CN116529389A - 用于从血培养物中分离细菌的血细胞裂解剂 - Google Patents
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Abstract
本文的公开内容包括适用于在处理包含血细胞和至少一种微生物的样品中使用的方法、组合物和试剂盒。在一些实施方案中,该方法包括使样品与裂解缓冲液接触以产生经处理的样品。裂解缓冲液可以包含能够裂解样品中的血细胞的体细胞消化剂(SDA)。在一些实施方案中,至少一种微生物在SDA的存在下保持完整和/或有活力。
Description
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2020年8月20日提交的美国临时申请第63/068,278号的优先权。这些申请的全部内容特此明确地通过引用以其整体并入。
背景
领域
本公开内容总体上涉及微生物分离和鉴定领域。
对相关技术的描述
脓毒症是一种由宿主免疫系统对感染的强烈应答引起的严重的医学状况。它可以触发广泛的炎症,其可以产生受损的血流。随着脓毒症的发展,身体器官可能会缺乏氧和缺乏营养,引起永久性损伤和最终衰竭。如果诊断不当或未经治疗,心脏可能会衰弱,并可能发生脓毒症休克,导致多于一个器官衰竭和死亡。需要血培养物来检测脓毒症患者血中细菌或酵母的存在。如果存在微生物,(阳性血培养物(“PBC”)),必须鉴定微生物并确定抗生素易感性以提供适当的治疗。PBC样品用于分离、鉴定和进行抗微生物剂易感性测试(“AST”)。通常通过诸如质谱(包括MALDI-TOF/MS)或基于表型生长的方法(诸如PhoenixTMID)的方法来鉴定微生物。
为了鉴定微生物,对微生物进行表型分析,并进行AST测试,需要从收集的样品中的血细胞和其他材料中分离出完整的和/或活的微生物。为了通过质谱鉴定微生物,微生物样品需要最大限度地不含已知会干扰MALDI-TOF/MS鉴定的物质,诸如血细胞组分、其他细胞碎片和盐。此外,为了获得可靠的鉴定,微生物样品需要有足够的数量。表型鉴定方法,诸如PhoenixTMID,需要完整的、活的微生物,不含可能干扰测定酶底物的物质。对于AST测试,诸如PhoenixTMID AST,如果存在抗性机制,微生物样品在测定进行期间需要包含能够在抗生素存在下生长的活的、未改变的微生物。对所有方法都重要的是要有足够的数量和纯度,因为残余血或介质组分的遗留会直接干扰或由于错误地增加微生物的浓度(浊度)而干扰。
目前用于从PBC样品中分离活的微生物的技术包括传代培养微生物,这可能需要长达72小时。这导致治疗延迟或用不适当的抗生素治疗。
某些微生物菌株特别难以在维持生物体生存力的同时从PBC样品中分离出来,诸如,例如,肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pneumoniae)。这种困难的一部分追溯到肺炎链球菌对自溶素的激活,这导致微生物细胞“自毁”。参见“Streptococcuspneumoniae Antigen Test Using Positive Blood Culture Bottles as anAlternative Method To Diagnose Pneumococcal Bacteremia”,Journal of ClinicalMicrobiology,第43卷,第5期,2005年5月,第2510-2512页。目前用于从脓毒症患者中分离微生物(包括,肺炎链球菌)的方法,包括接种血培养物瓶。在获得阳性信号之后,取出一部分PBC样品进行革兰氏染色,并且另一部分用于传代培养微生物。来自传代培养物的微生物菌落用于进行下游测试,诸如通过MALDI-TOF/MS的鉴定、表型鉴定方法和AST测试。
用于从PBC样品中分离活的微生物的另外的技术通常利用液体分离方法,该液体分离方法包含具有裂解PBC样品中的血细胞的去污剂的裂解缓冲液。裂解后,可以去除裂解的血细胞,同时保留微生物。然而,这些裂解缓冲液的使用通常会产生受损的、损伤的或无活力的微生物,这些微生物不足以进行某些基于生长的鉴定方法,诸如AST测试。
目前可用的样品处理方法和组合物存在各种缺陷,诸如(i)由于苛刻的去污剂在微生物细胞壁上的相互作用,样品处理后的生存力不足以支持基于生长的鉴定方法和AST方法;(ii)在一组微生物中产生物种水平上不一致的微生物鉴定;和/或(iii)不允许从不含干扰物质的PBC样品中分离活的微生物,并且不允许从一个PBC样品进行多于一种下游测试,诸如MALDI-TOF/MS鉴定和AST测试两者。
因此,需要有效的血细胞裂解剂,用于从阳性血培养物中分离微生物,以进行快速MALDI鉴定。需要血细胞裂解剂用于鉴定具有挑战性的物种,诸如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis),当使用目前可用的方法从阳性血培养物中分离时,这些物种产生低的MALDI评分。
概述
本文的公开内容包括处理样品的方法。该方法可以包括:使包含血细胞和至少一种微生物的样品与裂解缓冲液接触以产生经处理的样品,其中裂解缓冲液包含能够裂解样品中的血细胞的体细胞消化剂(SDA),其中SDA是式1的化合物,
式1
其中x是从2至20的整数,且其中y是从6至11的整数,从而裂解样品中的血细胞。在一些实施方案中,y是从8至10的整数。在一些实施方案中,y是8。在一些实施方案中,x是从5至15的整数。在一些实施方案中,x是从8至12的整数,例如9或10。在一些实施方案中,x是9。在一些实施方案中,SDA是壬苯醇醚-9。
在一些实施方案中,裂解缓冲液中SDA的浓度为约0.01g/L至约10g/L。在一些实施方案中,裂解缓冲液中SDA的浓度为约0.01%(w/w)至约10%(w/w)。在一些实施方案中,裂解缓冲液中SDA的浓度为约0.01%(w/w)至约1%(w/w)。在一些实施方案中,裂解缓冲液中SDA的浓度为约0.52%(w/w)。
在一些实施方案中,样品来源于怀疑患有感染的受试者的血培养物。在一些实施方案中,样品包括被确定为其中包含至少一种微生物的阳性血培养物样品。在一些实施方案中,至少一种微生物选自包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母的组。在一些实施方案中,至少一种微生物是表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。在一些实施方案中,至少一种微生物包括以下一种或更多种:粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(E.coli)和肺炎链球菌。
在一些实施方案中,接触步骤包括声处理、渗透冲击、化学处理或其任何组合。在一些实施方案中,裂解缓冲液包含一种或更多种蛋白酶和/或一种或更多种核酸酶。该方法可以包括:从经处理的样品中分离至少一种微生物以产生至少一种分离的微生物。在一些实施方案中,从经处理的样品中分离至少一种微生物包括从裂解的血细胞中分离至少一种微生物。在一些实施方案中,从裂解的血细胞中分离至少一种微生物包括:离心经处理的样品以产生沉淀和上清液;以及弃去上清液,同时保留包含至少一种分离的微生物的沉淀。该方法可以包括:从至少一种分离的微生物制备铺板的纯培养物,并分析从铺板的纯培养物获得的微生物。该方法可以包括:从至少一种分离的微生物制备接种物,并分析从接种物获得的至少一种微生物。
该方法可以包括:将包含至少一种分离的微生物的沉淀的至少一部分沉积在表面上,该表面适于放置在配置成通过质谱确定至少一种微生物的身份的装置中;任选地,干燥沉积样品;用挥发性酸溶液处理沉积样品,其中挥发性酸的体积百分比是与沉积样品组合的挥发性酸溶液的至少70%;任选地,干燥经处理的沉积样品;将基质放置在经处理的沉积样品上;以及任选地,干燥经处理的沉积样品。在一些实施方案中,挥发性酸溶液是在水中的挥发性酸或在有机溶剂中的挥发性溶液。在一些实施方案中,当与沉积样品组合时,挥发性酸溶液是以70%的体积百分比在水中的甲酸。在一些实施方案中,当与沉积样品组合时,挥发性酸溶液是以约80%的体积百分比在水中的甲酸。在一些实施方案中,当与沉积样品组合时,挥发性酸溶液是以约90%的体积百分比在水中的甲酸。该方法可以包括在用挥发性酸溶液处理沉积样品之前,用有机溶剂处理沉积样品并干燥沉积样品。在一些实施方案中,有机溶剂包括乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯或其任何组合。
该方法可以包括:在使样品与裂解缓冲液接触之前、同时和/或之后,使样品与含有胆碱的溶液接触。在一些实施方案中,含有胆碱的溶液包含至少一种季铵盐,季铵盐包含选自由式2组成的组的N,N,N-三甲基乙醇铵阳离子,
式2
其中R1、R2和R3独立地代表选自由饱和烃基团、不饱和烃基团、芳族基团及其组合组成的组中的一种,并且其中X代表带负电荷的基团。在一些实施方案中,X选自由以下组成的组:氯离子、氟离子、硝酸根和碳酸氢根。在一些实施方案中,含有胆碱的溶液包含氯化胆碱。在一些实施方案中,含有胆碱的溶液包含磷酰胆碱。在一些实施方案中,当与样品接触时,胆碱的最终浓度大于或等于按体积计约0.25%。在一些实施方案中,当与样品接触时,胆碱的最终浓度大于或等于按体积计约1%。在一些实施方案中,接触期间样品中胆碱的浓度为按体积计约1.8%。在一些实施方案中,接触期间样品中胆碱的浓度为按体积计约4%。在一些实施方案中,接触期间样品中胆碱的浓度在按体积计约0.25%至按体积计约10%的范围内。在一些实施方案中,接触包括使样品与含有胆碱的溶液孵育长达20分钟,并且所述孵育的温度为室温。
裂解缓冲液还可以包含消泡剂。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含消泡剂。在一些实施方案中,裂解缓冲液还包含至少一种硫醇。在一些实施方案中,至少一种硫醇包括L-半胱氨酸HCL、巯基乙酸钠、巯基乙胺、巯基琥珀酸、巯基乙醇、巯基乙磺酸、硫代甘油或其任何组合,任选地裂解缓冲液中至少一种硫醇的浓度为约0.005g/L至4g/L。在一些实施方案中,至少一种硫醇包含在裂解缓冲液中浓度为约0.01g/L至约2.5g/L的L-半胱氨酸,和/或在裂解缓冲液中浓度为约0.01g/L至约2.5g/L的巯基乙酸钠。在一些实施方案中,裂解缓冲液还包含氯化铵,其中裂解缓冲液中氯化铵的浓度为约0.01g/L至约80g/L。在一些实施方案中,裂解缓冲液还包含营养基础溶液,该营养基础溶液包含以下一种或更多种:在裂解缓冲液中浓度为约8g/L至约35g/L的酪蛋白胨、在裂解缓冲液中浓度为约2g/L至约10g/L的氯化钠、在裂解缓冲液中浓度为约1.5g/L至约15g/L的大豆蛋白胨、在裂解缓冲液中浓度为约0.5g/L至约5g/L的磷酸钾,以及至少一种其他营养物。在一些实施方案中,至少一种其他营养物包括在裂解缓冲液中浓度为约10g/L至约50g/L的营养肉汤。在一些实施方案中,至少一种其他营养物包括营养肉汤,该营养肉汤包含以下一种或更多种:i)胰蛋白胨;ii)大豆;iii)NaCl;iv)磷酸氢二钾(K2HPO4)和v)葡萄糖。
在一些实施方案中,裂解缓冲液还包含营养肉汤、等渗缓冲液、蛋白胨和盐中的一种或更多种,任选地裂解缓冲液中营养肉汤的浓度为约10g/L至约50g/L。在一些实施方案中,营养肉汤包括胰酪胨大豆肉汤(trypticase soy broth)。在一些实施方案中,等渗缓冲液包括磷酸钠、磷酸钾、磷酸盐缓冲盐水、盐水或其任何组合,任选地裂解缓冲液中等渗缓冲液的浓度为约1g/L至约20g/L。在一些实施方案中,蛋白胨包括酪蛋白胨和/或大豆蛋白胨。在一些实施方案中,裂解缓冲液还包含丙酮酸钠、酵母提取物、柠檬酸钠、肉蛋白胨、右旋糖、磷酸盐缓冲盐水或其任何组合。在一些实施方案中,裂解缓冲液还包含至少一种另外的非离子去污剂,任选地至少一种另外的非离子去污剂包括皂苷。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含另外的非离子去污剂。
