例32的区别在于，漂洗液A和漂洗液B中各组分的配比及浓度与实施例32不同。
实施例39~40与实施例38的区别在于，漂洗液A以及漂洗液B中部分组分的选择与实施例38不同。
实施例41~44与实施例39的区别在于，玻璃珠的粒径选择与实施例40不同。从表3提供的检测结果可知，实施例43提供的一种提取痰液核酸的试剂盒所提取的核酸的纯度最高。
对比例1与实施例1的区别在于，本对比例中的裂解液中没有添加胍盐。从表3提供的检测结果可知，若在提取分枝杆菌的裂解液中不添加胍盐，会明显的降低所提取的核酸的浓度以及纯度。
对比例2与实施例1的区别在于，本对比例中的裂解液中没有添加巯基还原剂。从表3提供的检测结果可知，若在提取分枝杆菌的裂解液中不添加巯基还原剂，会明显的降低所提取的核酸的浓度以及纯度。
对比例3与实施例1的区别在于，本对比例中的裂解液中没有添加巯基还原剂和胍盐。从表3提供的检测结果可知，若在提取分枝杆菌的裂解液中不添加巯基还原剂和胍盐，会明显的降低所提取的核酸的浓度以及纯度。结合实施例1、对比例1~3的结果发明人推测胍盐和巯基还原剂之间存在协同作用。
对比例4与实施例1的区别在于，对比例4在提取核酸时没有使用玻璃珠，从表3提供的检测数据可知，在提取分枝杆菌核酸时，使用玻璃珠可有效提高所提取的核酸的纯度以及浓度。
结合实施例1、对比例1~3的检测结果可知，当本申请中的裂解液同时包括胍盐以及巯基还原剂时，有利于提高所提取的核酸的浓度以及纯度。由此可知，本申请提供的裂解液中表面活性剂以及胍盐之间具有协同效果。
实验1
本实验使用由实施例38提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒对结核分枝杆菌的模拟样本进行核酸提取实验。本实验包括如下步骤：
S1、取10μL热灭活的结核分枝杆菌H37RV分别加入1mL的粘稠度为Ⅰ度、Ⅱ度和Ⅲ度的阴性分枝杆菌痰液基质中，制备模拟结核分枝杆菌阳性痰液样本。分别将3种不同粘度的结核分枝杆菌阳性痰液样本转移至5mL的无菌离心管内，管内装有1mL直径为0.5mm的玻璃珠。加入2倍痰液体积的裂解液；将上述的样本放入高速振荡仪中，以4000rpm的振荡频率振荡3min，未液化的痰液如图1所示，液化后效果如图2所示；
S2、转移1mL液化后痰液样本于干净的EP管中，加入20μL磁珠，混匀，室温静置10min；将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；加入漂洗液A，混匀，使磁珠充分悬浮；将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；加入漂洗液B，混匀，使磁珠充分悬浮；将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；将离心管置于磁力架上，室温晾晒3min；加入100μLddH2O，混匀重悬磁珠，56℃孵育5min；将离心管置于磁力架，待磁珠完全吸附后分别吸取洗脱的核酸溶液至新的离心管中，用于后续荧光定量核酸检测的模板。
对比例5
本对比例与实验1的相同之处在于，本对比例使用与实验1同样的模拟阳性痰液样本进行核酸提取实验。本对比例实验操作包括如下：
S1、取3种不同痰液粘度的模拟阳性痰液样本，加入2倍痰液体积的4%的NaOH溶液混匀，常温孵育30min，间或振荡混匀，使痰液充分液化，痰液液化后效果如图3所示；
S2、转移1mL的液化后痰液样本于干净的EP管中，在振荡频率为12000rpm的条件下离心5min，去除上清，并向沉淀中加入1mLPBS溶液，混匀，在振荡频率为12000rpm的条件下离心2min，小心去除上清；向沉淀中加入100μLTE溶液，混匀，沸水浴10min，在振荡频率为12000rpm的条件下离心2min，分别吸取上清到新的离心管中，用于后续荧光定量核酸检测的模板；
第一组荧光PCR检测
分别取5μL由实验1和对比例5获得的核酸溶液进行荧光定量PCR检测。扩增试剂采用商业化的“分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）”试剂盒（北京博奥生物有限公司）。检测结果如图4~5所示，图4为本申请实验1所用方法，图5为对比例5使用的传统NaOH液化煮沸法。
结果分析：
