CN107893120A - 检测运动基因snp的引物组及其应用和产品以及检测运动基因snp的检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，提供了一种检测运动基因SNP的引物组及其应用和产品以及检测运动基因SNP的检测方法及应用。本发明提供的引物组包含用于检测AMPD1基因、PPARGC1A基因、ACTN3基因、NRF‑1基因和COL5A1基因的探针组和一组引物对，可以同时检测五种基因的SNP情况，特异性好没有交叉反应。本发明提供的一种用于检测运动基因SNP的产品，检测操作方便，灵敏度高，特异性强，同时给出五个基因是否是野生型、突变纯合子或突变杂合子的结果。本发明提供的运动基因SNP多重检测方法操作简单，检测速度成倍提高，检测特异性好，结果准确，为运动基因SNP检测提供了快速多重检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种检测运动基因SNP的引物组及其应用和产品以及检测运动基因SNP的检测方法及应用。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富，从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2:1。SNP在探索人类健康和癌症诊断扮演着重要角色。至今已发现200多个染色体和18个线粒体的基因多态性位点和人类的肌肉力量、身体活动水平、耐力水平和训练敏感性相关。
目前已报道多种SNP的检测方法，聚合酶链式反应(PCR)作为经典的方法，通过进行目标序列预扩增来检测SNP。尽管PCR扩增的方法能达到很高的检测灵敏度，但也存在一些缺点，如仪器试剂成本和对实验人员的操作水平较高，选择性低及需要高精确度的温度循环仪器等。其他反应如滚环扩增反应(RCA)、链接酶链式扩增反应(LCR)、链置换扩增反应(SDA)由于其灵敏度原因，不能用于低浓度样品和多重SNP检测。
已报道的检测LAMP扩增方法主要是使用荧光标记的DNA探针、焦磷酸根离子沉淀、金属荧光指示剂等。荧光标记物质不仅会出现光漂白和光谱重叠等问题，而且成本较高，如精确定量还需要使用荧光显微镜或激光扫描仪等昂贵的仪器。另外，如果使用标记探针，在均相溶液中发生反应的探针信号很难与未反应的探针产生的背景信号分开。使用焦磷酸根离子或金属荧光指示剂进行检测，检出限高，灵敏度低，而且特异性差，极容易产生气溶胶等污染，造成假阳性结果。用凝胶电泳分离分析LAMP产物，而需要繁琐的步骤、高成本及很长的反应时间。
综上所述，找到一种可以同时检测多个位点SNP，操作快速简便，结果准确，特异性好的探针组、反应体系和检测方法具有重要的意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于检测运动基因SNP的引物组；本发明的第二目的在于提供一种上述引物组在检测运动基因SNP中的应用；本发明的第三个目的在于提供一种上述引物组在制备用于检测运动基因SNP的产品中的应用；本发明的第四个目的在于提供一种用于检测运动基因SNP的产品；本发明的第五个目的在于提供一种用于运动基因SNP的多重检测方法；本发明的第六个目的在于提供上述运动基因SNP的多重检测方法在运动基因SNP检测中的应用，以缓解现有技术中存在的若想检测AMPD1、PPARGC1A、ACTN3、NRF-1和COL5A1五种基因SNP时需要针对每种基因分别进行实验设计，费时费力的问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种用于检测运动基因SNP的引物组，所述引物组包括1个引物对和5个探针组，所述5个探针组包括：
用于检测AMPD1基因的探针组、用于检测PPARGC1A基因的探针组、用于检测ACTN3基因的探针组、用于检测NRF-1基因的探针组和用于检测COL5A1基因的探针组；
所述引物对包括
BIP：5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcgga-3’(SEQ ID NO.1)；
FIP：5’-FAM-atcgtcgtgactgaaagtgcggggctctgtcctattac-3’(SEQ ID NO.2)；
所述用于检测AMPD1基因的探针组包括
AMPD1-A：
5’-tttctcttcagctgtatgaattttatcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtcacgacgat-3’(SEQ ID NO.3)；
AMPD1-wt-B：
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttaaagtaatgcaatactcacg-3’(SEQ ID NO.4)；
AMPD1-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttaaagtaatgcaatactcaca-3’(SEQ ID NO.5)；
所述用于检测PPARGC1A基因的探针组包括
PPARG-A：
5’-ggtcttgtctgcttcgtcgtttttatcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtcacgacgat-3’(SEQ ID NO.6)；
PPARG-wt-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgtttttttttttttcactgtccctcagttcact-3’(SEQ ID NO.7)；
PPARG-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgtttttttttttttttcactgtccctcagttcacc-3’(SEQ ID NO.8)；
所述用于检测ACTN3基因的探针组包括
ACTN3-A:
5’-phosphate-gtcagcctcgggcagtgttg-tttt-atcgtcgtgactg-ttt-gtaataggacagagccccgcac-ttt-cagtcacgacgat-3’(SEQ ID NO.9)；
