CN113046486A - 一种基于lfd-rma法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组 - Google Patents

一种基于lfd-rma法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组 Download PDF

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Abstract

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于LFD‑RMA法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组，包括检测人类免疫缺陷病毒的引物对及对应的探针，所述下游引物的5’端用Biotin标记；探针的5’端用FAM标记，第33个碱基替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3‑spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。本发明的试剂盒灵敏度高、特异性好，检测方法效率高，能够有效地避免污染，有助于实现人类免疫缺陷病毒的早期诊断。

Description

一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组
技术领域
本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)又称艾滋病病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种逆转录病毒，属逆转录病科慢病毒亚科，有包膜，核心为两条正链RNA并与衣壳蛋白结合成双体结构。这一病毒会攻击并逐渐破坏人类的免疫系统，从而引起严重随机感染或继发肿瘤并致命，而艾滋病(获得性免疫缺陷综合征，AIDS)是人类免疫缺陷病毒感染的最后阶段。HIV根据基因结构、免疫学和流行病学的特征可分为HIV-1和HIV-2两种类型，目前世界范围的AIDS主要有HIV-1所致，约占95％。目前还没有能够有效预防AIDS的疫苗和特效的治疗方法，因此通过HIV检测，可以尽早发现、及时治疗HIV感染并预防HIV的传播。
目前HIV的检测方法主要包括抗体检测及核酸检测等。其中，抗体检测方法如酶联免疫吸附法(ELISA)存在以下问题：感染可能还处于窗口期，因此血清还没有形成典型的抗体反应；艾滋病进展到终末期时抗体水平下降；其他非病毒蛋白抗体的交叉反应与HIV P24核心蛋白抗体引起的反应很相似。常用的HIV核酸检测方法包括逆转录PCR实验(RT-PCR)、分支DNA杂交实验(bDNA)以及实时荧光定量PCR技术等。但这些方法都需要相关的昂贵仪器设备且需要有专业技术人员操作，因此在基层和现场的检测应用受到很大限制。
重组酶介导扩增(Recombinase Mediated Amplification,RMA)技术，作为一种等温核酸扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平；且RMA可以与侧流层析技术(LFD)结合，既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，仅使用侧流层析试纸就可以通过肉眼观察结果，因此可实现HIV的快速检测。
本发明采用LFD-RMA法建立快速检测人类免疫缺陷病毒HIV-1的方法，为人类免疫缺陷病毒HIV-1的现场检测提供一种快速、简单、可靠的新方法
发明内容
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组，本申请是通过下述方案实现的：
一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组，包括检测人类免疫缺陷病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：
HIV-1-F：
5’-TACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAG-3’；
HIV-1-R：
5’-[Biotin]TGGGTATCACTTCTGGGCTGAAAGCCTTCTCTT-3’；
HIV-1-P：
5’-[FAM]AGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAGG[dSpacer]CAGCCAAAATTACC[C3-spacer]-3’。
优选的，所述下游引物的5’端用Biotin标记；探针的5’端用FAM标记，第33个碱基替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。
一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，该试剂盒中包括有：核酸提取释放剂、含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性质控品、阴性质控品、侧流层析检测试纸条。
所述核酸提取释放剂包括：醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐MES、交联聚维酮PVPP、氢氧化钠、Tris-HCL、海藻糖、DMSO。
优选的，所述醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐MES的浓度为2％；所述交联聚维酮PVPP的浓度为1％；所述氢氧化钠的浓度为20mg/mL；所述Tris-HCL的浓度为50mM；所述海藻糖的浓度为5％；所述DMSO的浓度为4％。
所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括HIV-1引物对及检测探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、M-MLV逆转录酶、核酸内切酶IV。
所述缓冲液含有Tris、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
优选的，所述引物对及检测探针在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述M-MLV逆转录酶的终浓度为200ng/μL；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸内切酶IV的终浓度为80ng/μL。
所述阳性质控品为含有HIV-1基因片段的重组质粒，所述阴性质控品为不含有HIV-1的血清或血浆。
所述待测样本为血清或血浆。
此外，本发明还提供了一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的方法，包括以下步骤：
(1)设计用于HIV-1检测的引物对及探针；
(2)用核酸提取释放剂提取待测样本的RNA，提取方法为：将待测样本与核酸提取释放剂以体积比1:1-4的比例混合均匀，在56℃加热10-20min即可将核酸释放出来；
(3)以提取的待测样本RNA作为模板，加入上述试剂盒中的扩增反应试剂进行RMA扩增反应。扩增反应在恒温水浴锅中进行，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；
