CN118028433A - 核酸序列特异性的靶标切割等温指数扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于靶核酸片段扩增的试剂盒及其应用。该试剂盒包括正向gDNA、反向gDNA、正向扩增引物、反向扩增引物、Tthargonaute核酸内切酶和聚合酶，所述正向gDNA和所述反向gDNA特异性结合于靶核酸片段的相对链，且两者3’端指向彼此，能够指导所述Tthargonaute核酸内切酶切割包含所述靶核酸片段的核酸分子，所述正向gDNA和所述反向gDNA不能完全互补；正向扩增引物的序列含有与所述正向gDNA相同的序列，反向扩增引物的序列含有与所述反向gDNA相同的序列，所述正向扩增引物和反向扩增引物能够在所述聚合酶作用下扩增所述靶核酸片段。该试剂盒可以用于核酸扩增、实时的荧光检测等。

Description

核酸序列特异性的靶标切割等温指数扩增方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于靶核酸片段特异性指数级扩增的试剂盒及其应用。

背景技术

核酸分子体外扩增技术是开展分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展,建立一套灵敏、快速和高特异性的核酸扩增技术一直是研究工作者探讨的问题。在聚合酶链式反应(PCR)以其灵敏性和特异性而广泛应用的基础上，新的核酸扩增模式也不断涌现。现有核酸扩增技术根据其特点可分为两类：第一类是靶核酸的直接扩增，另一类是信号放大扩增。根据是否需要温度循环也可分为两类：一类是非等温扩增，另一类是等温扩增体系。

目前本专业研究工作者熟知的扩增技术有：PCR、LAMP、RPA等。这些技术各有自己的优缺点，如PCR扩增技术灵敏度高、特异性好，且检测时间越来越短，但仍然需要昂贵的专业设备进行扩增与检测。而LAMP扩增技术与RPA扩增技术则是在等温扩增技术种类中，产业转化应用率最高，表现较为优异的技术。其中LAMP扩增技术最大的特点是可以兼顾灵敏度、特异性和检测速度的同时，实现一种无需专业设备的简易检测，但LAMP引物的设计难度远高于PCR和RPA等扩增技术，且对设计引物的靶标核酸序列长度有比较高的要求。而RPA扩增技术主要以其超高的灵敏度，超快的检测速度著称，但高灵敏度之下必然很难保证其扩增的特异性，也是困扰本专业研究工作者的一个难题。

发明内容

本发明旨在发明一种不逊于PCR扩增的高灵敏度、不逊于LAMP扩增的高特异性与检测速度，且引物设计较为简单，同样能实现等温扩增的一种新型核酸扩增技术。而本发明揭示的技术，创新地使用了一种核酸内切酶，联合辅助聚合酶在恒温环境下实现等温扩增，设法弥补目前扩增技术中存在的不足。

本发明的目的之一在于提供一种用于靶核酸片段扩增的试剂盒。

本发明提供了一种用于靶核酸片段扩增的试剂盒，包括正向gDNA、反向gDNA、正向扩增引物、反向扩增引物、Tth argonaute核酸内切酶和聚合酶，

所述正向gDNA和所述反向gDNA特异性结合于靶核酸片段的相对链，且两者3’端指向彼此，能够指导所述Tth argonaute核酸内切酶切割包含所述靶核酸片段的核酸分子，所述正向gDNA和所述反向gDNA不能完全互补；

正向扩增引物的序列含有与所述正向gDNA相同的序列，反向扩增引物的序列含有与所述反向gDNA相同的序列，所述正向扩增引物和反向扩增引物能够在所述聚合酶作用下扩增所述靶核酸片段。

正向gDNA和反向gDNA均为单链DNA且5’端磷酸化。

正向gDNA和反向gDNA长度可为16～18nt。

正向扩增引物的序列5’端至少含有与所述正向gDNA5’端相同的10nt碱基，例如10～18nt，具体可为10、12、14、16或18nt。

反向扩增引物的序列5’端至少含有与所述反向gDNA5’端相同的10nt碱基，例如10～18nt，具体可为10、12、14、16或18nt。

该试剂盒利用Tth argonaute核酸内切酶、聚合酶与特殊设计的扩增引物，实现对不同靶标底物的高温等温特异性指数级扩增，并且扩增得到的产物可以用于多个方面的检测分析应用。

