CN112646803B - 一种病毒基因组核酸提取试剂盒、方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸提取技术领域，具体公开了一种病毒基因组核酸提取试剂盒、方法及应用。本发明的试剂盒包括裂解液、结合液，所述裂解液包括脱氧胆酸钠和盐酸胍，所述脱氧胆酸钠和所述盐酸胍的摩尔比为1：(240‑420)；所述结合液包括Triton X‑100和Tween 20，所述Triton X‑100和所述Tween 20的体积比为1：(0.1‑0.3)。本发明的试剂盒和检测方法无需样品预处理，可直接高效、高质地提取病毒基因核酸。

Description

一种病毒基因组核酸提取试剂盒、方法及应用

技术领域

本发明涉及核酸提取技术领域，具体地说，涉及一种病毒基因组核酸提取试剂盒、方法及应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，简称“新冠肺炎”，是一种由病毒引起的急性呼吸道传染性疾病。国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组将该病毒命名为SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)，由其所引起的疾病被世界卫生组织命名为COVID-19(Corona Virus Disease 2019)。其传染源主要来源于SARS-CoV-2感染者，无症状携带者也是传染源。临床数据表明，SARS-CoV-2感染的危重患者多见于老年人、糖尿病、高血压等有基础疾病的人群，但也表现出家庭聚集性的密切接触者感染。传染性强，严重影响人体健康，因此必须高度重视新型冠状病毒肺炎的防治，加强对新型冠状病毒的检测。目前主要将逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(ReverseTranscriptionQuantitative Real-time Poly-merase Chain Reaction，RT-qPCR)检测新型冠状病毒的核酸作为确诊及治疗监测的重要指标。但影响新冠病毒核酸检测结果的因素很多，尽管多数实验室都在关注检测试剂的性能，但实际上，核酸纯度及浓度对于RT-qPCR检测过程的设计也十分重要。

病毒基因组的提取效率直接影响样本的检测结果，对于病毒含量较低的临床样本，病毒核酸提取效率的高低对检测样本的阳性率影响较大。目前，对于大批量样本的核酸提取多采用商品化试剂盒，磁珠法提取以其简易、方便及提取效率高等优势占据主要市场。磁珠法核酸提取的原理是利用表面标记了一种官能团的纳米级磁珠微珠，官能团能与核酸吸附，蛋白质等杂质不会与磁珠吸附，磁珠可以在磁场下聚集和分散，从而实现将核酸与杂质分离的目的。因此，有望基于磁珠法进一步优化病毒核酸的检测提取方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种无需样品预处理，可直接高效地提取病毒基因核酸的试剂盒、方法和应用。

为了实现本发明的发明目的，本发明的技术方案如下：

一种病毒基因组核酸提取试剂盒，其包括裂解液、结合液，所述裂解液包括脱氧胆酸钠和盐酸胍，所述脱氧胆酸钠和所述盐酸胍的摩尔比为1：(240-420)；所述结合液包括Triton X-100和Tween 20，所述Triton X-100和所述Tween 20的体积比为1：(0.1-0.3)。

本发明经研究发现，在裂解液中加入特定比例的脱氧胆酸钠和盐酸胍，可充分破坏蛋白质三维结构，变性和溶解内源性DNase和RNase，并在PH值7.5～8.0环境中可使磁珠发挥更大的吸附能力，尽可能多地吸附标本中释放出来的核酸，从而获得高浓度的核酸，且显著缩短提取时间，实现快速高效准确检测。Tween 20可与多糖、多酚形成络合物，减少糖类、酚类等杂质的污染，去除溶液中的色素，有效提高核酸纯度。结合液中的Triton X-100作为一种非离子型表面活性剂，可以溶解脂类以增加细胞膜的通透性，利于核酸的释放；本发明将两者以特定比例结合，使得其可在PH值7.5～8.0环境中，更易溶解脂类以增加细胞膜的通透性，更利于核酸的释放以及基因组的完整性；同时更高效的与多糖、多酚形成络合物，减少糖类、酚类等杂质的污染，去除溶液中的色素，进一步有效提高核酸纯度。

本发明中，所述裂解液中所述脱氧胆酸钠的浓度为0.4％-2％，优选0.4％-1％。

本发明中，所述裂解液还包括：浓度为0.001M-0.005M的Tris-HCl、浓度为0.001M-0.005M的EDTA2Na、浓度为0.05％-0.25％的SDS、浓度为0.001M-0.005M的NaCl和浓度为0.3％-1.5％的异丙醇。

