JP2023539822A - 血液培養物から細菌を単離するための血液細胞溶解薬 - Google Patents

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Abstract

血液細胞と少なくとも１種の微生物とを含む試料を処理するのに適した方法、組成物、及びキットを開示する。一部の実施形態では、方法は、試料を溶解緩衝液と接触させて処理済み試料を生成するステップを含む。溶解緩衝液は、試料中の血液細胞を溶解させる能力がある体細胞消化薬（ＳＤＡ）を含むことができる。一部の実施形態では、少なくとも１種の微生物は、ＳＤＡの存在下で無傷及び／又は生存可能なままである。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０２０年８月２０日に出願された米国仮出願第６３／０６８，２７８号に対する優先権を主張する。これらの出願の内容全体は、それらの全体を通じて参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。
背景
分野
本開示は、一般的に微生物の単離及び同定の分野に関する。
関連技術の説明
敗血症は、宿主の免疫系の感染に対する激しい反応に起因する重篤な医学的状態である。それは広範囲の炎症を引き起こす恐れがあり、血流障害をもたらす可能性がある。敗血症が進行すると、体の器官が酸素及び栄養不足になる恐れがあり、永久的な損傷及び最終的な不全症を引き起こす。誤診のまま又はそうでなくても未処置におかれると、心臓が衰弱する可能性があり、敗血症性ショックが起こる恐れがあり、多臓器不全及び死に至る。血液培養は、敗血症患者の血液中の細菌又は酵母菌の存在を検出するために必要である。微生物が存在する場合（陽性血液培養（「ＰＢＣ」））、適切な治療を提供するために微生物を同定し、抗生物質感受性を判定しなければならない。ＰＢＣ試料は、単離し、同定し、抗菌薬感受性試験（「ＡＳＴ」）を行うために用いられる。微生物は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを含めた質量分析又は表現型成長に基づく方法、例えばＰｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤのような方法によって同定されることが多い。
微生物を同定し、微生物について表現型分析を行い、ＡＳＴ試験を行うためには、無傷の、及び／又は生存可能な微生物を採取試料中の血液細胞及び他の材料から単離する必要がある。質量分析による微生物の同定のためには、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ同定を妨害することが分かっている物質、例えば血液細胞成分、他の細胞デブリ、及び塩等を微生物試料から十分に無くす必要がある。さらに、微生物試料は、信頼できる同定を達成するために十分な量のものである必要がある。表現型同定法、例えばＰｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤは、アッセイの酵素基質と干渉する可能性のある物質のない無傷の生存可能な微生物を必要とする。Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＡＳＴ等のＡＳＴ試験のためには、微生物試料は、耐性機構が存在する場合、アッセイの実行中に、抗生物質の存在下で成長できる生存可能な不変微生物を含有する必要がある。全ての方法にとって、残存血液又は培地成分のキャリーオーバーは、直接的に又は不当に微生物の濃度（混濁度）を高めることによって妨害することになるので、十分な量と純度のものであることが重要である。
生存可能な微生物をＰＢＣ試料から単離するための現在の技術は、微生物の継代を含み、７２時間までかかる可能性がある。これは治療の遅延又は不適切な抗生物質による治療をもたらす。
例えば、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等の生物の生存能を維持しながら、微生物の特定株をＰＢＣ試料から単離することは特に困難である。この困難さの一部は、肺炎球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による自己溶菌酵素の活性化に端を発し、これは微生物細胞を「自滅」させる。“Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｓｔ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｏｔｔｌｅｓ ａｓ ａｎ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ Ｔｏ Ｄｉａｇｎｏｓｅ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４３， Ｎｏ． ５， Ｍａｙ ２００５， ｐｐ． ２５１０－２５１２を参照されたい。敗血症患者から、肺炎球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含め、微生物を単離するための現在の方法は、血液培養ボトルの接種を含む。陽性シグナルが達成されたら、ＰＢＣ試料の一部が取り出されてグラム染色が行われ、別の部分を用いて微生物が継代される。継代からの微生物コロニーを用いて下流の試験、例えばＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳによる同定、表現型同定法、及びＡＳＴ試験等が行われる。
生存可能な微生物をＰＢＣ試料から単離するためのさらなる技術は、ＰＢＣ試料中の血液細胞を溶解させる溶解緩衝液を界面活性剤と共に含む液体分離法を利用することが多い。溶解後、微生物を保持しながら、溶解した血液細胞を除去することができる。しかしながら、これらの溶解緩衝液の使用は、障害し、損傷し、又は生育不能な微生物をもたらすことが多く、ＡＳＴ試験のような特定の成長に基づく同定方法を行うためには不十分である。
現在利用可能な試料処理方法及び組成物は、種々の欠陥に悩まされている。例えば（ｉ）成長に基づく同定法及びＡＳＴ法を支援するための試料処理後の、微生物細胞壁上の粗い界面活性剤の相互作用のために、不十分な生存能；（ｉｉ）微生物のパネルにわたって種菌レベルで微生物の矛盾した同定をもたらし；及び／又は（ｉｉｉ）妨害物質を含まず、かつ１つのＰＢＣ試料から複数の下流の試験、例えばＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ同定及びＡＳＴ試験の両方を可能にする生存可能な微生物をＰＢＣ試料から単離できない。
従って、迅速なＭＡＬＤＩ同定のために陽性血液培養物から微生物を単離するための効率的な血液細胞溶解薬が必要である。陽性血液培養物から現在利用可能な方法を利用して単離すると低いＭＡＬＤＩスコアをもたらす表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）のような困難な菌種の同定のための血液細胞溶解薬が必要である。
概要
本明細書では、試料の処理方法を開示する。本方法は、血液細胞と少なくとも１種の微生物とを含む試料を溶解緩衝液と接触させて処理済み試料を生成するステップであって、この溶解緩衝液は、試料中の血液細胞を溶解させる能力がある体細胞消化薬（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ａｇｅｎｔ）（ＳＤＡ）を含み、このＳＤＡは、下記式１
Figure 2023539822000002
（式中、ｘは、２～２０の整数であり、ｙは、６～１１の整数である）の化合物であり、それによって試料中の血液細胞を溶解させる、ステップ含む。一部の実施形態では、ｙは８～１０の整数である。一部の実施形態では、ｙは８である。一部の実施形態では、ｘは、５～１５の整数である。一部の実施形態では、ｘは、８～１２の整数、例えば９又は１０である。一部の実施形態では、ｘは９である。一部の実施形態では、ＳＤＡはノノキシノール－９である。
一部の実施形態では、溶解緩衝液中のＳＤＡの濃度は、約０．０１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、溶解緩衝液中のＳＤＡの濃度は、約０．０１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）である。一部の実施形態では、溶解緩衝液中のＳＤＡの濃度は、約０．０１％（ｗ／ｗ）～約１％（ｗ／ｗ）である。一部の実施形態では、溶解緩衝液中のＳＤＡの濃度は、約０．５２％（ｗ／ｗ）である。
一部の実施形態では、試料は、感染していると疑われる被験者の血液培養に由来する。一部の実施形態では、試料は、その中に少なくとも１種の微生物を含むと判定された陽性血液培養試料を含む。一部の実施形態では、少なくとも１種の微生物は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、及び酵母菌を含む群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１種の微生物は表皮ブドウ球菌（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）である。一部の実施形態では、少なくとも１種の微生物は、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、及び肺炎球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１種以上を含む。
一部の実施形態では、接触ステップは、超音波処理、浸透圧ショック、化学処理、又はこれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液は１種以上のプロテイナーゼ及び／又は１種以上のヌクレアーゼを含む。方法は、少なくとも１種の微生物を処理済み試料から単離して少なくとも１種の単離微生物を生成するステップを含むことができる。一部の実施形態では、処理済み試料から少なくとも１種の微生物を単離するステップは、溶解血液細胞から少なくとも１種の微生物を分離するステップを含む。一部の実施形態では、溶解血液細胞から少なくとも１種の微生物を分離するステップは、処理済み試料を遠心分離してペレット及び上清を生成するステップと、少なくとも１種の単離微生物を含むペレットを保持しながら上清を捨てるステップとを含む。方法は、少なくとも１種の単離微生物から平板純粋培養物（ｐｌａｔｅｄ ｐｕｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）を調製し、この平板純粋培養物から得られた微生物を分析するステップを含むことができる。方法は、少なくとも１種の単離微生物から接種材料を調製し、この接種材料から得られた少なくとも１種の微生物を分析するステップを含むことができる。
方法は、少なくとも１種の単離微生物を含むペレットの少なくとも一部を、少なくとも１種の微生物の同一性を質量分析によって判定するように構成された装置内に配置するのに適した表面上に沈着させるステップと、場合により、この沈着試料を乾燥させるステップと、この沈着試料を揮発性酸溶液で処理するステップであって、この揮発性酸の体積パーセントが、沈着試料と合わせた揮発性酸溶液の少なくとも７０％である、ステップと、場合により、この処理済み沈着試料を乾燥させるステップと、処理済み沈着試料の上にマトリックスを配置するステップと、場合により、この処理済み沈着試料を乾燥させるステップとを含むことができる。一部の実施形態では、揮発性酸溶液は、揮発性酸水溶液又は有機溶媒中の揮発性溶液である。一部の実施形態では、揮発性酸溶液は、沈着試料と合わせたときに７０％の体積パーセントのギ酸水溶液である。一部の実施形態では、揮発性酸溶液は、沈着試料と合わせたときに８０％の体積パーセントのギ酸水溶液である。一部の実施形態では、揮発性酸溶液は、沈着試料と合わせたときに９０％の体積パーセントのギ酸水溶液である。方法は、沈着試料を揮発性酸溶液で処理する前に、沈着試料を有機溶媒で処理し、この沈着試料を乾燥させるステップを含むことができる。一部の実施形態では、有機溶媒は、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、又はこれらの任意の組み合わせを含む。
方法は、試料と溶解緩衝液の接触前、接触と同時、及び／又は接触後に、試料をコリン含有溶液と接触させるステップを含むことができる。一部の実施形態では、コリン含有溶液は、下記式２から選択される、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルエタノールアンモニウムカチオンを含有する少なくとも１種の四級アンモニウム塩を含む。
Figure 2023539822000003
式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、飽和炭化水素基、不飽和炭化水素基、芳香族基、及びこれらの任意の組み合わせから成る群より選択される基を独立に表し、Ｘは負荷電基を表す。一部の実施形態では、Ｘは、塩化物、フッ化物、硝酸、及び炭酸水素を表す。一部の実施形態では、コリン含有溶液は、塩化コリンを含む。一部の実施形態では、コリン含有溶液はホスホリルコリンを含む。一部の実施形態では、試料と接触したとき、コリンの最終濃度は約０．２５体積％以上である。一部の実施形態では、試料と接触したとき、コリンの最終濃度は約１体積％以上である。一部の実施形態では、接触ステップ中の試料中のコリンの濃度は約１．８体積％である。一部の実施形態では、接触ステップ中の試料中のコリンの濃度は約４体積％である。一部の実施形態では、接触ステップ中の試料中のコリンの濃度は、約０．２５体積％～約１０体積％の範囲内である。一部の実施形態では、接触ステップは、試料をコリン含有溶液と共に最長２０分間インキュベートすることを含み、前記インキュベーションの温度は室温である。
溶解緩衝液は、さらに消泡剤を含むことができる。一部の実施形態では、溶解緩衝液は消泡剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、さらに少なくとも１種のチオールを含む。一部の実施形態では、少なくとも１種のチオールは、Ｌ－システインＨＣＬ、チオグリコール酸ナトリウム、メルカプトエチルアミン、メルカプトコハク酸、メルカプトエタノール、メルカプトエタンスルホン酸、チオグリセロール、又はこれらの任意の組み合わせを含み、場合により、溶解緩衝液中の少なくとも１種のチオールび濃度は約０．００５ｇ／Ｌ～４ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、少なくとも１種のチオールは、溶解緩衝液中約０．０１ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度のＬ－システイン、及び／又は溶解緩衝液中約０．０１ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度のチオグリコール酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液はさらに塩化アンモニウムを含み、溶解緩衝液中の塩化アンモニウムの濃度は約０．０１ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、溶解緩衝液中約８ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌの濃度のカゼインペプトン、溶解緩衝液中約２ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌの濃度の塩化ナトリウム、溶解緩衝液中約１．５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度のソイペプトン、溶解緩衝液中約０．５ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌの濃度のリン酸カリウムの１種以上と、少なくとも１種の他の栄養素とを含む栄養基剤溶液をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１種の他の栄養素は、溶解緩衝液中約１０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの濃度で栄養培地を含む。一部の実施形態では、少なくとも１種の他の栄養素は、下記：ｉ）トリプトン；ｉｉ）大豆（ｓｏｙ）；ｉｉｉ）ＮａＣｌ；ｉｖ）リン酸二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）；及びｖ）グルコースの１種以上を含む栄養培地を含む。