ACTN3-wt-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttatgatggcacctcgctctcg-3’(SEQ ID NO.10)；
ACTN3-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttatgatggcacctcgctctca-3’(SEQ ID NO.11)；
所述用于检测NRF-1基因的探针组包括
NRF1-A:
5’-tgagtaccagctgaatggcattttatcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtcacgacgat-3’(SEQ ID NO.12)；
NRF1-wt-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttttttttgcctcttctctcctggtggt-3’(SEQ ID NO.13)；
NRF1-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttttttttttgcctcttctctcctggtggc-3’(SEQ ID NO.14)；
所述用于检测COL5A1基因的探针组包括
COL5A1-A:
5’-tgggtgtggacagagcgtggttttatcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtcacgacgat-3’(SEQ ID NO.15)；
COL5A1-wt-B
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttttttttttttggccccgctcccggggcgcg-3’(SEQ ID NO.16)；
COL5A-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttttttttttttttggccccgctcccggggcgca-3’(SEQ ID NO.17)。
本发明还提供了所述的引物组在检测运动基因SNP中的应用。
本发明还提供了所述的引物组在制备用于检测运动基因SNP的产品中的应用。
本发明还提供了一种用于检测运动基因SNP的产品，所述产品包括上述引物组。
本发明还提供了一种运动基因SNP的多重检测方法，所述方法应用所述的引物组或所述的产品。
进一步地，所述方法包括：先以所述探针组为引物，以待测样本DNA为模板，鲑鱼精DNA为封闭剂，进行连接反应，得到连接产物；接着以所述连接产物为模板，以所述引物对为引物进行扩增反应，得到扩增产物；然后将所述扩增产物进行酶切；最后通过毛细管电泳进行结果分析。
进一步地，所述连接反应温度为65-69℃，所述探针组浓度为4pmol/L-0.4nmol/L，所述鲑鱼精DNA用量为1-3μg。
进一步地，所述扩增反应时间为65-75min。
进一步地，所述毛细管电泳步骤中所用的扩增产物预先稀释5-20倍后上样检测。
本发明还提供了上述的多重检测方法在运动基因SNP检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的用于检测运动基因SNP的引物组包括用于检测AMPD1基因的探针组、用于检测PPARGC1A基因的探针组、用于检测ACTN3基因的探针组、用于检测NRF-1基因的探针组、用于检测COL5A1基因的探针组和引物对，可以同时检测AMPD1基因、PPARGC1A基因、ACTN3基因、NRF-1基因和COL5A1基因的SNP情况，特异性好没有交叉反应。本发明提供的用于检测运动基因SNP的产品，包括上述的引物组，检测操作方便，检测快速，灵敏度高，特异性强，可以一次检测AMPD1基因、PPARGC1A基因、ACTN3基因、NRF-1基因和COL5A1基因的SNP情况，同时给出五个基因是否是野生型、突变纯合子或突变杂合子的结果，保证了检测结果准确，同时降低了检测成本，可以直接应用于社会生产实践。本发明提供的运动基因SNP的多重检测方法操作简单，检测速度成倍提高，检测特异性好，灵敏度高，结果准确，同时降低了时间成本和人工成本，节省资源，可以同时检测五个基因的突变情况，为运动基因SNP检测提供了快速多重检测方法。
附图说明
图1为本发明提供的引物组中探针组探针B的设计原理示意图；
图2为本发明提供的运动基因SNP多重检测方法的原理操作流程示意图；
图3A为本发明实施例2-1中连接温度为65℃时对野生型DNA、突变型DNA和空白组结果的影响结果图；
图3B为本发明实施例2-1中连接温度为66℃时对野生型DNA、突变型DNA和空白组结果的影响结果图；
图3C为本发明实施例2-1中连接温度为67℃时对野生型DNA、突变型DNA和空白组结果的影响结果图；
图3D为本发明实施例2-1中连接温度为68℃时对野生型DNA、突变型DNA和空白组结果的影响结果图；
图4A为本发明实施例2-2中探针组浓度为4pmol/L是对野生型DNA检测信号峰的影响结果图；
图4B为本发明实施例2-2中探针组浓度为40pmol/L是对野生型DNA检测信号峰的影响结果图；
图4C为本发明实施例2-2中探针组浓度为0.4nmol/L是对野生型DNA检测信号峰的影响结果图；
图4D为本发明实施例2-2中探针组浓度为4nmol/L是对野生型DNA检测信号峰的影响结果图；
图5A为本发明实施例2-3中鲑鱼精DNA用量为1μg时对野生型DNA和突变型DNA检测信号峰的影响结果示意图；
图5B为本发明实施例2-3中鲑鱼精DNA用量为2μg时对野生型DNA和突变型DNA检测信号峰的影响结果示意图；
图5C为本发明实施例2-3中鲑鱼精DNA用量为4μg时对野生型DNA和突变型DNA检测信号峰的影响结果示意图；
图6A为本发明实施例3-1中扩增时间为60min时对野生型和突变型DNA检测信号峰的影响结果示意图；
图6B为本发明实施例3-1中扩增时间为70min时对野生型和突变型DNA检测信号峰的影响结果示意图；
图6C为本发明实施例3-1中扩增时间为80min时对野生型和突变型DNA检测信号峰的影响结果示意图；