根据图1~3所示的结果，本申请实施例38提供的裂解液与三种粘度的痰液进行混合，进行振荡10min后痰液可完全液化，用枪头吸取无拉丝现象，都可看到澄清的痰液液化液（见图2）。而用4%的NaOH溶液处理30min后的三种粘度的痰液虽也可被完全液化，用枪头吸取无拉丝现象，但是III度溶液浑浊不澄清（见图3）。表明本申请提供的裂解液可对不同粘度的痰液完全液化，且耗时更短，液化效果更理想。取液化液继续进行核酸提取和荧光定量检测。本申请在进行痰液液化过程中通过物理振荡的方式可同时实现对分枝杆菌的破壁裂解，释放出的核酸通过磁珠被富集和纯化，耗时短，操作简单，可实现自动化、高通量化。而用传统的4%的NaOH溶液处理的痰液需要先经过两轮离心来富集和漂洗菌体，之后通过煮沸的方式来提取核酸，操作复杂，无法实现自动化、通量化检测。核酸荧光定量检测结果显示，本申请较传统煮沸的核酸提取方式有着更高的相对荧光强度和更小的CT值（参见图4和图5）。表明本申请提供的核酸提取方法有着更高的提取效率，因此具有更高的检测灵敏度。
实验2
本实验使用由实施例43和实施例32提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒对结核分枝杆菌的模拟样本进行核酸提取实验。
本实验步骤S1使用由实施例43提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒。步骤S2使用由实施例32提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒。
本实验步骤为如下：
S1、取10μL灭活的结核分枝杆菌H37RV加入1mL阴性分枝杆菌痰液基质中，制备模拟结核分枝杆菌阳性痰液样本。分别准备2份；其中1份转移至5mL的无菌离心管内，离心管内装有1mL直径为0.1mm的玻璃珠。加入2倍痰液体积的裂解液，并将获得的样本放入高速振荡仪中，以3000rpm的振荡频率振荡8min；转移1mL的样本于干净的EP管中，加入20μL磁珠，混匀，室温静置10min；将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；加入漂洗液A，混匀，使磁珠充分悬浮；将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；加入漂洗液B，混匀，使磁珠充分悬浮；将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；将离心管置于磁力架上，室温晾晒4min；加入100μLddH2O，混匀重悬磁珠，58℃孵育5min；将离心管置于磁力架，待磁珠完全吸附后吸取洗脱的核酸溶液至新的离心管中，用于后续荧光定量核酸检测的模板；
S2、将第二份样本转移至5mL的无菌离心管内，离心管内装有1mL直径为0.5mm的玻璃珠。加入2倍痰液体积的裂解液；并将获得的样本放入高速振荡仪中，以3000rpm的振荡频率振荡5min；转移1mL的样本于干净的EP管中，加入20μL磁珠，混匀，室温静置10min；将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；加入漂洗液A，混匀，使磁珠充分悬浮；将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；加入漂洗液B，混匀，使磁珠充分悬浮；将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；将离心管置于磁力架上，室温晾晒3~5min；加入100μLddH2O，混匀重悬磁珠，58℃孵育8min；将离心管置于磁力架，待磁珠完全吸附后吸取洗脱的核酸溶液至新的离心管中，用于后续荧光定量核酸检测的模板。
对比例6
本对比例与实验2的相同之处在于，本对比例使用与实验2同样的模拟阳性痰液样本进行核酸提取实验，本对比例包括如下步骤：
S1、取模拟结核分枝杆菌阳性痰液样本，加入2倍痰液体积的4%的NaOH溶液混匀，常温孵育30min，间或振荡混匀，使痰液充分液化；转移1mL的样本于干净的EP管中，12000rpm，离心5min，小心去除上清；向沉淀中加入1mLPBS溶液，混匀，12000rpm，离心2min，小心去除上清；向沉淀中加入100μLTE溶液，混匀，沸水浴10min，12000rpm,离心2min，吸取上清到新的离心管中，用于后续荧光定量核酸检测的模板。
第二组荧光PCR检测
分别取5μL由实验2和对比例6获得的核酸溶液进行荧光定量PCR检测。扩增试剂采用商业化的“分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）”试剂盒（北京博奥生物有限公司）。检测结果如图6~8所示，图6为本申请实验2中步骤S1所用方法，图7为本申请实验2步骤S2所用方法，图8为对比例6所用的NaOH液化煮沸法。
结果分析：
根据图6所示的结果，使用本申请实施例43和实施例32提供的裂解液的液化效果与4%的NaOH溶液一致，痰液都可被完全液化，用枪头吸取无拉丝现象，可用于后续的核酸提取。核酸荧光定量检测结果显示，本申请不同的核酸提取组合方式，包括玻璃珠直径、振荡频率和时间、裂解液和漂洗液的配方，虽然有着不同的提取效率，但都较传统煮沸的核酸提取方式有着更高的相对荧光强度和更小的CT值（见图6~8）。