一部の実施形態では、溶解緩衝液は、栄養培地、等張緩衝液、ペプトン、及び塩の１種以上をさらに含み、場合により、溶解緩衝液中の栄養培地の濃度は約１０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、栄養培地はトリプチケースソイ培地を含む。一部の実施形態では、等張緩衝液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水、又はこれらの任意の組み合わせを含み、場合により、溶解緩衝液中の等張緩衝液の濃度は約１ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、ペプトンは、カゼインペプトン及び／又はソイペプトンを含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、ピルビン酸ナトリウム、酵母エキス、クエン酸ナトリウム、ミートペプトン、デキストロース、リン酸緩衝食塩水、又はこれらの任意の組み合わせをさらに含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、少なくとも１種の追加の非イオン性界面活性剤をさらに含み、場合により、少なくとも１種の追加の非イオン性界面活性剤はサポニンを含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液は追加の非イオン性界面活性剤を含まない。
方法は、少なくとも１種の微生物を同定するステップを含むことができる。一部の実施形態では、少なくとも１種の微生物の同定は、質量分析、表現型同定、抗菌薬感受性試験、分子試験、又はこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、質量分析は、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ－ＭＳ／（ＭＳ）n、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ）質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型（ｓｕｒｆａｃｅ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ）質量分析（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、シリコン上脱離イオン化（ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｉｌｉｃｏｎ）（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ－ＭＳ）、ＡＰＣＪ－ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ－（ＭＳ）n、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ－ＭＳ）、ＡＰＰＩ－ＭＳ／ＭＳ、及びＡＰＰＩ－（ＭＳ）n、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、及びイオントラップ質量分析の１つ以上を含み、ｎは、ゼロより大きい整数である。一部の実施形態では、質量分析はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを含む。
一部の実施形態では、ＳＤＡは少なくとも１種の微生物を損傷しない。例えば、少なくとも１種の微生物は、ＳＤＡの存在下で無傷及び／又は生存可能なままである。一部の実施形態では、本方法は、ＳＤＡを含まない溶解緩衝液を利用する比較方法に比べて少なくとも５％高いＭＡＬＤＩスコアをもたらす。一部の実施形態では、比較方法は、サポニンを含む溶解緩衝液を利用する。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、試料中の血液細胞の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％を選択的に溶解させる。一部の実施形態では、接触ステップ後に溶解した血液細胞と溶解した少なくとも１種の微生物の細胞の比は少なくとも約２：１である。一部の実施形態では、少なくとも１種の微生物の細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％が、接触ステップ後に無傷及び／又は生存可能なままである。
一部の実施形態では、溶解緩衝液は緩衝剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は酸性である。一部の実施形態では、少なくとも１種の微生物の同定は、分光測定、例えば、固有蛍光分光測定を含まない。一部の実施形態では、方法は密度勾配遠心分離を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液はサポニンを含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００－Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｃ－１００、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ－１００、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ ６３０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ（商標）２００、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６／９７、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ９、ポリドセノール（ｐｏｌｉｄｏｃｅｎｏｌ））、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、胆汁酸塩、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ＳＢ３－１０、ＳＢ３－１２、アミドスルホベタイン－１４、Ｃ７ＢｚＯ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９８、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ６４、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８４、非界面活性剤スルホベタイン（ＮＤＳＢ ２０１）、アンフィポール（ＰＭＡＬ－Ｃ８）、及びメチル－β－シクロデキストリンから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００－Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ ６３０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ ２００、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６／９７、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテルから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、胆汁酸塩、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ＳＢ３－１０、ＳＢ３－１２、アミドスルホベタイン－１４、Ｃ7ＢｚＯから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６Ｖ、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｃ－１００、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ－１００、及びポリドセノールから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、構造Ｃ12-18／Ｅ9-10（式中、Ｃ12-18は、１２～１８個の炭素原子の炭素鎖長を表し、Ｅ9-10は、９～１０個のオキシエチレン親水性頭部基を表す）を含むポリオキシエチレン界面活性剤を含まない。
本明細書では組成物（例えば、キット）を開示する。一部の実施形態では、組成物は、血液細胞を溶解させる能力がある体細胞消化薬（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ａｇｅｎｔ）（ＳＤＡ）を含む溶解緩衝液であって、ＳＤＡが、下記式１
Figure 2023539822000004
（式中、ｘは２～２０の整数であり、ｙは６～１１の整数である）
の化合物である、溶解緩衝液と、血液細胞及び／又はそのデブリとを含む。一部の実施形態では、ｙは８～１０の整数である。一部の実施形態では、ｙは８である。一部の実施形態では、ｘは５～１５の整数である。一部の実施形態では、ｘは８～１２の整数である。一部の実施形態では、ｘは９又は１０である。一部の実施形態では、ｘは９である。一部の実施形態では、ＳＤＡはノノキシノール－９である。
一部の実施形態では、溶解緩衝液中のＳＤＡの濃度は、約０．０１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、溶解緩衝液中のＳＤＡの濃度は、約０．０１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）、例えば、約０．０１％（ｗ／ｗ）～約１％（ｗ／ｗ）である。一部の実施形態では、溶解緩衝液中のＳＤＡの濃度は、約０．５２％（ｗ／ｗ）である。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、１種以上のプロテイナーゼ及び／又は１種以上のヌクレアーゼを含む。
一部の実施形態では、組成物は、下記式２
Figure 2023539822000005
（式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、飽和炭化水素基、不飽和炭化水素基、芳香族基、及びこれらの組み合わせから成る群より独立に選択される基を表し、Ｘは負荷電基を表す）
から成る群より選択される、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルエタノールアンモニウムカチオンを含有する少なくとも１種の四級アンモニウム塩を含むコリン含有溶液を含む。一部の実施形態では、Ｘは、塩化物、フッ化物、硝酸、及び炭酸水素から成る群より選択される。一部の実施形態では、コリン含有溶液は、塩化コリンを含む。一部の実施形態では、コリン含有溶液はホスホリルコリンを含む。
一部の実施形態では、溶解緩衝液は、さらに消泡剤を含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液は消泡剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、さらに少なくとも１種のチオールを含む。一部の実施形態では、少なくとも１種のチオールは、Ｌ－システインＨＣＬ、チオグリコール酸ナトリウム、メルカプトエチルアミン、メルカプトコハク酸、メルカプトエタノール、メルカプトエタンスルホン酸、チオグリセロール、又はこれらの任意の組み合わせを含み、場合により、溶解緩衝液中の少なくとも１種のチオールの濃度は、約０．００５ｇ／Ｌ～４ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、少なくとも１種のチオールは、溶解緩衝液中約０．０１ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度のＬ－システイン、及び／又は溶解緩衝液中約０．０１ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度のチオグリコール酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、さらに塩化アンモニウムを含み、溶解緩衝液中の塩化アンモニウムの濃度は約０．０１ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、溶解緩衝液中約８ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌの濃度のカゼインペプトン、溶解緩衝液中約２ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌの濃度の塩化ナトリウム、溶解緩衝液中約１．５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度のソイペプトン、溶解緩衝液中約０．５ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌの濃度のリン酸カリウムの１種以上と、少なくとも１種の他の栄養素とを含む栄養基剤溶液をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１種の他の栄養素は、栄養培地を約１０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの溶解緩衝液中の濃度で含む。一部の実施形態では、少なくとも１種の他の栄養素は、ｉ）トリプトン、ｉｉ）大豆、ｉｉｉ）ＮａＣｌ、ｉｖ）リン酸二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）、及びｖ）グルコースの１種以上を含む栄養培地を含む。
一部の実施形態では、溶解緩衝液は、栄養培地、等張緩衝液、ペプトン、及び塩の１種以上をさらに含み、場合により、溶解緩衝液中の栄養培地の濃度は約１０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、栄養培地はトリプチケースソイ培地を含む。一部の実施形態では、等張緩衝液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水、又はこれらの任意の組み合わせを含み、場合により、溶解緩衝液中の等張緩衝液の濃度は約１ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、ペプトンはカゼインペプトン及び／又はソイペプトンを含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、ピルビン酸ナトリウム、酵母エキス、クエン酸ナトリウム、ミートペプトン、デキストロース、リン酸緩衝食塩水、又はこれらの任意の組み合わせをさらに含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液 は、少なくとも１種の追加の非イオン性界面活性剤をさらに含み、場合により、少なくとも１種の追加の非イオン性界面活性剤はサポニンを含む。
