CN115074419A - 等温扩增核酸靶序列的方法 - Google Patents

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李春燕
朱兆奎
昃白尘
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Abstract

本发明提供一种等温扩增核酸靶序列的方法。该方法适用于双链DNA、单链DNA、单链RNA，包括切口酶和链置换酶的联合反应，在进行双链DNA和单链DNA检测时，采用3条引物和1条探针，而进行单链RNA检测时，可以为3条引物和1条探针，也可以是2条引物和1条探针。探针为分子信标，扩增过程中不发生降解，仅用于特异性结合目标片段，提供荧光信号，保证反应的特异性。本发明采用与引物之间在靶序列上的结合区域没有重叠的信标探针来实时判断结果，信标探针结合目标序列具有很强的特异性；同时反应后不开管，进一步避免假阳性的产生；反应在恒定温度下进行，耗时短，8min内即可完成检测，更符合POCT检测需求。

Description

等温扩增核酸靶序列的方法
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体来说是等温扩增核酸靶序列的方法。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR)是目前应用最广的一种核酸扩增检测技术(NucleicAcidAmplificationTest，NAAT)。该技术的经典反应包括变性、复性和延伸三个步骤，是一个需要温度快速循环的过程，需借助特定的热循环仪进行高精度的温度控制，消耗大量电力。同时反应时间较长，满足不了即时检测(POCT)的要求。尽管近年来有15-30分钟完成反应的产品面世，然而这些产品借助极为复杂的工业设计，成本过高。
为了解决PCR技术带来的诸多问题，出现了一系列的等温扩增技术。较常见的技术为重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、链置换扩增技术(SDA)、切口和延伸的扩增技术(NEAR)、转录扩增介导技术(TMA)等。
RPA技术依赖于三种酶：结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。通过重组酶识别单链核酸的互补序列，使它们结合，通过单链结合蛋白稳定结合区域，链置换DNA聚合酶进行延伸。反应一般在37-42℃进行，时长为15-30min，可加入特殊探针来判断结果。RPA涉及的组分较多，试剂成本过高。
LAMP利用链置换酶完成反应，通过设计4条或6条引物，通过形成茎环产物，在链置换酶的作用下，不断在茎环处起始反应。该技术需要30-45min完成，一般采用染料用于终点的判断。LAMP试剂价格便宜，不过用染料进行结果偏低，容易出现假阳性，引物设计难度较大。
SDA采用特殊修饰的核苷酸、内切酶和链置换DNA聚合酶，需要4条引物。使用解链引物和扩增引物与模板反应，生成两端带酶切位点的产物，因为带有修饰核苷酸的一端无法被内切酶切开，该产物在内切酶的作用下，产生切口，在链置换DNA聚合酶下进行置换延伸，形成指数型扩增。在双链DNA模板中，需要先进行高温解链和引物退火，再加入酶进行反应。反应时长一般在30-60min。
NEAR和SDA相似，采用切口酶和链置换，仅需要2条引物。这2条条引物(3′末端)之间的距离在1-5个碱基，通过引物侵入的作用，形成两端带切口酶位点的产物，该产物在切口酶和链置换DNA聚合酶的作用下，进行指数型扩增。产物可通过探针、染料进行分析。该技术已有不少的产品上市，在新冠病毒核酸检测中，出现灵敏度过低的报道。由于引物之间的距离过短，采用探针进行实时检测时，引物和探针之间由于有同源位置，容易出现假阳性。反应时长在12min左右。
转录扩增介导技术(TMA)通过反转录酶、RNA聚合酶进行反应，主要产物为RNA。反应时长15-60min。