Tth argonaute核酸内切酶，是一种可编辑的核酸内切酶，其通过在5’端磷酸化的gDNA指导下，可发挥DNA介导的核酸内切酶作用，并在与gDNA向导链第10和11个碱基互补的位置激活切割，切割后的底物生成新的5’/3’末端。本发明基于上述原理，分别设计两个识别不同区段的5’磷酸化的gDNA序列，指导核酸内切酶对底物或产物(即包含靶核酸片段的核酸分子)进行切割。

上述试剂盒主要工作原理为，包含靶核酸片段的核酸分子首先在正向gDNA指导的Tth argonaute核酸内切酶的作用下被切割，获得具有粘性末端的核酸分子(包含靶核酸片段的核酸分子为双链)或者单链核酸分子(包含靶核酸片段的核酸分子为单链)，正向扩增引物含有与所述正向gDNA相同的序列，与粘性末端或单链核酸分子匹配，具有粘性末端的核酸分子或者单链核酸分子和正向扩增引物并在聚合酶的作用下向5’端延伸；待延伸到特定切割位点时，被反向gDNA指导的Tth argonaute核酸内切酶切割，获得具有粘性末端的核酸分子或者单链核酸分子，反向扩增引物含有与所述反向gDNA相同的序列，与粘性末端或者单链核酸分子匹配，具有粘性末端的核酸分子或者单链核酸分子和反向扩增引物结合并在聚合酶的作用下向5’端延伸；延伸回到正向gDNA指导的Tth argonaute核酸内切酶的切割位点，并被正向gDNA指导的Tth argonaute核酸内切酶再次切割。往复如此，从而实现核酸序列特异性的靶标切割等温指数扩增。

可选地，根据上述的试剂盒，所述正向扩增引物序列和/或所述反向扩增引物序列的5’端还包括Barcode序列。

可选地，根据上述的试剂盒，所述正向扩增引物序列和/或所述反向扩增引物序列的3’端还包括能够特异性结合于靶核酸片段的序列，以便在所述聚合酶的作用下向所述靶核酸片段5’端延伸。

具体地，正向扩增引物与反向扩增引物可由三个区段组成，从3’端至5’端依次为：第一区段能够特异性结合于靶核酸片段的序列，以便在所述聚合酶的作用下向所述靶核酸片段5’端延伸；第二区段含有与所述正向gDNA或所述反向gDNA相同的序列，一方面用于固定扩增引物与核酸分子的结合，另一方面在相对扩增引物在聚合酶的作用下延伸时，将序列补齐，从再次激活gDNA引导的Tth argonaute核酸内切酶活性，实现循环切割；第三区段为Barcode序列。

可选地，根据上述的试剂盒，还包括ATP、KCl、MgCl2、dNTPs、Tris-Hcl(pH＝8.0)和/或DNA结合染料。

可选地，根据上述的试剂盒，所述正向gDNA特异性结合于靶核酸片段的结合区域和所述反向gDNA特异性结合于靶核酸片段的结合区域不重叠。

所述聚合酶可为Bst DNA聚合酶。

上述的试剂盒的应用也属于本发明的保护范围之内。所述应用可为在如下任一中的应用：

(1)靶核酸片段扩增；

(2)靶核酸片段等温扩增；

(3)靶核酸片段检测；

(4)测序；

(5)制备靶核酸片段扩增产品；

(6)制备靶核酸片段等温扩增产品；

(7)制备靶核酸片段检测产品；

(8)制备测序产品。

本发明还提供了靶核酸片段的扩增方法，包括

(1)将上述正向gDNA和上述反向gDNA混合获得预混物，再将所述预混物、ATP和Tthargonaute核酸内切酶混合孵育获得正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物；