本发明裂解液各组分可相互配合，实现有效裂解，保证提取效果和效率。

本发明中，所述结合液中所述Triton X-100的体积浓度为2％-10％，优选2％-5％。

本发明中，所述结合液还包括：浓度为0.001M-0.005M的Tris-HCl、浓度为0.001M-0.005M的EDTA2Na和浓度为40％-80％的无水乙醇。

本发明结合液各组分可相互配合，实现基因组的有效完整释放，提高提取效果和纯度。

本发明中，所述病毒基因组核酸提取试剂盒还包括洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、DEPC水、Carrier RNA、蛋白酶K和磁珠悬液；其中，洗涤液Ⅰ中含有体积浓度为40％-60％的乙醇，洗涤液Ⅱ中含有体积浓度为60％-80％的乙醇。

优选磁珠为超顺磁性羧基纳米微粒。

本发明还通过大量试验的调试验证，摸索出洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ中的乙醇最适浓度比，从而尽可能地消除了核酸的水化层，使更多的带负电荷的磷酸基团暴露出来；在沉淀形成的部位降低多核苷酸链之间的排斥作用，更易于与Na⁺互相聚合形成沉淀，同时最大限度地减少了乙醇残留对后续PCR扩增产生的抑制反应。

本发明中，所述病毒基因组核酸提取试剂盒具体包括：裂解液、结合液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、DEPC水、Carrier RNA、蛋白酶K和磁珠悬液；

其中，裂解液的组成如下：浓度为0.001M的Tris-HCl、浓度为0.001M的EDTA2Na、浓度为0.05％的SDS、浓度为0.001M的NaCl、浓度为0.4％的脱氧胆酸钠、浓度为3M的盐酸胍和浓度为0.3％的异丙醇；

结合液的组成如下：浓度为0.001M的Tris-HCl、浓度为0.001M的EDTA2Na、浓度为2％的Triton X-100、浓度为0.2％的Tween 20和浓度为45％的无水乙醇；

洗涤液Ⅰ的组成如下：浓度为0.002M的Tris-HCl和体积浓度为60％的乙醇；

洗涤液Ⅱ的组成如下：浓度为0.002M的Tris-HCl和体积浓度为75％的乙醇。

本发明所提供的一种病毒基因核酸提取试剂盒，优选各组分分别为：

1)裂解液：Tris-HCl、EDTA2Na、SDS、NaCl、脱氧胆酸钠、盐酸胍、异丙醇组成；

2)结合液：Tris-HCl、EDTA2Na、Triton X-100、Tween 20、无水乙醇组成；

3)洗涤液Ⅰ：Tris-HCl、乙醇；

4)洗涤液Ⅱ：Tris-HCl、乙醇；

5)DEPC水；

6)Carrier RNA；

7)蛋白酶K；

8)磁珠悬液：50mg/mL，800nm超顺磁性羧基纳米微粒。

本发明还提供一种病毒基因组核酸提取方法，其采用上述病毒基因组核酸提取试剂盒进行提取。

本发明中，提取方法具体包括：

(1)制备Carrier RNA的DEPC水溶液和蛋白酶K的DEPC水溶液；

(2)将待测样本与所述Carrier RNA的DEPC水溶液、蛋白酶K的DEPC水溶液和裂解液混合孵育；

(3)加入磁珠悬液，进行磁吸附分离；

(4)加入结合液，进行磁吸附分离；

(5)加入洗涤液Ⅰ，进行磁吸附分离；

(6)加入洗涤液Ⅱ，进行磁吸附分离；

(7)干燥后加入DEPC水进行洗脱后，分离磁珠。

本发明方法不用对待测样本进行预处理，可直接将样本加入到裂解液中进行灭活及基因组核酸提取，特别是针对来源于具有传染性机体的脱落细胞，无需单独处理，避免交叉感染。

本发明另提供一种上述病毒基因组核酸提取试剂盒或方法在新型冠状病毒基因组核酸提取中的应用。

本发明试剂盒和方法可用于血清、血浆、淋巴液、唾液、痰液、尿液、粪便稀释液和培养细胞上清液等样品的高效率提取获得病毒基因组核酸，可适用于RT-qPCR、基因分型、基因测序以及样本保存等多种用途，还可应用于输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。本发明试剂盒及其方法还可以用于包括口咽、鼻咽、食管、肺黏膜、胃黏膜、阴道、胸膜腔、腹膜腔、心包腔积液和脑脊髓膜腔积液等脱落细胞。

