CN105779570B - 一种检测snp位点的方法 - Google Patents
一种检测snp位点的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105779570B CN105779570B CN201410778560.XA CN201410778560A CN105779570B CN 105779570 B CN105779570 B CN 105779570B CN 201410778560 A CN201410778560 A CN 201410778560A CN 105779570 B CN105779570 B CN 105779570B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- sequence
- snp site
- section
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 237
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 69
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 26
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 4
- 101150030367 cls gene Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 13
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 12
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 12
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 108010063905 Ampligase Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N gelred Chemical compound [I-].[I-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测SNP位点的方法。本发明公开一组检测SNP位点的探针，该探针由检测各个SNP位点的各个探针组成，所述探针均由左区段和右区段组成。利用本发明公开的方法可以同时检测多个SNP位点，彻底实现了操作简便、高通量、低成本检测SNP，使SNP作为DNA分子标记在实际应用中充分发挥其绝对的优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测SNP位点的方法，属于生物技术领域。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，遍布于整个基因组，占DNA序列变异的90％，而且能够稳定遗传，在群体遗传学、分子标记辅助选择、基因分型、疾病检测等领域具有极高的应用价值。然而，由于SNP位点鉴定一般需要精密的仪器及高昂的试剂费用，而且需要有一定技术训练人员操作，所以很难得到广泛的应用。
到目前为止，SNP鉴定方法主要有以下几种：
(1)直接测序：这种方法鉴定SNP最直接、准确可靠，但如果进行群体样品测序，病原菌鉴定及基因分型等则不切实际。
(2)基于杂交原理，该方法主要根据DNA变性复性特点设计，不同检测方法采用不同的杂交方式，其中一种方法是首先设计带荧光标记的引物，然后扩增含SNP位点目的片段，再通过变性复性使其产生碱基错配，暴露出突变位点，之后利用化学断裂或酶解方法，从碱基错配处断开双链，在分辨率很高的聚丙烯酰胺凝胶检测突变位点。为了提高检测效率，美国研制出了价格不菲的LI-COR 4300 DNA分析仪，随后又研制出更贵的FragmentAnalyzerTM全自动毛细管电泳系统。毛细管电泳系统不需要荧光标记引物，可直接检测PCR酶切产物，但除了购买仪器外，所使用耗材全部需要进口。另一种方式是微阵列或芯片杂交，杂交后一般通过不同荧光发色进行检测，实际过程也不易操作，而且费用很高。还有近年报道的利用长链开环扣手探针杂交检测SNP位点，该技术要求制备高质量的长链探针，且很难同时检测多个SNP位点。
(3)基于PCR的检测方法，以PCR为基础的检测方法有很多，如Taqman定量PCR技术、引物延伸法、PCR溶解曲线分析法、等位基因特异引物PCR(AS-PCR)等等，其中等位基因特异引物PCR最简便、快速，但依然存在特异性不强，且每次扩增只能检测到一个SNP位点，通量不高的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测SNP位点的方法。
本发明提供一组检测SNP位点的探针，该探针由检测各个SNP位点的各个探针组成，所述探针均由左区段和右区段组成；所述左区段的序列从5’端到3’端依次为左通用引物序列和位于待测基因组上待测SNP位点的5’端上游、且与待测SNP位点相邻的核苷酸序列；所述右区段的序列从5’端到3’端依次为待测SNP位点的核苷酸、位于待测基因组上待测SNP位点的3’端下游、且与待测SNP位点相邻的核苷酸序列、可变区序列和右通用引物序列；
所述各个SNP位点的各个探针的长度均不同，一种SNP位点对应一种长度；
所述各个SNP位点的各个探针的左区段中，左通用引物序列均相同；
所述各个SNP位点的各个探针的右区段中，右通用引物序列均相同。
所述探针的退火温度基本一致，以适合在同一条件下与相应的目标序列杂交。
上述探针中，所述SNP位点为同一个位点时，检测该SNP位点的各个探针的左区段均相同；
所述左通用引物序列如SEQ ID No.3中自5’端起第1位至第23位核苷酸所示；
所述右通用引物序列如SEQ ID No.4中自5’端起第94位至第117位核苷酸所示。
上述任一所述的探针中，所述可变区序列为SEQ ID No.1中的任一段序列；
所述可变区序列还至少含有一个切刻内切酶Nb.BtsI酶切识别位点。
上述任一所述的探针中，所述左区段中，所述位于待测基因组上待测SNP位点的5’端上游、且与待测SNP位点相邻的核苷酸序列的长度为20-30bp；
所述右区段中，所述位于待测基因组上待测SNP位点的3’端下游、且与待测SNP位点相邻的核苷酸序列的长度为20-30bp。
所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.2中自5’端起的第122位碱基T时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.3所示，所述右区段的序列如SEQ ID No.4所示；和/或，所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.2中自5’端起的第122位的碱基C时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.3所示,所述右区段的序列如SEQ ID No.7所示；
和/或，
所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.10中自5’端起的第122位碱基C时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.11所示,所述右区段的序列如SEQ IDNo.12所示；和/或，所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.10中自5’端起的第122位核苷酸G时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.11所示，所述右区段的序列如SEQ ID No.15所示；