一部の実施形態では、溶解緩衝液は、追加の非イオン性界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は緩衝剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は酸性である。一部の実施形態では、溶解緩衝液はサポニンを含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００－Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｃ－１００、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ－１００、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ ６３０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ（商標）２００、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６／９７、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ９、ポリドセノール）、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、胆汁酸塩、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ＳＢ３－１０、ＳＢ３－１２、アミドスルホベタイン－１４、Ｃ７ＢｚＯ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９８、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ６４、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８４、非界面活性剤スルホベタイン（ＮＤＳＢ ２０１）、アンフィポール（ＰＭＡＬ－Ｃ８）、及びメチル－β－シクロデキストリンから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００－Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ ６３０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ ２００、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６／９７、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテルから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、胆汁酸塩、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ＳＢ３－１０、ＳＢ３－１２、アミドスルホベタイン－１４、Ｃ7ＢｚＯから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６Ｖ、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｃ－１００、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ－１００、及びポリドセノールから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、構造Ｃ12-18／Ｅ9-10（式中、Ｃ12-18は、１２～１８個の炭素原子の炭素鎖長を表し、Ｅ9-10は、９～１０個のオキシエチレン親水性頭部基を表す）を含むポリオキシエチレン界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、少なくとも１種の微生物は、ＳＤＡの存在下で無傷のままである。一部の実施形態では、ＳＤＡは、少なくとも１種の微生物を損傷しない。
異なる溶解薬を用いて陽性血液培養物から単離された表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）についてのＭＡＬＤＩスコアに関連する例となるデータを描写する。異なる溶解薬を用いて陽性血液培養物から単離された表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）についてのＭＡＬＤＩスコアを示している。ＳＡＰはサポニンを表し、ＳＤＡは体細胞消化薬ノノキシノール－９を表す。各溶解液の濃度は０．５２％（Ｗ／Ｗ）を使用している。同定の承認のためのスコアは、Ｓｅｐｓｉｔｙｐｅｒデータベースについては１．８であり、標準データベースについては２．０である。
詳細な説明
下記詳細な説明では、説明の一部を形成する添付図面を参照する。図面において、類似記号は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、典型的に類似成分を特定する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載の例示実施形態は、限定するつもりではない。他の実施形態を利用してよく、本明細書で提示する主題の精神及び範囲を逸脱することなく、他の変更を加えてよい。本開示の態様は、本明細書に一般的に記載し、図に示すように、種々多様の異なる構成でアレンジし、置き換え、組み合わせ、分離し、デザインすることができ、これらは全て明示的に本明細書で企図され、本明細書の開示の一部とされるものであることは容易に分かるであろう。
本明細書で参照した全ての特許、公開された特許出願、他の出版物、及びＧｅｎＢａｎｋからの配列、及び他のデータベースは、関連技術に関してそれらの全てが参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書では試料の処理方法を開示する。一部の実施形態では、本方法は、血液細胞と少なくとも１種の微生物とを含む試料を溶解緩衝液と接触させて処理済み試料を生成するステップであって、溶解緩衝液は、試料中の血液細胞を溶解させる能力がある体細胞消化薬（ＳＤＡ）を含み、ＳＤＡは下記式１
Figure 2023539822000006
（式中、ｘは２～２０の整数であり、ｙは６～１１の整数である）の化合物であり、それによって試料中の血液細胞を溶解させる、ステップを含む。一部の実施形態では、ｙは８～１０の整数である。一部の実施形態では、ｙは８である。一部の実施形態では、ｘは５～１５の整数である。一部の実施形態では、ｘは８～１２の整数である。一部の実施形態では、ｘは９又は１０である。一部の実施形態では、ｘは９である。一部の実施形態では、ＳＤＡはノノキシノール－９である。
本明細書では組成物（例えば、キット）を開示する。一部の実施形態では、組成物は、血液細胞を溶解させる能力がある体細胞消化薬（ＳＤＡ）を含む溶解緩衝液であって、ＳＤＡは下記式１
Figure 2023539822000007
（式中、ｘは２～２０の整数であり、ｙは６～１１の整数である）の化合物である、溶解緩衝液と、血液細胞及び／又はそのデブリとを含む。一部の実施形態では、ｙは８～１０の整数である。一部の実施形態では、ｙは８である。一部の実施形態では、ｘは５～１５の整数である。一部の実施形態では、ｘは８～１２の整数である。一部の実施形態では、ｘは９又は１０である。一部の実施形態では、ｘは９である。一部の実施形態では、ＳＤＡはノノキシノール－９である。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術の当業者が一般的に解釈するのと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ １９８９）を参照されたい。本開示の目的で、下記用語について以下に定義する。
本明細書で使用する場合、用語「約」は、本明細書で開示する化合物又は薬剤（例えば、ＳＤＡ）の量、用量、時間、温度等のような測定可能な値に言及するとき、その通常の意味が与えらるものとし、指定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、又は±０．１％の差異をも包含するものとする。
本明細書で使用する場合、用語「微生物」は、その通常の意味が与えらるものとし、かつ一般的に単細胞であり、実験室で増殖させ、取り扱うことができる生物をも指し、限定するものではないが、グラム陽性又はグラム陰性細菌、酵母菌、カビ、寄生生物、及びモリクテス綱細菌（ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）が含まれる。グラム陰性細菌の非限定例としては、下記属の細菌が挙げられる：シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ブレブンディモナス属（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ブランハメラ属（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、ハフニア属（Ｈａｆｎｉａ）、エドワージエラ属（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、及びレジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）。グラム陽性細菌の非限定例としては、下記属の細菌が挙げられる：エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ガードネレラ属（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、コクリア属（Ｋｏｃｕｒｉａ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）。酵母菌及びカビの非限定例としては、下記属のものが挙げられる：カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びトリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）。寄生生物の非限定例としては、下記属のものが挙げられる：トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、ウケレリア属（Ｗｕｃｈｅｒｉａ）、ブルギア属（Ｂｒｕｇｉａ）、オンコセルカ属（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ）、及びネグレリア属（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）。モリクテス綱細菌の非限定例としては、下記属のものが挙げられる：マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）及びウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）。
本明細書で開示する方法及び組成物の一部の実施形態では、試料又は成長培地から得た微生物を分離し、調べて試料中に存在する微生物を特徴づけ及び／又は同定することができる。本明細書で使用する場合、用語「分離する」は、その通常の意味が与えられるものとし、その最初の状態、又は成長培地若しくは培養液から除去され、濃縮され、又は他の方法で隔離された微生物のいずれの試料をも包含するものとする。例えば、一部の実施形態では、そうしなけれは特徴づけ及び／又は同定を妨害する可能性がある非微生物又は非微生物成分から微生物を（例えば、分離試料として）分離してよい。分離微生物試料は、微生物及び／又はその成分のいずれの収集物又は層をも含むとができ、これは原試料よりもっと濃縮されるか、又は他の方法で原試料から区別され、微生物のぎっしり詰まった高密度凝集塊から微生物の拡散層まで多岐にわたり得る。分離形態又は分離試料に含まれる可能性のある微生物成分としては、任意の組み合わせの線毛、鞭毛、毛縁、及び莢膜が挙げられるが、これらに限定されない。微生物から分離される非微生物成分としては、非微生物細胞（例えば、血液細胞及び／又は他の組織細胞）及び／又はその任意の成分が挙げられる。
本明細書で開示する方法及び組成物の一部の実施形態では、試料又は成長培地から微生物を単離し、調べて試料中に存在する微生物を特徴づけ及び／又は同定することができる。本明細書で使用する場合、用語「単離された」は、通常の意味が与えられるものとし、その最初の状態、又は成長培地若しくは培養液から少なくとも部分的に精製された微生物のいずれの試料をも包含し、その中に含まれるいずれの非微生物又は非微生物成分をも包含するものとする。例えば、一部の実施形態では、微生物は、そうしないと特徴づけ及び／又は同定を妨げる可能性がある非微生物又は非微生物成分から（例えば、単離試料として）単離される。微生物から分離される非微生物成分としては、非微生物細胞（例えば、血液細胞及び／又は他の組織細胞）及び／又はその任意の成分が挙げられる。
本明細書で開示する方法及び組成物の一部の実施形態では、試料又は成長培地から得た微生物をペレット化し、調べて、試料中に存在する微生物を特徴づけ及び／又は同定することができる。本明細書で使用する場合、用語「ペレット」は、その通常の意味が与えられるものとし、圧縮するか又は沈着させて微生物の塊にされた微生物のいずれの試料をも包含するものとする。例えば、試料から得た微生物を遠心分離、又は他の技術上周知の方法によって圧縮又は沈着させて管の底で塊にすることができる。この用語は、遠心分離後の容器の底面及び／又は側面上の微生物（及び／又はその成分）の収集物を包含する。ペレットに含まれ得る微生物成分としては、限定ではないが、任意の組み合わせの線毛、鞭毛、毛縁、及び莢膜が挙げられる。一部の実施形態では、そうしなければ特徴づけ及び／又は同定を妨げる可能性がある非微生物又は非微生物成分から離して（例えば、実質的に精製された微生物ペレットとして）微生物をペレット化することができる。微生物から分離される非微生物成分としては、非微生物細胞（例えば、血液細胞及び／又は他の組織細胞）及び／又はその任意の成分が挙げられる。
溶解緩衝液及び使用方法
本明細書で開示する種々の実施形態は、表皮ブドウ球菌（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を含む試料（例えば、ＰＢＣ）から無傷及び／又は生存可能な微生物細胞を迅速に単離するための試薬及び方法を提供する。種々の開示試薬及び方法を用いて結果として得られる微生物のペレットは、妨害物質から十分に免れることができ、同定方法、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ、成長に基づく同定及びＡＳＴ法に使用することができる。これは、微生物を継代する必要なしで迅速な結果を可能にし得る。種々の実施形態によって得られる生存可能な微生物細胞の濃縮塊は、従来型又は自動システム、例えばＢＤ（商標）Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ／ＡＳＴシステムによる迅速ＩＤシステム、例えばＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ、及びＩＤ／ＡＳＴ試験（ＡＳＴ）の直接植菌に使用することができる。種々の実施形態は、他のシステム、分子試験法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び当業者に既知の方法に適用可能でもあり得る。
本明細書で開示する種々の実施形態は、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を含め、微生物細胞を陽性血液培養試料から迅速に単離するための試薬及び方法を提供する。結果として生じる微生物ペレットは、同定法及び／又は成長に基づく方法、例えば抗菌薬感受性試験に使用することができる。一部の実施形態では、開示方法は、同定方法を妨げる可能性がある哺乳動物血液細胞からの細胞デブリを除去しながら、１本だけの試料調製管及び遠心分離を利用してＰＢＣ試料から生存可能な微生物を迅速に単離及び濃縮するためのプロセスを提供する。陽性血液培養（ＰＢＣ）試料は当業者に知られ、本明細書では詳述しない方法によって得ることができる。ＰＢＣ試料は、例えば、ＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）による検出によって少なくとも１種の微生物に陽性であると判定された試料が含まれ得る。一実施形態では、微生物には、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、又は酵母菌が含まれる。一部の実施形態では、微生物は表皮ブドウ球菌（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）である。ＰＢＣ試料の開始体積は、いずれの特定の最大又は最小体積にも限定されない。
本明細書では、新規かつ効率的な血液細胞溶解界面活性剤であるＳＤＡ（体細胞消化薬）を含む方法及び組成物を提供する。一部の実施形態では、ＳＤＡは、迅速なＭＡＬＤＩ同定のために陽性血液培養物から細菌を単離するための効率的な血液細胞溶解薬である。一部の実施形態では、ＳＤＡは非イオン性界面活性剤ノノキシノール－９である。本明細書で開示する組成物及び方法の一部の実施形態では、ＳＤＡは、ＭＡＬＤＩによる迅速な同定のために陽性血液培養物からの細菌細胞の単離を容易にするように血液細胞を溶解させるための溶解緩衝液中で利用される。一部の実施形態では、ＳＤＡは、細菌細胞を損傷せすに血液細胞膜を特異的に破壊することができる。