方法可以包括:鉴定至少一种微生物。在一些实施方案中,鉴定至少一种微生物包括质谱、表型鉴定、抗微生物剂易感性测试、分子测试或其任何组合。在一些实施方案中,质谱包括以下的一种或更多种:电喷雾电离质谱(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、硅的解吸/电离(desorption/ionization on silicon,DIOS)、次级离子质谱(SIMS)、四极杆飞行时间(Q-TOF)、大气压化学电离质谱(APCI-MS)、APCJ-MS/MS、APCI-(MS)n、大气压光电离质谱(APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS)n、四极杆质谱、傅立叶变换质谱(FTMS)和离子阱质谱,其中n是大于零的整数。在一些实施方案中,质谱包括MALDI-TOF-MS。
在一些实施方案中,SDA不损伤至少一种微生物。例如,至少一种微生物在SDA的存在下可以保持完整和/或有活力。在一些实施方案中,与采用不包含SDA的裂解缓冲液的可比方法相比,所述方法产生高至少5%的MALDI评分。在一些实施方案中,可比方法采用包含皂苷的裂解缓冲液。在一些实施方案中,裂解缓冲液选择性地裂解样品中的至少约1%、至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的血细胞。在一些实施方案中,在接触步骤之后,裂解的血细胞与裂解的至少一种微生物的细胞的比例为至少约2:1。在一些实施方案中,至少一种微生物的至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的细胞在接触步骤之后保持完整和/或有活力。
在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含缓冲剂。在一些实施方案中,裂解缓冲液是酸性的。在一些实施方案中,鉴定至少一种微生物不包括光谱术,例如固有荧光光谱术(intrinsic fluorescence spectroscopy)。在一些实施方案中,该方法不包括密度梯度离心。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含皂苷。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:X-100、/>X-100-R、/>X-114、NP-40、/>C-100、/>X-100、/>CA 630、ArlasolveTM200、/>96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、单十二烷基九乙二醇醚(C12E9,聚多卡醇)、十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆盐、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、酰胺基磺基甜菜碱-14、C7BzO、/>98、/>58、/>35、/>80、/>20、L64、/>P84、非去污剂磺基甜菜碱(NDSB 201)、amphipol(PMAL-C8)和甲基-β-环糊精。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:/>X-100、/>X-100-R、/>X-114、NP-40、Igepal CA 630、Arlasolve 200、/>96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、单十二烷基九乙二醇醚。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆盐、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、酰胺基磺基甜菜碱-14、C7BzO。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:/>97、/>96V、/>C-100、/>X-100和聚多卡醇。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含含有结构C12-18/E9-10的聚氧乙烯去污剂,其中C12-18表示12个至18个碳原子的碳链长度,并且E9-10表示9个至10个氧乙烯亲水性头基团。
本文的公开内容包括组合物(例如,试剂盒)。在一些实施方案中,组合物包含:裂解缓冲液,裂解缓冲液包含能够裂解血细胞的体细胞消化剂(SDA),其中SDA是式1的化合物,
式1
其中x是从2至20的整数,并且其中y是从6至11的整数;以及血细胞和/或其碎片。在一些实施方案中,y是从8至10的整数。在一些实施方案中,y是8。在一些实施方案中,x是从5至15的整数。在一些实施方案中,x是从8至12的整数。在一些实施方案中,x是9或10。在一些实施方案中,x是9。在一些实施方案中,SDA是壬苯醇醚-9。
在一些实施方案中,裂解缓冲液中SDA的浓度为约0.01g/L至约10g/L。在一些实施方案中,裂解缓冲液中SDA的浓度为约0.01%(w/w)至约10%(w/w),例如约0.01%(w/w)至约1%(w/w)。在一些实施方案中,裂解缓冲液中SDA的浓度为约0.52%(w/w)。在一些实施方案中,裂解缓冲液包含一种或更多种蛋白酶和/或一种或更多种核酸酶。
在一些实施方案中,组合物包含含有胆碱的溶液,含有胆碱的溶液包含至少一种季铵盐,季铵盐包含选自由式2组成的组的N,N,N-三甲基乙醇铵阳离子,
式2
其中R1、R2和R3独立地代表选自由饱和烃基团、不饱和烃基团、芳族基团及其组合组成的组中的一种,并且其中X代表带负电荷的基团。在一些实施方案中,X选自由以下组成的组:氯离子、氟离子、硝酸根和碳酸氢根。在一些实施方案中,含有胆碱的溶液包含氯化胆碱。在一些实施方案中,含有胆碱的溶液包含磷酰胆碱。
在一些实施方案中,裂解缓冲液还包含消泡剂。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含消泡剂。在一些实施方案中,裂解缓冲液还包含至少一种硫醇。在一些实施方案中,至少一种硫醇包括L-半胱氨酸HCL、巯基乙酸钠、巯基乙胺、巯基琥珀酸、巯基乙醇、巯基乙磺酸、硫代甘油或其任何组合,任选地裂解缓冲液中至少一种硫醇的浓度为约0.005g/L至4g/L。在一些实施方案中,至少一种硫醇包含在裂解缓冲液中浓度为约0.01g/L至约2.5g/L的L-半胱氨酸,和/或在裂解缓冲液中浓度为约0.01g/L至约2.5g/L的巯基乙酸钠。在一些实施方案中,裂解缓冲液还包含氯化铵,裂解缓冲液中氯化铵的浓度为约0.01g/L至约80g/L。在一些实施方案中,裂解缓冲液还包含营养基础溶液,该营养基础溶液包含以下一种或更多种:在裂解缓冲液中浓度为约8g/L至约35g/L的酪蛋白胨、在裂解缓冲液中浓度为约2g/L至约10g/L的氯化钠、在裂解缓冲液中浓度为约1.5g/L至约15g/L的大豆蛋白胨、在裂解缓冲液中浓度为约0.5g/L至约5g/L的磷酸钾,以及至少一种其他营养物。在一些实施方案中,至少一种其他营养物包括在裂解缓冲液中浓度为约10g/L至约50g/L的营养肉汤。在一些实施方案中,至少一种其他营养物包括营养肉汤,该营养肉汤包含以下一种或更多种:i)胰蛋白胨;ii)大豆;iii)NaCl;iv)磷酸氢二钾(K2HPO4)和v)葡萄糖。
在一些实施方案中,裂解缓冲液还包含营养肉汤、等渗缓冲液、蛋白胨和盐中的一种或更多种,任选地裂解缓冲液中营养肉汤的浓度为约10g/L至约50g/L。在一些实施方案中,营养肉汤包括胰酪胨大豆肉汤。在一些实施方案中,等渗缓冲液包括磷酸钠、磷酸钾、磷酸盐缓冲盐水、盐水或其任何组合,任选地裂解缓冲液中等渗缓冲液的浓度为约1g/L至约20g/L。在一些实施方案中,蛋白胨包括酪蛋白胨和/或大豆蛋白胨。在一些实施方案中,裂解缓冲液还包含丙酮酸钠、酵母提取物、柠檬酸钠、肉蛋白胨、右旋糖、磷酸盐缓冲盐水或其任何组合。在一些实施方案中,裂解缓冲液还包含至少一种另外的非离子去污剂,任选地至少一种另外的非离子去污剂包括皂苷。
在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含另外的非离子去污剂。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含缓冲剂。在一些实施方案中,裂解缓冲液是酸性的。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含皂苷。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:X-100、/>X-100-R、/>X-114、NP-40、/>C-100、/>X-100、/>CA 630、ArlasolveTM200、/>96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、单十二烷基九乙二醇醚(C12E9,聚多卡醇)、十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆盐、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、酰胺基磺基甜菜碱-14、C7BzO、/>98、/>58、/>35、/>80、/>20、/>L64、/>P84、非去污剂磺基甜菜碱(NDSB 201)、amphipol(PMAL-C8)和甲基-β-环糊精。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:/>X-100、X-100-R、/>X-114、NP-40、Igepal CA 630、Arlasolve 200、/>96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、单十二烷基九乙二醇醚。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆盐、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、酰胺基磺基甜菜碱-14、C7BzO。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:/>97、/>96V、/>C-100、/>X-100和聚多卡醇。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含含有结构C12-18/E9-10的聚氧乙烯去污剂,其中C12-18表示12个至18个碳原子的碳链长度,并且E9-10表示9个至10个氧乙烯亲水性头基团。在一些实施方案中,至少一种微生物在SDA的存在下保持完整。在一些实施方案中,SDA不损伤至少一种微生物。
附图简述
