CN112195220A - 一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法 - Google Patents

Abstract

本申请属于试剂盒技术领域，具体为一种用于核酸快速检测的侧流层析‑重组酶恒温扩增方法，步骤如下：(1)提总RNA，通过反转录获得cDNA；(2)设计引物和探针；(3)将cDNA中加入扩增反应试剂进行RMA扩增反应；(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：阳性样品，扩增产物由于毛细管作用力从样品垫侧流至结合垫，其上的生物素与结合垫上的链霉亲和素特异性结合，复合物侧流至T线后，扩增产物上的荧光素与T线上的荧光素抗体特异性结合，结合垫上过量的链霉亲和素又与C线上的生物素特异性结合，结合垫上链霉亲和素被胶体金标记，T线与C线同时显色；阴性样品，结合垫上的链霉亲和素与C线上的生物素特异性结合，所以只有C线显色。

Description

一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法

技术领域

本申请属于试剂盒技术领域，具体为一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法。

背景技术

目前针对RNA病毒的较成熟的核酸检测技术主要有：实时荧光定量PCR、环介导等温扩增(LAMP)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增技术(RMA)和基因芯片等。实时荧光定量PCR由于检测灵敏度高，适用范围广，操作简便等原因应用广泛，但其操作程序复杂、需要精密的仪器、检测时间较长，不利于非实验室环境下现场检测以及基层实验室的推广应用。基因芯片可以一次分析大量样品，但容易出现假阳性，重复性差，且技术成本昂贵、复杂。核酸恒温扩增技术由于其具备敏感、特异、快速、简便，不需要昂贵仪器设备等特点，已经在多个领域开展应用。但LAMP需要4-6条引物，设计复杂；NASBA方法容易出现假阴性或假阳性结果。另外，LAMP和NASBA反应时间至少需要60min。

重组酶介导扩增(RMA)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。其原理是重组酶与引物结合形成复合体，并在双链DNA中识别同源序列；然后重组酶解开双链，引物与同源序列发生链交换反应并启动DNA合成，对模板进行指数式扩增；被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。RMA反应最适温度在37～42℃，整个过程在10-30min内即可完成，30min内就可以将靶序列扩增到10～12数量级，可实现核酸的快速检测。

RMA技术可以与侧向流动免疫层析技术(LFD)相结合进行扩增产物的检测。在RMA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被核酸内切酶IV(nfo酶)识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的RMA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。

本发明采用LFD-RMA技术建立快速检测核酸的方法，为核酸的现场检测提供一种快速、简便、灵敏的新方法。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法，本申请是通过下述方案实现的：

一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法，步骤如下：(1)提取待检测样本的总RNA，通过反转录获得cDNA；(2)设计用于核酸检测的引物和探针；(3)将反转录得到的cDNA中加入扩增反应试剂进行RMA扩增反应，扩增条件为：37-42℃水浴5min后，混匀，再37-42℃水浴15min；(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：对于阳性样品，扩增产物由于毛细管作用力从样品垫侧流至结合垫，其上的生物素与结合垫上的链霉亲和素特异性结合，复合物又侧流至T线后，扩增产物上的荧光素与T线上的荧光素抗体特异性结合，结合垫上过量的链霉亲和素又与C线上的生物素特异性结合，又因结合垫上链霉亲和素被胶体金标记，所以T线与C线同时显色；对于阴性样品，结合垫上的链霉亲和素与C线上的生物素特异性结合，所以只有C线显色。

优选的，所述步骤(2)中所述核酸的引物长度一般为30-35bp，GC含量占40-60％，5’端的3-5个核苷酸不可多于两个G，3’端应有G和C且连续的三个核苷酸不可相同；核酸探针长度为46-52个核苷酸，探针5’端标记FAM基团，中间THF(dSpacer)替代G或C，dSpacer修饰距5’端28-32个碱基，距3’端13-17个碱基，3’端用C3-spacer修饰抑制DNA链的延伸。

优选的，所述水浴的温度为38或40℃。

优选的，所述步骤(4)中所述的侧向流层析试纸条包括支撑板、样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫。