和/或，
所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.18中自5’端起的第143位碱基C时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.19所示，所述右区段的序列如SEQ IDNo.20所示；和/或，所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.18中自5’端起的第143位碱基G时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.19所示，所述右区段的序列如SEQ ID No.23所示；
和/或，
所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.26中自5’端起的第122位碱基G时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.27所示，所述右区段的序列如SEQ IDNo.28所示；和/或，所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.26中自5’端起的第122位碱基A时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.27所示，所述右区段的序列如SEQ ID No.31所示。
一种检测SNP位点的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含如下1)或2)所述的分子：
1)上述任一所述的探针；
2)上述任一所述的探针的左区段、SEQ ID No.1所示的DNA分子和扩增含有上述任一所述的探针的右区段的前体的引物对；
所述上述任一所述的探针的右区段的前体经限制性内切酶MlyI和切刻内切酶Nb.BtsI消化得到上述任一所述的探针的右区段；
该试剂盒还包含使用说明书，说明书的记载内容如下：将待检测基因组序列与上述任一所述的探针进行杂交，得到杂交产物；在杂交产物中加入DNA连接酶对杂交产物进行连接，使得探针的左区段与右区段连接，得到连接产物；以连接产物为模板，以左通用引物序列和右通用引物序列为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；根据PCR扩增产物的长度与所述探针的长度是否一致判断SNP位点处碱基种类；
或，
以SEQ ID No.1所示的DNA分子为模板，以扩增上述任一所述的探针的右区段的前体的引物对为引物进行PCR扩增，得到右区段的前体，将该前体经限制性内切酶MlyI和切刻内切酶Nb.BtsI消化得到上述任一所述的探针的右区段；该右区段与左区段组成探针；将待检测基因组序列与探针进行杂交，得到杂交产物；在杂交产物中加入DNA连接酶对杂交产物进行连接，使得探针的左区段与右区段连接，得到连接产物；以连接产物为模板，以左通用引物序列和右通用引物序列为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；根据PCR扩增产物的长度与所述探针的长度是否一致判断SNP位点处碱基种类；
所述左通用引物序列为上述任一所述的探针的左区段的左通用引物序列；
所述右通用引物序列为上述任一所述的探针的右区段的右通用引物序列；
所述右区段的前体的引物对由正向引物和反向引物组成，正向引物从5’端到3’端方向依次为5个保护性碱基、5’-GAGTCNNNNN-3’、基因组序列中的SNP位点的核苷酸、位于待测基因组上待测SNP位点的3’端下游、且与所述待测SNP位点相邻的核苷酸序列、可变区序列1；反向引物从5’端到3’端方向依次为所述探针的所述右通用引物序列的反向互补序列和可变区序列2的反向互补序列；由于可变区序列1和可变区序列2的反向互补序列的与SEQID No.1所示DNA分子的结合位置不同使得右区段的前体的长度不同；
所述可变区序列1与可变区序列2分别位于上述任一所述的探针的右区段的可变区序列的5’方向和3’方向。
所述杂交中检测同一个SNP位点的探针的左区段与右区段的摩尔比具体为杂交实验中预检测的SNP位点核苷酸的可能数:1。
所述SNP位点具体为SEQ ID No.2中自5’端起的第122位碱基T；和/或，所述SNP位点具体为SEQ ID No.2中自5’端起的第122位的碱基C；
和/或，
所述SNP位点具体为SEQ ID No.10中自5’端起的第122位碱基C；和/或，所述SNP位点具体为SEQ ID No.10中自5’端起的第122位核苷酸G；
和/或，
所述SNP位点具体为SEQ ID No.18中自5’端起的第143位碱基C；和/或，所述SNP位点具体为SEQ ID No.18中自5’端起的第143位碱基G；
和/或，
所述SNP位点具体为SEQ ID No.26中自5’端起的第122位碱基G；和/或，所述SNP位点具体为SEQ ID No.26中自5’端起的第122位碱基A。
一种检测SNP位点的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将待测基因组与上述任一所述的探针的左区段和右区段进行杂交，得到杂交产物；在杂交产物中加入DNA连接酶，对杂交产物进行连接，使得探针的左区段与右区段连接，得到连接产物；以连接产物为模板，用所述探针中所述左通用引物序列和所述探针中所述右通用引物序列为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；根据PCR扩增产物的长度和探针的长度是否一致判断SNP位点处核苷酸种类；
所述杂交中检测同一个SNP位点的探针的所述左区段与所述右区段的摩尔比具体为杂交实验中预检测的SNP位点碱基的可能数:1。
上述方法中，所述探针的右区段的制备方法如下：以SEQ ID No.1所示的DNA分子为模板，以扩增上述任一所述的探针的右区段的前体的引物对为引物进行PCR扩增，得到右区段的前体，将该前体经限制性内切酶MlyI和切刻内切酶Nb.BtsI消化得到单链，即得；
所述右区段的前体的引物对由正向引物和反向引物组成，正向引物从5’端到3’端方向依次为5个保护性碱基、5’-GAGTCNNNNN-3’、基因组序列中的SNP位点的核苷酸、位于待测基因组上待测SNP位点的3’端下游、且与所述待测SNP位点相邻的核苷酸序列、可变区序列1；反向引物从5’端到3’端方向依次为所述探针的所述右通用引物序列的反向互补序列和可变区序列2的反向互补序列；由于可变区序列1和可变区序列2的反向互补序列的与SEQID No.1所示DNA分子的结合位置不同使得右区段的前体的长度不同；
所述可变区序列1与可变区序列2分别位于上述任一所述的探针的右区段的可变区序列的5’方向和3’方向；
所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.2中自5’端起的第122位碱基T时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.3所示，所述右区段的序列如SEQ ID No.4所示，扩增右区段的前体的引物对如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；和/或，所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.2中自5’端起的第122位的碱基C时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.3所示,所述右区段的序列如SEQ ID No.7所示，扩增右区段的前体的引物对如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示；