图6D为本发明实施例3-1中扩增时间为90min时对野生型和突变型DNA检测信号峰的影响结果示意图；
图6E为本发明实施例3-1中扩增时间为90min时对空白样品检测信号峰的影响结果示意图；
图7A为本发明实施例5-1中扩增产物稀释0倍对野生型DNA检测信号峰的影响结果示意图；
图7B为本发明实施例5-1中扩增产物稀释10倍对野生型DNA检测信号峰的影响结果示意图；
图7C为本发明实施例5-1中扩增产物稀释100倍对野生型DNA检测信号峰的影响结果示意图；
图8A为本发明实施例6中检测样本野生型DNA浓度为1pmol/L时对实验结果检测信号峰的影响示意图；
图8B为本发明实施例6中检测样本野生型DNA浓度为100fmol/L时对实验结果检测信号峰的影响示意图；
图8C为本发明实施例6中检测样本野生型DNA浓度为10fmol/L时对实验结果检测信号峰的影响示意图；
图8D为本发明实施例6中检测样本野生型DNA浓度为1fmol/L时对实验结果检测信号峰的影响示意图；
图9A为本发明实施例7中检测样本野生型DNA时多重探针对样本的检测信号峰结果示意图；
图9B为本发明实施例7中检测样本突变型DNA时多重探针对样本的检测信号峰结果示意图；
图9C为本发明实施例7中检测样本野生型DNA和突变型DNA时多重探针对样本的检测信号峰结果示意图；
图9D为本发明实施例7中检测样本基因组DNA时多重探针对样本的检测信号峰结果示意图；
图9E为本发明实施例7中检测样本空白样品时多重探针对样本的检测信号峰结果示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明提供了一种用于检测运动基因SNP的引物组，引物组包括1个引物对和5个探针组，所述5个探针组包括：
用于检测AMPD1基因的探针组、用于检测PPARGC1A基因的探针组、用于检测ACTN3基因的探针组、用于检测NRF-1基因的探针组和用于检测COL5A1基因的探针组；
引物对包括
BIP：5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcgga-3’(SEQ ID NO.1)；
FIP：5’-FAM-atcgtcgtgactgaaagtgcggggctctgtcctattac-3’(SEQ ID NO.2)；
用于检测AMPD1基因的探针组包括
AMPD1-A：
5’-tttctcttcagctgtatgaattttatcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtcacgacgat-3’(SEQ ID NO.3)；
AMPD1-wt-B：
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttaaagtaatgcaatactcacg-3’(SEQ ID NO.4)；
AMPD1-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttaaagtaatgcaatactcaca-3’(SEQ ID NO.5)；
用于检测PPARGC1A基因的探针组包括
PPARG-A：
5’-ggtcttgtctgcttcgtcgtttttatcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtcacgacgat-3’(SEQ ID NO.6)；
PPARG-wt-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgtttttttttttttcactgtccctcagttcact-3’(SEQ ID NO.7)；
PPARG-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgtttttttttttttttcactgtccctcagttcacc-3’(SEQ ID NO.8)；
用于检测ACTN3基因的探针组包括
5’-phosphate-gtcagcctcgggcagtgttg-tttt-atcgtcgtgactg-ttt-gtaataggacagagccccgcac-ttt-cagtcacgacgat-3’(SEQ ID NO.9)；
ACTN3-wt-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttatgatggcacctcgctctcg-3’(SEQ ID NO.10)；
ACTN3-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttatgatggcacctcgctctca-3’(SEQ ID NO.11)；
用于检测NRF-1基因的探针组包括
NRF1-A:
5’-tgagtaccagctgaatggcattttatcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtcacgacgat-3’(SEQ ID NO.12)；
NRF1-wt-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttttttttgcctcttctctcctggtggt-3’(SEQ ID NO.13)；
NRF1-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttttttttttgcctcttctctcctggtggc-3’(SEQ ID NO.14)；
用于检测COL5A1基因的探针组包括
COL5A1-A:
5’-tgggtgtggacagagcgtggttttatcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtcacgacgat-3’(SEQ ID NO.15)；
COL5A1-wt-B
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttttttttttttggccccgctcccggggcgcg-3’(SEQ ID NO.16)；