图1描绘了与使用不同裂解剂从阳性血培养物中分离的表皮葡萄球菌的MALDI评分相关的示例性数据。示出了使用不同裂解剂从阳性血培养物中分离的表皮葡萄球菌的MALDI评分。SAP代表皂苷,SDA代表体细胞消化剂壬苯醇醚-9。每种裂解剂的使用浓度为0.52%(W/W)。鉴定接受度评分对于Sepsityper数据库为大于或等于1.8,以及对于标准数据库为大于或等于2.0。
详述
以下详述中参考了形成本文的一部分的附图。在附图中,除非上下文另外指示,否则相似的符号通常标识相似的组成部分。在详述、附图和权利要求书中描述的说明性实施方案不意味着是限制性的。在不脱离本文呈现的主题的精神或范围的情况下,可以利用其他实施方案,并且可以做出其他改变。将容易理解的是,如本文一般描述的以及附图中图示的本公开内容的方面能够以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计,所有这些都在本文中明确设想并且构成本公开内容的一部分。
本文提及的所有专利、公开的专利申请、其他出版物和来自GenBank的序列,以及其他数据库关于相关技术通过引用以其整体并入。
本文的公开内容包括处理样品的方法。在一些实施方案中,该方法包括:使包含血细胞和至少一种微生物的样品与裂解缓冲液接触以产生经处理的样品,其中裂解缓冲液包含能够裂解样品中的血细胞的体细胞消化剂(SDA),其中SDA是式1的化合物,
式1
其中x是从2至20的整数,且其中y是从6至11的整数,从而裂解样品中的血细胞。在一些实施方案中,y是从8至10的整数。在一些实施方案中,y是8。在一些实施方案中,x是从5至15的整数。在一些实施方案中,x是从8至12的整数。在一些实施方案中,x是9或10。在一些实施方案中,x是9。在一些实施方案中,SDA是壬苯醇醚-9。
本文的公开内容包括组合物(例如,试剂盒)。在一些实施方案中,组合物包含:裂解缓冲液,裂解缓冲液包含能够裂解血细胞的体细胞消化剂(SDA),其中SDA是式1的化合物,
式1
其中x是从2至20的整数,并且其中y是从6至11的整数;以及血细胞和/或其碎片。在一些实施方案中,y是从8至10的整数。在一些实施方案中,y是8。在一些实施方案中,x是从5至15的整数。在一些实施方案中,x是从8至12的整数。在一些实施方案中,x是9或10。在一些实施方案中,x是9。在一些实施方案中,SDA是壬苯醇醚-9。
定义
除非另外定义,否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。参见,例如,Singleton等人,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,第2版,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994);Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor,NY 1989)。为了本公开内容的目的,下文定义了以下术语。
如本文所用,术语“约”在指可测量值,诸如本文所公开的化合物或剂(例如SDA)的量、剂量、时间、温度等时,应被给予其普通含义,并且还应涵盖指定量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或甚至±0.1%的变化。
如本文所用,术语“微生物”应被给予其普通含义,并且还应指通常是单细胞的生物体,其可在实验室中繁殖和处理,包括但不限于革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌、酵母、霉菌、寄生虫和柔膜细菌。革兰氏阴性菌的非限制性实例包括下列属的细菌:假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希菌属(Escherichia)、沙门菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)、沙雷菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、摩根氏菌属(Morganella)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森菌属(Yersinia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)、无色杆菌属(Achromobacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、布兰汉氏菌属(Branhamella)、奈瑟菌属(Neisseria)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、气单胞菌属(Aeromonas)、莫拉菌属(Moraxella)、布鲁氏菌属(Brucella)、巴斯德菌属(Pasteurella)、普鲁威登菌属(Providencia)以及军团菌属(Legionella)。革兰氏阳性菌的非限制性实例包括下列属的细菌:肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、梭菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)、加德纳菌属(Gardnerella)、考克氏菌属(Kocuria)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Mycobacteria)以及棒状杆菌属(Corynebacteria)。酵母和霉菌的非限制性实例包括下列属的那些:念珠菌属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、青霉属(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)、红酵母属(Rhodotorula)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、酵母菌属(Saccharomyces)以及丝孢酵母属(Trichosporon)。寄生虫的非限制性实例包括下列属的那些:锥虫属(Trypanosoma)、巴贝斯虫属(Babesia)、利什曼原虫属(Leishmania)、疟原虫属(Plasmodium)、吴策线虫属(Wucheria)、布鲁线虫属(Brugia)、盘尾丝虫属(Onchocerca)以及内格里虫属(Naegleria)。柔膜细菌的非限制性实例包括下列属的那些:支原体属(Mycoplasma)以及脲原体属(Ureaplasma)。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中,可以分离和探查来自样品或生长介质的微生物,以表征和/或鉴定样品中存在的微生物。如本文所用,术语“分离”应被给予其普通含义,并且还应涵盖从其原始状态或从生长介质或培养介质(growth or culturemedium)中取出、浓缩或以其他方式分离的任何微生物样品。例如,在一些实施方案中,微生物可以从可能以其他方式干扰表征和/或鉴定的非微生物或非微生物组分中分离出来(例如,作为分离的样品)。分离的微生物样品可以包括比原始样品更浓缩或以其他方式与原始样品分离的微生物和/或其组分的任何集合或层,并且其范围可以从紧密堆积的致密微生物团块(clump)到微生物的扩散层。可以包含在分离形式或样品中的微生物组分包括但不限于纤毛、鞭毛、菌毛(fimbriae)和荚膜的任何组合。与微生物分离的非微生物组分可以包括非微生物细胞(例如,血细胞和/或其他组织细胞)和/或其任何组分。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中,可以分离和探查来自样品或生长介质的微生物,以表征和/或鉴定样品中存在的微生物。如本文所用,术语“分离的”应被给予其普通含义,并且还应涵盖至少部分地从其原始状态或从生长介质或培养介质中纯化的任何微生物样品,以及其中包含的任何非微生物或非微生物组分。例如,在一些实施方案中,将微生物从可能以其他方式干扰表征和/或鉴定的非微生物或非微生物组分中分离出来(例如,作为分离的样品)。与微生物分离的非微生物组分可以包括非微生物细胞(例如,血细胞和/或其他组织细胞)和/或其任何组分。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中,可以沉淀和探查来自样品或生长介质的微生物,以表征和/或鉴定样品中存在的微生物。如本文所用,术语“沉淀”应被给予其普通含义,并且还应涵盖已被压缩或沉积成微生物块(mass)的任何微生物样品。例如,来自样品的微生物可以通过离心或本领域其他已知的方法被压缩或沉积成管底部的块。该术语包括离心后容器底部和/或侧面上的微生物(和/或其组分)的集合。可以包含在沉淀中的微生物组分包括但不限于纤毛、鞭毛、菌毛和荚膜的任何组合。在一些实施方案中,微生物可以从可能以其他方式干扰表征和/或鉴定的非微生物或非微生物组分中沉淀出来(例如,作为基本纯化的微生物沉淀)。与微生物分离的非微生物组分可以包括非微生物细胞(例如,血细胞和/或其他组织细胞)和/或其任何组分。
裂解缓冲液和使用方法
本文公开的各种实施方案提供了用于从包含表皮葡萄球菌的样品(例如PBC)中快速分离完整和/或活的微生物细胞的试剂和方法。使用各种所公开的试剂和方法获得的所得微生物沉淀可以最大限度地不含干扰物质,并且可以用于鉴定方法,诸如MALDI-TOF/MS、基于生长的鉴定和AST方法。这可以实现快速结果,而不需要传代培养微生物。通过各种实施方案获得的活的微生物细胞的浓缩块可用于快速ID系统(诸如MALDI-TOF/MS)的直接接种,以及通过常规或自动化系统(诸如BDTMPhoenixTMID/AST系统)的ID/AST测试(AST)。各种实施方案还可以应用于其他系统、分子测试方法,诸如聚合酶链式反应(PCR),以及本领域技术人员已知的其他方法。
本文公开的各种实施方案提供了用于从阳性血培养物样品快速分离微生物细胞(包括表皮葡萄球菌)的试剂和方法。所得微生物沉淀可用于鉴定和/或基于生长的方法,诸如抗微生物剂易感性测试。在一些实施方案中,所公开的方法提供了仅使用一个样品制备管和离心从PBC样品中快速分离和浓缩活的微生物,同时从哺乳动物血细胞中去除可能干扰鉴定方法的细胞碎片的方法。阳性血培养物(PBC)样品可以通过本领域技术人员已知的方法获得并且在本文不详细描述。PBC样品可以包括通过用例如BD BACTECTM仪器化血培养物系统(Becton,Dickinson and Company)检测而确定为对至少一种微生物呈阳性的样品。在一种实施方案中,微生物包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或酵母。在一些实施方案中,一种或更多种微生物是表皮葡萄球菌。PBC样品的起始体积不限于任何特定的最大或最小体积。
本文提供了包含SDA(体细胞消化剂)的方法和组合物,SDA是一种新的和有效的血细胞裂解表面活性剂。在一些实施方案中,SDA是用于从阳性血培养物中分离细菌以进行快速MALDI鉴定的有效血细胞裂解剂。在一些实施方案中,SDA是非离子表面活性剂壬苯醇醚-9。在本文公开的组合物和方法的一些实施方案中,在裂解缓冲液中采用SDA来裂解血细胞,以促进从阳性血培养物中分离细菌细胞,用于MALDI的快速鉴定。在一些实施方案中,SDA可以特异性破坏血细胞膜而不损伤细菌细胞。