CN104726549A公开了一种基于切口酶的双链等温扩增检测新方法，该方法使用3条引物，其中一条扩增引物可以设计成信标探针的方式，产物采用染料法、荧光法、电化学法、比色法、化学反光法进行分析，检测时长为30-60min。采用荧光法以外的方法都容易导致假阳性，而该专利对引物进行标记，使得反应无法正确进行，同时，标记引物的非特异反应都将带来假阳性结果。基于反应时间过长，产物分析不合理等因素，目前尚无产品上市。
发明内容
本发明的目的在于解决现有检测时间长、特异性差的技术问题。
为达到上述目的，第一方面，本发明提供一种等温扩增核酸靶序列的方法，包括如下步骤：
I、初始产物形成包括如下步骤：
A1、当所述单链靶标为单链的DNA时，将扩增引物P1和置换引物与单链靶标互补结合，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链靶标延伸扩增引物P1的同时用置换引物置换扩增引物P1的扩增产物；将由被置换出来的扩增引物P1延伸形成的产物作为单链模板；
A2、当所述单链靶标为单链RNA时，可通过两种方式反应获得单链模板：
(1)若所述DNA聚合酶兼具聚合酶功能、链置换功能和反转录功能，将扩增引物P1、置换引物和DNA聚合酶与单链RNA接触，所述单链RNA在DNA聚合酶反转录活性作用下反转录成cDNA，并被置换引物置换得到单链模板；
(2)若所述DNA聚合酶不具备反转录功能，需添加兼具RNaseH活性的反转录酶，将扩增引物P1和反转录酶与单链RNA接触，所述单链RNA在反转录酶作用下反转录成cDNA,形成cDNA-RNA复合双链产物，复合双链产物中的RNA链在反转录酶的RNaseH活性作用下水解得到单链模板。
B、将扩增引物P2与步骤A形成的单链模板互补结合，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链模板延伸扩增引物P2，再由切口酶作用于延伸产物，在切口处延伸并置换，形成两端各具1个酶切位点的双链初始产物；
II、指数扩增信号采集包括以下步骤：
C、将切口酶和DNA聚合酶与双链模板接触，所述双链模板在切口酶作用下产生双链切口位点，DNA聚合酶从所述切口位点出发扩增并置换得到可与扩增引物P1或P2互补的单链；
D、将扩增引物P1或P2与步骤C形成的单链互补结合，并在DNA聚合酶的作用下延伸形成两种各具1个酶切位点的双链产物；
E、将切口酶和DNA聚合酶与步骤D产生的两种双链产物接触，所述两种双链产物在切口酶作用下分别形成切口，DNA聚合酶从所述切口位点出发扩增并置换，分别得到可与扩增引物P1或P2互补的两条单链；单链再与扩增引物P1或P2接触，并在DNA聚合酶的作用下延伸形成双链产物；
F、重复步骤E，以指数形式得到扩增产物；
其中，上述步骤在等温的条件下实施，且无需在扩增前对靶序列进行变性；
步骤C～F还包括将扩增体系与分子信标探针互补结合，以提供荧光信号；
所述扩增引物P1和P2，沿5′-3′方向，依次包含稳定区、切口酶识别位点区以及能与靶序列互补的碱基区域；其中所述稳定区的长度为6-20bp；
所述置换引物与靶序列完全互补；
所述分子信标探针与靶序列互补或可与靶序列杂交，所述分子信标探针与所述扩增引物P1、P2在靶序列上的结合区域没有重叠；
所述单链靶标为单链的DNA时，所述单链靶标可以为单链DNA以及由双链DNA经切口酶和DNA聚合酶与双链DNA接触，在切口酶作用下产生切口，DNA聚合酶从所述切口出发扩增并置换得到的单链产物；
所述DNA聚合酶具有链置换功能；
所述方法为非疾病诊断目的。
优选地，所述扩增引物P1、P2上与靶序列互补的碱基区域位置进行修饰，所述修饰方式包括锁核酸修饰、甲基化修饰；
所述扩增引物P1和P2的3′端末端碱基之间处在靶序列上的距离不小于10bp。
分子信标可能包含和上述引物类似的常规合成修饰。
优选地，所述分子信标的长度为13-80bp，且所述分子信标与所述靶序列的结合位置为临近5‘端和3’不小于12bp的位置处。
优选地，扩增引物长度在17-40bp之间，置换引物在10-30bp之间，GC％含量在20-80％之间，探针长度在20-40bp之间，GC％含量在10％-80％之间。