和/或，
所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.10中自5’端起的第122位碱基C时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.11所示,所述右区段的序列如SEQ IDNo.12所示，扩增右区段的前体的引物对如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；和/或，所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.10中自5’端起的第122位核苷酸G时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.11所示，所述右区段的序列如SEQ IDNo.15所示，扩增右区段的前体的引物对如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示；
和/或，
所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.18中自5’端起的第143位碱基C时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.19所示，所述右区段的序列如SEQ IDNo.20所示，扩增右区段的前体的引物对如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示；和/或，所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.18中自5’端起的第143位碱基G时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.19所示，所述右区段的序列如SEQ IDNo.23所示，扩增右区段的前体的引物对如SEQ ID No.24和SEQ ID No.25所示；
和/或，
所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.26中自5’端起的第122位碱基G时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.27所示，所述右区段的序列如SEQ IDNo.28所示，扩增右区段的前体的引物对如SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示；和/或，所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.26中自5’端起的第122位碱基A时，检测该位点的探针的所述左区段的序列如SEQ ID No.27所示，所述右区段的序列如SEQ IDNo.31所示，扩增右区段的前体的引物对如SEQ ID No.32和SEQ ID No.33所示。
一种制备上述任一所述的探针中的右区段的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：以SEQ ID No.1所示DNA分子为模板，以右区段的前体的引物对为引物进行PCR扩增，得到右区段的前体，将该前体经限制性内切酶MlyI和切刻内切酶Nb.BtsI消化得到单链，即得；
所述右区段的前体的引物对由正向引物和反向引物组成，正向引物从5’端到3’端方向依次为5个保护性碱基、5’-GAGTCNNNNN-3’、基因组序列中的SNP位点的核苷酸、位于待测基因组上待测SNP位点的3’端下游、且与所述待测SNP位点相邻的核苷酸序列、可变区序列1；反向引物从5’端到3’端方向依次为所述探针的右通用引物序列的反向互补序列和可变区序列2的反向互补序列，由于可变区序列1和可变区序列2的反向互补序列的与SEQ IDNo.1所示DNA分子的结合位置不同使得右区段的前体的长度不同；
所述可变区序列1与可变区序列2分别位于上述任一所述探针的右区段的可变区序列的5’方向和3’方向。
SEQ ID No.1所示的DNA分子也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的探针、上述试剂盒、上述DNA分子在检测SNP位点中的应用也属于本发明的保护范围；
所述SNP位点的碱基具体为位于SEQ ID No.2所示序列中自5’端起第122位碱基T，和/或，所述SNP位点的碱基具体为SEQ ID No.2所示序列中自5’端起第122位碱基C；
和/或，
所述SNP位点的碱基具体为SEQ ID No.10所示序列中自5’端起第122位碱基C，和/或，所述SNP位点的碱基具体为SEQ ID No.10所示序列中自5’端起第122位碱基G；
和/或，
所述SNP位点的碱基具体为SEQ ID No.18所示序列中自5’端起第143位碱基C，和/或，所述SNP位点的碱基为SEQ ID No.18所示序列中自5’端起第143位碱基G；
和/或，
所述SNP位点的碱基具体为SEQ ID No.26所示序列中自5’端起第122位碱基G，和/或，所述SNP位点的碱基具体为SEQ ID No.26所示序列中自5’端起第122位碱基A。
利用本发明提供的方法可以同时检测多个SNP位点，彻底实现了操作简便、高通量、低成本检测SNP，使SNP作为DNA分子标记在实际应用中充分发挥其绝对的优势。
附图说明
图1为SNP位点检测原理图。
图2为单链探针分离纯化流程示意图。
图3为SNP位点检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
水稻明恢63(Oryza sativa L.，本专利缩写为mt)在文献“谢华安，明恢63的选育与利用，福建农业学报，第4期，1998.12.31”中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。
水稻珍汕97A(Oryza sativa L.，本专利缩写为Zs)在文献“胡家书杨德忠，珍汕97性状变异及其对生产的影响，种子，第4期，1997”中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。
实施例1、与水稻低温发芽连锁的4个SNP位点的检测
本发明的SNP位点检测原理如图1所示。
(一)探针设计
对于一个SNP位点的检测设计两条探针(如图1A所示,分别为P1-probe1-C-probe2-P2和P1-probe1-A-probe2-P2)，其中一条探针(如图1A中的P1-probe1-C-probe2-P2)检测野生型位点(如图1中的位点G)，另一条探针(如图1A中的P1-probe1-A-probe2-P2)检测突变位点(如图1中的位点T)，每条探针从突变位点处分成左右两个区段。两条探针的左区段序列相同，该区段序列包括两部分，左侧是左通用引物序列(如图1中的P1)，右侧是与SNP位点的5’端上游基因组序列完全匹配(如图1A中的probe1)的序列；两条探针的右区段由三部分组成，SNP位点的碱基，与SNP位点的3’端下游基因组序列完全匹配的序列，可变区序列，最右侧是右通用引物序列(如图1中的P2)。两条探针的右区段有两点不同，一是SNP位点，二是长度不同，检测野生型位点的探针(如图1A中的P1-probe1-C-probe2-P2)含有与该位点完全匹配的碱基(如图1中检测野生型位点的探针中为G)，检测突变型位点的探针(如图1A中的P1-probe1-A-probe2-P2)含有与突变位点完全匹配的碱基(如图1中检测突变型位点的探针中为T)，一般检测突变型位点的探针比检测野生型位点的探针长，长短由探针的右区段中的可变区域决定。图1中的probe2的浅色部分与基因组序列完全匹配，深色部分是可变区域。