現在利用可能な方法は、陽性血液培養物から細菌を単離するためにサポニンを利用して血液細胞を溶解させる。しかしながら、いくつかの細菌株に関するＭＡＬＤＩ同定は非常に低いスコアを有し、特に表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）については同定に至らない。この同定の失敗は、完全に溶解されない血液細胞及び／又は高含量の血液デブリが原因である可能性が高い。血液細胞を除去するための溶解緩衝液中のサポニンの代わりにＳＤＡを用いて、正確な同定で高いＭＡＬＤＩスコアが得られた（図１）。一部の実施形態では、ＳＤＡは水に非常によく溶ける。陽性血液培養物から細菌を単離するために溶解薬としてＳＤＡを用いる利点は、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）のような困難な菌種についてのＭＡＬＤＩスコアがカットオフ値より高い可能性があり、正確な菌種同定をもたらすことである。さらに、サポニンに対してＳＤＡを用いる処理時間はほとんど同一であり得る。
一部の実施形態では、試料の処理方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、血液細胞と少なくとも１種の微生物とを含む試料を溶解緩衝液と接触させて処理済み試料を生成するステップであって、溶解緩衝液は、試料中の血液細胞を溶解させる能力がある体細胞消化薬（ＳＤＡ）を含み、それによって試料中の血液細胞を溶解させるステップを含む。一部の実施形態では、組成物（例えば、キット）を提供する。一部の実施形態では、組成物は、血液細胞を溶解させる能力がある体細胞消化薬（ＳＤＡ）を含む溶解緩衝液と、血液細胞及び／又はそのデブリとを含む。一部の実施形態では、ＳＤＡは、下記式１の化合物である。
Figure 2023539822000008
一部の実施形態では、ｘは２～２０の整数である。一部の実施形態では、ｘは５～１５の整数である。一部の実施形態では、ｘは８～１２の整数である。一部の実施形態では、ｘは９又は１０である。一部の実施形態では、ｘは９である。一部の実施形態では、ｙは６～１１の整数である。一部の実施形態では、ｙは８～１０の整数である。一部の実施形態では、ｙは８である。一部の実施形態では、ＳＤＡはノノキシノール－９である。溶解緩衝液中、又は試料と組み合わせときは最終反応体積中のＳＤＡの濃度は、０．００１ｇ／Ｌ、０．００５ｇ／Ｌ、０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲であり得、或いは約０．００１ｇ／Ｌ、０．００５ｇ／Ｌ、０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲であり得、或いは少なくとも０．００１ｇ／Ｌ、０．００５ｇ／Ｌ、０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲であり得、或いは最大で０．００１ｇ／Ｌ、０．００５ｇ／Ｌ、０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲であり得る。溶解緩衝液中、又は試料と組み合わせたときは最終反応体積中のＳＤＡの濃度は、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｗ／ｗ）であり得、或いは約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｗ／ｗ）であり得、或いは少なくとも０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｗ／ｗ）であり得、或いは最大で０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｗ／ｗ）であり得る。溶解緩衝液中、又は試料と組み合わせときは最終反応体積中のＳＤＡの濃度は、約０．５２％（ｗ／ｗ）であり得る。他の実施形態では、本明細書で開示する溶解緩衝液成分の百分率は、％ｗ／ｗ、％ｍ／ｖ、％ｖ／ｖ、％ｍ／ｗ、％ｗ／ｖ、又はこれらの異形として提供している。試料と組み合わせたときはＳＤＡの最終濃度は、試料中の微生物の少なくとも一部を無傷及び／又は生存可能なままにしながら、血液細胞の少なくとも一部を溶血させる（又は別の方法で分解する）ことになる濃度でＳＤＡが使用される限りは制限されない。試料との接触時のＳＤＡの最終濃度は、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（体積で）であり得、或いは約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（体積で）であり得、或いは少なくとも０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲であり得、或いは最大で０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（体積で）であり得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の溶解緩衝液の種々の成分の濃度は、溶解緩衝液中の各成分の最終濃度を表す。一部の実施形態では、１：１体積比の試料（例えば、ＰＢＣ）が接触ステップ中に溶解緩衝液と混合されるが、他の体積比が企図される。従って、試料（例えば、ＰＢＣ）との混合時に溶解緩衝液の成分の望ましい最終濃度を達成するために溶解緩衝液とＰＢＣ試料の体積比の変化を考慮するように溶解緩衝液中の各成分の濃度を調整することができる。
本明細書に記載する、少なくとも１種の微生物を含有すると疑われる試料、例えばＰＢＣ試料から微生物を単離する方法は、種々の下流の試験方法、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳによる同定、成長に基づく表現型アッセイ及びＡＳＴ試験に使用できる生存可能な微生物のペレットを迅速に生成するように企図されたＳＤＡを含む種々の溶解緩衝液を利用することができる。一部の実施形態では、方法は、試料の一部をＳＤＡを含む溶解緩衝液に加えて混合物を形成するステップを含む。一部の実施形態では、試料とＳＤＡ含有溶解緩衝液の体積比は約１：１である。ＰＢＣ試料中の血液細胞を溶解させるための時間にわたって混合物をインキュベートすることができる。
一部の実施形態では、試料とＳＤＡ含有溶解緩衝液の体積比は、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４１、１：４２、１：４３、１：４４、１：４５、１：４６、１：４７、１：４８、１：４９、１：５０、１：５１、１：５２、１：５３、１：５４、１：５５、１：５６、１：５７、１：５８、１：５９、１：６０、１：６１、１：６２、１：６３、１：６４、１：６５、１：６６、１：６７、１：６８、１：６９、１：７０、１：７１、１：７２、１：７３、１：７４、１：７５、１：７６、１：７７、１：７８、１：７９、１：８０、１：８１、１：８２、１：８３、１：８４、１：８５、１：８６、１：８７、１：８８、１：８９、１：９０、１：９１、１：９２、１：９３、１：９４、１：９５、１：９６、１：９７、１：９８、１：９９、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、１：１００００、又はこれらの値のいずれか２つ間の数若しくは範囲であり得、或いは約１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４１、１：４２、１：４３、１：４４、１：４５、１：４６、１：４７、１：４８、１：４９、１：５０、１：５１、１：５２、１：５３、１：５４、１：５５、１：５６、１：５７、１：５８、１：５９、１：６０、１：６１、１：６２、１：６３、１：６４、１：６５、１：６６、１：６７、１：６８、１：６９、１：７０、１：７１、１：７２、１：７３、１：７４、１：７５、１：７６、１：７７、１：７８、１：７９、１：８０、１：８１、１：８２、１：８３、１：８４、１：８５、１：８６、１：８７、１：８８、１：８９、１：９０、１：９１、１：９２、１：９３、１：９４、１：９５、１：９６、１：９７、１：９８、１：９９、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、１：１００００、又はこれらの値のいずれか２つ間の数若しくは範囲であり得る。一部の実施形態では、試料とＳＤＡ含有溶解緩衝液の体積比は、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、２０００：１、３０００：１、４０００：１、５０００：１、６０００：１、７０００：１、８０００：１、９０００：１、１００００：１、又はこれらの値のいずれか２つ間の数若しくは範囲であり得、或いは約１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、２０００：１、３０００：１、４０００：１、５０００：１、６０００：１、７０００：１、８０００：１、９０００：１、１００００：１、又はこれらの値のいずれか２つ間の数若しくは範囲であり得る。
一部の実施形態では、試料は、溶解緩衝液と２回以上接触する。例えば、試料は、試料調製プロセス中に溶解緩衝液と２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回接触し得る。一部の該実施形態では、試料は、溶解緩衝液と接触し、遠心分離されてペレットを生成することができ、ペレットは、再懸濁されてから、再懸濁されたペレットは溶解緩衝液との１回以上のさらなる接触ステップを受け得る。一部の実施形態では、接触ステップは、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、１００、２００、３００、４００、５００、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（分）持続するインキュベーション時間を含む。
本明細書で提供する方法及び組成物の一部の実施形態は、血液含有培養液のような複雑な試料からの微生物の分離、特徴づけ及び／又は同定に有用である。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法は、現在利用可能な方法より速い微生物の特徴づけ及び／又は同定を可能にし、より速い診断（例えば、敗血症を有するか又は有すると疑われる被験者の）及び混入物質（例えば、食糧及び医薬品）の特徴づけ／同定をもたらす。開示方法に含まれるステップは、試料を得ることから微生物の特徴づけ／同定まで、非常に短い時間枠内で行われて、臨床関連の実用的な情報を得ることができる。特定実施形態では、開示方法は、約１２０分未満、例えば、約２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２、若しくは１分未満、又はこれらの値のいずれかの間の範囲若しくは数（分）未満で行われ得る。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法の迅速性は、現在利用可能な方法に比べた改善を意味する。開示方法を利用して、本明細書に記載のいずれの微生物をも特徴づけ及び／又は同定することができる。一部の実施形態では、開示方法を完全に自動化し、それによって感染性物質を取り扱い及び／又は試料を汚染するリスクを減らすことができる。
本明細書で開示する方法によって検査できる試料（例えば、検査試料）には、微生物の存在及び／又は成長が疑われるか又は疑われる可能性がある臨床及び非臨床の両試料のみならず、微生物の存在についてルーチン的に又は時折検査される材料の試料も含まれる。利用する試料の量は、本明細書で開示する方法の多用途性及び／又は感受性のため非常に大きく異なり得る。試料調製は、当業者に既知のいずれの数の技術によっても行えるが、開示方法の利点の１つは、ほとんど又は全く広範な前処理なしでシステムを直接利用して複雑な試料タイプ、例えば、血液、体液、及び／又は他の不透明な物質を検査できることである。一部の実施形態では、試料は培養物から採取される。一部の実施形態では、試料は微生物培養物（例えば、血液培養物）から採取される。一部の実施形態では、試料は、その中に微生物を含有すると疑われ、又は微生物を含有することが分かっている。
検査できる臨床試料には、臨床又は研究検査室で典型的に検査されるいずれのタイプの試料も含まれ、限定するものではないが、血液、血清、血漿、血液分画、滑液、尿、精液、唾液、大便、脳脊髄液、胃内容物、腟分泌物、組織ホモジネート、骨髄穿刺液、骨ホモジネート、痰、吸引液、スワブ及びスワブすすぎ液、他の体液等が挙げられる。一部の実施形態では、臨床試料は培養され、培養試料が使用される。
本明細書で開示する組成物及び方法は、研究のみならず獣医学及び医学的応用に用途を見出す。臨床試料を得ることができる適切な被験者は、一般的に哺乳動物被験者であるが、いずれの動物であってもよい。本明細書で使用する用語「哺乳動物」には、その通常の意味が与えられるものとし、限定するものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、ラット又はマウス）が挙げられる。ヒト被験者には、新生児、幼児、若年、成人及び老齢期被験者が含まれる。試料を得ることができる被験者としては、限定するものではないが、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、及び魚類が挙げられる。
検査できる非臨床試料には、限定するものではないが、食糧、飲料、医薬品、化粧品、水（例えば、飲料水、非飲料水、及び廃水）、海水バラスト、空気、土壌、下水、植物性物質（例えば、種子、葉、幹、根、花、果実）、血液産物（例えば、血小板、血清、血漿、白血球分画）、ドナー臓器又は組織試料、生物兵器試料等を包含する物質も含まれる。本明細書で開示する方法は、工業環境において汚染レベル、プロセス制御、品質制御等をモニターするためのリアルタイム検査に利用することができる。一部の実施形態では、非臨床試料は培養され、培養試料が使用される。
一部の実施形態では、試料は、細菌感染しているか又は細菌感染していると疑われる被験者（例えば、患者）から得られる。一部の実施形態では、被験者は、敗血症、例えば、細菌血症又は真菌血症にかかっているか又はかかっていると疑われる。試料は、被験者から直接得た血液試料であり得る。試料は、患者の血液の試料から成長した血液培養からのものであり得る。血液培養試料は、陽性血液培養、例えば、微生物の存在を示す血液培養からのものであり得る。一部の実施形態では、試料は、陽性血液培養から、それが陽性になった後の短い時間以内、例えば、約６時間以内、例えば約５、４、３、若しくは２時間以内、又は約６０分以内、例えば、約５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、若しくは１分以内、又はそれらの値間の範囲若しくは数以内に、採取される。一部の実施形態では、試料は、微生物が対数期増殖中である培養物から採取される。一部の実施形態では、試料は、微生物が静止期にある培養物から採取される。
開示方法の種々の実施形態は、微生物の検出、特徴づけ及び／又は同定に対して高い感受性を提供することができる。開示方法の種々の実施形態は、固形又は半固形培地上で微生物を増殖させ、増殖するコロニーをサンプリングすることによって微生物を単離するステップを最初に経る必要のない検出、特徴づけ及び／又は同定を可能にし得る。従って、一部の実施形態では、試料は、固形又は半固形表面上で増殖した微生物（例えば、細菌、酵母菌、又はカビ）のコロニーからのものでない。
一部の実施形態では、試料の体積は、本明細書で開示する方法の分離／単離ステップが行われた後に調べることができる微生物の単離試料又は微生物のペレットを生成するのに十分な大きさである。適切な体積は、試料の起源及び試料中の微生物の予測レベルによって決まる。例えば、陽性血液培養物は、汚染について検査すべき飲料水試料より高レベルの体積当たりの微生物を含有するので飲料水試料に比べて少ない体積の血液培養液が必要とされ得る。一般に、試料サイズは約５０ｍｌ未満、例えば、約４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、又は２ｍｌ、又はそれらの値間の範囲若しくは数（ｍｌ）未満であり得る。一部の実施形態では、試料サイズは、約１ｍｌ、例えば、約０．７５、０．５、若しくは０．２５ｍｌ、又はそれらの値間の範囲若しくは数（ｍｌ）であり得る。分離がマイクロスケールで行われる一部の実施形態では、試料サイズは、約２００μｌ未満（例えば、約１５０、１００、５０、２５、２０、１５、１０、若しくは５μｌ未満、又はそれらの値間の範囲若しくは数（μｌ）未満）であり得る。一部の実施形態では（例えば、試料が少数の微生物を含むと予想されるとき）、試料サイズは約１００ｍｌ以上、例えば、約２５０、５００、７５０、若しくは１０００ｍｌ以上、又はそれらの値間の範囲若しくは数（ｍｌ）以上であり得る。