本发明提供的等温扩增核酸靶序列的方法为闭管实时荧光检测，完成样本核酸加样后，上机进行反应，中间无开管过程，避免了因开盖造成产物污染的可能性。
优选地，所述单链靶标的长度为30-100个碱基；
所述扩增是在37℃-70℃之间实施；
整个反应时间为1-10min，优选地，所述方法的反应时间不超过8min，阳性和阴性结果在8min内获得，样本中存在高浓度阳性靶序列时可在1-2min获得阳性结果。
优选地，所述切口酶选自Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BsmI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nb.BtsI、Nt.CviPII中的至少一种。
优选地，所述DNA聚合酶选自BstDNA聚合酶、BsuDNA聚合酶、phi29DNA聚合酶中的一种。
优选地，所述DNA聚合酶为Bst2.0或Bst3.0。
优选地，所述分子信标探针的一端为荧光基团，另一端为荧光淬灭基团，且探针的5′端和3′端部分序列互补，可形成茎环结构。
优选地，所述扩增反应体系中包括TrisHCl缓冲液、BSA、NaCl、KCl、dNTP、Mg2+、(NH4)2SO4以及添加剂。
优选地，所述添加剂包括海藻糖、甜菜碱、二甲基亚砜、明胶、吐温20、Triton-x100、NP-40中的至少一种。
第二方面，本发明提供于实现方法的试剂盒，所述试剂盒至少包上述所述方法中的扩增引物P1、P2、置换引物、分子信标探针以及扩增反应体系。
与现有技术相比，本发明提供的等温扩增核酸靶序列的方法具有以下有益效果：
1、本发明提供的快速等温扩增和检测核酸的新方法。该方法适用于双链DNA、单链DNA、单链RNA，包括切口酶和链置换酶的联合反应，在进行双链DNA和单链DNA检测时，采用3条引物和1条探针，而进行单链RNA检测时，可以为3条引物和1条探针，也可以是2条引物和1条探针。探针为分子信标，扩增过程中不发生降解，仅用于特异性结合目标片段，提供荧光信号，保证反应的特异性。
2、本发明整个反应过程在等温的条件下实施，且无需在扩增前对靶序列进行变性，比变温核酸扩增检测技术操作更加简便。
3、本发明上下游扩增引物均引入切口酶酶切识别位点核酸序列，可获得产生的双链初始产物的5’和3’端均有一个切口酶酶切识别位点，可有效提高后续指数扩增阶段的反应效率，在更短时间内完成反应；且本发明采用锁核酸修饰引物，使得引物与模板结合的效率和稳定性比常规引物更优；同时反应体系中增加促进反应效率的添加剂以及升级版的兼具链置换活性的DNA聚合酶，进一步提高了反应体系的反应效率，使得反应耗时更短，8min内完成反应，而一般等温扩增反应均需30-60min以上，本发明更符合POCT检测需求。
4、本发明采用与引物之间在靶序列上的结合区域没有重叠的信标探针来实时判断结果，信标探针结合目标序列具有很强的特异性，避免使用染料法或电化学法等方案导致的假阳性；同时反应后不开管，进一步避免产物污染导致假阳性的产生。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中检测双链DNA时的原理图。
图2为本发明较佳实施例中检测单链DNA和单链RNA时初始模板形成的原理图。
图3为本发明较佳实施例中检测单链RNA时初始模板形成的原理图。
图4为本发明较佳实施例中检测携带人类基因PSMB2的质粒扩增效果图。
图5为本发明较佳实施例中检测肺炎支原体样本扩增效果图。
图6为本发明较佳实施例中检测乙型流感样本的扩增效果图。
图7为本发明较佳实施例中检测细小犬病毒的扩增效果图。
图8为本发明较佳实施例中样本自身链置换扩增的原理图。
图9为本发明较佳实施例中样本自身链置换扩增反应的扩增效果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述，附图中给出了本发明的若干实施例，但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