优选的，所述层析膜为硝酸纤维素膜；所述结合垫上含有链霉亲和素和胶体金复合物，C线上喷涂生物素，T线上喷涂荧光素抗体。

优选的，所述步骤(3)中所述的扩增反应试剂包括以下组分：

试剂	终浓度
		Tris	50mM
醋酸镁	100mM
		聚环氧乙烷	10％(w/v)
海藻糖	2mM
		甘露醇	2.5mM
ATP	10mM
		dNTPs	2mM
肌酸激酶	1000ng/mL
		磷酸肌酸	25mM
引物	10μM
		探针	10μM
大肠杆菌RecA蛋白	100ng/μL
		UvsY蛋白	40ng/μL
单链结合蛋白GP32	800ng/μL
		Bst聚合酶	60ng/μL
核酸外切酶III	80ng/μL

各组分浓度如上表。

优选的，该方法可用于血清、血浆、全血、口咽拭子、鼻咽拭子、细菌、真菌、各种组织细胞和尿液中核酸的检测。

其中，Tris作为缓冲液，用于维持反应体系的pH值，其pH为7.4；

聚环氧乙烷作为分子拥挤剂，可加大蛋白质和DNA的有效浓度，提高扩增反应效率，其分子量为120000；

醋酸镁维持反应离子环境；

海藻糖和甘露醇保持冷冻干燥过程中的酶活性；

ATP、肌酸激酶和磷酸肌酸提供持续能量，dNTPs提供合成单元；

重组酶是来自大肠杆菌的解旋蛋白RecA蛋白，它的功能是介导模板的解链以及实现模板和引物之间的链替换；

UvsY蛋白是一种辅助蛋白，可以协助或增强重组酶活性，是来自T4或T6噬菌体等的重组蛋白；

单链结合蛋白为来自大肠杆菌或T4噬菌体的GP32蛋白，可以局部结合被替换出来的同源DNA单链，避免其被核酸酶降解。

DNA聚合酶是Bst聚合酶，具有链置换活性，但不耐高温，因此非常适合在常温恒温条件下反应。

核酸内切酶IV可以识别并切割探针上的脱碱基位点(dSpacer)，产生新的羟基末端。

有益效果：本申请仅需要恒温水浴锅在37-42℃即可完成反应，对仪器设备要求低，无需热循环仪器，操作更加简单；

其次，检测速度快，反应时间在30min之内即可完成；

第三，可实现检测结果的可视化。

因此，本申请既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和检疫现场的核酸的快速筛查检测。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：侧流层析原理图；

图2：乙型流感病毒LFD-RMA检测方法的灵敏度试验；

图3：乙型流感病毒LFD-RMA检测方法的重复性试验；

图4：乙型流感病毒LFD-RMA检测方法的特异性试验。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施方式作进一步地详细描述。

实施例1

一种乙型流感病毒(Flu B)快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法，步骤如下：(1)根据乙型流感病毒非结构蛋白(NS)基因设计RMA引物与探针，如下表：

其中反向引物Flu B-R的5’端用Biotin标记；探针Flu B-P的5’端用FAM标记，第31个碱基替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰。

(2)阳性标准质粒的制备：根据病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取乙型流感病毒RNA，通过反转录，获得cDNA；以cDNA为模板，对NS基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证。将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得阳性质粒。

(3)RMA反应体系的建立：以反转录得到的cDNA为模板，加入下表所述RMA反应试剂，置于恒温水浴锅中进行RMA反应。扩增条件为：38℃水浴5min后，混匀，再38℃水浴15min。

(4)侧流层析试纸条检测方法的操作及结果判读：在RMA扩增结束后，取1μL RMA产物和49μL的产物稀释液，稀释至50μL，混合均匀后滴加于侧流层析试纸条加样垫。5min后，通过试纸条的显色进行判读。若质控线(C)和检测线(T)均显色，则判读结果为阳性；若仅质控线显色，则为阴性；若质控线不显色，表明试纸条失效。