(2)混合包含所述靶核酸片段的核酸分子、dNTPs、所述正向/反向gDNA-Tthargonaute核酸内切酶复合物、上述的正向扩增引物、上述的反向扩增引物和上述的聚合酶进行反应，实现靶核酸片段的扩增。

本发明还提供了靶核酸片段的检测方法，包括

(1)将上述正向gDNA和上述反向gDNA混合获得预混物，再将所述预混物、ATP和Tthargonaute核酸内切酶混合孵育获得正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物；

(2)混合核酸样本、dNTPs、所述正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物、上述的正向扩增引物、上述的反向扩增引物、上述的聚合酶和DNA结合染料进行反应获得荧光信号，根据所述荧光信号判断所述核酸样本中是否存在靶核酸片段。

可选地，根据上述的检测方法，所述DNA结合染料为EvaGreen和/或SYBRGreen。

可选地，根据上述的检测方法，根据所述荧光信号判断所述核酸样本中是否存在靶核酸片段为若所述荧光信号出现明显的S型曲线，且S型曲线出峰时间＜反应总时长×10％，则所述核酸样本中存在靶核酸片段；反之，则所述核酸样本中不存在靶核酸片段。

可选地，根据上述的扩增方法或上述的检测方法，步骤(2)中所述反应温度为62～72℃；所述反应时间为30～60min。

可选地，根据上述的扩增方法或上述的检测方法，步骤(1)中混合孵育温度为65～80℃；混合孵育时间为15～30min。

本发明提供的试剂盒可以用于核酸扩增、实时的荧光检测、基于微阵列芯片的多靶标检测以及一代测序或二代测序(单细胞测序)。

本发明提供的靶核酸片段的扩增方法属于一类聚焦于扩增与测序检测方向的新一代基于核酸内切酶的等温指数扩增技术。本发明的技术优点至少有以下几点：该方法属于高温等温扩增技术，其超过60℃的等温扩增条件，可有效的避免低温等温扩增技术经常出现的非特异性扩增与检测，大大提升了检测的特异性；并且高温环境更有助于在面对复杂二级结构的核酸序列时，更有效的打开双链。其次，该方法更加适用于等温的SNP位点的检测，首先通过核酸内切酶精准识别靶标序列，在完全互补配对的情况切割底物，从而才能开始基于聚合酶的等温扩增。最后，该扩增方法也可用于针对多靶标需求的同时检测，如基于微阵列芯片的超多重检测、一代测序或二代测序(单细胞测序)等领域，因该扩增方法中特殊的扩增引物设计，能对成百上千种检测靶标进行不重复的标记，从而实现对多靶标的同时检测。

综上所述，本发明提供的扩增方法涉及一种全新的，基于核酸内切酶的高温等温指数级扩增技术，具备在本学科乃至跨学科环境下，改造提升现有技术不足，实现基于分子生物学的跨学科应用或尝试解决现存技术问题的可能性。

附图说明

图1为试剂盒的工作原理。

图2为实施例2检测结果。

图3为实施例3667号SNP位点的检测结果。

图4为实施例31298号SNP位点的检测结果。

图5为实施例366号SNP位点的检测结果。

图6为667号SNP位点通过PCR与一代测序鉴定后的结果。

图7为1298号SNP位点通过PCR与一代测序鉴定后的结果。

图8为66号SNP位点通过PCR与一代测序鉴定后的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特别说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

Tth argonaute：Tth argonaute核酸内切酶，NEB公司，M0665S

Bst DNA聚合酶：Bst 2.0DNA聚合酶，NEB公司，M0538L

实施例1、用于靶核酸片段扩增的试剂盒

一、用于靶核酸片段扩增的试剂盒

试剂盒包括如下：

1、正向gDNA和反向gDNA

所述正向gDNA和所述反向gDNA特异性结合于靶核酸片段的互补链，且两者3’端指向彼此，能够指导Tth argonaute核酸内切酶切割包含靶核酸片段的核酸分子，所述正向gDNA和所述反向gDNA不能完全互补。