本发明的有益效果至少在于：

本发明的试剂盒和方法在一个体系中一次性完成对待测样本的细胞裂解，核酸释放，蛋白、糖类和酚类等杂质去除，磁珠吸附等一系列过程，重复性好，提取效率高。可适用于手工法和仪器法两种提取方法均可获得高浓度病毒基因组核酸。具体采用在反应体系中加入脱氧胆酸钠和超顺磁性羧基纳米微粒，配合各反应液组分搭配，一次性消化裂解细胞并吸附裂解释放出来的病毒核酸，超强吸附能力将实验过程由通常的30min～1h缩短至15min左右，实现快捷、高效、自动化地获取待测样本中的核酸，以便进一步用于RT-qPCR、基因分型、基因测序以及样本保存等。

本发明试剂盒提取病毒基因组核酸时，摒弃了酚-氯仿抽提法，避免了对操作人员的身体伤害，同时配备了手工法和仪器法两种提取方法，可满足不同类型的实验室环境和仪器设施需求。尤其是利用核酸提取仪进行核酸提取可实现快速、高通量、自动化提取过程，快捷、高效的提取样本中DNA和RNA。

具体地，手工法采用磁性分离器吸附磁珠，仪器法则根据不同厂家、型号的核酸提取仪，按照预先设定的程序将各试剂组分提前分装至96深孔板中并进行裂解，结合，再用含有不同浓度梯度乙醇的洗涤液进行漂洗，最后用无DNase和RNase的DEPC水进行洗脱，可实现快速、高通量、自动化的提取过程。

所述试剂盒和方法需要的样本量非常低，亦可提取得到高浓度的基因组核酸。通过本发明所述的试剂盒及其方法得到的高浓度基因组核酸，其经过微量分光光度计检测A260/A280比值大于1.8，表明无蛋白和酚类物质污染；A260/A230的比值大于2.0，表明无糖类、酚类、盐类等其他有机溶剂污染；满足所有基因研究和临床检测的样本要求。

附图说明

图1为本发明实验例1中，实施例1的六种试剂盒荧光定量PCR检测结果图。

图2为本发明实验例1中，实施例1与对比例1提取核酸电泳对比图。

图3为本发明实验例2中，实施例1的方法重复性验证核酸电泳图。

图4为本发明实验例3中，实施例2与对比例2提取PCR产物电泳对比图。

图5为本发明实验例3中，实施例2与对比例2提取PCR扩增曲线对比图。

图6为本发明实验例3中，实施例2的方法重复性验证PCR产物电泳图。

图7为本发明实验例3中，实施例2的方法重复性验证PCR扩增曲线图。

图8为本发明对比例3中荧光定量PCR检测结果图。

图9为本发明对比例4中荧光定量PCR检测结果图。

图10为本发明对比例5中荧光定量PCR检测结果图。

图11为本发明对比例6中荧光定量PCR检测结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供一种使用手工法以本发明试剂盒进行病毒基因组核酸提取的方法。

所用试剂盒制备方法如下：

1)裂解液：

①Tris储存液：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris，分子量121.14)60.57g，加400mL的灭菌水进行溶解，用磁力搅拌器充分混匀至沉淀完全溶解后，室温25℃下用浓HCl调节pH值至7.5±0.2，补加灭菌水定容至500mL。将配制好的溶液用0.22μm滤膜过滤后待用。

②EDTA-2Na储存液：称取乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na，分子量372.24)93.06g，加400mL的灭菌水进行溶解，缓慢加入200mg的NaOH固体颗粒，用磁力搅拌器充分混匀至沉淀完全溶解后，室温25℃下用10M NaOH溶液调节pH值至8.0±0.2，补加灭菌水定容至500mL。将配制好的溶液用0.22μm滤膜过滤后待用。

③SDS储存液：称取十二烷基硫酸钠(SDS，分子量288.38)50g，加400mL的灭菌水进行溶解，用磁力搅拌器加热并充分混匀至沉淀完全溶解后，补加灭菌水定容至500mL。将配制好的溶液用0.22μm滤膜过滤后待用。

④NaCl储存液称取氯化钠(NaCl，分子量58.44)73.05g，加400mL的灭菌水进行溶解，用磁力搅拌器充分混匀至沉淀完全溶解后，补加灭菌水定容至500mL。将配制好的溶液用0.22μm滤膜过滤后待用。

⑤脱氧胆酸钠储存液：称取脱氧胆酸钠(分子量414.55)50g，加400mL的灭菌水进行溶解，用磁力搅拌器加热并充分混匀至沉淀完全溶解后，补加灭菌水定容至500mL。将配制好的溶液用0.22μm滤膜过滤后待用。

⑥盐酸胍储存液：称取盐酸胍(分子量95.53)764.24g，加400mL的灭菌水进行溶解，用磁力搅拌器加热并充分混匀至沉淀完全溶解后，补加灭菌水定容至1000mL。将配制好的溶液用0.22μm滤膜过滤后待用。