目前可用的方法采用皂苷来裂解血细胞,以从阳性血培养物中分离细菌。然而,对一些细菌菌株的MALDI鉴定具有非常低的评分,导致没有鉴定,特别是对于表皮葡萄球菌。这种鉴定失败可能是由于血细胞没有被完全裂解和/或血碎片的高含量。SDA用于代替裂解缓冲液中的皂苷以去除血细胞,并且获得具有正确鉴定的高MALDI评分(图1)。在一些实施方案中,SDA是非常水溶性的。使用SDA作为从阳性血培养物中分离细菌的裂解剂的优点在于,对于挑战性物种诸如表皮葡萄球菌的MALDI评分可以高于截止值,导致正确的物种鉴定。此外,使用SDA相比于皂苷的处理时间可以是几乎相同的。
在一些实施方案中,提供了处理样品的方法。在一些实施方案中,该方法包括使包含血细胞和至少一种微生物的样品与裂解缓冲液接触,以产生经处理的样品,其中裂解缓冲液包含能够裂解样品中的血细胞的体细胞消化剂(SDA),从而裂解样品中的血细胞。在一些实施方案中,提供了组合物(例如,试剂盒)。在一些实施方案中,组合物包含含有能够裂解血细胞的体细胞消化剂(SDA)的裂解缓冲液,以及血细胞和/或其碎片。在一些实施方案中,SDA是式1的化合物:
式1
在一些实施方案中,x是从2至20的整数。在一些实施方案中,x是从5至15的整数。在一些实施方案中,x是从8至12的整数。在一些实施方案中,x是9或10。在一些实施方案中,x是9。在一些实施方案中,其中y是从6至11的整数。在一些实施方案中,y是从8至10的整数。在一些实施方案中,y是8。在一些实施方案中,SDA是壬苯醇醚-9。裂解缓冲液中的或当与样品组合时在最终反应体积中的SDA的浓度,可以是、可以是约、可以是至少或可以是至多0.001g/L、0.005g/L、0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L或任何这些值之间的数字或范围。裂解缓冲液中的或当与样品组合时在最终反应体积中的SDA的浓度,可以是、可以是约、可以是至少或可以是至多0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、10%(w/w),或任何这些值之间的数字或范围。裂解缓冲液中的或当与样品组合时在最终反应体积中的SDA的浓度,可以是约0.52%(w/w)。在其他实施方案中,本文公开的裂解缓冲液组分的百分比提供为%w/w、%m/v、%v/v、%m/w、%w/v或其变化形式。当与样品组合时,SDA的最终浓度不受限制,只要SDA以使至少一部分血细胞发生溶血(或以其他方式分解),同时使样品中的至少一部分微生物保持完整和/或有活力的浓度使用。当与样品接触时,SDA的最终浓度可以是、可以是约、可以是至少或可以是至多按体积计0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、10%,或任何这些值之间的数字或范围。
在一些实施方案中,本文描述的裂解缓冲液的各种成分的浓度代表裂解缓冲液中每种成分的最终浓度。在一些实施方案中,在接触步骤期间,将1:1体积比的样品(例如PBC)与裂解缓冲液混合;然而,也可以设想其他体积比。因此,为了在与样品(例如PBC)混合时获得裂解缓冲液成分的期望的最终浓度,可以调节裂解缓冲液中每种成分的浓度,以考虑裂解缓冲液与PBC样品的体积比的变化。
本文描述的用于从怀疑包含至少一种微生物的样品(例如PBC样品)中分离微生物的方法可以利用包含SDA的各种裂解缓冲液,该SDA被设想用于快速产生可用于各种下游测试方法(诸如通过MALDI-TOF/MS的鉴定、基于生长的表型测定和AST测试)的活的微生物沉淀。在一些实施方案中,该方法包括将一部分样品与包含SDA的裂解缓冲液一起添加以形成混合物。在一些实施方案中,样品与包含SDA的裂解缓冲液的体积比为约1:1。可以将混合物孵育一段时间以裂解PBC样品中的血细胞。
在一些实施方案中,样品与包含SDA的裂解缓冲液的体积比的比例可以是、或是约1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000或任两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中,样品与包含SDA的裂解缓冲液的体积比可以是、或是约1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1、10000:1或任两个值之间的数字或范围。
在一些实施方案中,样品与裂解缓冲液接触两次或更多次。例如,在样品制备过程期间,样品可以与裂解缓冲液接触2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。在一些这样的实施方案中,样品可以与裂解缓冲液接触,离心以产生沉淀,沉淀可以重悬,并且然后重悬的沉淀与裂解缓冲液进行一个或更多个另外的接触步骤。在一些实施方案中,接触步骤包括持续0.5分钟、0.6分钟、0.7分钟、0.8分钟、0.9分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、100分钟、200分钟、300分钟、400分钟、500分钟或任何这些值之间的数字或范围的孵育期。
本文提供的方法和组合物的一些实施方案可用于从复杂样品诸如含血介质中分离、表征和/或鉴定微生物。在一些实施方案中,本文公开的方法允许比目前可用的方法更快速地表征和/或鉴定微生物,导致更快的诊断(例如,在患有或怀疑患有败血症的受试者中)和对污染材料(例如,食品和药物)的表征/鉴定。所公开的方法中涉及的步骤,从获得样品到微生物的表征/鉴定,可以在非常短的时间框架内进行,以获得临床相关的可操作信息。在某些实施方案中,所公开的方法可以在小于约120分钟内进行,例如,在小于约210分钟、200分钟、190分钟、180分钟、170分钟、160分钟、150分钟、140分钟、130分钟、120分钟、110分钟、100分钟、90分钟、80分钟、70分钟、60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟或1分钟,或任何这些值之间的范围或数字内进行。在一些实施方案中,本文公开的方法的快速性代表了对目前可用方法的改进。所公开的方法可用于表征和/或鉴定本文描述的任何微生物。在一些实施方案中,所公开的方法可以是完全自动化的,从而降低处理感染性材料和/或污染样品的风险。
可以通过本文公开的方法测试的样品(例如,测试样品)包括其中怀疑或可能怀疑微生物存在和/或生长的临床和非临床样品,以及常规或偶尔测试微生物存在的材料样品两者。由于本文公开的方法的多功能性和/或灵敏度,所利用的样品量可以有很大变化。样品制备可以通过本领域技术人员已知的任何数量的技术来进行,不过所公开的方法的优点之一是可以利用该系统直接测试复杂的样品类型,诸如,例如血、体液和/或其他不透明物质,而很少或没有广泛的预处理。在一些实施方案中,样品取自培养物。在一些实施方案中,样品取自微生物培养物(例如,血培养物)。在一些实施方案中,样品中怀疑或已知包含微生物。
可以测试的临床样品包括通常在临床或研究实验室中测试的任何类型的样品,包括但不限于血、血清、血浆、血级分、关节液、尿液、精液、唾液、粪便、脑脊液、胃内容物、阴道分泌物、组织匀浆、骨髓抽吸物、骨匀浆、痰、抽吸物、拭子和拭子冲洗液、其他体液等。在一些实施方案中,培养临床样品,并使用培养物样品。
本文公开的组合物和方法可用于研究以及兽医和医学应用。可从中获得临床样品的合适受试者通常是哺乳动物受试者,但可以是任何动物。如本文所用,术语“哺乳动物”应被给予其普通含义,并且包括但不限于人类、非人灵长类动物、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔和啮齿动物(例如,大鼠或小鼠)。人类受试者包括新生儿、婴儿、青少年、成人和老年受试者。可从中获得样品的受试者包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类。
可以被测试的非临床样品还包括涵盖但不限于以下的物质:食品、饮料、药物、化妆品、水(例如饮用水、非饮用水和废水)、海水压载(seawater ballasts)、空气、土壤、污水、植物材料(例如种子、叶、茎、根、花、果实)、血液制品(例如血小板、血清、血浆、白细胞级分)、供体器官或组织样品、生物战样品等。本文公开的方法可被采用用于实时测试,以监测工业环境中的污染水平、过程控制、质量控制等。在一些实施方案中,培养非临床样品,并使用培养物样品。
在一些实施方案中,从患有或疑似患有微生物感染的受试者(例如,患者)获得样品。在一些实施方案中,受试者患有或被怀疑患有败血症,例如细菌血症或真菌血症。样品可以是直接来自受试者的血液样品。样品可以来自从患者的血液样品生长的血培养物。血培养物样品可以来自阳性血培养物,例如指示微生物存在的血培养物。在一些实施方案中,样品取自在阳性血培养物变成阳性后的短时间内,例如在约6小时内,例如在约5小时、4小时、3小时或2小时内,或在约60分钟内,例如在约55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟或1分钟内,或这些值之间的范围或数字内的阳性血培养物中。在一些实施方案中,样品取自其中微生物处于对数生长期的培养物。在一些实施方案中,样品取自其中微生物处于稳定期的培养物。
所公开的方法的各种实施方案可以为微生物的检测、表征和/或鉴定提供高灵敏度。所公开的方法的各种实施方案能够实现检测、表征和/或鉴定,而不必首先经历通过在固体或半固体介质上培养微生物来分离微生物,并对生长的菌落取样的步骤。因此,一些实施方案,样品并不来自生长在固体或半固体表面上的微生物(例如,细菌、酵母或霉菌)菌落。
在一些实施方案中,样品的体积足够大以在进行本文公开的方法的分离(separation)/分离(isolation)步骤后产生可以被探查的分离的微生物样品或微生物沉淀。适当的体积将取决于样品的来源和样品中微生物的预期水平。例如,阳性血培养物将包含比待检测污染的饮用水样品每体积更高水平的微生物,因此与饮用水样品相比,可以需要更小体积的血培养介质。通常,样品大小可以小于约50ml,例如小于约40ml、30ml、20ml、15ml、10ml、5ml、4ml、3ml或2ml,或这些值之间的范围或数字。在一些实施方案中,样品大小可以是约1ml,例如约0.75ml、0.5ml或0.25ml,或这些值之间的范围或数量。在其中分离在微观尺度上进行的一些实施方案中,样品大小可以是小于约200μl(例如,小于约150μl、100μl、50μl、25μl、20μl、15μl、10μl或5μl,或这些值之间的范围或数字)。在一些实施方案中(例如,当预期样品包含少量微生物时),样品大小可以是约100ml或更大,例如约250ml、500ml、750ml或1000ml或更大,或这些值之间的范围或数字。
样品可以来源于怀疑患有感染的受试者的血培养物。样品可以包括被确定为其中包含至少一种微生物的阳性血培养样品。至少一种微生物可选自包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母的组。至少一种微生物可以是表皮葡萄球菌。至少一种微生物可以是粪肠球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和/或肺炎链球菌。接触步骤可包括声处理、渗透冲击、化学处理或其任何组合。裂解缓冲液可以包含一种或更多种蛋白酶和/或一种或更多种核酸酶。该方法可以包括从经处理的样品中分离至少一种微生物以产生至少一种分离的微生物。从经处理的样品中分离至少一种微生物可以包括从裂解的血细胞中分离至少一种微生物。从裂解的血细胞中分离至少一种微生物可以包括:离心经处理的样品以产生沉淀和上清液;以及弃去上清液,同时保留包含至少一种分离的微生物的沉淀。该方法可以包括从至少一种分离的微生物制备铺板的纯培养物,并分析从铺板的纯培养物获得的微生物。该方法可以包括从至少一种分离的微生物制备接种物,并分析从接种物获得的至少一种微生物。用于从样品(例如阳性血培养物)中分离和鉴定微生物的方法、装置、组合物和系统已在美国专利第10,059,975号和第9,180,448号中描述,每一个专利的内容通过引用以其整体并入本文。