COL5A-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttttttttttttttggccccgctcccggggcgca-3’(SEQ ID NO.17)。
AMPD1基因编码骨骼肌特异性亚型(M)，AMPD1基因的C到T的突变导致蛋白质合成的终止，造成了AMPD骨骼肌表现的蛋白合成不足。
PPARGC1A基因是一个控制氧化磷酸化的OXPHOS基因的共活化剂。其通过OXPHOS基因控制氧化磷酸化从而调节线粒体生物合成、葡萄糖和脂质运输、氧化和骨骼肌纤维形成。
ACTN3基因编码只有在II型肌纤维才能够发现Z结构蛋白，这种纤维使得肌肉具有爆发力、加速糖酵解、Ⅱ型纤维合成等功能，并使得肌肉产生“爆炸性的”强力收缩。
NRF-1基因在哺乳动物细胞中存在的能量传递的重要组成部分，并可以将生理信号(尤其是那些运动诱导)转化为提高线粒体生物合成和氧化磷酸化的能力。
COL5A1是编码V型胶原蛋白的基因，它决定了V型胶原蛋白的大小和数量，这种蛋白可以支持肌腱，韧带，肌肉等许多身体组织结构。
所以检测以上五个基因的单核苷酸多态性可以评价运动员的耐力运动水平。本发明检测的SNP包括：ACTN3基因中C到T的突变，AMPD1基因中C到T的突变，PPARGC1A基因中A到G的突变，NRF-1基因中A到G的突变，COL5A1基因中C到T的突变。
上述五个基因的具体突变位点序列如下表所示：
图1为探针组中探针B的设计原理图，探针组中每种基因的野生型和突变型的探针A相同，每种基因的探针B分为野生型和突变型，带有与SNP突变位点互补的碱基。10个探针B通过不同T碱基长度区分，每个基因位点的探针长度相差2个碱基，探针B同时设计有HindIII限制性内切酶的酶切位点。
上述引物组包括用于检测AMPD1基因的探针组、用于检测PPARGC1A基因的探针组、用于检测ACTN3基因的探针组、用于检测NRF-1基因的探针组、用于检测COL5A1基因的探针组和一组引物对，可以同时检测AMPD1基因、PPARGC1A基因、ACTN3基因、NRF-1基因和COL5A1基因的SNP情况，特异性好没有交叉反应。
本发明还提供了上述的引物组在检测运动基因SNP中的应用。
本发明还提供了上述述的引物组在制备用于检测运动基因SNP的产品中的应用。
本发明还提供了一种用于检测运动基因SNP的产品，产品包括上述引物组。
该产品检测操作方便，检测快速，灵敏度高，特异性强，可以一次检测AMPD1基因、PPARGC1A基因、ACTN3基因、NRF-1基因和COL5A1基因的SNP情况，同时给出五个基因是否是野生型、突变纯合子或突变杂合子的结果，保证了检测结果准确，同时降低了检测成本，可以直接应用于社会生产实践。
本发明还提供了一种运动基因SNP的多重检测方法，方法应用所述的引物组或所述的产品。
优选地，方法包括：先以上述探针组为引物，以待测样本DNA为模板，鲑鱼精DNA为封闭剂，进行连接反应，得到连接产物；接着以连接产物为模板，以上述引物对为引物进行扩增反应，得到扩增产物；然后将所述扩增产物进行酶切；最后通过毛细管电泳进行结果分析。
需要说明的是：本发明提供的多重检测方法的原理操作流程如图2所示，具体为，设计了3’末端与FIP颈环结构互补，5’端进行磷酸标记并与目标DNA序列完全匹配的探针A；3’末端与BIP颈环结构互补，5’端带有检测SNP位点的与目标位点互补的碱基的探针B，并在探针B颈环结构上设计了根据T碱基长度区分探针的编码序列和符合HindIII限制性内切酶的酶切位点；FIP引物的5’末端用FAM荧光进行标记。当突变位点与探针B的5’端碱基相互匹配，连接酶会依照其特性将探针A和B的3’端和5’端通过高能磷酸键连接。相反，如果突变位点和探针B的5’端碱基不匹配连接酶就不会将其连接成环。下一步，在连接好的探针A和探针B的整体探针中加入Bst DNA聚合酶大片段，dNTPs和FIP、BIP引物进行LAMP扩增反应，最终反应产生大量不同长度的长链DNA。扩增产物经过酶切后，形成单一长度5’端FAM荧光标记的酶切片段，每条酶切片段含有一个编码序列，根据基因型和突变位点不同，编码序列的T碱基长度不同，从而调节每种LAMP酶切产物的长度，实现多个基因位点和SNP的区分。
采用ABI310TM基因分析仪的对酶切产物进行片段分析。将荧光染料标记的酶切产物，经过毛细管电泳分离，采用固定的激光光源对荧光信号进行激发，并检测收集数据。根据每个基因位点的探针长度相差2个碱基，不同基因型的酶切产物长度不同，具有不同的迁移速率，能通过电泳彼此分离。在每个基因位点的两组探针中，探针杂交部分的溶解温度需保持在很窄范围内，使热力学和动力学过程保持一致。
当单一位点和探针匹配时，会产生单一信号峰，多个位点和探针匹配时，会产生多重信号峰，当位点和探针不匹配时，不会产生信号峰。检测人类基因组样品时，设计了10组编码序列不同长度的探针，分别和五个基因的野生型DNA、突变型DNA的5’端碱基相匹配。当进行样品检测时，某个基因是野生纯合子，相应会产生野生型探针信号峰，突变型探针检测无信号峰；当是突变纯合子时，突变型探针会出现检测信号峰，野生型探针不会产生信号峰；当样品是杂合子时，两套探针都会出现信号峰，以此类推，当实际样品的五个基因都是杂合子时，就会出现十个不同位置的信号峰，每个峰的距离均差2个碱基长度。
优选地，连接反应温度为65-69℃，探针组浓度为4pmol/L-0.4nmol/L，鲑鱼精DNA用量为1-3μg。
连接反应温度典型但不限定为：65℃、66℃、67℃或68℃；
探针组浓度典型但不限定为：4pmol/L、25pmol/L、40pmol/L、100pmol/L、200pmol/L、300pmol/L或400pmol/L；
鲑鱼精DNA用量典型但不限定为：1μg、2μg或3μg。
优选地，扩增反应时间为65-75min。扩增反应时间典型但不限定为：65min、68min、70min、72min或75min。
优选地，毛细管电泳步骤中所用的扩增产物预先稀释5-20倍后上样检测。稀释倍数典型但不限定为：5倍、10倍、15倍或20倍。