正向gDNA和反向gDNA均为单链DNA且5’端磷酸化。

正向gDNA和反向gDNA长度可为16～18nt。

所述正向gDNA和所述反向gDNA需要与Tth argonaute核酸内切酶按照摩尔浓度5：5：2的比例进行混合，并加入终浓度0.5mM的ATP，放置在65～80℃环境中孵育15～30min后使用。

2、正向扩增引物和反向扩增引物

正向扩增引物的序列含有与所述正向gDNA相同的序列，反向扩增引物的序列含有与所述反向gDNA相同的序列。所述正向扩增引物和反向扩增引物能够在Bst DNA聚合酶作用下，在62～68℃等温扩增所述靶核酸片段。所述正向扩增引物序列和/或所述反向扩增引物序列的5’端还可包括Barcode序列，Barcode序列用于区分混合样本中的不同样本来源。所述Barcode序列的长度可以是5nt～10nt，例如6nt Barcode序列可以为TTTTTT、TTTTTA、TTTTTC和TTTTTG等由6位碱基组成的，任意排列，但有规律的序列。

所述正向扩增引物序列和/或所述反向扩增引物序列的3’端还可包括能够特异性结合于靶核酸片段的序列，以便在Bst DNA聚合酶的作用下向靶核酸片段5’端延伸，能够特异性结合于靶核酸片段的序列长度可为8-12nt，例如10nt。

3、Tth argonaute核酸内切酶

4、聚合酶

聚合酶例如为Bst DNA聚合酶；

上述试剂盒还可以包括KCl、MgCl₂、dNTPs、Tris-Hcl(pH＝8.0)和/或DNA结合染料。

二、试剂盒的工作原理

上述试剂盒的工作原理如图1所示。

(1)双链/单链核酸分子(Nucleic acid substrate)在被正向gDNA指导的Tthargonaute核酸内切酶(gDNA-1&TtAgo argonaute)的作用下被切割，获得含有与正向扩增引物互补粘性末端的双链核酸分子或与正向扩增引物互补的单链核酸分子(Nucleic acidsubstrate-1)，该核酸分子还含有靶核酸片段；

(2)含有与正向扩增引物互补粘性末端的双链核酸分子或与正向扩增引物互补的单链核酸分子结合正向扩增引物(forward primer)，在Bst DNA聚合酶的作用下向5’端延伸获得含有正向扩增引物的扩增产物，即含有正向扩增引物和靶核酸片段的核酸分子；

(3)含有正向扩增引物的扩增产物在被反向gDNA指导的Tth argonaute核酸内切酶(gDNA-2&TtAgo argonaute)的作用下被切割获得含有与反向扩增引物互补粘性末端的双链核酸分子或与反向扩增引物互补的单链核酸分子；

(4)含有与反向扩增引物互补粘性末端的双链核酸分子或与反向扩增引物互补的单链核酸分子结合反向扩增引物，在Bst DNA聚合酶的作用下向5’端延伸获得含有反向扩增引物的扩增产物，即含有正向扩增引物、反向扩增引物和靶核酸片段的核酸分子；

(5)将含有正向扩增引物、反向扩增引物和靶核酸片段的核酸分子作为步骤(1)中的双链/单链核酸分子(Nucleic acid substrate)，重复步骤(1)-(4)，直至靶核酸片段达到期望的扩增程度。

三、靶核酸片段的扩增方法

采用上述中任一种试剂盒进行靶核酸片段扩增的方法具体如下。

(1)将1.25μL浓度为10μM的正向gDNA和1.25μL浓度为10μM的反向gDNA混合获得预混物，再将预混物、5μL浓度为1μM Tth argonaute内切酶和2.5μL浓度为10mM的ATP混合，70℃孵育15～30min获得5×正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物。具体配方见表1，5×正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物代表在50μL的反应体系里，该复合物只取10μL。