(二)步骤一设计的探针与目标序列分别形成杂交双链，probe1和probe2在SNP位点处由耐高温连接酶连接，得到杂交产物(如图1B所示)。
(三)将步骤二得到的杂交产物直接用作PCR模板，以通用引物(P1和P2)为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将其进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判断SNP位点(如图1C中，G带代表检测位点为野生型位点G；T带代表检测位点为突变位点T；G、T两条带代表杂合型位点)。
如果同时检测多个SNP位点，可以设计多对探针，设计原则与检测方法均与上述检测单一SNP位点相同。
本实施例选取与水稻低温发芽连锁的4个SNP位点进行基因定位，定位群体是水稻亲本明恢63(mh)和珍汕97A(Zs)的F2代，F2代是以明恢63为父本，珍汕97A为母本杂交获得F1代，F1代自交获得F2代，共211个。
下述步骤获得探针右区段的前体的PCR扩增体系如下：
下述步骤中获得探针右区段的前体的PCR反应程序如下：
下述步骤中探针右区段的前体经过如下步骤得到相应的探针右区段：
将探针右区段的前体进行纯化，得到探针右区段的前体的纯化产物，将其溶于130ul体积的水中，再经限制性内切酶MlyI和切刻内切酶Nb.BtsI消化，产生单链探针，具体步骤如下：
(一)酶切反应体系及条件如下：
将反应体系置于37℃反应2小时。
(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化单链探针
将酶切后的产物在圆盘凝胶槽电泳，使目的单链探针与Nb.BtsI消化的目的单链探针的互补链分离。电泳结束后，将凝胶从玻璃管取出，GelRed(购自美国Biotium Inc.，货号为41003)染色30分钟，在紫外灯下切下凝胶柱最上面的亮带，然后将切下的凝胶块塞到另外一个凝胶柱底部，通过电泳将目的单链DNA探针收集到小槽中，无水乙醇沉淀，溶于30ul水中，经Eppendorf核酸蛋白测定仪(BioPhotometer plus)测定，目的单链探针的浓度为10-15ng/μl。
具体操作流程如图2所示，图2中，凝胶柱中亮带下的弱带是Nb.BtsI消化后得到的目的单链探针的互补链片段。
本实施例的步骤如下：
一、设计并合成可变区序列
可变区序列如SEQ ID No.1所示，将其命名为Spacer M。可变区序列是下述探针右区段的前体扩增的模板，同时通过扩增探针右区段的前体探针的反向引物在可变区序列的结合位置调整探针右区段的前体的长度，其最大特点是随机性及非同源性，目的是利用该可变区序列的探针能够广泛应用于检测各种生物的突变位点，包括动植物，微生物等。经NCBI Blast比较，该可变区序列与大肠杆菌的同源性仅70％，与其它生物基因组序列的同源性均低于70％，而且连续匹配碱基在10bp以下。
Spacer M的组成：238 A；243 C；291 G；224 T；
Spacer M中各碱基的比例:23.9％A；24.4％C；29.2％G；22.5％T；
Spacer M：5’-CGACGATTCACCAGTGTCCTGCTGGTAGATGAAGACGAGATGCTGTCGTACTTACGCTGCTACTGCTGAGAATTCTAGCGGCCGCTAGACTGTACGCGAGCACGTAGGACATGTATCTGCAgTGCTGCAAGGCAACGGTTCATGCGACCAGCTTCGTGCTGCATGACTGTCGATCAGAACTGACGTGACAGCTCCAGTTCGAACAGTGGTGTGAGAACTCGCTCTCAGTCACGTCATACGTGACCAGTGAAGACCTCAGCA AAGCACAGCTACGCGAGATCAGGATGGCAGCCTACACTCGATAGTGAGAAGGAAGACACTGACAGCATGTCGATGGTCACAGGTAGGCAGACCTTAGATGGTATCGCTCAGAGTATGACCGCTGACCTTCAGTGAGTAGTCCTGACGAAGCTCTACGTCAACAGTCACTGATGCAAGGATTCTCCATGCTGCCAGTGTAGTTCTCCGAAGAGTATCCTCAGCACCATTGGAACCTGTCGATCCATCAGCGTCAGACGGTACAGGCATTCAGGACGCGAGATTCCATTGTGCAACCAACGGATCTACGCGATCCGTAGTGAGCCAGCCGAGATTGTTCACACTCCTGAGTTCGTCTTGACTTCAAGCTGCTGGATTGGAGTGAGGAATCTATACCTTCTGATCTAACTCACAGTCGGTTCTGCTAGTACACCTAGGATGATAACTCGGATGCGTCCAAGCCGTCTGAGCAGACCAATCCATATGAACAACGTGTCCACGTAGGACGATGAGATGCTGTTGCACTGTAGCCATGCTTCAGCATTGCGTGATGAGATCCAGTCCTAGATGGTCACCTGTTGTGAACCTTGACGACAGTTGTCAGTC-3’(SEQ ID No.1)
在上述可变区序列中引入22个切刻内切酶Nb.BtsI位点(5’-GCAGTG-3’，深色背景显示)，均匀地分布在SEQ ID No.1所示的996bp可变区序列中，约50bp的距离有一个Nb.BtsI位点，目的是在得到探针右区段的前体后由Nb.BtsI酶消化目的单链探针的互补链，经聚丙烯酰胺电泳，分离出高质量的目的单链探针。
二、待检测的4个SNP位点分别是Marker331，336、3811和347,各位点的序列信息、SNP位点、探针及其引物设计如下：
(说明：下述各序列中带连续下划线的序列为探针杂交的目标序列；带点式下划线的序列为通用引物序列；加粗的碱基为SNP位点；探针右区段的前体扩增时的正向引物中SNP位点前为保护碱基和MlyI位点；探针右区段以及探针右区段的前体的扩增时的引物的其余序列为可变区序列)
(一)Marker331(加粗的为SNP位点，mh为T，Zs为C)
1、Marker331的目标序列如下：
5’-GGAGGGGAATGCGATGCAATGTGAGGAGTCGTGGCTCTGGAGACGACGAGTCAAAGGGATAGATGCGATGAGTTTGAGGCTACAAGACTACGAGGTGGGCTGGGTCACGCTCACTGTCGGTTGAGTAGCCTCCATGATTGT CTCCGGATTTTATGTGTCCAGATTAAAGTCACATTGCATTGTGAACCTTGTAGCTTTTGAAGTTCCTAGTCTATTTGGCAGCTCAGG-3’(SEQ ID No.2)。
2、检测Marker331的探针如下：
1)检测Marker331SNP位点为T的探针：
①该探针左区段由左通用引物序列(5’-CGGAGTAAGATCCTGCGAAGAGC-3’)+目标序列构成，具体为331probe1：
5’- GGGTCACGCTCACTGTCGGT-3’(SEQ ID No.3)。
②该探针右区段为100-600nt,属于长链探针，具体为331probe2M：5’-TGAGTAGCC TCCATGATTGTCTCCGACGATTCACCAGTGTCCTGCTGGTAGATGAAGACGAGATGCTGTCGTACTTACGCT-3’(SEQ ID No.4)。
本实施例中所有扩增探针右区段的前体的引物设计原则如下：根据探针结构设计引物，正向引物的结构：5bp保护碱基(如5’-CATCG-3’)+MlyI位点(如5’-ACTCG-3’)+SNP位点碱基+目标序列+可变区序列；反向引物结构：右通用引物序列的反向互补序列(5’-CAATGTAGAGGTGGTCAGGCAATG-3’)+可变区序列的反向互补序列。可变区序列位置因探针长度不同而异。目标序列20-30nt,原则是使所有探针的退火温度基本一致，一般在65℃左右，以适合多个探针在同一条件下与相应的目标序列杂交。