本文描述的一些实施方案可与美国专利第9,631,221号中描述的用于从阳性血培养物中快速处理和鉴定微生物的组合物和方法一起使用,该美国专利的内容通过引用以其整体并入本文。该方法可以包括:将包含至少一种分离的微生物的沉淀的至少一部分沉积在表面上,该表面适于放置在配置成通过质谱确定至少一种微生物的身份的装置中;任选地,干燥沉积样品;用挥发性酸溶液处理沉积样品,其中挥发性酸的体积百分比可以是与沉积样品组合的挥发性酸溶液的至少70%;任选地,干燥经处理的沉积样品;将基质放置在经处理的沉积样品上;以及任选地,干燥经处理的沉积样品。挥发性酸溶液可以是在水中的挥发性酸或在有机溶剂中的挥发性溶液。在一些实施方案中,当与沉积样品组合时,挥发性酸溶液可以是以约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%,或这些值之间的范围或数字的体积百分比在水中的甲酸。该方法可以包括在用挥发性酸溶液处理沉积样品之前,用有机溶剂处理沉积样品并干燥沉积样品。有机溶剂可以包括乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯或其任何组合。
本文描述的一些实施方案可以与各种试剂(例如含有胆碱的溶液)和方法一起使用,用于从阳性血培养物样品中快速分离活的微生物细胞,以用于下游分析,诸如已在美国专利第8,603,769号中描述的鉴定和抗微生物剂易感性测试,该美国专利的内容通过引用以其整体并入本文。尽管申请人不希望被特定理论约束,但在本文公开的缓冲液的裂解组分(例如SDA)存在的情况下,添加含有胆碱的溶液可抑制、防止和/或减轻微生物的自溶。该方法可以包括在使样品与裂解缓冲液接触之前、同时和/或之后,使样品与含有胆碱的溶液接触。在一些实施方案中,本文公开的组合物还包含含有胆碱的溶液。含有胆碱的溶液可包含至少一种季铵盐,季铵盐包含选自由式2组成的组的N,N,N-三甲基乙醇铵阳离子,
式2
其中R1、R2和R3独立地代表选自由饱和烃基团、不饱和烃基团、芳族基团及其组合组成的组中的一种,并且其中X代表带负电荷的基团。在一些实施方案中,X选自由以下组成的组:氯离子、氟离子、硝酸根和碳酸氢根。含有胆碱的溶液可以包含氯化胆碱。含有胆碱的溶液可以包含磷酰胆碱。当与样品接触时,胆碱的最终浓度可以是、可以是约、可以是至少或可以是至多按体积计0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、10%,或任何这些值之间的数字或范围。在其他实施方案中,本文公开的裂解缓冲液组分的百分比提供为%w/w、%m/v、%v/v、%m/w、%w/v或其变化形式。在接触期间样品中胆碱的浓度可以是、可以是约、可以是至少或可以是至多按体积计0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、10%,或任何这些值之间的数字或范围。在接触期间,样品中胆碱的浓度可以在按体积计约0.25%至按体积计约10%的范围内(例如,0.25%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,或任何这两个值之间的数字或范围)。接触可以包括使样品与含有胆碱的溶液孵育长达20分钟。所述孵育的温度可以是室温。
本文公开的裂解缓冲液可以包含一种或更多种帮助稳定微生物的组分,裂解试剂裂解血细胞和/或去除干扰细胞碎片。本文描述的一些实施方案可以与已在美国专利第10,519,482号中描述的用于从阳性血培养物样品中快速分离活的微生物细胞的各种试剂和方法一起使用,该美国专利的内容通过引用以其整体并入本文。裂解缓冲液可以包含消泡剂。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含消泡剂。裂解缓冲液可以包含至少一种硫醇。至少一种硫醇可以包括L-半胱氨酸HCL、巯基乙酸钠、巯基乙胺、巯基琥珀酸、巯基乙醇、巯基乙磺酸、硫代甘油或其任何组合。裂解缓冲液中至少一种硫醇的浓度可以是、可以是约、可以是至少或可以是至多0.001g/L、0.005g/L、0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L,或任何这些值之间的数字或范围。至少一种硫醇可以包括L-半胱氨酸和/或巯基乙酸钠。裂解缓冲液中L-半胱氨酸和/或巯基乙酸钠的浓度可以是、可以是约、可以是至少或可以是至多0.001g/L、0.005g/L、0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L,或任何这些值之间的数字或范围。裂解缓冲液可以包含氯化铵。裂解缓冲液中氯化铵的浓度可以是、可以是约、可以是至少或可以是至多0.001g/L、0.005g/L、0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L,或任何这些值之间的数字或范围。
裂解缓冲液可以包含营养基础溶液,该营养基础溶液包含以下一种或更多种:在裂解缓冲液中浓度为约8g/L至约35g/L的酪蛋白胨、在裂解缓冲液中浓度为约2g/L至约10g/L的氯化钠、在裂解缓冲液中浓度为约1.5g/L至约15g/L的大豆蛋白胨、在裂解缓冲液中浓度为约0.5g/L至约5g/L的磷酸钾,以及至少一种其他营养物。至少一种其他营养物可以包括营养肉汤。裂解缓冲液中营养肉汤的浓度可以是、可以是约、可以是至少或可以是至多1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L,或任何这些值之间的数字或范围。至少一种其他营养物可包括营养肉汤,该营养肉汤包含以下一种或更多种:i)胰蛋白胨;ii)大豆;iii)NaCl;iv)磷酸氢二钾(K2HPO4)和v)葡萄糖。裂解缓冲液可以包含营养肉汤、等渗缓冲液、蛋白胨和盐中的一种或更多种。营养肉汤可以包括胰酪胨大豆肉汤。等渗缓冲液可以包含磷酸钠、磷酸钾、磷酸盐缓冲盐水、盐水或其任何组合。裂解缓冲液中等渗缓冲液的浓度可以是、可以是约、可以是至少或可以是至多0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L,或任何这些值之间的数字或范围。蛋白胨可以包括酪蛋白胨和/或大豆蛋白胨。裂解缓冲液可以包含丙酮酸钠、酵母提取物、柠檬酸钠、肉蛋白胨、右旋糖、磷酸盐缓冲盐水或其任何组合。在一些实施方案中,裂解缓冲液可以包含至少一种另外的非离子去污剂(例如皂苷)。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含另外的非离子去污剂。
方法可以包括鉴定至少一种微生物。鉴定至少一种微生物可以包括质谱、表型鉴定、抗微生物剂易感性测试、分子测试或其任何组合。质谱可以包括以下的一种或更多种:电喷雾电离质谱(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、硅的解吸/电离(DIOS)、次级离子质谱(SIMS)、四极杆飞行时间(Q-TOF)、大气压化学电离质谱(APCI-MS)、APCJ-MS/MS、APCI-(MS)n、大气压光电离质谱(APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS)n、四极杆质谱、傅立叶变换质谱(FTMS)和离子阱质谱,其中n是大于零的整数。质谱可以包括MALDI-TOF-MS
在一些实施方案中,SDA不损伤至少一种微生物。至少一种微生物可以在SDA的存在下保持完整。在一些实施方案中,与采用不包含SDA的裂解缓冲液的可比方法相比,所述方法产生高至少1%(例如,1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、2000%、3000%、4000%、5000%、6000%、7000%、8000%、9000%、10000%或任何这些值之间的数字或范围)的MALDI评分。在一些实施方案中,可比方法采用包含皂苷的裂解缓冲液。在一些实施方案中,裂解缓冲液选择性地裂解样品中的至少约1%、至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约99%或任何这些值之间的数字或范围的血细胞。在一些实施方案中,在接触步骤之后裂解的血细胞与裂解的至少一种微生物的细胞的比例可以是或是约1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1、10000:1,或任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中,在接触步骤之后裂解的血细胞与裂解的至少一种微生物的细胞的比例可以是至少或是至多1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1或10000:1。在一些实施方案中,至少一种微生物的至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的细胞在接触步骤之后保持完整和/或有活力。
由本文描述的各种实施方案得到的活的和/或完整的微生物沉淀可用于制备用于各种下游测试方法的通用样品,下游测试方法包括质谱鉴定,例如MALDI-TOF/MS鉴定;基于表型生长的鉴定,例如PhoenixTMID;以及AST测试,例如PhoenixTMID AST测试。此外,整个方法可以在一个样品管中进行,而不需要在多于一个管之间转移样品。因此,本文描述的方法可以容易地适用于自动化系统。
本文描述的技术诸如较高的PBC样品体积、PBC样品的多于一个等分试样、多于一次旋转等可用于增加起始体积中的微生物数量以改善产量。此外,这些方法提供了快速样品制备方法,并且易于自动化。此外,本文描述的方法和缓冲液使血细胞裂解,从PBC样品中去除干扰物质,并提供高产量的活的微生物。在一种实施方案中,通过增加PBC样品的起始体积和/或通过对来自一个PBC样品的若干等分试样进行分离方法并将所得微生物沉淀合并成一个样品,可以增加活的微生物沉淀的产量。
在一种实施方案中,处理分离的微生物以准备下游测试。这包括例如将至少一部分分离的微生物重悬在流体中,流体例如水、OG、BD PhoenixTMID肉汤或非离子去污剂。在一种实施方案中,通过将分离的微生物沉淀重悬在溶液中并将一部分重悬的沉淀沉积在MALDI-TOF MS板上,或通过将一部分分离的微生物沉淀直接沉积在MALDI-TOF MS板上而不首先将沉淀重悬在溶液中,制备分离的微生物用于质谱鉴定。在另一种实施方案中,通过将分离的微生物沉淀重悬在溶液中并将悬浮液调节至约0.5McFarland标准的特定浓度,制备分离的微生物沉淀用于BD PhoenixTMID/AST测试。设想了用于制备用于下游分析的分离的微生物的另外的方法,该方法对本领域技术人员是已知的并且在本文不详细描述。