实验3
本实验使用由实施例43提供的一种提取痰液核酸的试剂盒对分枝杆菌的模拟样本进行核酸提取实验。本实验包括如下步骤：
S1、取10μL灭活的鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌分别加入1mL阴性分枝杆菌痰液基质中，制备模拟鸟分枝杆菌的阳性痰液样本和脓肿分枝杆菌的阳性痰液样本。分别准备2份；其中1份转移至5mL的无菌离心管内，离心管内装有3.5mL直径为0.1mm的玻璃珠。分别加入与痰液等体积的裂解液；并将获得的样本放入高速振荡仪中，以4000rpm的振荡频率振荡10min；分别转移1mL的液化痰液样本于干净的EP管中，加入20μL磁珠，混匀，室温静置10min；将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；分别加入漂洗液A，混匀，使磁珠充分悬浮；将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；分别加入漂洗液B，混匀，使磁珠充分悬浮；将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后用移液器小心去除上清液；将离心管置于磁力架上，室温晾晒5min；分别加入100μLddH2O，混匀重悬磁珠，60℃孵育10min；将离心管置于磁力架，待磁珠完全吸附后分别吸取洗脱的核酸溶液至新的离心管中，用于后续荧光定量核酸检测的模板。
对比例7
本对比例与实验3的相同之处在于，本对比例使用与实验3同样的模拟鸟分枝杆菌的阳性痰液样本和脓肿分枝杆菌的阳性痰液样本进行核酸提取实验，本对比例包括如下步骤：
S1、取样本，分别加入等体积的4%的NaOH溶液混匀，常温孵育30min，间或振荡混匀，使痰液充分液化；分别转移1mL的样本于干净的EP管中，12000rpm，离心5min，小心去除上清；分别向沉淀中加入1mLPBS溶液，混匀，12000rpm，离心2min，小心去除上清；分别向沉淀中加入100μLTE溶液，混匀，沸水浴10min，12000rpm，离心2min，分别吸取上清到新的离心管中，用于后续荧光定量核酸检测的模板。
第三组荧光PCR检测
分别取5μL实验3和对比例7的核酸溶液进行荧光定量PCR检测。扩增试剂采用商业化的“分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）”试剂盒（北京博奥生物有限公司）。
检测结果如图9和图10所示，图9为本申请实验3所用方法，图10为对比例7所用的传统NaOH液化煮沸法。
结果分析：
根据图9和图10所示的结果，对于鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌的检测，相比于传统煮沸的核酸提取方式，使用本申请提供的核酸提取方法有着更高的检测灵敏度，荧光检测的CT值更小，荧光强度更高。表明本申请提供的痰液样本核酸提取方法也可以用于非结核分枝杆菌的检测，为临床快速鉴定痰液样本中分枝杆菌的菌种提供有效的实现手段。
由于痰液样本中的大量粘液会使细胞难以分离，而，本申请提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液能够有效液化粘液，使其中的细胞易于分离。这有助于提高细胞的纯度和提取核酸的效率。并且，裂解液能够用于高效地破坏结核分枝杆菌细胞壁的特殊结构，使核酸更容易被提取出来，这有助于提高核酸提取的效果和准确性。
同时，该裂解液能够用于消除痰液样本中其他成分的干扰，从而提取出高纯度、高质量的结核分枝杆菌核酸。这对于后续的分析和检测至关重要。综上所述，本申请提供的裂解液能够有效液化痰液样本中的粘液，使其中的细胞易于分离，能够用于高效地提取痰液样本中的结核分枝杆菌核酸，并保证提取的核酸的高纯度和高质量。这将为结核病的早期诊断提供更准确和有效的工具。
通过使用本申请提供的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的方法，可以一步实现痰液的液化和分枝杆菌的裂解，从而将操作步骤简化为一步，节省了时间和劳动成本。同时，该方法能够更彻底地液化痰液样本中的粘液，使其中的细胞易于分离，有助于提高核酸提取的效率。在实际临床应用中，本核酸提取方法的自动化和通量化具有潜在的优势。通过将该方法与自动化设备结合，可以实现分枝杆菌检测的高通量处理，提高样本处理的效率和准确性。这对于临床实验室来说非常重要，可以加速结核病的诊断和治疗过程。综上所述，本申请提供的核酸提取方法具有操作简便、液化痰液更彻底、核酸提取效率更高等优点，在实际临床应用中具有优化实现分枝杆菌检测的自动化和通量化的潜力。这将显著提高痰液中分枝杆菌阳性检测率，并为结核病的诊断和治疗提供更高效的工具。