该探针右区段的前体的扩增引物如下：
正向引物331M-F：
5’-CATCGACTCGTGAGTAGCCTCCATGATTGTCTCCGACGATTCACCAGT-3’(SEQID No.5)。
反向引物331M-R:5’-AGCCACTGCGTAAGTAC-3’(SEQID No.6)。
以可变区序列Spacer M为模板，331M-F和331M-R为引物进行PCR扩增，得到该探针右区段的前体，长度为132bp。
得到探针右区段的前体后经过酶切以及聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到该探针右区段(目的单链探针SEQ ID No.4)。
③以该探针的左区段和右区段一起检测Marker331SNP位点为T的序列获得的目的序列长度为160bp。
2)检测Marker331SNP位点为C的探针：
①该探针的左区段序列为331probe1，如SEQ ID No.3所示。
②该探针右区段为100-600nt,属于长链探针，具体为331probe2Z：5’-CGAGTAGCC TCCATGATTGTCTCCGACGATTCACCAGTGTCCTGCTGGTAGATGAAGACGAGATGCTGTCGTACTTACGCTGCTACTGCTGAGAATTCTAGCGG-3’(SEQ ID No.7)。
该探针右区段的前体的扩增引物如下：
正向引物331Z-F：
5’-CATCGACTCGCGAGTAGCCTCCATGATTGTCTCCGACGATTCACCAGT-3’(SEQID No.8)。
反向引物331Z-R:5’-CCGCTAGAATTCTCAGC-3’(SEQID No.9)。
以可变区序列Spacer M为模板，331Z-F和331Z-R为引物进行PCR扩增，得到该探针右区段的前体，长度为155bp。
得到探针右区段的前体后经过酶切以及聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到该探针右区段(目的单链探针SEQ ID No.7)。
③以该探针的左区段和右区段一起检测Marker331SNP位点为C的序列获得的目的序列长度为183bp。
(二)Marker 336(加粗的为SNP位点，mh为C，Zs为G)
1、Marker336的目标序列如下：
5’-TGCGTTAATATACGCGTCAATGTGCCATCGCAACCGATCATGACCAGCTCGGTACAACGGTACTCCTGTACTACTGCGTGTACTTGCACGACGTCACGGTCAGCTTAAGGCGTGTGTAATTGATTTCATCCTTGGTATCGC GTTCCGGCCCAGATGTCTCGGCCCAAATTGGCTGCTTCGGCATGGACGGGTCGTAACACTGGCTCGGTCCACATACATGGGCCCGAT-3’(SEQ ID No.10)。
2、检测Marker336的探针如下：
1)检测Marker336SNP位点为C的探针：
①该探针左区段由左通用引物序列(5’-CGGAGTAAGATCCTGCGAAGAGC-3’)+目标序列构成，具体为336probe1：
5’- GGTCAGCTTAAGGCGTGTGTAATT-3’(SEQ ID No.11)
②该探针右区段为100-600nt,属于长链探针，具体为336probe2M：
5’-CATTTCATCCTTGGTATCGCGTTCCGACGATTCACCAGTGTCCTGCTGGTAGATGAAGACGAGATGCTGTCGTACTTACGCTGCTACTGCTGAGAATTCTAGCGGCCGCTAGACTGTACGC -3’(SEQ ID No.12)
该探针右区段的前体的扩增引物如下：
正向引物336M-F：
5’-CATCGACTCGCATTTCATCCTTGGTATCGCGTTCCGACGATTCACCAGT-3’(SEQID No.13)。
反向引物336M-R:5’-CACTGCGCGTACAGTCT-3’(SEQID No.14)。
以可变区序列Spacer M为模板，336M-F和336M-R为引物进行PCR扩增，得到该探针右区段的前体，长度为178bp。
得到探针右区段的前体后经过酶切以及聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到该探针右区段(目的单链探针SEQ ID No.12)。
③以该探针的左区段和右区段一起检测Marker336 SNP位点为C的序列获得的目的序列长度为210bp。
2)检测Marker336SNP位点为G的探针：
①该探针的左区段序列为336probe1，如SEQ ID No.11所示。
②该探针右区段为100-600nt,属于长链探针，具体为336probe2Z：
5’-GATTTCATCCTTGGTATCGCGTTCCGACGATTCACCAGTGTCCTGCTGGTAGATGAAGACGAGATGCTGTCGTACTTACGCTGCTACTGCTGAGAATTCTAGCGGCCGCTAGACTGTACGCGAGCACGTAGGACATGTATCTCTGCAAGGCAACGGTTC-3’(SEQ ID No.15)。
该探针右区段的前体的扩增引物如下：
正向引物336Z-F：
5’-CATCGACTCGGATTTCATCCTTGGTATCGCGTTCCGACGATTCACCAGT-3’(SEQID No.16)。
反向引物336Z-R:5’CACTGCGAACCGTTGCC-3’(SEQID No.17)。
以可变区序列Spacer M为模板，336Z-F和336Z-R为引物进行PCR扩增，得到该探针右区段的前体，长度为228bp。
得到探针右区段的前体后经过酶切以及聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到该探针右区段(目的单链探针SEQ ID No.15)。
③以该探针的左区段和右区段一起检测Marker336 SNP位点为G的序列获得的目的序列长度为260bp。
(三)Marker 3811(加粗的为SNP位点，mh为C，Zs为G)
1、Marker 3811的目标序列如下：
5’-CACTCGCGGCGTGCCCGCGCGCGCCGCCGCGCCGCCGCCACGCGCCCTGGATCGTCTGTGGCCACGGCGATTCACCGCATCACTGTGGCCCTAGATCTCACATACATTGTTCTGTTCGTGAAAAGGAGAAGTATACCGCTCGTAGAATCTTCTATACATAGCTTTCTGAACTGAAGAAACGGAAGCAA-3’(SEQ ID No.18)。
2、检测Marker 3811的探针如下：
1)检测Marker3811SNP位点为C的探针：
①该探针左区段由左通用引物序列(5’-CGGAGTAAGATCCTGCGAAGAGC-3’)+目标序列构成，具体为3811probe1:
5’- CGCCATGGATTTTGAGCTTGAAC-3’(SEQ ID No.19)。
②该探针右区段为100-600nt,属于长链探针，具体为3811probe2M：
5’-CCAGTACACTCCTACTCCATGTGCGACGATTCACCAGTGTCCTGCTGGTAGATGAAGACGAGATGCTGTCGTACTTACGCTGCTACTGCTGAGAATTCTAGCGGCCGCTAGACTGTACGCGAGCACGTAGGACATGTATCTGTGCAAGGCAACGGTTCATGCGACCAGCTTCGTGCTGCATGACTGTCGATCAGAA-3’(SEQ ID No.20)。