試料は、感染しているか又は感染していると疑われる被験者の血液培養に由来し得る。試料は、その中に少なくとも１種の微生物を含むと判定された陽性血液培養試料を含み得る。少なくとも１種の微生物は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、及び酵母菌を含む群から選択され得る。少なくとも１種の微生物は表皮ブドウ球菌（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）であり得る。少なくとも１種の微生物はフェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、及び／又は肺炎球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり得る。接触ステップは、超音波処理、浸透圧ショック、化学処理、又はこれらの任意の組み合わせを含むことができる。溶解緩衝液は、１種以上のプロテイナーゼ及び／又は１種以上のヌクレアーゼを含み得る。方法は、少なくとも１種の微生物を処理済み試料から単離して少なくとも１種の単離微生物を生成するステップを含むことができる。少なくとも１種の微生物を処理済み試料から単離するステップは、少なくとも１種の微生物を溶解血液細胞から分離するステップを含むことができる。少なくとも１種の微生物を溶解血液細胞から分離するステップは、処理済み試料を遠心分離してペレットと上清を生成するステップと、少なくとも１種の単離微生物を含むペレットを保持しながら上清を捨てるステップとを含むことができる。方法は、少なくとも１種の単離微生物から平板純粋培養物を調製し、この平板純粋培養物から得られた微生物を分析するステップを含むことができる。方法は、少なくとも１種の単離微生物から接種材料を調製し、この接種材料から得られた少なくとも１種の微生物を分析するステップを含むことができる。試料（例えば、陽性血液培養物）からの微生物の単離及び同定のための方法、装置、組成物、及びシステムについては、参照することにより各内容全体を本明細書に援用する米国特許第１０，０５９，９７５号及び第９，１８０，４４８号に記載されている。
本明細書に記載の一部の実施形態は、参照することによりその内容全体を本明細書に援用する米国特許第９，６３１，２２１号に記載された陽性血液培養物からの微生物の迅速な処理及び同定のための組成物及び方法と共に使用することができる。この方法は、質量分析によって少なくとも１種の微生物の同一性を判定するように構成された装置内に配置するのに適した表面上に、少なくとも１種の単離微生物を含むペレットの少なくとも一部を沈着させるステップと、場合により、この沈着試料を乾燥させるステップと、沈着試料を揮発性酸溶液で処理するステップであって、揮発性酸の体積パーセントは、沈着試料と合わせた揮発性酸溶液の少なくとも７０％であり得る、ステップと、場合により、処理済み沈着試料を乾燥させるステップと、処理済み沈着試料の上にマトリックスを配置するステップと、場合により、処理済み沈着試料を乾燥させるステップとを含むことができる。揮発性酸溶液は、揮発性酸水溶液又は有機溶媒中の揮発性溶液であり得る。一部の実施形態では、揮発性酸溶液は、沈着試料と組み合わせたとき、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又はそれらの値間の範囲若しくは数（％）の体積パーセントのギ酸水溶液であり得る。方法は、沈着試料を揮発性酸溶液で処理する前に、沈着試料を有機溶媒で処理し、沈着試料を乾燥させるステップを含むことができる。有機溶媒は、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。
本明細書に記載の一部の実施形態は、参照することによりその内容全体を本明細書に援用する米国特許第８，６０３，７６９号に記載された、同定及び抗菌薬感受性試験のような下流の分析に用いるために陽性血液培養試料から生存可能な微生物細胞を迅速に単離するための種々の試薬（例えば、コリン含有溶液）及び方法と共に使用することができる。出願人は特定の理論によって束縛されることを望まないが、本明細書で開示する緩衝液の溶解成分（例えば、ＳＤＡ）の存在下で、コリン含有溶液を添加すると、微生物の自己分解を阻止し、予防し、及び／又は軽減する可能性がある。方法は、試料と溶解緩衝液の接触前、接触と同時、及び／又は接触後に、試料をコリン含有溶液と接触させるステップを含むことができる。一部の実施形態では、本明細書で開示する組成物は、さらにコリン含有溶液を含む。コリン含有溶液は、下記式２
Figure 2023539822000009
（式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、飽和炭化水素基、不飽和炭化水素基、芳香族基、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される基を独立に表し、Ｘは負荷電基を表す）
から成る群より選択される、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルエタノールアンモニウムカチオンを含有する少なくとも１種の四級アンモニウム塩を含み得る。一部の実施形態では、Ｘは、塩化物、フッ化物、硝酸、及び炭酸水素から成る群より選択される。コリン含有溶液は塩化コリンを含み得る。コリン含有溶液はホスホリルコリンを含み得る。試料と接触したとき、コリンの最終濃度は、体積で、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲であり得、或いは約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲であり得、或いは少なくとも０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲であり得、或いは最大で０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲であり得る。他の実施形態では、本明細書で開示する溶解緩衝液成分の百分率は、％ｗ／ｗ、％ｍ／ｖ、％ｖ／ｖ、％ｍ／ｗ、％ｗ／ｖ、又はこれらの異形として提供される。接触ステップ中の試料中のコリンの濃度は、体積で、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲であり得、或いは約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲であり得、或いは少なくとも０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲であり得、或いは最大で０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲であり得る。接触ステップ中の試料中のコリンの濃度は、約０．２５体積％～約１０体積％の範囲内（例えば、０．２５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又はこれらの２つの値のいずれかの間の範囲若しくは数）であり得る。接触ステップは、試料をコリン含有溶液と共に最長２０分間インキュベートするステップを含み得る。前記インキュベーションの温度は室温であり得る。
本明細書で開示する溶解緩衝液は、微生物を安定化し、溶解試薬が血液細胞を溶解させ、及び／又は妨害細胞デブリを除去するのに役立つ１種以上の成分を含み得る。本明細書に記載の一部の実施形態は、参照することによりその内容全体を本明細書に援用する米国特許第１０，５１９，４８２号に記載された、陽性血液培養試料から生存可能な微生物細胞を迅速に単離するための種々の試薬及び方法と共に使用することができる。溶解緩衝液は消泡剤を含み得る。一部の実施形態では、溶解緩衝液は消泡剤を含まない。溶解緩衝液は少なくとも１種のチオールを含み得る。少なくとも１種のチオールは、Ｌ－システインＨＣＬ、チオグリコール酸ナトリウム、メルカプトエチルアミン、メルカプトコハク酸、メルカプトエタノール、メルカプトエタンスルホン酸、チオグリセロール、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。溶解緩衝液中の少なくとも１種のチオールの濃度は、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは約０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは最大で０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得る。少なくとも１種のチオールはＬ－システイン及び／又はチオグリコール酸ナトリウムを含み得る。溶解緩衝液中のＬ－システイン及び／又はチオグリコール酸ナトリウムの濃度は、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは約０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは最大で０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得る。溶解緩衝液は塩化アンモニウムを含み得る。溶解緩衝液中の塩化アンモニウムの濃度は、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは約０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは最大で０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得る。
溶解緩衝液は、溶解緩衝液中約８ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌの濃度のカゼインペプトン、溶解緩衝液中約２ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌの濃度の塩化ナトリウム、溶解緩衝液中約１．５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度のソイペプトン、溶解緩衝液中約０．５ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌの濃度のリン酸カリウムの１種以上と、少なくとも１種の他の栄養素とを含む栄養基剤溶液を含み得る。少なくとも１種の他の栄養素は栄養培地を含み得る。溶解緩衝液中の栄養培地の濃度は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得る。少なくとも１種の他の栄養素は、ｉ）トリプトン、ｉｉ）大豆、ｉｉｉ）ＮａＣｌ、ｉｖ）リン酸二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）、及びｖ）グルコースの１つ以上を含む栄養培地を含み得る。溶解緩衝液は、栄養培地、等張緩衝液、ペプトン、及び塩の１つ以上を含み得る。栄養培地はトリプチケースソイ培地を含み得る。等張緩衝液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。溶解緩衝液中の等張緩衝液の濃度は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得、或いは最大で０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（ｇ／Ｌ）であり得る。ペプトンはカゼインペプトン及び／又はソイペプトンを含み得る。溶解緩衝液はピルビン酸ナトリウム、酵母エキス、クエン酸ナトリウム、ミートペプトン、デキストロース、リン酸緩衝食塩水、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、溶解緩衝液は少なくとも１種の追加の非イオン性界面活性剤（例えば、サポニン）を含み得る。一部の実施形態では、溶解緩衝液は追加の非イオン性界面活性剤を含まない。
方法は、少なくとも１種の微生物を同定するステップを含むことができる。少なくとも１種の微生物の同定ステップは、質量分析、表現型同定、抗菌薬感受性試験、分子試験、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。質量分析は、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ－ＭＳ／（ＭＳ）n、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、シリコン上脱離イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ－ＭＳ）、ＡＰＣＪ－ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ－（ＭＳ）n、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ－ＭＳ）、ＡＰＰＩ－ＭＳ／ＭＳ、及びＡＰＰＩ－（ＭＳ）n、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、及びイオントラップ質量分析の１つ以上を含むことができ、ｎは、ゼロより大きい整数である。質量分析はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを含み得る。
一部の実施形態では、ＳＤＡは少なくとも１種の微生物を損傷しない。少なくとも１種の微生物は、ＳＤＡの存在下で無傷のままであり得る。一部の実施形態では、方法は、ＳＤＡを含まない溶解緩衝液を利用する比較方法に比べて、少なくとも１％（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％、６０００％、７０００％、８０００％、９０００％、１００００％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲）高いＭＡＬＤＩスコアをもたらす。一部の実施形態では、比較方法は、サポニンを含む溶解緩衝液を利用する。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、試料中の血液細胞の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又はこれらの値のいずれかの間の数若しくは範囲（％）を選択的に溶解させる。一部の実施形態では、接触ステップ後に溶解した血液細胞と溶解した少なくとも１種の微生物の細胞の比は、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、２０００：１、３０００：１、４０００：１、５０００：１、６０００：１、７０００：１、８０００：１、９０００：１、１００００：１、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であり得、或いは約１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、２０００：１、３０００：１、４０００：１、５０００：１、６０００：１、７０００：１、８０００：１、９０００：１、１００００：１、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であり得る。一部の実施形態では、接触ステップ後に溶解した血液細胞と溶解した少なくとも１種の微生物の細胞の比は、少なくとも１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、２０００：１、３０００：１、４０００：１、５０００：１、６０００：１、７０００：１、８０００：１、９０００：１、又は１００００：１であり得、或いは最大で１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、２０００：１、３０００：１、４０００：１、５０００：１、６０００：１、７０００：１、８０００：１、９０００：１、又は１００００：１であり得る。一部の実施形態では、少なくとも１種の微生物の細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％は、接触ステップ後に無傷及び／又は生存可能なままである。
本明細書に記載の種々の実施形態の結果として生じる生存可能及び／又は無傷の微生物ペレットは、質量分析による同定、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ同定、表現型の成長に基づく同定、例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ、及びＡＳＴ試験、例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＡＳＴ試験を含めた種々の下流の試験方法のための共通試料を調製するために使用することができる。さらに、複数の管間の試料の移動を必要とせずに１つの試料管内で方法全体を行うことができる。従って、本明細書に記載の方法は、自動システムに容易に適応可能であり得る。