⑦DEPC水：量取2000mL灭菌水，加2mL焦碳酸二乙酯(DEPC)，25℃恒温摇床400rpm过夜混匀(混匀时间不低于8h)，121℃高压处理30min。将配制好的溶液分装至DEPC水浸泡过夜处理后的玻璃瓶中待用。

分别取1M Tris储存液1mL、0.5M EDTA-2Na储存液2mL、10％SDS储存液5mL、2.5MNaCl储存液0.4mL、10％脱氧胆酸钠储存液20mL、40mL、60mL、80mL、100mL、8M盐酸胍储存液250mL、375mL、500mL、625mL、750mL、异丙醇3mL，用DEPC水定容至1000mL，配制成5种裂解液(脱氧胆酸钠和盐酸胍具有5种浓度梯度)，分别分装至Nuclease-free低吸附塑料瓶中，用于获得试剂盒1-5；另设一对照裂解液，其不加入脱氧胆酸钠储存液和盐酸胍储存液，其余组分与上述裂解液相同，用于获得试剂盒6。

各试剂盒的裂解液中脱氧胆酸钠、盐酸胍的浓度见表1。

表1

	脱氧胆酸钠％	盐酸胍M
			试剂盒1	0.2	2
试剂盒2	0.4	3
			试剂盒3	0.6	4
试剂盒4	0.8	5
			试剂盒5	1.0	6
试剂盒6	0	0

2)结合液

分别取1M Tris储存液1mL、0.5M EDTA-2Na储存液2mL、Triton X-100原液10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、Tween 20原液1mL、2mL、5mL、10mL、15mL、无水乙醇450mL，用DEPC水定容至1000mL，配制成5种结合液(Triton X-100和Tween 20具有5种浓度梯度)；分别分装至Nuclease-free低吸附塑料瓶中，再分别对应分装至上述5种试剂盒1-5中。另设一对照结合液，其不加入Triton X-100和Tween 20，其余组分与上述结合液相同，用于获得上述试剂盒6。

各试剂盒的结合液中Triton X-100、Tween 20的浓度见表2。

表2

	Triton X-100％	Tween 20％
			试剂盒1	1	0.1
试剂盒2	2	0.2
			试剂盒3	3	0.5
试剂盒4	4	1.0
			试剂盒5	5	1.5
试剂盒6	0	0

试剂盒1-6中其余组分相同，具体如下：

3)洗涤液Ⅰ

分别取1M Tris储存液2mL、无水乙醇600mL，用DEPC水定容至1000mL，配制成洗涤液Ⅰ，分装至Nuclease-free低吸附塑料瓶中；

4)洗涤液Ⅱ

分别取1M Tris储存液2mL、无水乙醇750mL，用DEPC水定容至1000mL，配制成洗涤液Ⅱ，分装至Nuclease-free低吸附塑料瓶中；

5)DEPC水

配制好的DEPC水分装至Nuclease-free低吸附塑料瓶中；

6)Carrier RNA

称取0.3mg Carrier RNA干粉(杭州新景生物试剂开发有限公司，货号：4003201)至Nuclease-free低吸附离心管中。

7)蛋白酶K

称取20mg蛋白酶K干粉至Nuclease-free低吸附离心管中。

8)磁珠悬液

磁珠悬液(上海领骏生物科技有限公司，货号：160012，平均粒径为800nm)分装前需在血液混悬仪上3档转速混匀30min，分装至Nuclease-free低吸附离心管中。

使用各试剂盒具体提取过程包括以下步骤：

①取300μL DEPC水至Carrier RNA干粉管中，颠倒混匀至完全溶解后待用。另取1mL DEPC水至蛋白酶K干粉管中，颠倒混匀至完全溶解后待用。

②取200μL待测样本至Nuclease-free低吸附离心管中。

③加入5μL Carrier RNA溶液、20μL蛋白酶K溶液和300μL裂解液，震荡混匀，置于65℃孵育5min，期间颠倒混匀。

④加入20μL磁珠悬液震荡混匀，将离心管放置于磁性分离器上静置至磁珠完全吸附后，小心吸弃液体。

⑤加入600μL结合液震荡混匀，将离心管放置于磁性分离器上静置至磁珠完全吸附后，小心吸弃液体。

⑥加入600μL洗涤液Ⅰ震荡混匀，将离心管放置于磁性分离器上静置至磁珠完全吸附后，小心吸弃液体。

⑦加入600μL洗涤液Ⅱ震荡混匀，将离心管放置于磁性分离器上静置至磁珠完全吸附后，小心吸弃液体。

⑧将离心管放置于磁性分离器上，开盖室温晾干。

⑨加入50μL DEPC水震荡混匀，置于56℃孵育5min。

⑩将离心管放置于磁性分离器上静置至磁珠完全吸附后，小心吸取上清液至一个新的Nuclease-free低吸附离心管中，待下游实验检测或于-25℃～-15℃保存待用。以上提取过程大约需要15分钟。