上述方法中当突变型探针和突变型DNA匹配时，连接酶通过高能磷酸键将两个探针链接成环，然后通过加入Bst DNA聚合酶、dNTPs和荧光标记的引物进行LAMP扩增反应，将扩增产物进行酶切，用ABI310TM基因分析仪的对酶切产物进行片段分析。经过毛细管电泳分离，采用固定的激光光源对荧光信号进行激发，并检测收集数据，根据每个基因位点的探针长度相差2个碱基，当多个位点和探针匹配时，会产生多重信号峰，当位点和探针不匹配时，不会产生信号峰，据此进行基因分型。该方法具有很高的灵敏度和特异性，检测速度成倍提高，检测特异性好，结果准确，同时降低了时间成本和人工成本，节省资源，可以同时检测五个基因的突变情况，为运动基因SNP检测提供了快速多重检测方法。
本发明还提供了上述的多重检测方法在运动基因SNP检测中的应用。
为了有助于更清楚的理解本发明的内容，相结合具体的实施例详细介绍如下。如未明确指出，以下实施例中采用的2720PCR仪(Applied Biosystems，美国)被用来控制反应的温度；ABI310TM基因分析仪(Applied Biosystems，美国)用来进行产物片段长度分析，NanoDrop 2000TM超微量分光光度计(Thermo，美国)用来定量基因组样品。
血液基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司(北京，中国)，Bst DNA聚合酶大片段、TermoPol缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)2SO4，2mmol/L MgSO4，0.1％Triton X-100)、HindIII限制性内切酶、NEBuffer 2.1(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，100μg/ml BSA)和dNTPs购自NEW England Biolabs公司(美国)，DNA连接酶(Ampligase Thermostable DNALigase)购自Epicentre公司(美国)，甜菜碱购自Sigma公司(美国)，鲑鱼精DNA溶液购自Invitrogen(美国)。合成的DNA目标链、探针、引物购自宝生物科技有限公司(大连，中国)。合成的DNA序列用HPLC纯化。所有溶液均用去离子灭菌水配制。其它试剂均为分析纯。
实施例1人类基因组样品的提取
人类基因组样品取自运动员的外周静脉血，采用血液基因组提取试剂盒提取，样品在260nm波长下进行紫外定量。
实施例2连接反应
连接反应实验步骤包括：在LAMP探针的连接反应中，反应混合溶液中包含1μL 10×Ampligase反应缓冲液，0.2μL DNA连接酶(Ampligase Thermostable DNALigase)，5.8μL水，每一种引物浓度为40pmol/L，1μL2μg/μL鲑鱼精DNA，1μL不同浓度的DNA目标链或人类基因组样品，混合后总体积10μL。反应先在95℃，3min使DNA双链解链后，再于67℃进行30min的连接反应。
实施例2-1连接反应温度优化
连接反应的温度会影响探针和目标链的杂交效率，对基于连接反应的SNP检测至关重要。为了考察探针在连接温度对检测SNP反应的影响，分别对ACTN3基因野生型和突变型探针组做了预实验，所用野生型和突变型DNA浓度分别为10fmol/L，分别在65℃、66℃、67℃和68℃的连接反应温度下进行试验，在同一时间进行扩增反应，最后毛细管电泳检测结果。对目标DNA检测，实验结果分别如图3A、图3B、图3C和图3D所示，选出空白、突变型样品和野生型样品的POI差值最大的条件。最佳实验条件选择连接温度为67℃。
实施例2-2连接反应探针组浓度优化
连接探针组通过连接酶同目标DNA杂交连接成环并进行扩增反应，所以探针组浓度和目标DNA浓度有对应关系，合适浓度的匹配探针组可以提高检测灵敏度，不匹配的探针组浓度过高反而会影响反应特异性。为此对连接探针组浓度进行了优化，所用ACTN3基因野生型DNA浓度为100fmol/L，探针组浓度设置为4pmol/L、40pmol/L、0.4nmol/L和4nmol/L，获得连接产物后在同一时间进行扩增反应，最后通过毛细管电泳检测实验结果。图4A、图4B、图4C和图4D分别为4pmol/L、40pmol/L、0.4nmol/L和4nmol/L的实验结果，从图中可以看出，在4pmol/L至40pmol/L之间时，随着探针组的浓度增加，信号峰逐渐增强，其他不匹配探针组的信号峰强度降低。当探针组浓度在40pmol/L至0.4nmol/L之间时，信号峰逐渐增强，不匹配探针组的信号峰强度也增高，因此最佳实验条件选择探针组浓度为40pmol/L。
实施例2-3鲑鱼精DNA用量的优化
合适浓度的鲑鱼精DNA可以提高连接反应的特异性，但添加量过多会影响探针连接效率和酶切反应效率，使得检测灵敏度下降。为此对鲑鱼精DNA用量进行了优化，所用ACTN3基因野生型DNA浓度为100fmol/L，鲑鱼精DNA用量分别设置为1μg、2μg和4μg，获得连接产物后在同一时间进行扩增反应，最后通过毛细管电泳检测实验结果。图5A、图5B和图5C分别为1μg、2μg和4μg的实验结果，从图中可以看出，当鲑鱼精浓度为1μg时，和检测无关的信号峰较多，随着鲑鱼精浓度增加，无关的信号峰减少但峰强度下降，当鲑鱼精浓度达到4μg时，连接反应被抑制，没有信号峰，因此最佳实验条件选择鲑鱼精用量为2μg。
实施例3扩增反应
扩增反应实验步骤包括：连接反应完成后，将反应混合物冷却至室温，放在冰板上，并加入6μL混合液A，包含：0.8μL 10×ThermoPol Reaction缓冲液，0.2μL 1μmol/L的引物FIP和BIP，2μL 5mol/L的甜菜碱，0.8μL2.5mmol/L的dNTPs和2μL水。然后加入混合液B，包含：0.2μL 10×ThermoPol Reaction缓冲液,2.5U Bst DNA聚合酶大片段和1.6μL水，最终混合物迅速放入2720PCR仪(Applied Biosystems，美国)在65℃下反应70min。
实施例3-1扩增反应时间的优化