より多いＰＢＣ試料体積、複数アリコートのＰＢＣ試料、複数スピン等のような技術を配備して、開始体積中の微生物の数を増やして収率を改善することができる。さらに、これらの方法は迅速な試料調製方法を提供し、容易に自動化される。さらに、本明細書に記載の方法及び緩衝液は、血液細胞を溶解にさらし、ＰＢＣ試料から妨害物質を除去し、高収率の生存可能な微生物をもたらす。一実施形態では、生存可能な微生物ペレットの収率は、ＰＢＣ試料の開始体積を増やすことによって及び／又は１つのＰＢＣ試料からいくつかのアリコートについて単離方法を実施し、結果として生じた微生物ペレットを組み合わせて１つの試料にするとによって高めることができる。
一実施形態では、単離微生物は、下流の試験のための調製で処理される。これには、例えば、単離微生物の少なくとも一部を流体、例えば、水、ＯＧ、ＢＤ Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ培地、又は非イオン性界面活性剤に再懸濁させることが含まれる。一実施形態では、単離微生物は、単離微生物ペレットを溶液に再懸濁させ、再懸濁ペレットの一部をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳプレート上に沈着させることによって、又は最初に溶液にペレットを再懸濁させることなく単離微生物の一部をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳプレート上に直接沈着させることによって、質量分析による同定のために調製される。別の実施形態では、単離微生物ペレットは、単離微生物ペレットを溶液に再懸濁させ、この懸濁液を特定濃度の約０．５マクファーランド標準液（ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ）に調整することによってＢＤ Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ／ＡＳＴ試験のために調製される。下流の分析のために単離微生物を調製するためのさらなる方法は当業者に知られており、本明細書では詳述しない。
単離微生物は、微生物の同定（例えば、質量分析、表現型又は分子同定法等）及びＡＳＴ試験を含めた複数の下流の分析のために使用することができる。ＡＳＴ法は、ＢＤ Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ／ＡＳＴ、ディスク拡散法（Ｓｅｎｓｉ－Ｄｉｓｃ）、寒天希釈、及びマイクロ／マクロチューブ希釈法を含め、技術上周知の多くのマニュアル及び自動ＡＳＴシステムに適用可能である。同定方法及びＡＳＴ試験は当業者に周知であり、本明細書には詳述しない。さらなる下流の試験としては、例えば、酵素反応、生化学反応、様々な分子若しくは表現型同定システム、及び／又は成長に基づく同定スキームを利用する様々な表現型同定システム又は方法も挙げられる。それらを利用して、特定の抗菌薬及びクラスからの細菌分離株の保護を与える耐性マーカーを検出してもよい。
本明細書に記載の種々の方法としてはさらに、単離微生物からの平板純粋培養又は単一接種材料の調製が挙げられる。平板純粋培養又は接種材料の調製方法は当業者に知られている。さらなる下流の試験が必要とされる場合に、平板純粋培養又は接種材料を調製して十分な量の試料を得ることができる。
開示方法によって得られた単離（例えば、ペレット化）微生物の一部を用いてＢＤ Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ培地（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）に接種することができる。接種材料の一部を用いてＢＤ Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ／ＡＳＴパネル（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）のＡＳＴ部分に接種することができる。ＢＤ Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ／ＡＳＴシステムは、参照することによりそれらの内容全体を本明細書に援用する、例えば、米国特許第５，９２２，５９３号、第６，０９６，２７２号、第６，３７２，４８５号、第６，８４９，４２２号、及び第７，１１５，３８４号に記載されている。
一部の実施形態では、溶解緩衝液は緩衝剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は酸性である。一部の実施形態では、少なくとも１種の微生物の同定は分光測定（例えば、固有蛍光分光測定）を含まない。一部の実施形態では、方法は密度勾配遠心分離を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液はサポニンを含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００－Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｃ－１００、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ－１００、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ ６３０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ（商標）２００、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６／９７、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ９、ポリドセノール）、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、胆汁酸塩、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ＳＢ３－１０、ＳＢ３－１２、アミドスルホベタイン－１４、Ｃ７ＢｚＯ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９８、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ６４、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８４、非界面活性剤スルホベタイン（ＮＤＳＢ ２０１）、アンフィポール（ＰＭＡＬ－Ｃ８）、及びメチル－β－シクロデキストリンから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００－Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ ６３０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ ２００、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６／９７、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテルから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、胆汁酸塩、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ＳＢ３－１０、ＳＢ３－１２、アミドスルホベタイン－１４、Ｃ7ＢｚＯから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６Ｖ、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｃ－１００、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ－１００、及びポリドセノールから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤を含まない。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、構造Ｃ12-18／Ｅ9-10（式中、Ｃ12-18は、１２～１８個の炭素原子の炭素鎖長を表し、Ｅ9-10は、９～１０個のオキシエチレン親水性頭部基を表す）を含むポリオキシエチレン界面活性剤を含まない。
実施例
上記実施形態のいくつかの態様について、本開示の範囲を決して限定する意図ではない下記実施例でさらに詳細に開示する。
実施例１
異なる溶解薬を用いて陽性血液培養物から単離された表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）についてのＭＡＬＤＩスコア
この例は、本明細書で提供する試料処理方法及び組成物を利用して陽性血液培養物から単離された表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の同定を実証する。図１は、異なる溶解薬、すなわちサポニン（ＳＡＰ）、ノノキシノール－９（体細胞消化薬（ＳＤＡ））、及びその組み合わせを用いて陽性血液培養物から単離された表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）についてのＭＡＬＤＩスコアに関する例となるデータを示す。各溶解薬の濃度は０．５２％（ｗ／ｗ）で用いた。同定が承認されるためのスコアは、Ｓｅｐｓｉｔｙｐｅｒデータベースについては１．８以上であり、標準データベースについては２．０以上である。驚いたことに、溶解緩衝液にＳＤＡを使用すると、より高いＭＡＬＤＩスコア及び正確な同定を達成した。現在用いられている溶解薬であるサポニンを使用すると、より低いＭＡＬＤＩが得られた。ＳＤＡは一般的に、アクロソームの膜及び精子の中片部内で脂質と相互作用することによる殺精子薬として使用される。ＳＤＡは一般的に殺精子薬として使用されるとはいえ、驚いたことにＳＤＡは血液細胞を非常に効率的に溶解できることが分かった。
前述の実施形態の少なくともいくつかにおいては、ある実施形態で用いる１つ以上の要素を別の実施形態で互換的に使用できるが、該交換が技術的に実行可能な場合に限る。請求項に係る主題の範囲を逸脱することなく、上記方法及び構造に種々の他の省略、追加及び修正を行えてよいことが当業者なら分かるであろう。全てのこのような修正及び変更は、添付の特許請求の範囲によって定義される主題の範囲内に入るものとする。
本明細書における実質的にいずれの複数及び／又は単数の用語の使用に関しても、当業者は、文脈及び／又は適用に妥当なように、複数から単数に及び／又は単数から複数に置き換えることができる。本明細書では分かりやすくするために種々の単数／複数の順列を明示的に示すことがある。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上明白に他の意味に解すべき場合を除き、複数の言及が含まれる。本明細書における「又は」へのいずれの言及も、特に明記しない限り「及び／又は」を包含する意図である。
一般に、本明細書、及び特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）で使用する用語は、一般的に「非限定な（ｏｐｅｎ）」用語（例えば、用語「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は「含まれるが限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」と解釈すべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は「少なくとも有する（ｈａｖｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」と解釈すべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は「含むが限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」と解釈すべきである等）であることを当業者なら理解するであろう。さらに、特定数の導入請求項列挙が意図される場合、該意図は明示的に請求項に記載され、該列挙の非存在下では該意図は存在しないことを当業者なら理解するであろう。例えば、理解を助けるものとして、以下に添付する特許請求の範囲は、請求項列挙を導入するために前置き句「少なくとも１つ」及び「１つ以上）」という用法を含むことがある。しかしながら、該句の使用は、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による請求項列挙の導入が、該導入請求項列挙を含むいずれかの特定の請求項を、同請求項が前置き句「１つ以上」又は「少なくとも１つ」及び不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」を含むときでさえ、１つの該列挙のみを含む実施形態に限定する意味であると解釈すべきでなく（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」は、「少なくとも１つ」又は「１つ以上」を意味すると解釈すべきである）；請求項列挙を導入するために用いられる定冠詞の使用についても同じことが言える。さらに、たとえ特定数の導入請求項列挙が明示的に記載されていても、該列挙は少なくとも列挙数を意味する（例えば、他の修飾詞のない「２つの列挙」という最小限の（ｂａｒｅ）列挙は、少なくとも２つの列挙、又は２つ以上の列挙を意味する）と解釈すべきであると当業者なら認識するであろう。さらに、「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つ等」に類似の慣例が使用される場合、一般に該構成は、当業者がその慣例を解釈する意味に意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つを有するシステム」には、限定するものではないが、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ一緒に、ＡとＣ一緒に、ＢとＣ一緒に、及び／又はＡとＢとＣ一緒に有するシステムが含まれることになる等）。「Ａ、Ｂ、又はＣの少なくとも１つ等」に類似の慣例が使用される場合、一般に該構成は、当業者がその慣例を解釈する意味に意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣの少なくとも１つを有するシステム」には、限定するものではないが、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ一緒に、ＡとＣ一緒に、ＢとＣ一緒に、及び／又はＡとＢとＣ一緒に有するシステムが含まれることになる等）。さらに、明細書、請求項、又は図面のいずれであれ、実際上、２つ以上の代替用語を表すいずれの離接的単語及び／又は句もそれらの用語の１つ、それらの用語のどちらか、又は両用語を含む可能性を企図すると理解すべきであることが当業者なら分かるであろう。
さらに、開示の特徴又は態様がマーカッシュ群に関して記載される場合、結果として、その開示は、マーカッシュ群のいずれの個々のメンバー又はメンバーのサブグループに関しても記載されているものと当業者なら認めるであろう。
当業者なら理解するように、書面による明細を提供するという観点のようないずれの全ての目的についても、ここで開示する全ての範囲は、いずれの全ての可能な部分範囲及びその部分範囲の組み合わせをも包含する。いずれの記載された範囲も少なくとも等価な半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１等に分解される同範囲を十分に表し、可能にするように容易に認識することができる。非限定例として、ここに記載の各範囲は、下部３分の１、中部３分の１及び上部３分の１等に容易に分解することができる。また、当業者なら分かるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より少ない」等の全ての言語は、列挙した数を含み、かつ引き続き上記部分範囲に分解され得る範囲を指す。最後に、当業者なら分かるように、範囲は、それぞれ個々のメンバーを包含する。従って、例えば、１～３個の項目を有する群は、１、２、又は３個の項目を有する群を指す。同様に、１～５個の項目を有する群は、１、２、３、４、又は５個の項目を有する群を指す等である。