实施例2

本实施例提供一种使用仪器法以本发明试剂盒进行病毒基因组核酸提取的方法。

所用试剂盒如实施例1所述。

具体提取过程包括如下：

采用天隆NP968-C全自动核酸提取仪，选取适配机型的Nuclease-free 96深孔板，按照下表3加入相应试剂及待测样本。

表3

按照下表4设定程序。

表4

程序结束后，将第6、12列孔中的上清液吸取至一个新的Nuclease-free低吸附离心管中，待下游实验检测或于-25℃～-15℃保存待用。以上提取过程大约需要15分钟。

对比例1

本对比例采用手工法提取病毒基因组核酸，提取流程参照康为世纪生物科技有限公司生产的CWY071试剂盒。

1)在1.5mL离心管，加入20μL蛋白酶K，200μL待测样本，200μL裂解缓冲液，300μL异丙醇，涡旋震荡混匀5秒后，置于室温，1200rpm的恒温混匀仪上震荡混匀10分钟。

2)向离心管中加入10μL磁珠悬浮液，漩涡震荡10秒，置于室温，1200rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟。

3)将离心管置于磁力架，磁珠完全吸附后，小心吸弃所有液体。

4)向离心管中加入500μL漂洗缓冲液1，涡旋振荡，置于室温，1200rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟。

5)将离心管置于磁力架，磁珠完全吸附后，小心吸弃所有液体。

6)向离心管中加入500μL漂洗缓冲液2，涡旋振荡，置于室温，1200rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟。

7)将离心管置于磁力架，磁珠完全吸附后，小心吸弃所有液体。

8)晾干离心管2～5分钟，确保无乙醇残留。

9)向离心管中加入100μL无RNA酶的水，涡旋震荡，56℃，1200rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟。

10)离心管置于磁力架上，磁珠吸附后，收集核酸溶液于新的离心管中，置于-80℃长期保存。以上提取过程大约需要30分钟。

对比例2

本对比例采用核酸提取仪提取病毒基因组核酸，提取流程参照康为世纪生物科技有限公司生产的CWY071试剂盒。提取仪使用康为世纪生物科技有限公司生产的CWE2100核酸提取仪。

1)按照下表5向96孔深孔板中加入相应试剂：

表5

2)将加样板放入CWE2100仪器，放入磁棒套，运行CWE2100-CWY071程序。运行结束后取出96孔深孔板，将第6、12列的样本转移至离心管中，-80℃长期保存。以上提取过程大约需要30分钟。

实验例1

本实验例对实施例1中的6种试剂盒的提取效果进行荧光定量PCR检测。

具体以同一份新型冠状病毒为阳性的待测样本(咽拭子)进行提取后，进行检测，检测方式参见实验例3。

检测结果见图1。

从图1中可知，同一样本采用试剂盒1～6提取的PCR产物进行比较，试剂盒6的裂解液中不加入脱氧胆酸钠和盐酸胍、结合液中不加入Triton X-100和Tween 20提取效率最低，由此可知，裂解液中的脱氧胆酸钠和盐酸胍、结合液中的Triton X-100和Tween 20是关键因子；此外，裂解液中的脱氧胆酸钠和盐酸胍的不同配比、结合液中的Triton X-100和Tween 20的不同配比，对提取效率影响显著，本发明试剂盒2的效果最佳。

本实验例进一步以本发明实施例1和对比例1的方法对相同的5份新型冠状病毒为阳性的待测样本(咽拭子)分别进行提取后，采用电泳法进行检测。其中，以实施例1的方法进行测试时，使用实施例1中记载的试剂盒2。5份待测样本(来源于不同取样对象)1～5号保存温度与时间分别为：样本1为2℃～8℃保存时间小于24小时；样本2为2℃～8℃保存3天；样本3为2℃～8℃保存7天；样本4为-25℃～-15℃保存1个月；样本5为-40℃～-80℃保存3个月。

具体地，将提取的基因组核酸用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。配制100mL凝胶时加入10μL GelRed核酸染料。分别取5μL核酸提取样本，加入1μL Loading buffer混合点样，并点样5μL DNA Marker，电泳条件为电压5.6V/cm，时间20min，用紫外凝胶成像系统对电泳结果进行拍照。