分离的微生物可用于多于一种下游分析,包括微生物的鉴定(例如,质谱、表型或分子鉴定方法等)和AST测试。AST方法可适用于本领域已知的大多数手动和自动化AST系统,包括BD PhoenixTMID/AST、圆片扩散(Sensi-Disc)、琼脂稀释和微管/大管(macrotube)稀释方法。鉴定方法和AST测试是本领域技术人员熟知的,并且在本文不详细描述。另外的下游测试还可以包括,例如,利用酶促反应、生化反应的不同表型鉴定系统或方法,不同的分子或表型鉴定系统,和/或基于生长的鉴定方案。它们也可用于检测赋予细菌分离物对某些抗微生物剂和类别的保护的抗性标志物。
本文描述的各种方法还可以包括从分离的微生物制备铺板的纯培养物或单一接种物。用于制备铺板的纯培养物或接种物的方法是本领域技术人员已知的。如果需要另外的下游测试,可以制备铺板的纯培养物或接种物以获得足够量的样品。
通过所公开的方法获得的分离的(例如,沉淀的)微生物的一部分可用于接种BDPhoenixTMID肉汤(Becton,Dickinson and Company)。一部分接种物可用于接种BDPhoenixTMID/AST组(Becton,Dickinson and Company)的AST部分。BD PhoenixTMID/AST系统在例如美国专利第5,922,593号、第6,096,272号、第6,372,485号、第6,849,422号和第7,115,384号中描述,这些美国专利的内容通过引用以其整体在此并入。
在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含缓冲剂。在一些实施方案中,裂解缓冲液是酸性的。在一些实施方案中,鉴定至少一种微生物不包括光谱术(例如,固有荧光光谱术)。在一些实施方案中,该方法不包括密度梯度离心。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含皂苷。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:X-100、/>X-100-R、/>X-114、NP-40、/>C-100、/>X-100、/>CA 630、ArlasolveTM200、/>96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、单十二烷基九乙二醇醚(C12E9,聚多卡醇)、十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆盐、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、酰胺基磺基甜菜碱-14、C7BzO、/>98、58、/>35、/>80、/>20、/>L64、/>P84、非去污剂磺基甜菜碱(NDSB 201)、amphipol(PMAL-C8)和甲基-β-环糊精。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:/>X-100、/>X-100-R、X-114、NP-40、Igepal CA 630、Arlasolve 200、/>96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、单十二烷基九乙二醇醚。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆盐、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、酰胺基磺基甜菜碱-14、C7BzO。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:/>97、/>96V、/>C-100、/>X-100和聚多卡醇。在一些实施方案中,裂解缓冲液不包含含有结构C12-18/E9-10的聚氧乙烯去污剂,其中C12-18表示12个至18个碳原子的碳链长度,并且E9-10表示9个至10个氧乙烯亲水性头基团。/>
实施例
上文讨论的实施方案的一些方面在以下实施例中进一步详细公开,其并不以任何方式意在限制本公开内容的范围。
实施例1
使用不同裂解剂从阳性血培养物中分离的表皮葡萄球菌的MALDI评分
本实施例展示了采用本文提供的样品处理方法和组合物鉴定从阳性血培养物中分离的表皮葡萄球菌。图1描绘了与使用不同裂解剂即皂苷(SAP)、壬苯醇醚-9(体细胞消化剂(SDA))及其组合从阳性血培养物中分离的表皮葡萄球菌的MALDI评分相关的示例性数据。每种裂解剂的使用浓度为0.52%(w/w)。鉴定接受度评分对于Sepsityper数据库为大于或等于1.8,对于标准数据库为大于或等于2.0。令人惊讶的是,在裂解缓冲液中使用SDA获得了更高的MALDI评分和正确的鉴定。使用目前使用的裂解剂皂苷获得了较低的MALDI评分。SDA通常通过与精子的顶体和中段的膜中的脂质相互作用而用作杀精子剂。令人惊讶的是尽管SDA通常被用作杀精子剂,但发现SDA可以非常有效地裂解血细胞。
在至少一些先前描述的实施方案中,一种实施方案中使用的一个或更多个要素可以互换地用于另一种实施方案中,除非这样的替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解,在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下,可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修改。所有这样的修改和改变都旨在落在由所附权利要求书限定的主题的范围内。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用,在对于上下文和/或应用适当的情况下,本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见,可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。如本说明书和所附权利要求书中使用的,单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物,除非上下文另外明确指示。除非另外说明,否则在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。
本领域技术人员将理解,一般来说,本文使用的术语,并且尤其是所附权利要求(例如,所附权利要求的主体)中的术语,通常意在作为“开放式”术语(例如,术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”,术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”,术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”,等等)。本领域技术人员将进一步理解,如果意图所介绍的权利要求陈述的特定数字,则这样的意图将明确地陈述于权利要求中,并且在这种陈述不存在的情况下,不存在这样的意图。例如,作为对理解的帮助,以下所附权利要求书可以包含介绍性措辞“至少一种”和“一种或更多种”的使用,以介绍权利要求陈述。然而,这样的措辞的使用不应解读为意味着由不定冠词“一(a)”或“一(an)”介绍的权利要求陈述会将任何包含这样的介绍的权利要求陈述的特定权利要求限制为包含仅一种这样的陈述的实施方案,甚至当同一权利要求包括介绍性措辞“一种或更多种”或“至少一种”以及不定冠词诸如“一(a)”或“一(an)”时也是如此(例如,“一(a)”和/或“一(an)”应解释为意指“至少一种”或“一种或更多种”);这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。此外,即使明确地陈述了介绍的权利要求陈述的特定数字,本领域技术人员将认识到,这样的陈述应解释为意指至少所陈述的数字(例如,仅陈述“两种陈述”而没有其他修饰词意指至少两种陈述或者两种或更多种陈述)。此外,在使用类似于“A、B和C等中的至少一种”的惯例的那些情况下,通常这种句法结构意在为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如,“具有A、B和C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A,具有单独的B,具有单独的C,A和B一起,A和C一起,B和C一起,和/或A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一种”的惯例的那些情况下,通常这种句法结构意在为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如,“具有A、B或C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A,具有单独的B,具有单独的C,A和B一起,A和C一起,B和C一起,和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解,实际上,无论在说明书、权利要求书还是在附图中,呈现两个或更多个替代术语的任何分离性词语和/或措辞应被理解为设想到包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。
此外,当本公开内容的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时,本领域技术人员将认识到,本公开内容还由此以马库什组的任何个体成员或成员子组描述。
如本领域技术人员将理解的,为了任何和所有目的,诸如在提供书面描述方面,本文公开的所有范围还涵盖该范围的任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并使相同的范围能被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例,本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的,所有语言,诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所陈述的数字,并且指可以随后分解为如上文讨论的子范围的范围。最后,如本领域技术人员将理解的,范围包括每个个体的成员。因此,例如,具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地,具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组,等等。
尽管本文已经公开了各种方面和实施方案,但其他方面和实施方案对本领域技术人员将是明显的。本文公开的各种方面和实施方案用于说明的目的而并不旨在限制,真正范围和精神由所附权利要求指出。
Claims (84)
1.一种用于处理样品的方法,包括:
使包含血细胞和至少一种微生物的样品与裂解缓冲液接触以产生经处理的样品,其中所述裂解缓冲液包含能够裂解所述样品中的血细胞的体细胞消化剂(SDA),其中所述SDA是式1的化合物,
式1
其中x是从2至20的整数,且其中y是从6至11的整数,从而裂解所述样品中的所述血细胞。
2.根据权利要求1所述的方法,其中y是从8至10的整数,并且任选地y是8。