本明細書では種々の態様及び実施形態について開示したが、当業者には他の態様及び実施形態が明白であろう。本明細書で開示した種々の態様及び実施形態は、説明のためであり、限定する意図ではなく、下記特許請求の範囲によって真の範囲及び精神が示される。

Claims (84)

  1. 血液細胞と少なくとも１種の微生物とを含む試料を溶解緩衝液と接触させて処理済み試料を生成するステップであって、前記溶解緩衝液は、前記試料中の血液細胞を溶解させる能力がある体細胞消化薬（ＳＤＡ）を含み、前記ＳＤＡは、下記式１
    Figure 2023539822000010
     （式中、ｘは２～２０の整数であり、ｙは６～１１の整数である）の化合物であり、
    それによって前記試料中の血液細胞を溶解させる、ステップ
    を含む、試料の処理方法。
  2. ｙが、８～１０の整数であり、場合によりｙが８である、請求項１に記載の方法。
  3. ｘが、５～１５の整数であり、場合によりｘが、８～１２の整数であり、さらに場合によりｘが９又は１０である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  4. 前記ＳＤＡが、ノノキシノール－９である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記溶解緩衝液中の前記ＳＤＡの濃度が、約０．０１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記溶解緩衝液中の前記ＳＤＡの濃度が、約０．０１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）、場合により約０．０１％（ｗ／ｗ）～約１％（ｗ／ｗ）、さらに場合により約０．５２％（ｗ／ｗ）である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記試料が、感染していると疑われる被験者の血液培養に由来する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記試料が、その中に少なくとも１種の微生物を含むと判定された陽性血液培養試料を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記少なくとも１種の微生物が、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び酵母菌を含む群から選択され、場合により前記少なくとも１種の微生物が、表皮ブドウ球菌（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、及び肺炎球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１種以上を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記接触ステップが、超音波処理、浸透圧ショック、化学処理、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記溶解緩衝液が、１種以上のプロテイナーゼ及び／又は１種以上のヌクレアーゼを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１種の微生物を前記処理済み試料から単離して少なくとも１種の単離微生物を生成するステップを含み、場合により前記少なくとも１種の微生物を前記処理済み試料から単離するステップが、前記少なくとも１種の微生物を溶解血液細胞から分離するステップを含み、さらに場合により前記少なくとも１種の微生物を溶解血液細胞から分離するステップが、
    前記処理済み試料を遠心分離してペレット及び上清を生成するステップと、
    少なくとも１種の単離微生物を含む前記ペレットを保持しながら前記上清を捨てるステップとを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記少なくとも１種の単離微生物から平板純粋培養物を調製し、前記平板純粋培養物から得られた前記微生物を分析するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記少なくとも１種の単離微生物から接種材料を調製し、前記接種材料から得られた前記少なくとも１種の微生物を分析するステップをさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 少なくとも１種の単離微生物を含む前記ペレットの少なくとも一部を、前記少なくとも１種の微生物の同一性を質量分析によって判定するように構成された装置内に配置するのに適した表面上に沈着させるステップと、
    場合により、この沈着試料を乾燥させるステップと、
    前記沈着試料を揮発性酸溶液で処理するステップであって、前記揮発性酸溶液の体積パーセントが、前記沈着試料と合わせた前記揮発性酸溶液の少なくとも７０％である、ステップと、
    場合により、この処理済み沈着試料を乾燥させるステップと、
    前記処理済み沈着試料の上にマトリックスを配置するステップと、
    場合により、この処理済み沈着試料を乾燥させるステップと
    をさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記揮発性酸溶液が、揮発性酸水溶液又は有機溶媒中の揮発性溶液であり、場合により前記有機溶媒が、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記揮発性酸溶液が、前記沈着試料と合わせたときに約７０％～約９０％の体積パーセントのギ酸水溶液である、請求項１５～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記沈着試料を揮発性酸溶液で処理する前に、前記沈着試料を有機溶媒で処理し、この沈着試料を乾燥させるステップをさらに含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記試料と前記溶解緩衝液の接触前、接触と同時、及び／又は接触後に前記試料をコリン含有溶液と接触させるステップをさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記コリン含有溶液が、下記式２
    Figure 2023539822000011
     （式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、飽和炭化水素基、不飽和炭化水素基、芳香族基、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される基を独立に表し、Ｘは負荷電基を表す）
    から成る群より選択される、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルエタノールアンモニウムカチオンを含有する少なくとも１種の四級アンモニウム塩を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. Ｘが、塩化物、フッ化物、硝酸、及び炭酸水素から成る群より選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記コリン含有溶液が、塩化コリン、ホスホリルコリン、又は両方を含む、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記試料と接触したとき、コリンの最終濃度が、約０．２５体積％又は約１体積％以上である、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記接触ステップ中の前記試料中のコリンの濃度が、約０．２５体積％～約１０体積％、場合により約１．８体積％で～約４体積％の範囲内である、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記接触ステップが、前記試料を前記コリン含有溶液と共に最長２０分間インキュベートすることを含み、前記インキュベーションの温度は室温である、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記溶解緩衝液がさらに消泡剤を含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記溶解緩衝液が消泡剤を含まない、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記溶解緩衝液がさらに少なくとも１種のチオールを含み、場合により前記少なくとも１種のチオールがＬ－システインＨＣＬ、チオグリコール酸ナトリウム、メルカプトエチルアミン、メルカプトコハク酸、メルカプトエタノール、メルカプトエタンスルホン酸、チオグリセロール、又はこれらの任意の組み合わせを含み、さらに場合により前記溶解緩衝液中の前記少なくとも１種のチオールの濃度が約０．００５ｇ／Ｌ～４ｇ／Ｌである、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記少なくとも１種のチオールが、前記溶解緩衝液中約０．０１ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度のＬ－システイン、及び／又は前記溶解緩衝液中約０．０１ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度のチオグリコール酸ナトリウムを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記溶解緩衝液がさらに塩化アンモニウムを含み、前記溶解緩衝液中の塩化アンモニウムの濃度が約０．０１ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌである、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記溶解緩衝液が、前記溶解緩衝液中約８ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌの濃度のカゼインペプトン、前記溶解緩衝液中約２ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌの濃度の塩化ナトリウム、前記溶解緩衝液中約１．５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度のソイペプトン、前記溶解緩衝液中約０．５ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌの濃度のリン酸カリウムの１種以上と、少なくとも１種の他の栄養素とを含む栄養基剤溶液をさらに含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記少なくとも１種の他の栄養素が、前記溶解緩衝液中約１０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの濃度で栄養培地を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記少なくとも１種の他の栄養素が、ｉ）トリプトン、ｉｉ）大豆、ｉｉｉ）ＮａＣｌ、ｉｖ）リン酸二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）、及びｖ）グルコースの１種以上を含む栄養培地を含む、請求項３１～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記溶解緩衝液が、栄養培地、等張緩衝液、ペプトン、及び塩の１種以上をさらに含み、場合により前記溶解緩衝液中の前記栄養培地の濃度が約１０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌである、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記栄養培地がトリプチケースソイ培地を含む、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記等張緩衝液が、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水、又はこれらの任意の組み合わせを含み、場合により前記溶解緩衝液中の等張緩衝液の濃度が約１ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌである、請求項３４～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記ペプトンがカゼインペプトン及び／又はソイペプトンを含む、請求項３４～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記溶解緩衝液が、ピルビン酸ナトリウム、酵母エキス、クエン酸ナトリウム、ミートペプトン、デキストロース、リン酸緩衝食塩水、又はこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記溶解緩衝液が、少なくとも１種の追加の非イオン性界面活性剤をさらに含み、場合により前記少なくとも１種の追加の非イオン性界面活性剤がサポニンを含む、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記溶解緩衝液が追加の非イオン性界面活性剤を含まない、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記少なくとも１種の微生物を同定するステップをさらに含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記少なくとも１種の微生物の同定が、質量分析、表現型の同定、抗菌薬感受性試験、分子試験、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 質量分析が、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ－ＭＳ／（ＭＳ）n、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、シリコン上脱離イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ－ＭＳ）、ＡＰＣＪ－ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ－（ＭＳ）n、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ－ＭＳ）、ＡＰＰＩ－ＭＳ／ＭＳ、及びＡＰＰＩ－（ＭＳ）n、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、及びイオントラップ質量分析の１つ以上を含み、ｎは、ゼロより大きい整数である、請求項１５～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記ＳＤＡが、前記少なくとも１種の微生物を損傷しない、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記少なくとも１種の微生物が、前記ＳＤＡの存在下で無傷のままである、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記方法が、前記ＳＤＡを含まない溶解緩衝液を利用する比較方法に比べて、少なくとも５％高いＭＡＬＤＩスコアをもたらす、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記比較方法が、サポニンを含む溶解緩衝液を利用する、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記溶解緩衝液が、前記試料中の前記血液細胞の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％を選択的に溶解させる、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記接触ステップ後に溶解した血液細胞と溶解した前記少なくとも１種の微生物の細胞の比が少なくとも約２：１である、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記接触ステップ後に、前記少なくとも１種の微生物の細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％が無傷及び／又は生存可能なままである、請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記溶解緩衝液が緩衝剤を含まない、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記溶解緩衝液が酸性である、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記少なくとも１種の微生物の同定が分光測定を含まず、場合により前記分光測定は固有蛍光分光測定である、請求項４１～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記方法が、密度勾配遠心分離を含まない、請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記溶解緩衝液が、