(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有HIV-1；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有HIV-1；
有益效果：相较于传统的离心柱法、萃取法、磁珠法等核酸提取方法，本发明无需复杂的样本处理过程，无需特殊的仪器和操作设备，一步法即可对样本进行核酸提取并用于下游的恒温扩增，过程中全程闭管操作，避免了样本处理过程的样品交叉污染和环境污染，同时大大提高了检测效率，可实现野外的实时核酸检测过程；
本发明使用冻干粉试剂，能够提高试剂稳定性，实现常温储存及运输，减少企业生产成本及客户使用成本；
本发明提供的基于LFD-RMA法快速检测HIV-1的试剂盒，与普通PCR方法相比，仅需在恒温水浴锅中37-42℃、30min内即可完成反应，对仪器设备要求低，无需热循环仪器，操作更加简单快速，同时可实现检测结果的可视化。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 LFD-RMA法检测HIV-1的灵敏性试验；
图2 LFD-RMA法检测HIV-1的特异性试验。
图中序号代表：1：1×105copies/μL；2：1×104copies/μL；3：1×103copies/μL；4：1×102copies/μL；5：1×101copies/μL。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
1、待测样本的采集和处理
血浆：将采集的抗凝全血1500-3000r/min离心15min，上层即为血浆，吸出置于合适的容器中，备用。
血清：用一次性注射器(或真空采血管)抽取5-10mL静脉血，室温下自然放置1-2h，待血液凝固、血块收缩后再用1500-3000r/min离心15min，吸出血清，置于合适的容器中，备用。
2、核酸的提取
取100μL待测样本，加入100μL核酸提取释放剂，混合均匀，在56℃加热10-20min即可将核酸释放出来。
所述核酸提取释放剂包括醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐MES、交联聚维酮PVPP、氢氧化钠、Tris-HCL、海藻糖、DMSO。
优选的，所述醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐MES的浓度为2％；所述交联聚维酮PVPP的浓度为1％；所述氢氧化钠的浓度为20mg/mL；所述Tris-HCL的浓度为50mM；所述海藻糖的浓度为5％；所述DMSO的浓度为4％。
3、阳性质控品的制备
以HIV-1的核酸作为模板，对HIV-1的特异性基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证，将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得质控品。
4、RMA引物与探针的设计
根据HIV-1的Gag基因设计了特异性RMA引物与探针，具体如表1所示：
表1引物与探针序列
Figure BDA0003039310620000061
5、RMA反应体系的建立
将42.5μL缓冲液和5μL提取的待测样本核酸加入到含有扩增反应试剂的检测管中，混匀，最后向管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀，将上述反应管放置于恒温水浴锅中进行RMA反应，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；每次反应均以阳性质控品作为阳性对照，以阴性质控品为阴性对照。
其中，所述恒温扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括HIV-1引物对及检测探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、M-MLV逆转录酶、核酸内切酶IV；
所述缓冲液含有Tris、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；
所述引物对及检测探针在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述M-MLV逆转录酶的终浓度为200ng/μL；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸内切酶IV的终浓度为80ng/μL。
所述阳性质控品为含有HIV-1基因片段的重组质粒；所述阴性质控品为不含有HIV-1的血清或血浆。
6、侧流层析试纸条检测方法的操作及结果判读
在RMA扩增结束后，将反应管放到含有侧流层析试纸条的一次性核酸检测装置中，5min后，通过试纸条的显色进行判读。若质控线(C)和检测线(T)均显色，则判读结果为阳性；若仅质控线显色，则为阴性；若质控线不显色，表明试纸条失效。
7、LFD-RMA法检测HIV-1的灵敏度分析
将阳性质控品经PBS进行10倍系列稀释(包括5×105、5×104、5×103、5×102、5×101copies/mL)，以阴性质控品作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行LFD-RMA反应，每个浓度重复3次试验。根据图1可知，LFD-RMA检测方法的最低检测限为5×103copies/mL。即，LFD-RMA法检测试剂盒的灵敏度达到5×103copies/mL。
8、LFD-RMA法检测HIV-1的特异性分析
为了检验LFD-RMA检测方法的特异性，选择HIV-1、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒螺旋体(TP)、EB病毒(EBV)等病原体核酸样本，用LFD-RMA方法进行检测，以阴性质控品作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图2可知，只有HIV-1阳性模板呈现质控线(C)和检测线(T)两条线，检测结果是阳性，其他病毒均只有质控线(C)一条线，检测结果是阴性。该结果表明所建立的LFD-RMA检测方法具有良好的特异性。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 济南国益生物科技有限公司
<120> 一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus 1，HIV-1)
<400> 1
tactgggaca gctacaacca tcccttcaga cag 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus 1，HIV-1)
<400> 2
tgggtatcac ttctgggctg aaagccttct ctt 33
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus 1，HIV-1)
<400> 3
agcagcagct gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacc 47