电泳检测结果见图2。其中，B1～B5为采用本发明实施例1的方法提取核酸电泳检测结果，D1～D5为采用对比例1的方法提取核酸电泳检测结果。从图2中可知，使用本发明试剂盒和康为世纪公司生产的试剂盒提取的核酸进行比较，样本保存时间越长，核酸降解越快，提取效率越低；本发明试剂盒仅提取保存3个月的样本提取物条带亮度稍弱，而对比试剂盒提取保存3天的样本提取物条带已经明显减弱，提取保存7天、1个月和3个月的样本提取物条带几乎不可见；此外，同一保存时间样本比较，本发明试剂盒提取物电泳条带亮度明显高于对比试剂盒，有提取物的背景拖尾弱于对比试剂盒，即说明本发明试剂盒提取产量更高，残留物少，更具有优势。

实验例2

以本发明实施例1的方法对实验例1中随机抽取的一份样本行10次提取，考察该方法重复性。其中，以实施例1的方法进行测试时，使用实施例1中记载的试剂盒2。

采用实验例1中的电泳法进行检测。结果见图3，其中S1～S10分别为10次提取核酸电泳检测结果。从图3中可知，来源于同一取样对象的样本10份，重复使用本发明试剂盒提取，电泳条带亮度均一，即重复性好，干扰因素影响小，更具有优势。

另各取2μL基因组核酸提取样本，以DEPC水为空白，用微量分光光度计(NanoDropOne^c)测定波长为230nm、260nm和280nm的吸光度值，即A230、A260和A280。获得的结果见表6。

表6提取物吸光度比值

样本名称	A260/A280	A260/A230
			S1	1.85	2.04
S2	1.86	2.03
			S3	1.84	2.03
S4	1.83	2.05
			S5	1.86	2.08
S6	1.85	2.08
			S7	1.82	2.07
S8	1.84	2.03
			S9	1.86	2.02
S10	1.87	2.01

本发明的试剂盒及其方法提取得到的基因组核酸经微量分光光度计检测，A260/A280比值均大于1.8，表明无蛋白和酚类物质污染；A260/A230的比值均大于2.0，表明无糖类、盐类或有机溶剂污染。

实验例3

本实验例对采用实施例2(以实施例2的方法，使用实施例1中记载的试剂盒2)和对比例2的方法对实验例1中的5份待测样本的提取结果进行电泳和PCR检测。PCR检测方法：各取5μL核酸提取物作为模板，使用硕世生物科技有限公司生产的JC10223-1N试剂盒进行荧光定量PCR检测。PCR仪使用ABI公司生产的ABI 7500荧光定量PCR仪。

加样(样品处理区)：按以下表7反应条件加入各反应液。

表7

RT-PCR扩增检测(核酸扩增区)，见表8：

表8

结果判读：

在阳性对照和空白对照均正常的情况下进行结果分析：FAM通道为新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因、VIC通道为新型冠状病毒(2019-nCoV)N基因、CY5通道为内标。

阳性对照：FAM、VIC和CY5三通道检测结果均为Ct≤30.00，视为正常；

空白对照：FAM、VIC和CY5三通道检测结果均为“UNDET”，视为正常；

待测样本：

阳性：待测样本单通道或双通道检测结果Ct≤37，曲线呈S型且有明显指数增长期，判为阳性；

阴性：所有通道Ct>40或未检出，此次结果判断为阴性；

可疑：当出现任一通道及双通道检测结果37<Ct≤40时，应对样本进行重复检测，如复检实验结果单通道Ct值≤37或者两个通道Ct值在37～40范围，曲线呈标准S型且有明显指数增长期，则判断为阳性，否则判断为阴性；

内标：样本内标CY5通道检测结果应Ct≤37，否则采样复测。当样本判读为阳性时，如内标Ct>37或未检出，结果仍可信。

采用实施例2和对比例2方法获得的提取物的PCR产物电泳(电泳方式与实验例1相同)和PCR扩增(PCR方式如本实验例中所述)结果见图4和图5，其中，B6～B10为实施例2中采用试剂盒2进行5份待测样本提取后的结果，D6～D10为对比例2对应进行5份待测样本提取后的结果。

从图4中可知，5份待测样本(编号为6-10)分别使用本发明试剂盒和康为世纪公司生产的试剂盒提取的PCR产物进行比较，针对同一样本本发明试剂盒提取物电泳条带亮度明显高于对比试剂盒，背景拖尾弱于对比试剂盒，即提取纯度高，杂质少，更具有优势。