适合的扩增时间能提高扩增产物的浓度，从而增加检测灵敏度。然而延长扩增时间也会造成酶切不完全产生的信号峰个数增多，同时会引起空白样品引物的非特异性扩增。ACTN3基因野生型DNA浓度为100fmol/L，实验设计扩增时间分别为60min、70min、80min和90min，最后通过毛细管电泳检测。如图6A、图6B、图6C、图6D和图6E所示，分别为扩增时间60min、70min、80min、90min和90min空白样品的实验结果。从图中可以看出，当扩增时间为60min时，没有足够的扩增产物所以没有酶切产物的无信号峰。随着扩增时间增加，产物的浓度增高，信号峰增高，当90min时，空白样品也产生信号，因此最佳实验条件选择扩增时间为70min。
实施例4酶切反应
扩增反应完成后，将反应混合物冷却至室温，放在冰板上，并加入5μL NEBuffer2.1，包含100U HindIII限制性内切酶和35μL水。混合物放入2720PCR仪(AppliedBiosystems，美国)在37℃下反应60min。
实施例5毛细管电泳和数据分析
毛细管电泳是在ABI310TM基因分析仪(Applied Biosystems，美国)中进行的。LAMP产物用水稀释10倍，将2μL的稀释溶液与18μL的高纯去离子甲酰胺(Applied Biosystem)、0.5μL的GeneScan 120LIZ Size Standard(Applied Biosystem)混合。95℃变性10min，迅速取出放到冰板上骤冷15min。使用47cm的毛细管和POP-4polymer(Applied Biosystem)。进样时间20s，进样电压10KV，运行电压15KV，运行温度60℃，运行时间20min。采用CCD检测荧光波长和强度。数据分析采用GeneMapper 4.1software(Applied Biosystem)分析，确定峰位置和峰面积。
实施例5-1扩增产物稀释倍数的优化
扩增产物在酶切之前稀释到合适的浓度，有利于酶切反应和毛细管电泳荧光检测的实施。过高浓度的产物会产生过高的荧光信号，而且容易造成酶切不完全，过低的产物浓度会影响检测的灵敏度，因此选择合适的产物稀释倍数非常重要。对同一扩增产物ACTN3基因野生型DNA(1pmol/L)分别稀释0倍、10倍和100倍进行毛细管电泳检测，结果分别如图7A、图7B和图7C所示。图7A、图7B和图7C分别代表扩增产物稀释0倍、10倍和100倍的毛细管电泳检测结果。从图中可以看出最佳稀释倍数为10倍。
实施例6灵敏度和线性分析
对方法的灵敏度进行了考察，实验考察了野生型探针组对1pmol/L、100fmol/L、10fmol/L和1fmol/L浓度XXX基因野生型DNA样品的检测结果，结果分别如图8A、图8B、图8C和图8D所示。检测结果显示，随着野生型DNA样品浓度的增加，酶切产物的信号峰增强，引物的峰降低，LAMP和酶切产物量提高，该方法的检出限为1fmol/L。
实施例7多重探针检测验证
在最佳反应条件下，考察了多重探针对不同样品的检测结果。混合探针组中包括AMPD1基因和ACTN3基因探针组，实验组分别设置为：野生型DNA、突变型DNA、野生型DNA+突变型DNA、基因组DNA及空白样品，其中DNA样品浓度为1pmol/L，图9A、图9B、图9C、图9D和图9E分别表示实验组野生型DNA、突变型DNA、野生型DNA+突变型DNA、基因组DNA及空白样品的实验结果。野生型探针和突变型探针均应出现两个信号峰，且野生型产物长度为120bp、124bp，突变型产物长度为122bp、126bp，混合型产物长度为120bp、122bp、124bp、126bp，野生型和突变型信号峰差2个碱基。从图中可以看出，人基因组DNA产物长度为120bp、124bp，测序结果为野生型，毛细管电泳荧光检测结果与理论结果一致。由此表明方法对SNP检测具有很好的特异性。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 保定佑安生物科技有限公司
<120> 检测运动基因SNP的引物组及其应用和产品以及检测运动基因SNP的检测方法
及应用
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgacagcaga ggatttgttg tgtggaagct tgagcgga 38
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcgtcgtga ctgaaagtgc ggggctctgt cctattac 38
<210> 3
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tttctcttca gctgtatgaa ttttatcgtc gtgactgttt gtaataggac agagccccgc 60
actttcagtc acgacgat 78
<210> 4
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgacagcaga ggatttgttg tgtggaagct tgagcggatt ttcctctgct gtcgtttttt 60
ttaaagtaat gcaatactca cg 82
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgacagcaga ggatttgttg tgtggaagct tgagcggatt ttcctctgct gtcgtttttt 60
ttttaaagta atgcaatact caca 84
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<213> 人工序列
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ggtcttgtct gcttcgtcgt ttttatcgtc gtgactgttt gtaataggac agagccccgc 60
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<213> 人工序列
<400> 7
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tttttttcac tgtccctcag ttcact 86