本发明提供的本发明提供双链DNA、单链DNA和单链RNA的快速等温扩增和检测新方法。包括如下步骤：
反应包括初始产物生成阶段(双链初始产物形成阶段)和指数扩增信号采集阶段。
1、在初始产物生成阶段中，根据模板情况和使用的酶体系略有差异：
a)当模板为双链DNA时，切口酶作用于双链DNA模板上的切口酶酶切位点，形成切口，链置换酶(具有链置换功能的DNA聚合酶)从该切口出发进行延伸和链置换，形成单链产物，带单链酶切位点的引物(F/R，即扩增引物P1)和置换引物(B)结合到单链产物上，通过延伸和链置换，形成带酶切位点的单链产物，另一条带单链酶切位点的引物(R/F，即扩增引物P2)与该单链产物结合并延伸，再经过酶切和链置换，形成了初始产物，即两端带有2个酶切位点的双链初始产物(图1)。
b)当模板为单链DNA时，带单链酶切位点的引物(F/R)和置换引物(B)结合到单链产物上，通过上述相同的过程，形成初始产物(图2)。
c)当模板为单链RNA时，有2种不同的方式可形成初始模板。第1种，使用带RNaseH活性的反转录酶时，不需要置换引物(B)，如图3所示，通过反转录和RnaseH作用，形成带酶切位点的单链，后续反应同前所述；第2种，使用反转录酶(如Bst3.0)，通过反转录和链置换功能，生成带酶切位点的单链，过程类似于单链DNA模板。
2、指数扩增信号采集阶段，切口酶在初始产物上产生切口，形成两种一侧带酶切位点的双链DNA，如图4的“指数扩增”区域所示，第1种产物可在切口酶和扩增酶的作用下，生成单链产物，该产物进一步和扩增引物结合并延伸，可形成第2种；反之，第2种产物，也可生成第1种产物，两者形成指数型扩增。分子信标探针可以与其中一种单链产物结合，合适的荧光检测系统可以采集到扩增信号。
本方法在检测双链DNA、单链DNA和单链RNA时，使用2条扩增引物、1条置换引物和1条分子信标探针；在检测单链RNA时还可以是2条扩增引物和1条分子信标探针。
所述分子信标的长度为13-80bp，且所述分子信标与所述靶序列的结合位置为临近5‘端和3’不小于12bp的位置处。
本发明使用的扩增酶具有以DNA为模板合成DNA的功能，同时具备链置换功能，有些种类的扩增酶还具有以RNA为模板反转录成DNA的功能。
所述初始产物的特异性区域(不计算引物扩增引入的酶切位点等序列)长度在30-100bp之间。
所述分子信号探针在单链产物上结合时，与扩增引物在单链产物上的结合区域没有重叠。扩增引物P1和P2的3′端末端碱基之间处在靶序列上的距离不小于10bp。在引物探针设计时，保证足够的特异性位置使探针与靶序列结合，且探针和扩增引物之间在靶序列上没有碱基的重叠。
反应过程中温度恒定，反应可以在8min内完成。
本发明采用3条引物和1条信标探针(检测单链RNA检测时，可以是2条引物和1条探针)，切口酶和链置换DNA聚合酶，在8min内可完成核酸扩增和产物的实时荧光检测。
所述的方法为等温扩增，在反应中温度恒定，反应温度在37-70℃之间。
所述的方法反应时间不超过8min，阳性和阴性结果在8min内获得，样本中存在高浓度阳性靶序列时可在1-2min获得阳性结果。所述的方法为闭管实时荧光检测，完成样本核酸加样后，上机进行反应，中间不存在开管过程。
所述的引物为单链核苷酸聚合物，如有必要，引物中可能包含锁核酸(LNA)、甲基化等常规合成修饰。3条引物中，1条为链置换引物，2条为扩增引物，链置换引物和模板完全互补，而扩增引物包含3个区域，分别是特异结合区、酶切位点区和稳定区。
所述信标探针是指带荧光基团和淬灭基团修饰的单链核苷酸聚合物，5′和3′末端的人工序列为互补，形成茎环结构。如有必要，可能包含和上述引物类似的常规合成修饰，以及可能在5′和3′末端包含spacer修饰，以增加其长度。信标探针和引物在靶序列上没有重合部分，保证其特异性。