该探针右区段的前体的扩增引物如下：
正向引物3811M-F：
5’-CATCGACTCGCCAGTACACTCCTACTCCATGTGCGACGATTCACCAGT-3’(SEQID No.21)。
反向引物3811M-R:5’-TTCTGATCGACAGTCATG-3’(SEQ ID No.22)。
以可变区序列Spacer M为模板，3811M-F和3811M-R为引物进行PCR扩增，得到该探针右区段的前体，长度为265bp。
得到探针右区段的前体后经过酶切以及聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到该探针右区段(目的单链探针SEQ ID No.20)。
③以该探针的左区段和右区段一起检测Marker3811SNP位点为C的序列获得的目的序列长度为296bp。
2)检测Marker3811SNP位点为G的探针：
①该探针的左区段序列为3811probe1，如SEQ ID No.19所示。
②该探针右区段为100-600nt,属于长链探针，具体为3811probe2Z：
5’-GCGACGATTCACCAGTGTCCTGCTGGTAGATGAAGACGAGATGCTGTCGTACTTACGCTGCTACTGCTGAGAATTCTAGCGGCCGCTAGACTGTACGCGAGCACGTAGGACATGTATCTCTGCAAGGCAACGGTTCATGCGACCAGCTTCGTGCTGCATGACTGTCGATCAGAACTGACGTGACAGCTCCAGTTCGAACAGTGGTGTGAGAACTCGCTCTCA -3’(SEQ ID No.23)。
该探针右区段的前体的扩增引物如下：
正向引物3811Z-F:
5’-CATCGACTCGGCAGTACACTCCTACTCCATGTGCGACGATTCACCAGT-3’(SEQID No.24)。
反向引物3811Z-R:5’-TGAGAGCCACTGCGAGT-3’(SEQID No.25)。
以可变区序列Spacer M为模板，3811Z-F和3811Z-R为引物进行PCR扩增，得到该探针右区段的前体，长度为325bp。
得到探针右区段的前体后经过酶切以及聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到该探针右区段(目的单链探针SEQ ID No.23)。
③以该探针的左区段和右区段一起检测Marker3811SNP位点为G的序列获得的目的序列长度为356bp。
(四)Marker 347(加粗的为SNP位点，mh为G，Zs为A)
1、Marker347的目标序列如下：
5’-TGATAAGGATTTGCTGAAGTAGGAACTGATGCTAGGAAACGACTGAACAGCACATTAGTATTTTCTGCAGCTAAAACATGTTTATTGTCATGTGGCAATGTGAACCTTTGGAGCAGCACTGACCTTTAGTTGCTGCATCTT ACTAGATCAAGTGTGGTTGCTCTCCAGAGTTCCTGACCCTATCCTGCTGTTTGGATTAGTTTTGTCTATGCTTCTTTTATGTCGCAT-3’(SEQ ID No.26)。
2、检测Marker347的探针如下：
1)检测Marker347SNP位点为G的探针：
①该探针左区段由左通用引物序列(5’-CGGAGTAAGATCCTGCGAAGAGC-3’)+目标序列构成，具体为347probe1:
5’- GTGAACCTTTGGAGCAGCACTG-3’(SEQ ID No.27)。
②该探针右区段为100-600nt,属于长链探针，具体为347probe2M:
5’-
GCGACGATTCACCAGTGTCCTGCTGGTAGATGAAGACGAGATGCTGTCGTACTTACGCTGCTACTGCTGAGAATTCTAGCGGCCGCTAGACTGTACGCGAGCACGTAGGACATGTATCTGCTGCAAGGCAACGGTTCATGCGACCAGCTTCGTGCTGCATGACTGTCGATCAGAACTGACGTGACAGCTCCAGTTCGAACAGTGGTGTGAGAACTCGCTCTCAGTCACGTCATACGTGACCAGTGAAGACCTCAGCAAAGCACAGCTACGCGAGATCAGGATGGCAGC -3’(SEQ ID No.28)。
该探针右区段的前体的扩增引物如下：
正向引物347M-F：5’-
CATCGACTCGGCCTTTAGTTGCTGCATCTTACTAGCGACGATTCACCAGT-3’(SEQ IDNo.29)。
反向引物347M-R:5’-GCTGCCATCCTGATCTC-3’(SEQID No.30)。
以可变区序列Spacer M为模板，347M-F和347M-R为引物进行PCR扩增，得到该探针右区段的前体，长度为398bp。
得到探针右区段的前体后经过酶切以及聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到该探针右区段(目的单链探针SEQ ID No.28)。
③以该探针的左区段和右区段一起检测Marker347SNP位点为G的序列获得的目的序列长度为428bp。
2)检测Marker347SNP位点为A的探针：
①该探针的左区段序列为347probe1，如SEQ ID No.27所示。
②该探针右区段为100-600nt,属于长链探针，具体为347probe2Z:
5’-
ACCTTTAGTTGCTGCATCTTACTAGCGACGATTCACCAGTGTCCTGCTGGTAGATGAAGACGAGATGCTGTCGTACTTACGCTGCTACTGCTGAGAATTCTAGCGGCCGCTAGACTGTACGCGAGCACGTAGGACATGTATCTCTGCAAGGCAACGGTTCATGCGACCAGCTTCGTGCTGCATGACTGTCGATCAGAACTGACGTGACAGCTCCAGTTCGAACAGTGGTGTGAGAACTCGCTCTCAGTCACGTCATACGTGACCAGTGAAGACCTCAGCAAAGCACAGCTACGCGAGATCAGGATGGCAGCCTACACTCGATAGTGAGAAGGAAGACACTGACAGCATGTCGATGGTCA -3’(SEQ ID No.31)。
该探针右区段的前体的扩增引物如下：
正向引物347Z-F:5’-
CATCGACTCGACGACGATTCACCAGT-3’(SEQID No.32)。
反向引物347Z-R:5’-CACTGCTGACCATCGAC-3’(SEQID No.33)。
以可变区序列Spacer M为模板，347Z-F和347Z-R为引物进行PCR扩增，得到该探针右区段的前体，长度为458bp。
得到探针右区段的前体后经过酶切以及聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到该探针右区段(目的单链探针SEQ ID No.31)。
③以该探针的左区段和右区段一起检测Marker347突变型位点获得的目的序列长度为488bp。
三、探针与基因组DNA杂交
将如下所有探针均稀释成2ng/μl，水稻亲本明辉(mh)和珍汕(Zs)的F2代的基因组DNA 100-500ng，建立如下体系：
上述反应体系中对应位点的probe1与probe2的摩尔比为2:1，因为一个probe1(如331probe1)分别与两个probe2(如331probe2M和331probe2Z)连接才能形成两条完整的检测两个SNP位点的探针。