3.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中x是从5至15的整数,任选地x是从8至12的整数,并且还任选地x是9或10。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述SDA是壬苯醇醚-9。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液中所述SDA的浓度为约0.01g/L至约10g/L。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液中所述SDA的浓度为约0.01%(w/w)至约10%(w/w),任选地为约0.01%(w/w)至约1%(w/w),并且还任选地为约0.52%(w/w)。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述样品来源于怀疑患有感染的受试者的血培养物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述样品包括被确定为其中包含至少一种微生物的阳性血培养物样品。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述至少一种微生物选自包括以下的组:革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母;任选地所述至少一种微生物包括以下一种或更多种:表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(E.coli)和肺炎链球菌(S.pneumoniae)。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述接触步骤包括声处理、渗透冲击、化学处理或其任何组合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液包含一种或更多种蛋白酶和/或一种或更多种核酸酶。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,所述方法包括从所述经处理的样品中分离所述至少一种微生物以产生至少一种分离的微生物;任选地从所述经处理的样品中分离所述至少一种微生物包括从裂解的血细胞中分离所述至少一种微生物,并且还任选地从裂解的血细胞中分离所述至少一种微生物包括:
离心所述经处理的样品以产生沉淀和上清液;以及
弃去所述上清液,同时保留包含至少一种分离的微生物的沉淀。
13.根据权利要求12所述的方法,所述方法还包括从所述至少一种分离的微生物制备铺板的纯培养物并分析从所述铺板的纯培养物获得的微生物。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法,所述方法还包括从所述至少一种分离的微生物制备接种物并分析从所述接种物获得的至少一种微生物。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,所述方法还包括:
将包含至少一种分离的微生物的所述沉淀的至少一部分沉积在表面上,所述表面适于放置在配置成通过质谱确定所述至少一种微生物的身份的装置中;
任选地,干燥沉积样品;
用挥发性酸溶液处理所述沉积样品,其中挥发性酸的体积百分比是与所述沉积样品组合的所述挥发性酸溶液的至少70%;
任选地,干燥经处理的沉积样品;
将基质放置在所述经处理的沉积样品上;以及
任选地,干燥所述经处理的沉积样品。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述挥发性酸溶液是在水中的挥发性酸或在有机溶剂中的挥发性溶液;并且任选地所述有机溶剂包括乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯或其任何组合。
17.根据权利要求15-16中任一项所述的方法,其中当与所述沉积样品组合时,所述挥发性酸溶液是以约70%至约90%的体积百分比在水中的甲酸。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法,所述方法还包括在用挥发性酸溶液处理所述沉积样品之前,用有机溶剂处理所述沉积样品并干燥所述沉积样品。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法,所述方法还包括在使所述样品与所述裂解缓冲液接触之前、同时和/或之后使所述样品与含有胆碱的溶液接触。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述含有胆碱的溶液包含至少一种季铵盐,所述季铵盐包含选自由式2组成的组的N,N,N-三甲基乙醇铵阳离子,
式2
其中R1、R2和R3独立地代表选自由饱和烃基团、不饱和烃基团、芳族基团及其组合组成的组中的一种,并且其中X代表带负电荷的基团。
21.根据权利要求20所述的方法,其中X选自由以下组成的组:氯离子、氟离子、硝酸根和碳酸氢根。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法,其中所述含有胆碱的溶液包含氯化胆碱、磷酰胆碱或两者。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法,其中在与所述样品接触时,胆碱的最终浓度大于或等于按体积计约0.25%或约1%。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的方法,其中在所述接触期间,所述样品中胆碱的浓度在按体积计约0.25%至按体积计约10%的范围内,并且任选地在按体积计约1.8%至约4%的范围内。
25.根据权利要求19-24中任一项所述的方法,其中所述接触包括使所述样品与所述含有胆碱的溶液孵育长达20分钟,并且其中所述孵育的温度为室温。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液还包含消泡剂。
27.根据权利要求1-25中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液不包含消泡剂。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液还包含至少一种硫醇;任选地所述至少一种硫醇包括L-半胱氨酸HCL、巯基乙酸钠、巯基乙胺、巯基琥珀酸、巯基乙醇、巯基乙磺酸、硫代甘油或其任何组合;还任选地所述裂解缓冲液中所述至少一种硫醇的浓度为约0.005g/L至4g/L。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述至少一种硫醇包含在所述裂解缓冲液中浓度为约0.01g/L至约2.5g/L的L-半胱氨酸,和/或在所述裂解缓冲液中浓度为约0.01g/L至约2.5g/L的巯基乙酸钠。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液还包含氯化铵,其中所述裂解缓冲液中氯化铵的浓度为约0.01g/L至约80g/L。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液还包含营养基础溶液,所述营养基础溶液包含以下一种或更多种:在所述裂解缓冲液中浓度为约8g/L至约35g/L的酪蛋白胨、在所述裂解缓冲液中浓度为约2g/L至约10g/L的氯化钠、在所述裂解缓冲液中浓度为约1.5g/L至约15g/L的大豆蛋白胨、在所述裂解缓冲液中浓度为约0.5g/L至约5g/L的磷酸钾,以及至少一种其他营养物。
32.根据权利要求31所述的方法,其中所述至少一种其他营养物包括在所述裂解缓冲液中浓度为约10g/L至约50g/L的营养肉汤。
33.根据权利要求31-32中任一项所述的方法,其中所述至少一种其他营养物包括营养肉汤,所述营养肉汤包含以下一种或更多种:(i)胰蛋白胨;(ii)大豆;(iii)NaCl;(iv)磷酸氢二钾(K2HPO4)和(v)葡萄糖。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液还包含营养肉汤、等渗缓冲液、蛋白胨和盐中的一种或更多种,任选地所述裂解缓冲液中所述营养肉汤的浓度为约10g/L至约50g/L。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法,其中所述营养肉汤包括胰酪胨大豆肉汤。
36.根据权利要求34-35中任一项所述的方法,其中所述等渗缓冲液包括磷酸钠、磷酸钾、磷酸盐缓冲盐水、盐水或其任何组合,任选地所述裂解缓冲液中等渗缓冲液的浓度为约1g/L至约20g/L。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法,其中所述蛋白胨包括酪蛋白胨和/或大豆蛋白胨。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液还包含丙酮酸钠、酵母提取物、柠檬酸钠、肉蛋白胨、右旋糖、磷酸盐缓冲盐水或其任何组合。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液还包含至少一种另外的非离子去污剂,任选地所述至少一种另外的非离子去污剂包括皂苷。
40.根据权利要求1-38中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液不包含另外的非离子去污剂。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法,所述方法还包括鉴定所述至少一种微生物。
42.根据权利要求41所述的方法,其中鉴定所述至少一种微生物包括质谱、表型鉴定、抗微生物剂易感性测试、分子测试或其任何组合。
43.根据权利要求15-42中任一项所述的方法,其中质谱包括以下的一种或更多种:电喷雾电离质谱(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、硅的解吸/电离(DIOS)、次级离子质谱(SIMS)、四极杆飞行时间(Q-TOF)、大气压化学电离质谱(APCI-MS)、APCJ-MS/MS、APCI-(MS)n、大气压光电离质谱(APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS)n、四极杆质谱、傅立叶变换质谱(FTMS)和离子阱质谱,其中n是大于零的整数。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法,其中所述SDA不损伤所述至少一种微生物。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法,其中所述至少一种微生物在所述SDA的存在下保持完整。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法,其中与采用不包含所述SDA的裂解缓冲液的可比方法相比,所述方法产生高至少5%的MALDI评分。
47.根据权利要求46所述的方法,其中所述可比方法采用包含皂苷的裂解缓冲液。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液选择性地裂解所述样品中的至少约1%、至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的血细胞。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法,其中在所述接触步骤之后裂解的血细胞与裂解的至少一种微生物的细胞的比例为至少约2:1。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法,其中至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的所述至少一种微生物的细胞在所述接触步骤之后保持完整和/或有活力。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液不包含缓冲剂。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液是酸性的。