所述的切口酶是识别双链DNA特异序列在其上形成切口的一类特殊酶，如Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BsmI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nb.BtsI、Nt.CviPII或其它均有同样功能的酶。
所述的链置换DNA聚合酶，是一类具有核酸3′末端聚合活性，同时拥有置换聚合方向核酸功能的聚合酶。如BstDNA聚合酶(包括Bst2.0，Bst3.0等升级产品)、BstDNA聚合酶大片段、BsuDNA聚合酶、BsuDNA聚合酶大片段、phi29DNA聚合酶等。
除了上述引物、探针、酶外，所述方法，还包括常见核酸扩增反应中用的各类物质，比如TrisHCl缓冲液、BSA、NaCl、KCl、dNTP、Mg2+、(NH4)2SO4等反应中常用的缓冲液和离子成分，另外还包括添加剂，比如海藻糖、甜菜碱、二甲基亚砜、明胶、吐温20、Triton-x100、NP-40等。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1携带人类基因PSMB2的质粒的检测对比
将实验组(本发明)：使用升级的DNA聚合酶、引物引入锁核酸标记、反应体系添加反应增强剂与对照组：使用低级版本DNA聚合酶、引物未进行锁核酸标记、反应体系未添加反应增强剂进行反应时间的对比。
本发明和对照组扩增反应体系组成以、添加剂以及所用引物修饰情况如下
表1：
Figure BDA0003721106560000101
表1
(1)本发明引物探针序列：
引物探针序列(5′-3′)如下：
PSMB2-B(引物)：CCCAGCACTTT
PSMB2-F(引物)：TTCAGACTATTGAGTCTATTCTGACCAACAT
PSMB2-R(引物)：GTCAGACTATTGAGTCTTCTCCCAGCTAAT
PSMB2-P(探针)：ATGGTAGTAGAGACGGGGTTTTACCAT
注：“A”用LNA修饰。
(2)未进行修饰的引物探针如下：
引物探针序列(5′-3′)如下：
PSMB2-B(引物)：CCCAGCACTTT
PSMB2-F(引物)：TTCAGACTATTGAGTCTATTCTGACCAACAT
PSMB2-R(引物)：GTCAGACTATTGAGTCTTCTCCCAGCTAAT
PSMB2-P(探针)：ATGGTAGTAGAGACGGGGTTTTACCAT
各组反应均在55℃下进行，每10s采集一次信号，仪器为LightCycler480II。检测质粒1E5、1E4、1E3、1E2、1E1样本，各组结果如表1所示，本发明检测结果曲线图如图4所示。表2携带人类基因PSMB2的质粒的检测对比结果。
组别 本发明 对照组1 对照组2 对照组3 对照组4
检测时间 2.5-4min 5-9min 5.5-9min 7-10min 9-12min
表2
由此可见本发明检测时间明显提前于各对照组，说明本发明在双链DNA核酸检测的应用中具有更好的时间优势。
实施例2肺炎支原体临床样本检测对比
将实验组(本发明)：使用升级的DNA聚合酶、引物引入锁核酸标记、反应体系添加反应增强剂与对照组：使用低级版本DNA聚合酶、引物为进行锁核酸标记、反应体系未添加反应增强剂进行反应时间的对比。
本发明和对照组扩增反应体系组成以、添加剂以及所用引物修饰情况如下
表3：
Figure BDA0003721106560000121
表3
(1)本发明引物探针序列：
引物探针序列(5′-3′)如下：
Mp-B(引物)：CTCTCCACTAA
Mp-F(引物)：CATAGACTTATGAGTCTTCTATTCGCTTC
Mp-R(引物)：GTTAGACTTTTGAGTCTTCTTGCTCTGGT
Mp-P(探针)：CGCAGCTGGTTACGGGAATACTGCG
注：“A”用LNA修饰。
(2)未标记引物探针序列如下：
引物探针序列(5′-3′)如下：
Mp-B(引物)：CTCTCCACTAA
Mp-F(引物)：CATAGACTTATGAGTCTTCTATTCGCTTC
Mp-R(引物)：GTTAGACTTTTGAGTCTTCTTGCTCTGGT
