CN111808847A - 一种一步法快速提取核酸的释放剂及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于核酸提取技术领域，具体为一种一步法快速提取核酸的释放剂，包括下述原料：醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐，交联聚维酮PVPP，氢氧化钠，Tris‑HCL，海藻糖，DMSO。与传统的离心柱法、萃取法、磁珠法等核酸提取方法相比，本发明无需复杂的样本处理过程，无需特殊的仪器和操作设备，一步法即可对样本进行核酸提取并用于下游的PCR扩增或恒温扩增，过程中全程闭管操作，避免了样本处理过程的样品交叉污染和环境污染，同时大大提高了检测效率，可实现野外的实时核酸检测过程，可广泛应用于病原体检测，基因型检测，农业与疾控等领域的现场检测。
Description
技术领域
本申请属于核酸提取技术领域，具体为一种一步法快速提取核酸的释放剂及其制备和使用方法。
背景技术
分子检测方法由于具有的高敏感性、高通量和适合的价格，越来越多的应用在各种病原体的诊断中。核酸扩增技术是分子生物学领域常用的技术，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是使用最为广泛的核酸扩增技术，可以扩增和分离目的基因，以其灵敏性、特异性和快速性得到广泛应用。然而，PCR技术需要反复的热变性，无法摆脱依赖精良仪器设备的局限，从而限制了其在临床现场检测中的应用。自20世纪90年代初，很多实验室尝试发展无须热变性的核酸恒温扩增技术，现已开发出了如依赖核酸序列的扩增、链置换扩增、核酸序列扩增、转录酶扩增、滚环扩增、环介导恒温扩增、解链酶扩增等多种恒温扩增技术。
无论何种核酸扩增技术都需要将细胞或病毒内的核酸成分裂解暴露出来，常常需要对检测样本进行核酸提取纯化，常用的核酸提取方法包括萃取方法，离心柱法，磁珠法等，萃取法需要用到大量有毒试剂基本现在用的很少，离心柱法主要用于科研实验室中，磁珠法由于可以实现在核酸检测过程中实现全自动化应用非常普遍，但全自动核酸提取设备非常昂贵，上述方法都需要投入大量的时间，其复杂的提取步骤容易造成交叉污染。
因此，为能更加快速准确的进行疫病检测，如何实现免核酸提取成为了疫病检测急需解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本申请提供了一种一步法快速提取核算的释放剂及其制备和使用方法，本申请是通过下述方案实现的：
一种一步法快速提取核酸的释放剂，包括下述原料：醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐，交联聚维酮PVPP，氢氧化钠，Tris-HCL，海藻糖，DMSO和水。
优选的，稀释剂中醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐的质量浓度为1-3％，交联聚维酮PVPP的质量浓度为0.5-3％，氢氧化钠的质量浓度为1mg/mL-30mg/mL，Tris-HCL的浓度为1mM-100mM，海藻糖的质量浓度为5-8％，DMSO的质量浓度为2-5％。
优选的，所述稀释剂的pH为7.9-8.1。
优选的，于50℃下将醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐，交联聚维酮PVPP，氢氧化钠，Tris-HCL，海藻糖，DMSO和水在常温下混合均匀即可得到释放剂。
优选的，将待测样本与释放剂以体积比1：1-4的比例混合均匀，静置10-30min即可将核酸释放出来。
优选的，将待测样本粉碎后与释放剂以体积比1：1-4的比例混合均匀，静置10-30min即可将核酸释放出来。
优选的，将待测样本粉碎后在56℃下进行30分钟灭活处理，后与释放剂以体积比1：1-4的比例混合均匀，静置10-30min即可将核酸释放出来。
有益效果：与传统的离心柱法、萃取法、磁珠法等核酸提取方法相比，本申请无需复杂的样本处理过程，无需特殊的仪器和操作设备，一步法即可对样本进行核酸提取并用于下游的PCR扩增或恒温扩增中，且过程中全程闭管操作，避免了样本处理过程的样品交叉污染和环境污染，同时大大提高了检测效率，可实现野外的实时核酸检测过程，可广泛应用于病原体检测，基因型检测，农业与疾控等领域的现场检测。
本申请的一步法核酸提取释放剂应用样本广泛，可用于血清，血浆，全血，口咽拭子，鼻咽拭子，细菌，真菌，各种组织细胞，尿液，PCR产物等。
醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐：对细胞和病毒的外层蛋白脂类结构进行破坏，促进核酸释放的同时，不影响核酸的活性，也不会影响后续核酸扩增的扩增效率和酶活性；
PVPP可以在液体中形成交联，吸附蛋白等非核酸物质，对核酸起到保护作用，促进杂质蛋白的去除；
氢氧化钠为释放剂提供碱性环境，促进核酸的释放，同时可以加速蛋白等杂质的裂解变性；