53.根据权利要求41-52中任一项所述的方法,其中鉴定所述至少一种微生物不包括光谱术,并且任选地所述光谱术是固有荧光光谱术。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法,其中所述方法不包括密度梯度离心。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液不包含:
(a)皂苷;
(b)一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:X-100、/>X-100-R、X-114、NP-40、/>C-100、/>X-100、/>CA 630、ArlasolveTM200、/>96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、单十二烷基九乙二醇醚(C12E9,聚多卡醇)、十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆盐、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、酰胺基磺基甜菜碱-14、C7BzO、/>98、/>58、/>35、80、/>20、/>L64、/>P84、非去污剂磺基甜菜碱(NDSB 201)、amphipol(PMAL-C8)和甲基-β-环糊精;
(c)一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:X-100、/>X-100-R、X-114、NP-40、Igepal CA 630、Arlasolve 200、/>96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、单十二烷基九乙二醇醚;
(d)一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆盐、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、酰胺基磺基甜菜碱-14、C7BzO;
(e)一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:97、/>96V、/>C-100、/>X-100和聚多卡醇;和/或
(f)包含结构C12-18/E9-10的聚氧乙烯去污剂,其中C12-18表示12个至18个碳原子的碳链长度,并且E9-10表示9个至10个氧乙烯亲水性头基团。
56.一种组合物,所述组合物包含:
裂解缓冲液,所述裂解缓冲液包含能够裂解血细胞的体细胞消化剂(SDA),其中所述SDA是式1的化合物,
式1
其中x是从2至20的整数,并且其中y是从6至11的整数;以及
血细胞和/或其碎片。
57.根据权利要求56所述的组合物,其中y是从8至10的整数,任选地y是8。
58.根据权利要求56-57所述的组合物,其中x是从5至15的整数,任选地x是从8至12的整数,并且还任选地x是9或10。
59.根据权利要求56所述的组合物,其中所述SDA是壬苯醇醚-9。
60.根据权利要求56-59中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液中所述SDA的浓度为约0.01g/L至约10g/L。
61.根据权利要求56-60中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液中所述SDA的浓度为约0.01%(w/w)至约10%(w/w),任选地为约0.01%(w/w)至约1%(w/w),并且还任选地为约0.52%(w/w)。
62.根据权利要求56-61中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液包含一种或更多种蛋白酶和/或一种或更多种核酸酶。
63.根据权利要求56-62中任一项所述的组合物,所述组合物还包含含有胆碱的溶液,所述含有胆碱的溶液包含至少一种季铵盐,所述季铵盐包含选自由式2组成的组的N,N,N-三甲基乙醇铵阳离子,
式2
其中R1、R2和R3独立地代表选自由饱和烃基团、不饱和烃基团、芳族基团及其组合组成的组中的一种,并且其中X代表带负电荷的基团。
64.根据权利要求63所述的组合物,其中X选自由以下组成的组:氯离子、氟离子、硝酸根和碳酸氢根。
65.根据权利要求63-64中任一项所述的组合物,其中所述含有胆碱的溶液包含氯化胆碱、磷酰胆碱或两者。
66.根据权利要求56-65中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液还包含消泡剂。
67.根据权利要求56-66中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液不包含消泡剂。
68.根据权利要求56-67中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液还包含至少一种硫醇;任选地所述至少一种硫醇包括L-半胱氨酸HCL、巯基乙酸钠、巯基乙胺、巯基琥珀酸、巯基乙醇、巯基乙磺酸、硫代甘油或其任何组合;并且还任选地所述裂解缓冲液中所述至少一种硫醇的浓度为约0.005g/L至4g/L。
69.根据权利要求68所述的组合物,其中所述至少一种硫醇包含在所述裂解缓冲液中浓度为约0.01g/L至约2.5g/L的L-半胱氨酸,和/或在所述裂解缓冲液中浓度为约0.01g/L至约2.5g/L的巯基乙酸钠。
70.根据权利要求56-69中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液还包含氯化铵,其中所述裂解缓冲液中氯化铵的浓度为约0.01g/L至约80g/L。
71.根据权利要求56-70中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液还包含营养基础溶液,所述营养基础溶液包含以下一种或更多种:在所述裂解缓冲液中浓度为约8g/L至约35g/L的酪蛋白胨、在所述裂解缓冲液中浓度为约2g/L至约10g/L的氯化钠、在所述裂解缓冲液中浓度为约1.5g/L至约15g/L的大豆蛋白胨、在所述裂解缓冲液中浓度为约0.5g/L至约5g/L的磷酸钾,以及至少一种其他营养物。
72.根据权利要求71所述的组合物,其中所述至少一种其他营养物包括在所述裂解缓冲液中浓度为约10g/L至约50g/L的营养肉汤。
73.根据权利要求71-72中任一项所述的组合物,其中所述至少一种其他营养物包括营养肉汤,所述营养肉汤包含以下一种或更多种:i)胰蛋白胨;ii)大豆;iii)NaCl;iv)磷酸氢二钾(K2HPO4)和v)葡萄糖。
74.根据权利要求56-73中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液还包含营养肉汤、等渗缓冲液、蛋白胨和盐中的一种或更多种;任选地所述裂解缓冲液中所述营养肉汤的浓度为约10g/L至约50g/L;并且还任选地所述营养肉汤包括胰酪胨大豆肉汤。
75.根据权利要求74所述的组合物,其中所述等渗缓冲液包括磷酸钠、磷酸钾、磷酸盐缓冲盐水、盐水或其任何组合,任选地所述裂解缓冲液中等渗缓冲液的浓度为约1g/L至约20g/L。
76.根据权利要求56-75中任一项所述的组合物,其中所述蛋白胨包括酪蛋白胨和/或大豆蛋白胨。
77.根据权利要求56-76中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液还包含丙酮酸钠、酵母提取物、柠檬酸钠、肉蛋白胨、右旋糖、磷酸盐缓冲盐水或其任何组合。
78.根据权利要求56-77中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液还包含至少一种另外的非离子去污剂,任选地所述至少一种另外的非离子去污剂包括皂苷。
79.根据权利要求56-77中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液不包含另外的非离子去污剂。
80.根据权利要求56-79中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液不包含缓冲剂。
81.根据权利要求56-80中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液是酸性的。
82.根据权利要求56-81中任一项所述的组合物,其中所述裂解缓冲液不包含:
(a)皂苷;
(b)一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:X-100、/>X-100-R、X-114、NP-40、/>C-100、/>X-100、/>CA 630、ArlasolveTM200、/>96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、单十二烷基九乙二醇醚(C12E9,聚多卡醇)、十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆盐、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、酰胺基磺基甜菜碱-14、C7BzO、/>98、/>58、/>35、80、/>20、/>L64、/>P84、非去污剂磺基甜菜碱(NDSB 201)、amphipol(PMAL-C8)和甲基-β-环糊精;
(c)一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:X-100、/>X-100-R、X-114、NP-40、Igepal CA 630、Arlasolve 200、/>96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、单十二烷基九乙二醇醚;
(d)一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆盐、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、酰胺基磺基甜菜碱-14、C7BzO;
(e)一种或更多种选自由以下组成的组的去污剂:97、/>96V、/>C-100、/>X-100和聚多卡醇;和/或
(f)包含结构C12-18/E9-10的聚氧乙烯去污剂,其中C12-18表示12个至18个碳原子的碳链长度,并且E9-10表示9个至10个氧乙烯亲水性头基团。
83.根据权利要求56-82中任一项所述的组合物,其中所述至少一种微生物在所述SDA的存在下保持完整。
84.根据权利要求56-83中任一项所述的组合物,其中所述SDA不损伤所述至少一种微生物。
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