制备后的复合物可放置在4℃暂存，或-20℃长期保存。

(2)将步骤(1)获得的5×正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物、25μL2×扩增缓冲Buffer、0.25μL 50μM正向扩增引物、0.25μL 50μM反向扩增引物、10μL核酸样本，无酶无核酸水补充至50μL，混合后获得反应体系。将反应体系在62～72℃进行反应30～60min，实现靶核酸片段的扩增。2×扩增缓冲Buffer具体配方参见表2或表9(其中20×Evagreen也可以不添加)，反应体系具体配方参见表3。

表15×正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物组分

表22×扩增缓冲Buffer

表3反应体系

实施例2、用于靶核酸片段扩增的试剂盒在检测病原体感染方向的应用

采用本发明提供的试剂盒检测病原体感染的具体方法如下。

1.核酸样本的准备：使用细菌核酸DNA提取试剂盒，对金黄色葡萄球菌的培养物进行DNA提取，保存备用。该DNA通过使用Qubit3.0进行相对精准的定量，并计算拷贝数，并根据拷贝浓度进行梯度稀释获得DNA样本。DNA样本中，每5μl分别含有1、5、50或500个拷贝。

2.正向/反向gDNA、与正向/反向扩增引物的设计：针对金黄色葡萄球菌的FemA基因(序列如SEQ ID No.1所示)分别设计并人工合成两条gDNA序列，正向gDNA和反向gDNA 5’端磷酸化，用于引导Tth argonaute核酸内切酶对底物的切割。并在gDNA设计位置的区域，分别对应设计并人工合成两条正向/反向扩增引物。具体序列如下所示。

正向gDNA序列：5’P-GGATCGATATGTAGGTAT(SEQ ID No.2)；

反向gDNA序列：5’P-GATTATGAAAATCAAGAA(SEQ ID No.3)；

正向扩增引物序列：5’-Barcode sequences-GGATCGATATGTAGGTAT-AGACAACG(SEQID No.4)，其中“AGACAACG”为能够特异性结合于靶核酸片段的序列，“GGATCGATATGTAGGTAT”为与所述正向gDNA相同的序列；

反向扩增引物序列:5’-Barcode sequences-GATTATGAAAATCAAGAA-CTCGTACA(SEQID No.5)，其中“CTCGTACA”为能够特异性结合于靶核酸片段的序列，“GATTATGAAAATCAAGAA”为与所述反向gDNA相同的序列。

金黄色葡萄球菌Barcode sequences序列(正反相同)：TTTGC3.试剂与反应条件：

根据表4、5和6制备5×正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物、2×扩增缓冲Buffer和反应体系。

表45×正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物

表52×扩增缓冲Buffer

表6反应体系

将反应体系在68℃进行反应50min，并进行核酸实时荧光检测。

若荧光信号出现明显的S型曲线，且S型曲线出峰时间＜反应总时长×10％，则表明待测样本存在病原体，若荧光信号没有出现S型曲线，则表明待测样本不存在病原体。

本实施例结果如图2和表7所示，表7为图2扩增检测结果的导出。结果表明，利用该试剂盒可在短时间特异性扩增病原体的靶核酸片段，使该检测方法可以在短时间内实现高敏感的检测，且三次重复的CV值小于10％，具有优异的检测稳定性。

采用本发明提供的试剂盒检测靶核酸的方法可以如同PCR一般，扩增极短的核酸序列，但又不需要变温过程，极大的提升了检测效率。并且与类似的等温扩增方法相比较，例如LAMP检测需要较长的引物设计范围，对于变异度较高的物种，很难从压缩序列中得到有效的、能覆盖多种亚型的检测引物，而本发明所提供的方法，只需要两条扩增引物，并且对于扩增区段的长短没有限制，可以更加灵活、自由地选择核酸序列位置完成对靶核酸的特异性检测。

表7扩增检测结果

实施例3、用于靶核酸片段扩增的试剂盒在检测SNP位点方向的应用

采用本发明提供的试剂盒检测SNP位点的具体方法如下。

1.核酸样本的准备：共准备了3份已经通过PCR和一代测序鉴定SNP位点基因型后的，取自不同人的全血样本，并使用对应的核酸DNA提取试剂盒进行核酸DNA的提取，保存备用。