检测群体是211个水稻亲本明辉(mh)和珍汕(Zs)的F2代，加亲本明辉/珍汕及其杂交种汕优(F1代)作对照，一共214个基因组样本。
杂交条件：98℃，3min；85℃，30min；68℃，30min；60℃杂交过夜。
四、连接探针并进行PCR扩增
探针与基因组DNA杂交后，检测同一个SNP位点的probe1和probe2(如检测Marker331的331probe1分别与331probe2M和331probe2Z)在SNP位点处仍然处于断开状态，需要连接酶连接。为了提高连接的特异性，采用美国Epicentre公司生产的DNA耐高温连接酶Ampligase(货号为A3210K)进行连接，即在步骤三得到的每个杂交反应体系中直接加入3μl如下的Ampligase酶连接体系，混匀，50℃连接3-4小时。
连接体系如下：
连接反应结束后，将连接产物直接用作PCR模板，由通用引物P1、P2进行PCR扩增。
P1：5’-；(SEQ ID No.34)
P2:5’-；(SEQ ID No.35)
PCR反应体系：
PCR反应程序：
五、取7μl步骤四得到的PCR产物，在3％(琼脂糖与电泳缓冲液的比例为3g：100ml)琼脂糖凝胶电泳，检测SNP位点类型，其中45个株系及其亲本、杂交种的检测结果如图3所示。
图3中，泳道上方的数字是211个重组自交系的编号；M、Z和S分别代表亲本明辉、珍汕及其杂交种汕优。
图3表明，亲本明辉、珍汕各4条带，为4个SNP位点，各自处于纯合状态；杂交种汕优为8条带，4个SNP位点处于完全杂合状态；其它株系各自有不同的基因型。经过测序证明测序结果与本方法得出的结果一致，本技术真实可靠性。
利用本实施例的方法在水稻中可以同时检测5-6个SNP位点，而且在其它2倍体生物能够得到很好应用，彻底实现了操作简便、高通量、低成本检测SNP，使SNP作为DNA分子标记在实际应用中充分发挥其绝对的优势。
Claims (10)
1.一组检测SNP位点的探针，该探针由检测各个SNP位点的各个探针组成，所述探针均由左区段和右区段组成；所述左区段的序列从5’端到3’端依次为左通用引物序列和位于待测基因组上待测SNP位点的5’端上游、且与待测SNP位点相邻的核苷酸序列；所述右区段的序列从5’端到3’端依次为待测SNP位点的核苷酸、位于待测基因组上待测SNP位点的3’端下游、且与待测SNP位点相邻的核苷酸序列、可变区序列和右通用引物序列；
所述各个SNP位点的各个探针的长度均不同，一种SNP位点对应一种长度；
所述各个SNP位点的各个探针的左区段中，左通用引物序列均相同；
所述各个SNP位点的各个探针的右区段中，右通用引物序列均相同；
所述探针的退火温度基本一致，以适合在同一条件下与相应的目标序列杂交。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述SNP位点为同一个位点时，检测该SNP位点的各个探针的左区段均相同；
所述左通用引物序列如SEQ ID No.3中自5’端起第1位至第23位核苷酸所示；
所述右通用引物序列如SEQ ID No.4中自5’端起第94位至第117位核苷酸所示。
3.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于：所述可变区序列为SEQ ID No.1中的任一段序列。
4.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于：所述左区段中，所述位于待测基因组上待测SNP位点的5’端上游、且与待测SNP位点相邻的核苷酸序列的长度为20-30bp；
所述右区段中，所述位于待测基因组上待测SNP位点的3’端下游、且与待测SNP位点相邻的核苷酸序列的长度为20-30 bp。
5.一种检测SNP位点的试剂盒，该试剂盒包含如下1）或2）所述的分子：
1）权利要求1-4任一所述的探针；
2）权利要求1-4任一所述的探针的左区段、SEQ ID No.1所示的DNA分子和扩增含有权利要求1-4任一所述的探针的右区段的前体的引物对；
所述权利要求1-4任一所述的探针的右区段的前体经限制性内切酶MlyI和切刻内切酶Nb.BtsI消化得到权利要求1-4任一所述的探针的右区段；
该试剂盒还包含使用说明书，说明书的记载内容如下：将待检测基因组序列与权利要求1-4任一所述的探针进行杂交，得到杂交产物；在杂交产物中加入DNA连接酶对杂交产物进行连接，使得探针的左区段与右区段连接，得到连接产物；以连接产物为模板，以左通用引物序列和右通用引物序列为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；根据PCR扩增产物的长度与所述探针的长度是否一致判断SNP位点处碱基种类；
或，
以SEQ ID No.1所示的DNA分子为模板，以扩增权利要求1-4任一所述的探针的右区段的前体的引物对为引物进行PCR扩增，得到右区段的前体，将该前体经限制性内切酶MlyI和切刻内切酶Nb.BtsI消化得到权利要求1-4任一所述的探针的右区段；该右区段与左区段组成探针；将待检测基因组序列与探针进行杂交，得到杂交产物；在杂交产物中加入DNA连接酶对杂交产物进行连接，使得探针的左区段与右区段连接，得到连接产物；以连接产物为模板，以左通用引物序列和右通用引物序列为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；根据PCR扩增产物的长度与所述探针的长度是否一致判断SNP位点处碱基种类；
所述左通用引物序列为权利要求1-4任一所述的探针的左区段的左通用引物序列；
所述右通用引物序列为权利要求1-4任一所述的探针的右区段的右通用引物序列。
6.一种检测SNP位点的方法，包括如下步骤：将待测基因组与权利要求1-4任一所述的探针的左区段和右区段进行杂交，得到杂交产物；在杂交产物中加入DNA连接酶，对杂交产物进行连接，使得探针的左区段与右区段连接，得到连接产物；以连接产物为模板，用所述探针中所述左通用引物序列和所述探针中所述右通用引物序列为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；根据PCR扩增产物的长度和探针的长度是否一致判断SNP位点处核苷酸种类。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述探针的右区段的制备方法如下：以SEQID No.1所示的DNA分子为模板，以扩增权利要求1-4任一所述的探针的右区段的前体的引物对为引物进行PCR扩增，得到右区段的前体，将该前体经限制性内切酶MlyI和切刻内切酶Nb.BtsI消化得到单链，即得。
8.一种制备权利要求1-4任一所述的探针中的右区段的方法，包括如下步骤：以SEQ IDNo.1所示DNA分子为模板，以右区段的前体的引物对为引物进行PCR扩增，得到右区段的前体，将该前体经限制性内切酶MlyI和切刻内切酶Nb.BtsI消化得到单链，即得。
9.SEQ ID No.1所示的DNA分子。
10.权利要求1-4任一所述的探针、权利要求5所述的试剂盒或权利要求9所述的DNA分子在检测SNP位点中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410778560.XA CN105779570B (zh) | 2014-12-15 | 2014-12-15 | 一种检测snp位点的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410778560.XA CN105779570B (zh) | 2014-12-15 | 2014-12-15 | 一种检测snp位点的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105779570A CN105779570A (zh) | 2016-07-20 |