Tris-HCL作为缓冲液成分存在，保证液体环境的PH值稳定，同时后续核酸扩增体系也使用Tris-HCL作为缓冲液成分，可以进行后续过度；
海藻糖作为细胞裂解促进成分，形成高渗环境，促进细胞的裂解和核酸释放，同时也可以起到保护核酸和后续扩增反应体系中酶活性的作用；
DMSO作为重要的促溶剂存在，可以对很多有机物质进行保护，包括后续反应体系中的酶和探针成分。
本发明的一步法核酸提取释放剂应用样本广泛，可用于血清，血浆，全血，口咽拭子，鼻咽拭子，细菌，真菌，各种组织细胞，尿液，PCR产物等。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1，呼吸道合胞病毒样本01核酸一步法提取荧光定量PCR扩增结果，磁珠法对比无明显差异。
图2，呼吸道合胞病毒样本02核酸一步法提取荧光定量PCR扩增结果，磁珠法对比无明显差异。
图3，呼吸道合胞病毒样本03核酸一步法提取荧光定量PCR扩增结果，磁珠法对比无明显差异。
图4，肺炎支原体样本01核酸一步法提取重组酶恒温扩增结果，磁珠法对比无明显差异。
图5，肺炎支原体样本02核酸一步法提取重组酶恒温扩增结果，磁珠法对比无明显差异。
图6，肺炎支原体样本03核酸一步法提取重组酶恒温扩增结果，磁珠法对比无明显差异。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
一种一步法快速提取核酸的释放剂，包括下述原料：醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐，交联聚维酮PVPP，氢氧化钠，Tris-HCL，海藻糖，DMSO和水。
实施例2
在实施例1的基础上，稀释剂中醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐的质量浓度为1-3％，交联聚维酮PVPP的质量浓度为0.5-3％，氢氧化钠的质量浓度为1mg/mL-30mg/mL，Tris-HCL的浓度为1mM-100mM，海藻糖的质量浓度为5-8％，DMSO的质量浓度为2-5％。
实施例3
在实施例2的基础上，所述稀释剂的pH为7.9-8.1。
实施例4
在实施例3的基础上，于50℃下将醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐，交联聚维酮PVPP，氢氧化钠，Tris-HCL，海藻糖，DMSO和水在常温下混合均匀即可得到释放剂。
实施例5
在实施例4的基础上，将待测样本与释放剂以体积比1：1-4的比例混合均匀，静置10-30min即可将核酸释放出来。
实施例6
在实施例5的基础上，将待测样本粉碎后与释放剂以体积比1：1-4的比例混合均匀，静置10-30min即可将核酸释放出来。
实施例7
在实施例6的基础上，将待测样本粉碎后在56℃下进行30分钟灭活处理，后与释放剂以体积比1：1-4的比例混合均匀，静置10-30min即可将核酸释放出来。
实验一：呼吸道合胞病毒咽拭子样本一步法核酸提取释放剂应用实例
一种一步法快速提取核酸的释放剂，包括下述原料：醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐，交联聚维酮PVPP，氢氧化钠，Tris-HCL，海藻糖，DMSO和水；
优选的，稀释剂中醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐的质量浓度为2％，交联聚维酮PVPP的质量浓度为1％，氢氧化钠的质量浓度为20mg/mL，Tris-HCL的浓度为50mM，海藻糖的质量浓度为5％，DMSO的质量浓度为4％；
优选的，于50℃下将醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐，交联聚维酮PVPP，氢氧化钠，Tris-HCL，海藻糖，DMSO和水在常温下混合均匀即可得到释放剂；
样本处理：使用生理盐水作为保存液采集呼吸道合胞病毒阳性患者鼻咽拭子后，在保存液中不断上下左右混匀7-8次。取200uL保存液，使用磁珠法核酸提取试剂提取病毒核酸，并溶解于100ul洗脱液中；取100uL保存液，加入本实验所制备的100uL核酸提取释放剂，混匀；
加样：磁珠法洗脱液取最终样本5uL加入到PCR反应体系中，一步法核酸提取释放剂取5uL加入到PCR反应体系中；
引物探针设计：按照引物探针设计原则，设计呼吸道合胞病毒核酸检测引物探针。
| 引物名称 | 引物序列(5′-3′) |
| 上游引物 | GAGCGTCCTCTGGAAATCG |
| 下游引物 | CTACCCCTGGTTTGAACATTTCT |
| 探针 | FAM-TCTGGTAATGGCATCCTCAAGTG-BHQ2 |
(1)按照如下配方配制呼吸道合胞病毒荧光PCR试剂
| 试剂 | 用量(μl) | 终浓度 |
| PCR缓冲液(2x) | 25 | 1x |