    （ａ）サポニン；
    （ｂ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００－Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｃ－１００、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ－１００、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ ６３０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ（商標）２００、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６／９７、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ９、ポリドセノール）、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、胆汁酸塩、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ＳＢ３－１０、ＳＢ３－１２、アミドスルホベタイン－１４、Ｃ７ＢｚＯ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９８、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ６４、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８４、非界面活性剤スルホベタイン（ＮＤＳＢ ２０１）、アンフィポール（ＰＭＡＬ－Ｃ８）、及びメチル－β－シクロデキストリンから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤；
    （ｃ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００－Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ ６３０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ ２００、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６／９７、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテルから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤；
    （ｄ）ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、胆汁酸塩、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ＳＢ３－１０、ＳＢ３－１２、アミドスルホベタイン－１４、Ｃ7ＢｚＯから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤；
    （ｅ）Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６Ｖ、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｃ－１００、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ－１００、及びポリドセノールから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤；及び／又は
    （ｆ）構造Ｃ12-18／Ｅ9-10（式中、Ｃ12-18は、１２～１８個の炭素原子の炭素鎖長を表し、Ｅ9-10は、９～１０個のオキシエチレン親水性頭部基を表す）を含むポリオキシエチレン界面活性剤
    を含まない、請求項１～５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 血液細胞を溶解させる能力がある体細胞消化薬（ＳＤＡ）を含む溶解緩衝液であって、前記ＳＤＡが下記式１
    Figure 2023539822000012
     （式中、ｘは、２～２０の整数であり、ｙは、６～１１の整数である）の化合物である、溶解緩衝液と、
    血液細胞及び／又はそのデブリと
    を含む組成物。
  57. ｙが、８～１０の整数であり、場合によりｙが８である、請求項５６に記載の組成物。
  58. ｘが、５～１５の整数であり、場合によりｘが、８～１２の整数であり、さらに場合によりｘが９又は１０である、請求項５６～５７のいずれか１項に記載の組成物。
  59. 前記ＳＤＡが、ノノキシノール－９である、請求項５６に記載の組成物。
  60. 前記溶解緩衝液中の前記ＳＤＡの濃度が、約０．０１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌである、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の組成物。
  61. 前記溶解緩衝液中の前記ＳＤＡの濃度が、約０．０１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）、場合により約０．０１％（ｗ／ｗ）～約１％（ｗ／ｗ）、さらに場合により約０．５２％（ｗ／ｗ）である、請求項５６～６０のいずれか１項に記載の組成物。
  62. 前記溶解緩衝液が、１種以上のプロテイナーゼ及び／又は１種以上のヌクレアーゼを含む、請求項５６～６１のいずれか１項に記載の組成物。
  63. 下記式２
    Figure 2023539822000013
     （式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、飽和炭化水素基、不飽和炭化水素基、芳香族基、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される基を独立に表し、Ｘは負荷電基を表す）
    から成る群より選択される、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルエタノールアンモニウムカチオンを含有する少なくとも１種の四級アンモニウム塩を含むコリン含有溶液をさらに含む、
    請求項５６～６２のいずれか１項に記載の組成物。
  64. Ｘが、塩化物、フッ化物、硝酸、及び炭酸水素から成る群より選択される、請求項６３に記載の組成物。
  65. 前記コリン含有溶液が、塩化コリン、ホスホリルコリン、又は両方を含む、請求項６３～６４のいずれか１項に記載の組成物。
  66. 前記溶解緩衝液が、さらに消泡剤を含む、請求項５６～６５のいずれか１項に記載の組成物。
  67. 前記溶解緩衝液が消泡剤を含まない、請求項５６～６６のいずれか１項に記載の組成物。
  68. 前記溶解緩衝液がさらに少なくとも１種のチオールを含み、場合により前記少なくとも１種のチオールがＬ－システインＨＣＬ、チオグリコール酸ナトリウム、メルカプトエチルアミン、メルカプトコハク酸、メルカプトエタノール、メルカプトエタンスルホン酸、チオグリセロール、又はこれらの任意の組み合わせを含み、さらに場合により前記溶解緩衝液中の前記少なくとも１種のチオールの濃度が約０．００５ｇ／Ｌ～４ｇ／Ｌである、請求項５６～６７のいずれか１項に記載の組成物。
  69. 前記少なくとも１種のチオールが、前記溶解緩衝液中約０．０１ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度のＬ－システイン、及び／又は前記溶解緩衝液中約０．０１ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度のチオグリコール酸ナトリウムを含む、請求項６８に記載の組成物。
  70. 前記溶解緩衝液がさらに塩化アンモニウムを含み、前記溶解緩衝液中の塩化アンモニウムの濃度が、約０．０１ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌである、請求項５６～６９のいずれか１項に記載の組成物。
  71. 前記溶解緩衝液が、前記溶解緩衝液中約８ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌの濃度のカゼインペプトン、前記溶解緩衝液中約２ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌの濃度の塩化ナトリウム、前記溶解緩衝液中約１．５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度のソイペプトン、前記溶解緩衝液中約０．５ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌの濃度のリン酸カリウムの１種以上と、少なくとも１種の他の栄養素とを含む栄養基剤溶液をさらに含む、請求項５６～７０のいずれか１項に記載の組成物。
  72. 前記少なくとも１種の他の栄養素が、前記溶解緩衝液中約１０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの濃度で栄養培地を含む、請求項７１に記載の組成物。
  73. 前記少なくとも１種の他の栄養素が、ｉ）トリプトン、ｉｉ）大豆、ｉｉｉ）ＮａＣｌ、ｉｖ）リン酸二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）、及びｖ）グルコースの１種以上を含む栄養培地を含む、請求項７１～７２のいずれか１項に記載の組成物。
  74. 前記溶解緩衝液が、栄養培地、等張緩衝液、ペプトン、及び塩の１種以上をさらに含み、場合により前記溶解緩衝液中の前記栄養培地の濃度が約１０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌであり、さらに場合より前記栄養培地がトリプチケースソイ培地を含む、請求項５６～７３のいずれか１項に記載の組成物。
  75. 前記等張緩衝液が、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水、又はこれらの任意の組み合わせを含み、場合により前記溶解緩衝液中の等張緩衝液の濃度が約１ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌである、請求項７４に記載の組成物。
  76. 前記ペプトンがカゼインペプトン及び／又はソイペプトンを含む、請求項５６～７５のいずれか１項に記載の組成物。
  77. 前記溶解緩衝液が、ピルビン酸ナトリウム、酵母エキス、クエン酸ナトリウム、ミートペプトン、デキストロース、リン酸緩衝食塩水、又はこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項５６～７６のいずれか１項に記載の組成物。
  78. 前記溶解緩衝液が少なくとも１種の追加の非イオン性界面活性剤をさらに含み、場合により前記少なくとも１種の追加の非イオン性界面活性剤がサポニンを含む、請求項５６～７７のいずれか１項に記載の組成物。
  79. 前記溶解緩衝液が追加の非イオン性界面活性剤を含まない、請求項５６～７７のいずれか１項に記載の組成物。
  80. 前記溶解緩衝液が緩衝剤を含まない、請求項５６～７９のいずれか１項に記載の組成物。
  81. 前記溶解緩衝液が酸性である、請求項５６～８０のいずれか１項に記載の組成物。
  82. 前記溶解緩衝液が、
    （ａ）サポニン；
    （ｂ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００－Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｃ－１００、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ－１００、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ ６３０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ（商標）２００、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６／９７、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ９、ポリドセノール）、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、胆汁酸塩、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ＳＢ３－１０、ＳＢ３－１２、アミドスルホベタイン－１４、Ｃ７ＢｚＯ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９８、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ６４、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８４、非界面活性剤スルホベタイン（ＮＤＳＢ ２０１）、アンフィポール（ＰＭＡＬ－Ｃ８）、及びメチル－β－シクロデキストリンから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤；
    （ｃ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００－Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ ６３０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ ２００、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６／９７、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテルから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤；
    （ｄ）ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、胆汁酸塩、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ＳＢ３－１０、ＳＢ３－１２、アミドスルホベタイン－１４、Ｃ7ＢｚＯから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤；
    （ｅ）Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６Ｖ、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｃ－１００、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ－１００、及びポリドセノールから成る群より選択される１つ又は複数の界面活性剤；及び／又は
    （ｆ）構造Ｃ12-18／Ｅ9-10（式中、Ｃ12-18は、１２～１８個の炭素原子の炭素鎖長を表し、Ｅ9-10は、９～１０個のオキシエチレン親水性頭部基を表す）を含むポリオキシエチレン界面活性剤
    を含まない、請求項５６～８１のいずれか１項に記載の組成物。
  83. 前記少なくとも１種の微生物が、前記ＳＤＡの存在下で無傷のままである、請求項５６～８２のいずれか１項に記載の組成物。
  84. 前記ＳＤＡが、前記少なくとも１種の微生物を損傷しない、請求項５６～８３のいずれか１項に記載の組成物。
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