(5)乙型流感病毒LFD-RMA检测方法的灵敏度及重复性检测：将标准阳性质粒经PBS进行10倍系列稀释(包括5×10⁵copies/μL，5×10⁴copies/μL，5×10³copies/μL，5×10²copies/μL，5×10¹copies/μL，5copies/μL，1copies/μL)，每个梯度的模板浓度做3个重复，以ddH₂O为阴性对照(NC)，通过RMA-侧流层析试纸条检测，验证LFD-RMA技术的批内重复性；另外，每间隔2d重复一次，共进行3次重复，验证LFD-RMA技术的批间重复性。所获得的RMA产物分别进行侧流层析试纸条检测。结果表明，LFD-RMA的检测限为5个拷贝(图2)。

(6)乙型流感病毒LFD-RMA检测方法的特异性分析：参照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取甲型流感病毒H1N1(Flu A H1N1)、甲型流感病毒H3N2(Flu A H3N2)、人冠状病毒(CoV)、副流感病毒(HPIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)的RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA。

按照上述步骤建立的RMA方法进行特异性试验，分别以乙型流感病毒Flu B的DNA，Flu A H1N1、Flu A H3N2、CoV、HPIV、RSV的cDNA为模板，以ddH₂O为阴性对照，进行RMA扩增，试验重复3次。

所有的RMA产物进行侧流层析试纸条检测，如图4所示，从图中可以看出，RMA扩增乙型流感病毒特异性好，与其它检测病毒无交叉反应。因此，该检测乙型流感病毒的RMA-侧流层析试纸条方法适用于鉴定未知样本的乙型流感病毒。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法，其特征在于，步骤如下：(1)提取待检测样本的总RNA，通过反转录获得cDNA；(2)设计用于核酸检测的引物和探针；(3)将反转录得到的cDNA中加入扩增反应试剂进行RMA扩增反应，扩增条件为：37-42℃水浴5min后，混匀，再37-42℃水浴15min；(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：对于阳性样品，扩增产物由于毛细管作用力从样品垫侧流至结合垫，其上的生物素与结合垫上的链霉亲和素特异性结合，复合物又侧流至T线后，扩增产物上的荧光素与T线上的荧光素抗体特异性结合，结合垫上过量的链霉亲和素又与C线上的生物素特异性结合，又因结合垫上链霉亲和素被胶体金标记，所以T线与C线同时显色；对于阴性样品，结合垫上的链霉亲和素与C线上的生物素特异性结合，所以只有C线显色。

2.如权利要求1所述的一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述核酸的引物长度一般为30-35bp，GC含量占40-60％，5’端的3-5个核苷酸不可多于两个G，3’端应有G和C且连续的三个核苷酸不可相同；核酸探针长度为46-52个核苷酸，探针5’端标记FAM基团，中间THF(dSpacer)替代G或C，dSpacer修饰距5’端28-32个碱基，距3’端13-17个碱基，3’端用C3-spacer修饰抑制DNA链的延伸。

3.如权利要求1所述的一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法，其特征在于，所述水浴的温度为38℃。

4.如权利要求1所述的一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的侧向流层析试纸条包括支撑板、样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫。

5.如权利要求4所述的一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法，其特征在于，所述层析膜为硝酸纤维素膜；所述结合垫上含有链霉亲和素和胶体金复合物，C线上喷涂生物素，T线上喷涂荧光素抗体。

6.如权利要求1所述的一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述的扩增反应试剂包括以下组分：

试剂 终浓度 Tris 50mM 醋酸镁 100mM 聚环氧乙烷 10％(w/v) 海藻糖 2mM 甘露醇 2.5mM ATP 10mM dNTPs 2mM 肌酸激酶 1000ng/mL 磷酸肌酸 25mM 引物 10μM 探针 10μM 大肠杆菌RecA蛋白 100ng/μL UvsY蛋白 40ng/μL 单链结合蛋白GP32 800ng/μL Bst聚合酶 60ng/μL 核酸外切酶III 80ng/μL

各组分浓度如上表。

7.如权利要求1所述的一种用于核酸快速检测的侧流层析-重组酶恒温扩增方法，其特征在于，该方法可用于血清、血浆、全血、口咽拭子、鼻咽拭子、细菌、真菌、各种组织细胞和尿液中核酸的检测。

Images