Mp-P(探针)：CGCAGCTGGTTACGGGAATACTGCG
各组反应均在55℃下进行，每10s采集一次信号，仪器为LightCycler480II。检测8例肺支样本，以及8例其它呼吸道病原体：甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、人细小病毒B19、金黄色葡萄球菌、人呼吸道腺病毒、鼻病毒，各组结果如表4所示，本发明检测结果曲线图如图5所示。下表为肺炎支原体的检测对比结果。
组别 本发明 对照组1 对照组2 对照组3 对照组4
检测时间 3-7min 10-15min 14-19min 15-19min 18-22min
检测非特异性 0/8 2/8 0/8 1/8 2/8
表4
由此可见，本发明在双链DNA核酸的检测时间和检测特异性方面有明显的优势。
实施例3乙型流感病毒(单链RNA病毒)临床样本检测对比
将实验组(本发明)：使用升级的DNA聚合酶、引物引入锁核酸标记、反应体系添加反应增强剂与对照组：使用低级版本DNA聚合酶、引物为进行锁核酸标记、反应体系未添加反应增强剂进行反应时间的对比。
本发明和对照组扩增反应体系组成以、添加剂以及所用引物修饰情况如下
表5：
Figure BDA0003721106560000131
Figure BDA0003721106560000141
表5
(1)本发明引物探针序列：
引物探针序列(5′-3′)如下：
FluB-B(引物)：TGTTGCTAAACT
FluB-F(引物)：CTACTGATGAGTCTTTTAGTGGAGGAT
FluB-R(引物)：CCTTCATTGAGTCTTTTGAAGAGTGA
FluB-P(探针)：ACGGCCATCGGATCCTCAAGCCGT
注：“A”用LNA修饰。
(1)未标记引物探针序列如下：
引物探针序列(5′-3′)如下：
FluB-B(引物)：TGTTGCTAAACT
FluB-F(引物)：CTACTGATGAGTCTTTTAGTGGAGGAT
FluB-R(引物)：CCTTCATTGAGTCTTTTGAAGAGTGA
FluB-P(探针)：ACGGCCATCGGATCCTCAAGCCGT
各组反应均在55℃下进行，每10s采集一次信号，仪器为LightCycler480II。检测8例乙型流感病毒临床样本，以及8例其它呼吸道病原体：甲型流感病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、人细小病毒B19、金黄色葡萄球菌、人呼吸道腺病毒、鼻病毒验证反应体系特异性，各组结果如表3所示，本发明检测结果曲线图如图6所示。
由此可见，本发明在单链RNA核酸的检测时间和检测特异性方面有明显的优势。表6为乙型流感病毒的检测对比结果。
组别 本发明 对照组1 对照组2 对照组3 对照组4
检测时间 3-5min 7-10min 9-13min 11-15min 20-24min
检测非特异性 0/8 1/8 0/8 1/8 2/8
表6
实施例4细小犬病毒检测对比
将实验组(本发明)：使用升级的DNA聚合酶、引物引入锁核酸标记、反应体系添加反应增强剂与对照组：使用低级版本DNA聚合酶、引物为进行锁核酸标记、反应体系未添加反应增强剂进行反应时间的对比。
本发明和对照组扩增反应体系组成以、添加剂以及所用引物修饰情况如下
表7：
Figure BDA0003721106560000151
Figure BDA0003721106560000161
表7
(1)本发明引物探针序列：
CVP-F(引物)：GAACTTTTGAGTCTTTTACTATACACATC
CVP-R(引物)：GAACTTTTGAGTCTTTTCCCAGTTTTCAT
CVP-B(引物)：AGTCTTTGCAACCT
CVP-P(探针)：CGCCAGGAAAAGTACCAGAATGGCG
注：“A”用LNA修饰。
(2)未标记引物探针序列如下：
CVP-F(引物)：GAACTTTTGAGTCTTTTACTATACACATC