2.gDNA、正/反向扩增引物的设计：针对目前已知的叶酸代谢667、1298和66号SNP位点，各设计并人工合成对应的两条针对突变型位点识别的gDNA序列，正向gDNA和反向gDNA 5’端磷酸化，作为Tth argonaute核酸内切酶核酸内切酶的向导，以及设计并人工合成对应的正/反向扩增引物。

具体序列如下，划线处为相应SNP位点的突变碱基。

叶酸代谢667号SNP位点(rs1801133，NC_000001.11:g.11796321G>A)：

正向gDNA序列：5’P-CTGCGGGAGTCGATTT(SEQ ID No.6)；

反向gDNA序列：5’P-GACGATGGGGCAAGTG(SEQ ID No.7)；

正向扩增引物序列：5’-Barcode sequences-CTGCGGGAGTCGATTT-CATCATCA(SEQID No.8)；

反向扩增引物序列:

5’-Barcode sequences-GACGATGGGGCAAGTG-ATGCCCAT(SEQ ID No.9)。

叶酸代谢1298号SNP位点(rs1801131，NC_000001.11:g.11794419T>G)：

正向gDNA序列：5’P-CCAGTGAAGCAAGTGT(SEQ ID No.10)；

反向gDNA序列：5’P-TCCCCACTCCAGCATC(SEQ ID No.11)；

正向扩增引物序列：5’-Barcode sequences-CCAGTGAAGCAAGTGT-CTTTGAAG(SEQID No.12)；

反向扩增引物序列:5’-Barcode sequences-TCCCCACTCCAGCATC-ACTCACTT(SEQID No.13)。

叶酸代谢66号SNP位点(rs1801394，NC_000005.10:g.7870860A>G)：

正向gDNA序列：5’P-TTGCTCACACATTTCT(SEQ ID No.14)；

反向gDNA序列：5’P-TTTCAGTTTCACTGTT(SEQ ID No.15)；

正向扩增引物序列：5’-Barcode sequences-TTGCTCACACATTTCT-TCTGCGAT(SEQID No.16)；

反向扩增引物序列:5’-Barcode sequences-TTTCAGTTTCACTGTT-ACATGCCT(SEQID No.17)。

叶酸代谢Barcode sequences序列：

667Barcode sequences(正反相同)：TTTTA；

1298Barcode sequences(正反相同)：TTTTG；

66Barcode sequences(正反相同)：TTTTC。

3.试剂与反应条件：

根据表8分别制备各SNP位点的5×正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物。

表8叶酸代谢SNP位点的5×正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物

注：设计的针对叶酸代谢的三个SNP位点序列不同，但配制方法相同。

根据表9配制2×扩增缓冲Buffer。

表92×扩增缓冲Buffer

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根据表10分别配制各SNP位点的反应体系。

表10反应体系

将各SNP位点的反应体系在68℃进行反应50min，并进行核酸实时荧光检测。

判断标准：若荧光信号出现明显的S型曲线，且S型曲线出峰时间＜反应总时长×10％，则表明待测样本的SNP位点为纯合突变型或杂合突变型，若荧光信号没有出现S型曲线，则表明待测样本的SNP位点为野生型。

结果如图3-图5所示，从左到右分别为1号样本、2号样本和3号样本，667号SNP位点，1号样本为纯合突变型或杂合突变型、2号样本为野生型、3号样本为纯合突变型或杂合突变型；1298号SNP位点，1号样本为野生型、2号样本为野生型、3号样本为野生型；66号SNP位点，1号样本为野生型、2号样本为纯合突变型或杂合突变型、3号样本为野生型。图6-图8为通过PCR和一代测序鉴定SNP位点基因型确认结果，从左到右分别为1号样本、2号样本和3号样本。通过PCR和一代测序鉴定，667号SNP位点，1号样本为纯合突变型、2号样本为野生型、3号样本为杂合突变型；1298号SNP位点，1号样本为野生型、2号样本为野生型、3号样本为野生型；66号SNP位点，1号样本为野生型、2号样本为纯合突变型、3号样本为野生型。