| CN105779570B true CN105779570B (zh) | 2019-06-11 |
Family
ID=56374820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410778560.XA Expired - Fee Related CN105779570B (zh) | 2014-12-15 | 2014-12-15 | 一种检测snp位点的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105779570B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109337993B (zh) * | 2018-12-14 | 2021-06-11 | 中山大学 | 一种双脐螺snp分子标记及其在溯源中的应用 |
| CN110964791B (zh) * | 2019-12-26 | 2023-08-15 | 贵州中医药大学第二附属医院 | 一种单核苷酸多态性的检测方法及相应的试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1824786A (zh) * | 2005-12-23 | 2006-08-30 | 上海生物芯片有限公司 | 基于连接的选择性扩增方法 |
| CN103014141A (zh) * | 2011-09-26 | 2013-04-03 | 复旦大学 | 用于筛查多发畸形综合征的组合探针 |
-
2014
- 2014-12-15 CN CN201410778560.XA patent/CN105779570B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1824786A (zh) * | 2005-12-23 | 2006-08-30 | 上海生物芯片有限公司 | 基于连接的选择性扩增方法 |
| CN103014141A (zh) * | 2011-09-26 | 2013-04-03 | 复旦大学 | 用于筛查多发畸形综合征的组合探针 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105779570A (zh) | 2016-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104164488B (zh) | 一种单引物引发的核酸恒温扩增方法 | |
| EP2382330B1 (en) | Cross priming amplification of target nucleic acids | |
| CN105525357A (zh) | 一种测序文库的构建方法及试剂盒和应用 | |
| CN107488711B (zh) | 点突变的基因型检测的方法及其试剂盒 | |
| CN108220399B (zh) | 一种基于通用探针技术的荧光定量pcr方法 | |
| CN107619870B (zh) | 能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记及其特异性引物对和应用 | |
| CN106893781A (zh) | 一种基于dna折纸探针特异性标记的单分子基因分型方法及其应用 | |
| CN106191214B (zh) | 一种多色荧光熔解曲线pcr检测方法 | |
| CN102586456B (zh) | 一种多重竞争性pcr检测拷贝数变异的方法 | |
| CN104164478A (zh) | 一种基因单碱基变异的cras-pcr检测方法 | |
| KR101358416B1 (ko) | 리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법 | |
| CN105779570B (zh) | 一种检测snp位点的方法 | |
| CN111793712A (zh) | 小麦snp iwa586位点的单核苷酸多态性的物质的用途 | |
| CN107937493B (zh) | 一种用于等位基因pcr的发夹修饰引物 | |
| CN101985659A (zh) | 检测精神分裂关联基因的试剂盒及其制备方法 | |
| CN108642209B (zh) | 一种小麦植株千粒重判断标记及其应用 | |
| CN108359713B (zh) | 一种基因多态性检测探针的筛选方法 | |
| KR101727598B1 (ko) | Pna 프로브 및 융해곡선분석을 이용한 미토콘드리아 dna의 snp 분석방법 | |
| CN110172500A (zh) | 一种单核苷酸多态性的等温分型方法 | |
| CN102943109B (zh) | 一种基于串联多内对照的检测拷贝数变异的方法 | |
| CN109266723A (zh) | 稀有突变检测方法、其试剂盒及应用 | |
| CN114606335A (zh) | 玉米抗甘蔗花叶病毒病基因的kasp分子标记的开发及应用 | |
| CN108642199B (zh) | 与谷子旗叶长性状相关的snp标记及其检测引物和应用 | |
| CN111607664A (zh) | 一种与小麦条锈病相关的1ds染色体上的snp分子标记的应用 | |
| CN111793676A (zh) | 一种基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210527 Address after: 314000 Room 101, building C4, 555 Chuangye Road, Dayun Town, Jiashan County, Jiaxing City, Zhejiang Province Patentee after: ZHEJIANG SHANCE HEQISHI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 100093 Beijing City, Haidian District Xiangshan Nanxin Village No. 20 Patentee before: Institute of Botany of the Chinese Academy of Sciences |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210924 Address after: 310000 room 902-15, 9 / F, West Building 4, Xigang development center, No. 298 Zhenhua Road, Sandun Town, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province Patentee after: Hangzhou heknight future Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 314000 Room 101, building C4, 555 Chuangye Road, Dayun Town, Jiashan County, Jiaxing City, Zhejiang Province Patentee before: ZHEJIANG SHANCE HEQISHI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190611 |