CVP-R(引物)：GAACTTTTGAGTCTTTTCCCAGTTTTCAT
CVP-B(引物)：AGTCTTTGCAACCT
CVP-P(探针)：CGCCAGGAAAAGTACCAGAATGGCG
各组反应均在55℃下进行，每10s采集一次信号，仪器为LightCycler480II。检测5例细小犬病毒样本，以及8例其它呼吸道病原体：甲型流感病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、人细小病毒B19、金黄色葡萄球菌、人呼吸道腺病毒、鼻病毒，各组结果如表4所示，本发明检测结果曲线图如图7所示。
由此可见，本发明在单链DNA核酸的检测时间和检测特异性方面有明显的优势。下表8为犬细小病毒的检测对比结果。
组别 本发明 对照组1 对照组2 对照组3 对照组4
检测时间 3.5-5min 8-12min 9-15min 13-17min 15-22min
检测非特异性 0/8 2/8 0/8 2/8 3/8
表8
实施例5样本自身的链置换扩增
在使用链置换酶和切口酶进行样本扩增时，由于样本上有非常多的酶切点，样本自身会发生链置换扩增，这个过程与多重置换反应类似(multipledisplacementamplification)，原理如图8所示。只是不需要引物探针的参与。反应示例如下：
配制以下反应体系：
Tris-HClpH8.0，50mM
(NH4)2SO4，20mM
MgCl2，8mM
NaCl，30mM
KCl，10mM
dNTP，1mM
Evagreen1×
Nt.BstNBI，3U
Bst3.0，6U
反应在55℃下进行，每1min采集一次信号，共60个循环，仪器为LightCycler480II，样本为咽拭子提取的核酸原液、该原液的10倍和100稀释，各重复2次。结果如图9所示，咽拭子提取的核酸样本在12min左右出现扩增信号。在使用链置换酶和切口酶进行扩增时，这种样本自身扩增是不可避免的，CN104726549A采用染料法判断结果时，当反应进行30-60min时，无法避免这种假阳性现象的出现。以上所述实施例仅表达了本发明的某种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围；因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.等温扩增核酸靶序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
I、初始产物形成包括如下步骤：
A1、当所述单链靶标为单链的DNA时，将扩增引物P1和置换引物与单链靶标互补结合，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链靶标延伸扩增引物P1的同时用置换引物置换扩增引物P1的扩增产物；将由被置换出来的扩增引物P1延伸形成的产物作为单链模板；
A2、当所述单链靶标为单链RNA时，可通过两种方式反应获得单链模板：
(1)若所述DNA聚合酶兼具聚合酶功能、链置换功能和反转录功能，将扩增引物P1、置换引物和DNA聚合酶与单链RNA接触，所述单链RNA在DNA聚合酶反转录活性作用下反转录成cDNA，并被置换引物置换得到单链模板；
(2)若所述DNA聚合酶不具备反转录功能，需添加兼具RNase H活性的反转录酶，将扩增引物P1和反转录酶与单链RNA接触，所述单链RNA在反转录酶作用下反转录成cDNA,形成cDNA-RNA复合双链产物，复合双链产物中的RNA链在反转录酶的RNase H活性作用下水解得到单链模板；
B、将扩增引物P2与步骤A形成的单链模板互补结合，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链模板延伸扩增引物P2，再由切口酶作用于延伸产物，在切口处延伸并置换，形成两端各具1个酶切位点的双链初始产物；
II、指数扩增信号采集包括以下步骤：