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<212> DNA
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<400> 8
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tttttttttc actgtccctc agttcacc 88
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<213> 人工序列
<400> 9
gtcagcctcg ggcagtgttg ttttatcgtc gtgactgttt gtaataggac agagccccgc 60
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<400> 10
cgacagcaga ggatttgttg tgtggaagct tgagcggatt ttcctctgct gtcgttttat 60
gatggcacct cgctctcg 78
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
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atgatggcac ctcgctctca 80
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<213> 人工序列
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tgagtaccag ctgaatggca ttttatcgtc gtgactgttt gtaataggac agagccccgc 60
actttcagtc acgacgat 78
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgacagcaga ggatttgttg tgtggaagct tgagcggatt ttcctctgct gtcgtttttt 60
tttttttttt gcctcttctc tcctggtggt 90
<210> 14
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgacagcaga ggatttgttg tgtggaagct tgagcggatt ttcctctgct gtcgtttttt 60
tttttttttt ttgcctcttc tctcctggtg gc 92
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgggtgtgga cagagcgtgg ttttatcgtc gtgactgttt gtaataggac agagccccgc 60
actttcagtc acgacgat 78
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<400> 16
cgacagcaga ggatttgttg tgtggaagct tgagcggatt ttcctctgct gtcgtttttt 60
tttttttttt ttttggcccc gctcccgggg cgcg 94
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<213> 人工序列
<400> 17
cgacagcaga ggatttgttg tgtggaagct tgagcggatt ttcctctgct gtcgtttttt 60
tttttttttt ttttttggcc ccgctcccgg ggcgca 96
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tttacttcat acagctgaag agaaacgtga gtattgcatt acttttgctg c 51
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<213> 人工序列
<400> 19
tttacttcat acagctgaag agaaatgtga gtattgcatt acttttgctg c 51
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ttttgacgac gaagcagaca agaccagtga actgagggac agtgatttca g 51
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<213> 人工序列
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ttttgacgac gaagcagaca agaccggtga actgagggac agtgatttca g 51
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caaggcaaca ctgcccgagg ctgaccgaga gcgaggtgcc atcatgggca t 51
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ccgccccacg ctctgtccac acccacgcgc cccgggagcg gggccatgcc t 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ccgccccacg ctctgtccac acccatgcgc cccgggagcg gggccatgcc t 51
Claims (10)
1.一种用于检测运动基因SNP的引物组，其特征在于，所述引物组包括1个引物对和5个探针组，所述5个探针组包括：