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液，其特征在于，所述裂解液包括盐离子、胍盐、金属离子螯合剂、巯基还原剂以及表面活性剂；
所述盐离子为NaCl和KCl的混合物，其中，NaCl的摩尔浓度为80mmol/L，KCl的摩尔浓度为80mmol/L；
所述胍盐为异硫氰酸胍；所述异硫氰酸胍在所述裂解液中的浓度为4mol/L；
所述金属离子螯合剂在所述裂解液中的浓度为30mmol/L；所述金属离子螯合剂为EDTA；
所述巯基还原剂为DTT和N-乙酰半胱氨酸的组合物；DTT和N-乙酰半胱氨酸的摩尔浓度均为15mmol/L；
所述表面活性剂在所述裂解液中的质量百分数为1.5％；所述表面活性剂为吐温20和TritonX-100的组合物；其中，所述吐温20和所述TritonX-100的重量比为1：1。
2.根据权利要求1所述的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液，其特征在于，所述裂解液还包括缓冲液；
所述缓冲液的浓度为10～50mmol/L；所述缓冲液的pH值为7.0～8.5；
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或MOPS缓冲液中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液，其特征在于，所述裂解液还包括醇类；所述醇类在所述裂解液中的质量百分数为10～60％；所述醇类为异丙醇、乙醇、正丁醇以及正丙醇中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液，其特征在于，所述醇类为异丙醇；所述异丙醇的质量百分数为30％。
5.一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、漂洗液A、漂洗液B以及玻璃珠；
所述漂洗液A包括缓冲液、胍盐以及异丙醇；
其中，所述漂洗液A中的缓冲液的浓度为10～50mmol/L；
所述胍盐在所述漂洗液A中的浓度为1～5mol/L；
所述异丙醇在所述漂洗液A中的质量百分数为10～60％；
其中，所述胍盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的至少一种；
漂洗液B包括缓冲液和乙醇；所述漂洗液B中的缓冲液的浓度为10～50mmol/L；
所述乙醇在所述漂洗液B中的质量百分数为75％；
所述漂洗液A和所述漂洗液B中的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液中的一种，所述漂洗液A和所述漂洗液B中的缓冲液的pH值为7.0～8.5；
其中，所述玻璃珠的直径为0.1～5mm。
6.一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求5所述一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的试剂盒，包括如下步骤：
S1、将痰液样本加入装有直径为0.1～5mm的玻璃珠和裂解液的样本管中；
S2、将所述样本管放入振荡器，设置所述振荡器的振荡频率为2000～4000rpm，振荡3～10min；
S3、将所述样本管静置5min，自所述样本管取1mL液体转移到离心管中；
S4、加20μL磁珠于所述离心管中，混匀，室温静置10min；
S5、将离心管置于磁力架上，待所述磁珠吸附后去除上清液；
S6、加入漂洗液A，混匀，使所述磁珠悬浮；
S7、将所述离心管置于所述磁力架上，待所述磁珠吸附后去除上清液；
S8、加入漂洗液B，混匀，使所述磁珠悬浮；
S9、将所述离心管置于所述磁力架上，待所述磁珠吸附后去除上清液；
S10、将所述离心管置于所述磁力架上，室温晾晒3～5min；
S11、加入100μL ddH2O，混匀重悬磁珠，56～60℃孵育5～8min；
S12、将所述离心管置于所述磁力架，待所述磁珠吸附后吸取洗脱的核酸溶液至新的离心管中；
S13、将洗脱的核酸用作模板直接扩增或冻存于-20℃。
7.一种权利要求1所述的一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液在制备分枝杆菌检测产品中的应用。
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