C、将切口酶和DNA聚合酶与双链模板接触，所述双链模板在切口酶作用下产生双链切口位点，DNA聚合酶从所述切口位点出发扩增并置换得到可与扩增引物P1或P2互补的单链；
D、将扩增引物P1或P2与步骤C形成的单链互补结合，并在DNA聚合酶的作用下延伸形成两种各具1个酶切位点的双链产物；
E、将切口酶和DNA聚合酶与步骤D产生的两种双链产物接触，所述两种双链产物在切口酶作用下分别形成切口，DNA聚合酶从所述切口位点出发扩增并置换，分别得到可与扩增引物P1或P2互补的两条单链；单链再与扩增引物P1或P2接触，并在DNA聚合酶的作用下延伸形成双链产物；
F、重复步骤E，以指数形式得到扩增产物；
其中，上述步骤在等温的条件下实施，且无需在扩增前对靶序列进行变性；
步骤C～F还包括将扩增体系与分子信标探针互补结合，以提供荧光信号；
所述扩增引物P1和P2，沿5′-3′方向，依次包含稳定区、切口酶识别位点区以及能与靶序列互补的碱基区域；其中所述稳定区的长度为6-20bp；
所述置换引物与靶序列完全互补；
所述分子信标探针与靶序列互补或可与靶序列杂交，所述分子信标探针与所述扩增引物P1、P2在靶序列上的结合区域没有重叠；
所述单链靶标为单链的DNA时，所述单链靶标可以为单链DNA以及由双链DNA经切口酶和DNA聚合酶与双链DNA接触，在切口酶作用下产生切口，DNA聚合酶从所述切口出发扩增并置换得到的单链产物；
所述DNA聚合酶具有链置换功能；
所述方法为非疾病诊断目的。
2.根据权利要求1所述的等温扩增核酸靶序列的方法，其特征在于：
所述扩增引物P1、P2上与靶序列互补的碱基区域位置进行修饰，所述修饰方式包括锁核酸修饰、甲基化修饰；
所述扩增引物P1和P2的3′端末端碱基之间处在靶序列上的距离不小于10bp。
3.根据权利要求1所述的等温扩增核酸靶序列的方法，其特征在于：所述分子信标的长度为13-80bp，且所述分子信标与所述靶序列的结合位置为临近5‘端和3’不小于12bp的位置处。
4.根据权利要求1所述的等温扩增核酸靶序列的方法，其特征在于：
所述单链靶标的长度为30-100个碱基；
所述扩增是在37℃-70℃之间实施；
整个反应时间为1-10min。
5.根据权利要求1所述的等温扩增核酸靶序列的方法，其特征在于：所述切口酶选自Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BsmI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nb.BtsI、Nt.CviPII中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的等温扩增核酸靶序列的方法，其特征在于：所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶中的一种。
7.根据权利要求1所述的等温扩增核酸靶序列的方法，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst 2.0或Bst3.0。
8.根据权利要求1所述的等温扩增核酸靶序列的方法，其特征在于：所述分子信标探针的一端为荧光基团，另一端为荧光淬灭基团，且探针的5′端和3′端部分序列互补，可形成茎环结构。
9.根据权利要求1所述的等温扩增核酸靶序列的方法，其特征在于：所述扩增反应体系中包括Tris HCl缓冲液、BSA、NaCl、KCl、dNTP、Mg2+、(NH4)2SO4以及添加剂。
10.根据权利要求1所述的等温扩增核酸靶序列的方法，其特征在于：所述添加剂包括海藻糖、甜菜碱、二甲基亚砜、明胶、吐温20、Triton-x100、NP-40中的至少一种。
11.根据权利要求1所述的等温扩增核酸靶序列的方法，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-10任一项所述方法中所述的扩增引物P1、P2、置换引物、分子信标探针以及扩增反应体系。
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