从图5中可知，5份待测样本(编号为6-10)分别使用本发明试剂盒和康为世纪公司生产的试剂盒提取的PCR扩增曲线图，针对同一样本本发明试剂盒提取物的Ct值明显小于对比试剂盒，扩增曲线明显高于对比试剂盒，即提取效率高，抑制物少，更具有优势。

本实验例进一步从实验例1中随机抽取一份样本采用本发明实施例2的方法，使用实施例1中记载的试剂盒2进行10次提取后进行PCR检测(检测方法如上所述)，考察实施例2方法的重复性。结果参见图6、图7和表9(PCR扩增曲线Ct值)。其中，P1～P10分别代表各次结果。

表9

名称	COVID-19Ct	内标Ct
			P1	17.60	19.80
P2	17.06	19.32
			P3	18.47	20.07
P4	17.85	20.00
			P5	16.95	19.34
P6	17.97	19.97
			P7	17.34	19.58
P8	18.41	19.95
			P9	17.02	19.42
P10	17.54	18.86

从图6中可知，同一来源样本提取10次，重复使用本发明试剂盒提取并进行扩增反应，PCR产物电泳条带亮度均一，背景几乎无拖尾，即重复性好，残留物少，更具有优势。

从图7中可知，同一来源样本提取10次，重复使用本发明试剂盒提取并进行扩增反应，提取物Ct值偏差小，扩增曲线高度均一，即精密度好，减少了对PCR反应的污染，更具有优势。

对比例3

本对比例提供一种核酸提取方式，其与实施例1的方法相同，区别仅在于，将实施例1的5个试剂盒中的裂解液进行改变，具体依次将试剂盒1-5中的脱氧胆酸钠换为碘化钠，并在试剂盒1-5中对应采用如表10所示的浓度，其余组分和浓度不变。

表10

	碘化钠％
		试剂盒D3-1	0.5
试剂盒D3-2	1.0
		试剂盒D3-3	1.5
试剂盒D3-4	1.8
		试剂盒D3-5	2.0

从实验例1中随机抽取一份样本，以实施例1的方法(采用试剂盒2)和对比例3方法(采用试剂盒D3-1～D3-5)分别进行检测，荧光定量PCR检测结果参见图8(检测方法同实验例3)，其中，SZ1为实施例1试剂盒2提取的结果，DZ1～DZ5为对比例3中碘化钠五个浓度梯度裂解液组分(分别对应试剂盒D3-1～D3-5)的结果。

从图8中可知，采用本发明实施例1中试剂盒2的Ct值远远小于采用对比例3各试剂盒的Ct值，说明以本发明方案的试剂盒进行测试可以大大提高核酸提取效率。

对比例4

本对比例提供一种核酸提取方式，其与实施例1的方法相同，区别仅在于，将实施例1的5个试剂盒中的裂解液进行改变，具体依次将试剂盒1-5中的盐酸胍换为异硫氰酸胍，并在试剂盒1-5中对应采用如表11所示的浓度，其余组分和浓度不变。

表11

	异硫氰酸胍M
		试剂盒D4-1	2
试剂盒D4-2	3
		试剂盒D4-3	4
试剂盒D4-4	5
		试剂盒D4-5	6

从实验例1中随机抽取一份样本，以实施例1的方法(采用试剂盒2)和对比例4方法(采用试剂盒D4-1～D4-5)分别进行检测，荧光定量PCR检测结果参见图9(检测方法同实验例3)，其中，SZ2为实施例1试剂盒2提取的结果，DZ6～DZ10为对比例4中异硫氰酸胍五个浓度梯度裂解液组分(分别对应试剂盒D4-1～D4-5)的结果。

从图9中可知，采用本发明实施例1中试剂盒2的Ct值远远小于采用对比例4各试剂盒的Ct值，说明以本发明方案的试剂盒进行测试可以大大提高核酸提取效率。

对比例5

本对比例提供一种核酸提取方式，其与实施例1的方法相同，区别仅在于，将实施例1的5个试剂盒中的结合液进行改变，具体依次将试剂盒1-5中的Triton X-100换为NP-40，并在试剂盒1-5中对应采用如表12所示的浓度，其余组分和浓度不变。

表12

从实验例1中随机抽取一份样本，以实施例1的方法(采用试剂盒2)和对比例5方法(采用试剂盒D5-1～D5-5)分别进行检测，荧光定量PCR检测结果参见图10(检测方法同实验例3)，其中，SZ3为实施例1试剂盒2提取的结果，DZ11～DZ15为对比例5中NP-40五个浓度梯度结合液组分(分别对应试剂盒D5-1～D5-5)的结果。