| 上游引物(50μmol/L) | 4 | 0.2μM |
| 下游引物(50μmol/L) | 4 | 0.2μM |
| 探针(50μmol/L) | 2 | 0.1μM |
| RT-PCR酶类(5U/μL) | 1 | 2.5U/50μl |
| ddH<sub>2</sub>0 | 9 | |
| 总体积 | 45 |
(1)将步骤(1)所述试剂混匀后，按照45μL/孔分装至八联管中，加入5uL样本；
(2)反应温度体系：
55℃×20min；95℃×10min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环40次。
(3)采用3例临床样本对照进行荧光定量PCR结果对比如图1-3；
(4)结果分析：
检测结果如下表，对扩增Ct值进行分析，磁珠法与一步法核酸提取效率没有显著性差别，都可用于后续的病原体核酸扩增诊断：
实施例二：肺炎支原体一步法核酸提取释放剂恒温扩增应用实例
一种一步法快速提取核酸的释放剂，包括下述原料：醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐，交联聚维酮PVPP，氢氧化钠，Tris-HCL，海藻糖，DMSO和水；
优选的，稀释剂中醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐的质量浓度为1％，交联聚维酮PVPP的质量浓度为1％，氢氧化钠的浓度为20mg/mL，Tris-HCL的浓度为50mM，海藻糖的质量浓度为4％，DMSO的质量浓度为4％；
优选的，于50℃下将醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐，交联聚维酮PVPP，氢氧化钠，Tris-HCL，海藻糖，DMSO和水在常温下混合均匀即可得到释放剂。
样本处理：用生理盐水作为保存液采集肺炎支原体阳性患者鼻咽拭子后，在保存液中不断上下左右混匀7-8次。取200uL保存液，使用磁珠法核酸提取试剂提取病毒核酸，溶解于100ul洗脱液中；取100uL保存液，加入上述一步法核酸提取释放剂100uL，混匀；
加样：磁珠法洗脱液取最终样本5uL加入到PCR反应体系中，一步法核酸提取释放剂取5uL加入到PCR反应体系中；
引物探针设计：按照引物探针设计原则，设计肺炎支原体恒温扩增核酸检测引物探针。
(1)按照如下配方配制肺炎支原体恒温扩增试剂
(2)分别取6个反应管，按照上述体系配制反应液，对至少3例临床肺炎支原体阳性患者的待测样本进行恒温扩增技术对比。
(3)反应温度体系：42℃恒温扩增，15分钟，荧光分析仪进行荧光分析，如图4-6。
(4)结果分析：检测结果如下表，对扩增Ct值进行分析，磁珠法与一步法核酸提取效率没有显著性差别，都可用于后续的病原体核酸扩增诊断：
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种一步法快速提取核酸的释放剂，其特征在于，包括下述原料：醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐，交联聚维酮PVPP，氢氧化钠，Tris-HCL，海藻糖，DMSO和水。
2.如权利要求1所述的一种一步法快速提取核酸的释放剂，其特征在于，稀释剂中醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐的质量浓度为1-3％，交联聚维酮PVPP的质量浓度为0.5-3％，氢氧化钠的质量浓度为1mg/mL-30mg/mL，Tris-HCL的浓度为1mM-100mM，海藻糖的质量浓度为5-8％，DMSO的质量浓度为2-5％。
3.如权利要求2所述的一种一步法快速提取核酸的释放剂的制备方法，其特征在于，所述稀释剂的pH为7.9-8.1。
4.如权利要求2所述的一种一步法快速提取核酸的释放剂的制备方法，其特征在于，于50℃下将醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐，交联聚维酮PVPP，氢氧化钠，Tris-HCL，海藻糖，DMSO和水在常温下混合均匀即可得到释放剂。
5.如权利要求4所述的一种一步法快速提取核酸的释放剂的使用方法，其特征在于，将待测样本与释放剂以体积比1：1-4的比例混合均匀，静置10-30min即可将核酸释放出来。
6.如权利要求5所述的一种一步法快速提取核酸的释放剂的使用方法，其特征在于，将待测样本粉碎后与释放剂以体积比1：1-4的比例混合均匀，静置10-30min即可将核酸释放出来。
7.如权利要求6所述的一种一步法快速提取核酸的释放剂的使用方法，其特征在于，将待测样本粉碎后在56℃下进行30分钟灭活处理，后与释放剂以体积比1：1-4的比例混合均匀，静置10-30min即可将核酸释放出来。
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