用于检测AMPD1基因的探针组、用于检测PPARGC1A基因的探针组、用于检测ACTN3基因的探针组、用于检测NRF-1基因的探针组和用于检测COL5A1基因的探针组；
所述引物对包括
BIP：5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcgga-3’(SEQ ID NO.1)；
FIP：5’-FAM-atcgtcgtgactgaaagtgcggggctctgtcctattac-3’(SEQ ID NO.2)；
所述用于检测AMPD1基因的探针组包括
AMPD1-A：
5’-tttctcttcagctgtatgaattttatcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtcacg acgat-3’(SEQ ID NO.3)；
AMPD1-wt-B：
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttaaagtaatgca atactcacg-3’(SEQ ID NO.4)；
AMPD1-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttaaagtaatgc aatactcaca-3’(SEQ ID NO.5)；
所述用于检测PPARGC1A基因的探针组包括
PPARG-A：
5’-ggtcttgtctgcttcgtcgtttttatcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtcacg acgat-3’(SEQ ID NO.6)；
PPARG-wt-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgtttttttttttttcactgtcc ctcagttcact-3’(SEQ ID NO.7)；
PPARG-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgtttttttttttttttcactgtc cctcagttcacc-3’(SEQ ID NO.8)；
所述用于检测ACTN3基因的探针组包括
ACTN3-A:
5’-phosphate-gtcagcctcgggcagtgttg-tttt-atcgtcgtgactg-ttt-gtaataggacagagccc cgcac-ttt-cagtcacgacgat-3’(SEQ ID NO.9)；
ACTN3-wt-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttatgatggcacctcg ctctcg-3’(SEQ ID NO.10)；
ACTN3-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttatgatggcacct cgctctca-3’(SEQ ID NO.11)；
所述用于检测NRF-1基因的探针组包括
NRF1-A:
5’-tgagtaccagctgaatggcattttatcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtca cgacgat-3’(SEQ ID NO.12)；
NRF1-wt-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttttttttgcctct tctctcctggtggt-3’(SEQ ID NO.13)；
NRF1-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttttttttttgcct cttctctcctggtggc-3’(SEQ ID NO.14)；
所述用于检测COL5A1基因的探针组包括
COL5A1-A:
5’-tgggtgtggacagagcgtggttttatcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtcacgacgat-3’(SEQ ID NO.15)；
COL5A1-wt-B
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttttttttttttggc cccgctcccggggcgcg-3’(SEQ ID NO.16)；
COL5A-mut-B:
5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagcttgagcggattttcctctgctgtcgttttttttttttttttttttttg gccccgctcccggggcgca-3’(SEQ ID NO.17)。
2.如权利要求1所述的引物组在检测运动基因SNP中的应用。
3.如权利要求1所述的引物组在制备用于检测运动基因SNP的产品中的应用。
4.一种用于检测运动基因SNP的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的引物组。
5.一种运动基因SNP的多重检测方法，其特征在于，所述方法应用权利要求1所述的引物组或权利要求4所述的产品。
6.根据权利要求5所述的多重检测方法，其特征在于，所述方法包括：先以所述探针组为引物，以待测样本DNA为模板，鲑鱼精DNA为封闭剂，进行连接反应，得到连接产物；接着以所述连接产物为模板，以所述引物对为引物进行扩增反应，得到扩增产物；然后将所述扩增产物进行酶切；最后通过毛细管电泳进行结果分析。
7.根据权利要求6所述的多重检测方法，其特征在于，所述连接反应温度为65-69℃，所述探针组浓度为4pmol/L-0.4nmol/L，所述鲑鱼精DNA的用量为1-3μg。
8.根据权利要求6所述的多重检测方法，其特征在于，所述扩增反应时间为65-75min。
9.根据权利要求6所述的多重检测方法，其特征在于，所述毛细管电泳步骤中所用的扩增产物预先稀释5-20倍后上样检测。
10.权利要求5-9任一项所述的多重检测方法在运动基因SNP检测中的应用。
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