从图10中可知，采用本发明实施例1中试剂盒2的Ct值远远小于采用对比例5各试剂盒的Ct值，说明以本发明方案的试剂盒进行测试可以大大提高核酸提取效率。

对比例6

本对比例提供一种核酸提取方式，其与实施例1的方法相同，区别仅在于，将实施例1的5个试剂盒中的结合液进行改变，具体依次将试剂盒1-5中的Tween 20换为PEG 400，并在试剂盒1-5中对应采用如表13所示的浓度，其余组分和浓度不变。

表13

	PEG 400％
		试剂盒D6-1	0.1
试剂盒D6-2	0.25
		试剂盒D6-3	0.5
试剂盒D6-4	0.75
		试剂盒D6-5	1

从实验例1中随机抽取一份样本，以实施例1的方法(采用试剂盒2)和对比例6方法(采用试剂盒D6-1～D6-5)分别进行检测，荧光定量PCR检测结果参见图11(检测方法同实验例3)，其中，SZ4为实施例1试剂盒2提取的结果，DZ16～DZ20为对比例6中PEG 400五个浓度梯度结合液组分(分别对应试剂盒D6-1～D6-5)的结果。

从图11中可知，采用本发明实施例1中试剂盒2的Ct值远远小于采用对比例6各试剂盒的Ct值，说明以本发明方案的试剂盒进行测试可以大大提高核酸提取效率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种病毒基因组核酸提取试剂盒，其特征在于，包括裂解液、结合液，所述裂解液包括脱氧胆酸钠和盐酸胍；所述结合液包括Triton X-100和Tween 20，所述Triton X-100和所述Tween 20的体积比为1：（0.1-0.3）；

所述裂解液中所述脱氧胆酸钠的浓度为0.4%-1%，所述盐酸胍的浓度为3M-6M，所述裂解液还包括：浓度为0.001M-0.005M的Tris-HCl、浓度为0.001M-0.005M的EDTA2Na、浓度为0.05%-0.25%的SDS、浓度为0.001M-0.005M的NaCl和浓度为0.3%-1.5%的异丙醇；

所述结合液中所述Triton X-100的体积浓度为2%-5%，所述结合液还包括：浓度为0.001M-0.005M的Tris-HCl、浓度为0.001M-0.005M的EDTA2Na和浓度为40%-80%的无水乙醇。

2.根据权利要求1所述的病毒基因组核酸提取试剂盒，其特征在于，所述病毒基因组核酸提取试剂盒还包括洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、DEPC水、Carrier RNA、蛋白酶K和磁珠悬液；其中，洗涤液Ⅰ中含有体积浓度为40%-60%的乙醇，洗涤液Ⅱ中含有体积浓度为60%-80%的乙醇。

3.根据权利要求2所述的病毒基因组核酸提取试剂盒，其特征在于，所述病毒基因组核酸提取试剂盒包括：裂解液、结合液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、DEPC水、Carrier RNA、蛋白酶K和磁珠悬液；

其中，裂解液的组成如下：浓度为0.001M的Tris-HCl、浓度为0.001M的EDTA2Na、浓度为0.05%的SDS、浓度为0.001M的NaCl、浓度为0.4%的脱氧胆酸钠、浓度为3M的盐酸胍和浓度为0.3%的异丙醇；

结合液的组成如下：浓度为0.001M的Tris-HCl、浓度为0.001M的EDTA2Na、浓度为2%的TritonX-100、浓度为0.2%的Tween20和浓度为45%的无水乙醇；

洗涤液Ⅰ的组成如下：浓度为0.002M的Tris-HCl和体积浓度为60%的乙醇；

洗涤液Ⅱ的组成如下：浓度为0.002M的Tris-HCl和体积浓度为75%的乙醇。

4.一种病毒基因组核酸提取方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的病毒基因组核酸提取试剂盒进行提取。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括：

（1）制备Carrier RNA的DEPC水溶液和蛋白酶K的DEPC水溶液；

（2）将待测样本与所述Carrier RNA的DEPC水溶液、蛋白酶K的DEPC水溶液和裂解液混合孵育；

（3）加入磁珠悬液，进行磁吸附分离；

（4）加入结合液，进行磁吸附分离；

（5）加入洗涤液Ⅰ，进行磁吸附分离；

（6）加入洗涤液Ⅱ，进行磁吸附分离；

（7）干燥后加入DEPC水进行洗脱后，分离磁珠。

6.权利要求1-3任一项所述的病毒基因组核酸提取试剂盒或权利要求4-5任一项所述的方法在新型冠状病毒基因组核酸提取中的应用。

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