结果表明，通过本方法对上述已经鉴定后的样本进行检测，符合率为100％。但因为引物时针对突变型的样本进行设计的，所以样本中存在的野生型样本就无法检测出曲线。但本发明所设计的引物的5’端可以进行barcode序列的标记，从而也可以通过测序的方法对产物进行测序检测。

采用本发明提供的试剂盒对靶向性的SNP位点检测具有很好的特异性，因其gDNA需要识别完全匹配的底物才能激活核酸内切酶活性，所以遇到不匹配的SNP位点时，可以很好进行区分，从而无法激活后续的连锁扩增反应。其次，本发明提供的扩增检测方法，在混合样本、肿瘤标志物等需要广谱撒网式检测中也具备很好的应用，通过本发明扩增引物上的barcode序列，可以在测序时作为身份识别标签，对一管中的混合样本进行有效的区分。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.用于靶核酸片段扩增的试剂盒，其特征在于：包括正向gDNA、反向gDNA、正向扩增引物、反向扩增引物、Tth argonaute核酸内切酶和聚合酶，

所述正向gDNA和所述反向gDNA特异性结合于靶核酸片段的相对链，且两者3’端指向彼此，能够指导所述Tth argonaute核酸内切酶切割包含所述靶核酸片段的核酸分子，所述正向gDNA和所述反向gDNA不能完全互补；

正向扩增引物的序列含有与所述正向gDNA相同的序列，反向扩增引物的序列含有与所述反向gDNA相同的序列，所述正向扩增引物和反向扩增引物能够在所述聚合酶作用下扩增所述靶核酸片段。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

所述正向扩增引物序列和/或所述反向扩增引物序列的5’端还包括Barcode序列。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：

所述正向扩增引物序列和/或所述反向扩增引物序列的3’端还包括能够特异性结合于靶核酸片段的序列，以便在所述聚合酶的作用下向所述靶核酸片段5’端延伸。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述正向gDNA特异性结合于靶核酸片段的结合区域和所述反向gDNA特异性结合于靶核酸片段的结合区域不重叠。

5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述聚合酶为Bst DNA聚合酶。

6.权利要求1-5任一所述的试剂盒在如下任一中的应用：

(1)靶核酸片段扩增；

(2)靶核酸片段等温扩增；

(3)靶核酸片段检测；

(4)测序；

(5)制备靶核酸片段扩增产品；

(6)制备靶核酸片段等温扩增产品；

(7)制备靶核酸片段检测产品；

(8)制备测序产品。

7.靶核酸片段的扩增方法，其特征在于：包括

(1)将权利要求1中的所述正向gDNA和权利要求1中的所述反向gDNA混合获得预混物，再将所述预混物、ATP和权利要求1中的所述Tth argonaute核酸内切酶混合孵育获得正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物；

(2)混合包含所述靶核酸片段的核酸分子、dNTPs、所述正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物、权利要求1中的所述正向扩增引物、权利要求1中的所述反向扩增引物和权利要求1中的所述聚合酶进行反应，实现靶核酸片段的扩增。

8.靶核酸片段的检测方法，其特征在于：包括

(1)将权利要求1中的正向gDNA和权利要求1中的反向gDNA混合获得预混物，再将所述预混物、ATP和权利要求1中的Tth argonaute核酸内切酶混合孵育获得正向/反向gDNA-Tthargonaute核酸内切酶复合物；

(2)混合核酸样本、dNTPs、所述正向/反向gDNA-Tth argonaute核酸内切酶复合物、权利要求1中的正向扩增引物、权利要求1中的反向扩增引物、权利要求1中的聚合酶和DNA结合染料进行反应获得荧光信号，根据所述荧光信号判断所述核酸样本中是否存在靶核酸片段。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述DNA结合染料选自EvaGreen和/或SYBRGreen。

10.根据权利要求7所述的扩增方法或权利要求8所述的检测方法，其特征在于：

步骤(2)中所述反应温度为62～72℃；

步骤(2)中所述反应时间为30～60min。