Claims (10)

1.一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组，其特征在于，包括检测人类免疫缺陷病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：
HIV-1-F：
5’-TACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAG-3’；
HIV-1-R：
5’-[Biotin]TGGGTATCACTTCTGGGCTGAAAGCCTTCTCTT-3’；
HIV-1-P：
5’-[FAM]AGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAGG[dSpacer]CAGCCAAAATTACC[C3-spacer]-3’。
2.如权利要求1所述的一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组，其特征在于，所述下游引物的5’端用Biotin标记；探针的5’端用FAM标记，第33个碱基替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。
3.如权利要求1所述的一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括有：核酸提取释放剂、含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性质控品、阴性质控品、侧流层析检测试纸条；所述核酸提取释放剂包括：醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐MES、交联聚维酮PVPP、氢氧化钠、Tris-HCL、海藻糖、DMSO。
4.如权利要求3所述的一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐MES的浓度为2％；所述交联聚维酮PVPP的浓度为1％；所述氢氧化钠的浓度为20mg/mL；所述Tris-HCL的浓度为50mM；所述海藻糖的浓度为5％；所述DMSO的浓度为4％。
5.如权利要求4所述的一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括HIV-1引物对及检测探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、M-MLV逆转录酶、核酸内切酶IV。
6.如权利要求5所述的一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液含有Tris、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
7.如权利要求6所述的一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述引物对及检测探针在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述M-MLV逆转录酶的终浓度为200ng/μL；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸内切酶IV的终浓度为80ng/μL。
8.如权利要求7所述的一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有HIV-1基因片段的重组质粒，所述阴性质控品为不含有HIV-1的血清或血浆。
9.如权利要求8所述的一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒可以检测的样品为血清或血浆。
10.如权利要求9所述的一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计用于HIV-1检测的引物对及探针；
(2)用核酸提取释放剂提取待测样本的RNA，提取方法为：将待测样本与核酸提取释放剂以体积比1:1-4的比例混合均匀，在56℃加热10-20min即可将核酸释放出来；
(3)以提取的待测样本RNA作为模板，加入上述试剂盒中的扩增反应试剂进行RMA扩增反应。扩增反应在恒温水浴锅中进行，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；
(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有HIV-1；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有HIV-1。
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